JP2529816B2 - 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 - Google Patents
新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト組織プラスミノゲ
ン活性化因子(t−ＰＡ)の新規な突然変異体に関するも
のである。これらの突然変異体は、後述する様に、既に
文献中に総括的に開示されている。しかし、本発明の突
然変異体は、他の研究者によってなされた基本的なヒト
−プラスミノゲン活性化因子分子を用いた研究や、セリ
ンプロテアーゼ類、トリプシンおよびキモトリプシンを
用いたモデル研究の結果からは予測し得ない活性を示
す、新規で特異的なものである。
ン活性化因子(t−ＰＡ)の新規な突然変異体に関するも
のである。これらの突然変異体は、後述する様に、既に
文献中に総括的に開示されている。しかし、本発明の突
然変異体は、他の研究者によってなされた基本的なヒト
−プラスミノゲン活性化因子分子を用いた研究や、セリ
ンプロテアーゼ類、トリプシンおよびキモトリプシンを
用いたモデル研究の結果からは予測し得ない活性を示
す、新規で特異的なものである。
【０００２】
【発明の背景】コレン(Ｃollen)らは、初めて、天然起
源からヒト組織プラスミノゲン活性化因子を実質上、純
粋な形で単離して同定し、プラスミノゲン活性化因子に
とって必要な活性の測定を行った(ヨーロッパ特許出願
公開Ｎo．０４１７６６、１９８１年１２月１６日公
開、最初の出願日、１９８０年６月１１日)。
源からヒト組織プラスミノゲン活性化因子を実質上、純
粋な形で単離して同定し、プラスミノゲン活性化因子に
とって必要な活性の測定を行った(ヨーロッパ特許出願
公開Ｎo．０４１７６６、１９８１年１２月１６日公
開、最初の出願日、１９８０年６月１１日)。
【０００３】その後、譲受人の研究室において、ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子に通常伴なっているタン
パク質を、実質上、含まない状態のt−ＰＡを、組換え
ＤＮＡ技術を用いて生産することに成功した。この研究
は化学の学術文献およびヨーロッパ特許出願公開Ｎo．
０９３６１９(１９８３年１１月９日公開、１９８２年
５月５日出願)に記載されている。上記の特許出願(ＥＰ
Ｏ公開Ｎo．０９３６１９)は、ヒトプラスミノゲン活性
化因子の誘導体、即ち、アミノ酸の置換、欠失、付加、
あるいは、基礎的なＤＮＡに対する部位特異的突然変異
誘発による置換等により様々な修飾を受けている種々の
誘導体をも想定している。
織プラスミノーゲン活性化因子に通常伴なっているタン
パク質を、実質上、含まない状態のt−ＰＡを、組換え
ＤＮＡ技術を用いて生産することに成功した。この研究
は化学の学術文献およびヨーロッパ特許出願公開Ｎo．
０９３６１９(１９８３年１１月９日公開、１９８２年
５月５日出願)に記載されている。上記の特許出願(ＥＰ
Ｏ公開Ｎo．０９３６１９)は、ヒトプラスミノゲン活性
化因子の誘導体、即ち、アミノ酸の置換、欠失、付加、
あるいは、基礎的なＤＮＡに対する部位特異的突然変異
誘発による置換等により様々な修飾を受けている種々の
誘導体をも想定している。
【０００４】上記出願で開示されている様に、ヒトプラ
スミノゲン活性化因子(t−ＰＡ)は、一本鎖および二本
鎖のいずれの形でも、存在している。後者は前者のタン
パク分解的加水分解産物である。一本鎖形から２本鎖形
へのタンパク分解的変換は、フイブリン血餅(クロット)
の溶解段階に起きることが示された[リッケン(Ｒijken)
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)２５７、２９２０(１９８２)]。
プラスミノゲン活性化因子の活性は二本鎖形にあると考
えられているが、初期の報告では、一本鎖形のヒトt−
ＰＡ(リッケン、同上)や、一本鎖形のプロシン(procin
e)t−ＰＡ[ランビイ(Ｒanby)ら、トロンボ・レス(Ｔhro
mb．Ｒes．)２７ １７６(１９８２)]も幾分かの活性を
有しているかもしれないと、指摘されていた[リッケン
ら、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ(Ｂioche
m．Ｂiophy．Ａcta)５８０,１４０(１９７９)をも参
照]。
スミノゲン活性化因子(t−ＰＡ)は、一本鎖および二本
鎖のいずれの形でも、存在している。後者は前者のタン
パク分解的加水分解産物である。一本鎖形から２本鎖形
へのタンパク分解的変換は、フイブリン血餅(クロット)
の溶解段階に起きることが示された[リッケン(Ｒijken)
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)２５７、２９２０(１９８２)]。
プラスミノゲン活性化因子の活性は二本鎖形にあると考
えられているが、初期の報告では、一本鎖形のヒトt−
ＰＡ(リッケン、同上)や、一本鎖形のプロシン(procin
e)t−ＰＡ[ランビイ(Ｒanby)ら、トロンボ・レス(Ｔhro
mb．Ｒes．)２７ １７６(１９８２)]も幾分かの活性を
有しているかもしれないと、指摘されていた[リッケン
ら、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ(Ｂioche
m．Ｂiophy．Ａcta)５８０,１４０(１９７９)をも参
照]。
【０００５】しかしながら、その後の研究者達は、一本
鎖形のt−ＰＡ製品には、少量の二本鎖形t−ＰＡが不純
物として含まれていたことから、上記の如き一本鎖形の
活性についての報告を放逐した[アンドレーセン(Ａndre
asen)ら、ＥＭＢＯジャーナル、３０、１５１(１９８
４);イチノセ(Ｉchinose)ら、ＦＥＢＳ．レターズ１７
５,４１２(１９８４)]。これらの後続文献において、研
究者達は、t−ＰＡ等のセリンプロテアーゼは一本鎖形
の不活性な酵素原として発現され、このタンパク質が特
異的な部位(t−ＰＡの場合は、２７５番目の位置にある
アルギニン)で加水分解された初めて活性となる、とい
う一般的な説を再確認している。
鎖形のt−ＰＡ製品には、少量の二本鎖形t−ＰＡが不純
物として含まれていたことから、上記の如き一本鎖形の
活性についての報告を放逐した[アンドレーセン(Ａndre
asen)ら、ＥＭＢＯジャーナル、３０、１５１(１９８
４);イチノセ(Ｉchinose)ら、ＦＥＢＳ．レターズ１７
５,４１２(１９８４)]。これらの後続文献において、研
究者達は、t−ＰＡ等のセリンプロテアーゼは一本鎖形
の不活性な酵素原として発現され、このタンパク質が特
異的な部位(t−ＰＡの場合は、２７５番目の位置にある
アルギニン)で加水分解された初めて活性となる、とい
う一般的な説を再確認している。
【０００６】ウサギおよび犬を用い、１本鎖プラスミノ
ゲン活性化因子と二本鎖プラスミノゲン活性化因子の、
フイブリン血餅溶解活性のインビボでの比較研究がなさ
れた。ウサギの場合、この酵素の２つの形における能力
は同等であることが認められた[コレンら、ジェイ・ク
リン・インベスト(Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．)７１ ３６８
(１９８３)]。しかし、犬に関して、同じモデルを用い
て行った評価では、二本鎖形のプラスミノゲン活性因子
に比べて一本鎖形のものの方がやや活性が低いことが報
告されている[コーニンガー(Ｋorninger)ら、ジェイ・
クリン・インベスト(Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．)６９ ５７
３(１９８２)]。これらの研究報告は、インビボにおけ
るフイブリン血餅の溶解能力において、一本鎖プラスミ
ノーゲン活性化因子が、二本鎖プラスミノーゲン活性化
因子以上に優れていることはなく、むしろ、実際には、
劣っていることを示唆している。
ゲン活性化因子と二本鎖プラスミノゲン活性化因子の、
フイブリン血餅溶解活性のインビボでの比較研究がなさ
れた。ウサギの場合、この酵素の２つの形における能力
は同等であることが認められた[コレンら、ジェイ・ク
リン・インベスト(Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．)７１ ３６８
(１９８３)]。しかし、犬に関して、同じモデルを用い
て行った評価では、二本鎖形のプラスミノゲン活性因子
に比べて一本鎖形のものの方がやや活性が低いことが報
告されている[コーニンガー(Ｋorninger)ら、ジェイ・
クリン・インベスト(Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．)６９ ５７
３(１９８２)]。これらの研究報告は、インビボにおけ
るフイブリン血餅の溶解能力において、一本鎖プラスミ
ノーゲン活性化因子が、二本鎖プラスミノーゲン活性化
因子以上に優れていることはなく、むしろ、実際には、
劣っていることを示唆している。
【０００７】
【発明の要約】本発明は、ヒトt−ＰＡの新規な突然変
異体であって、驚くべきことに、コレンら(ＥＰＯ公開
Ｎo．０４７６６)によって最初に単離されたヒトt−Ｐ
Ａ、並びに前記の組換え特許出願(ＥＰＯ公開Ｎo．０９
３６１９)に示されているt−ＰＡ分子と同等、あるいは
それ以上の活性を示す突然変異体に関するものである。
さらに詳しくは、本発明は、ヒトt−ＰＡアミノ酸配列
の２７５および２７６位(それぞれ、アルギニンおよび
イソロイシンによって占められている)付近の部位に、
あるアミノ酸置換を有する特異的な突然変異体に関する
ものである。ある種の酵素的に活性な分子は、この(こ
れらの)部位(１または１以上)を認識し(おそらく、それ
と隣接している１またはそれ以上のアミノ酸と一緒
に)、塩基性アミノ酸の後方で機能的に加水分解して結
合(特に、アルギニン／イソロイシンおよびリジン／グ
リシン間)を切り、その結果、二本鎖物質を与える。こ
れらの２本の鎖は、システイン残基を介したジスルフイ
ド結合により、互いに結合している。本発明によれば、
これらの位置で、例えばアルギニンおよびリジン以外の
アミノ酸による置換が起るので、開裂部位に変化を来
し、２本鎖ヒトt−ＰＡがインビトロまたはインビボで
生成されないか、あるいは、その形成成度が遅延されて
いる突然変異体が生産される。従って、本発明によれ
ば、生物学的な活性を試験する目的で、突然変異を誘発
された一本鎖ヒトt−ＰＡを得ることができる。これら
の突然変異体は免疫を与えることができ、または、少な
くとも２７５／２７６部位で加水分解されることに抵抗
性を有しており、さらには、得られた一本鎖t−ＰＡ突
然変異体は、意外にも、コレンらのt−ＰＡおよび／ま
たは前記の組換えt−ＰＡ分子と同等の活性を有するこ
とが、ある生物学的検定法で見出された。その上、これ
ら突然変異体は、天然に存在しているt−ＰＡ阻害物質
との反応性が低いことも示された。
異体であって、驚くべきことに、コレンら(ＥＰＯ公開
Ｎo．０４７６６)によって最初に単離されたヒトt−Ｐ
Ａ、並びに前記の組換え特許出願(ＥＰＯ公開Ｎo．０９
３６１９)に示されているt−ＰＡ分子と同等、あるいは
それ以上の活性を示す突然変異体に関するものである。
さらに詳しくは、本発明は、ヒトt−ＰＡアミノ酸配列
の２７５および２７６位(それぞれ、アルギニンおよび
イソロイシンによって占められている)付近の部位に、
あるアミノ酸置換を有する特異的な突然変異体に関する
ものである。ある種の酵素的に活性な分子は、この(こ
れらの)部位(１または１以上)を認識し(おそらく、それ
と隣接している１またはそれ以上のアミノ酸と一緒
に)、塩基性アミノ酸の後方で機能的に加水分解して結
合(特に、アルギニン／イソロイシンおよびリジン／グ
リシン間)を切り、その結果、二本鎖物質を与える。こ
れらの２本の鎖は、システイン残基を介したジスルフイ
ド結合により、互いに結合している。本発明によれば、
これらの位置で、例えばアルギニンおよびリジン以外の
アミノ酸による置換が起るので、開裂部位に変化を来
し、２本鎖ヒトt−ＰＡがインビトロまたはインビボで
生成されないか、あるいは、その形成成度が遅延されて
いる突然変異体が生産される。従って、本発明によれ
ば、生物学的な活性を試験する目的で、突然変異を誘発
された一本鎖ヒトt−ＰＡを得ることができる。これら
の突然変異体は免疫を与えることができ、または、少な
くとも２７５／２７６部位で加水分解されることに抵抗
性を有しており、さらには、得られた一本鎖t−ＰＡ突
然変異体は、意外にも、コレンらのt−ＰＡおよび／ま
たは前記の組換えt−ＰＡ分子と同等の活性を有するこ
とが、ある生物学的検定法で見出された。その上、これ
ら突然変異体は、天然に存在しているt−ＰＡ阻害物質
との反応性が低いことも示された。
【０００８】
【詳しい記述】本明細書において、「ヒト組織プラスミ
ノゲン活性化因子」、「ヒトt−ＰＡ」または「t−ＰＡ」と
いう語句は、例えば組換え細胞培養系において、プロテ
アーゼ部分を含み、天然のヒト組織プラスミノゲン活性
因子以外のプラスミノゲン活性化因子に相当する生物活
性な形で生産された外因性のヒト(組織型)プラスミノゲ
ン活性化因子を意味する。全配列を通じて、１個または
それ以上のアミノ酸が異なることに起因する天然のアレ
ル変異体が存在し、また、生成され得ることは理解され
るであろう。また、宿主の細胞環境の性質により、グリ
コシル化のパターンにも変化がある。
ノゲン活性化因子」、「ヒトt−ＰＡ」または「t−ＰＡ」と
いう語句は、例えば組換え細胞培養系において、プロテ
アーゼ部分を含み、天然のヒト組織プラスミノゲン活性
因子以外のプラスミノゲン活性化因子に相当する生物活
性な形で生産された外因性のヒト(組織型)プラスミノゲ
ン活性化因子を意味する。全配列を通じて、１個または
それ以上のアミノ酸が異なることに起因する天然のアレ
ル変異体が存在し、また、生成され得ることは理解され
るであろう。また、宿主の細胞環境の性質により、グリ
コシル化のパターンにも変化がある。
【０００９】ヒト組織プラスミノゲン活性化因子は、プ
ラスミノゲンをプラスミンに変化させるプロテアーゼ領
域と、フイブリンとの結合に関与すると考えられている
クリングル(kringle)含有領域との２個の機能的な領域
を有するポリペプチドである。従って、t−ＰＡは、全
配列の一部にこれらの機能的な配列を含有しているポリ
ペプチドを包含するものである。
ラスミノゲンをプラスミンに変化させるプロテアーゼ領
域と、フイブリンとの結合に関与すると考えられている
クリングル(kringle)含有領域との２個の機能的な領域
を有するポリペプチドである。従って、t−ＰＡは、全
配列の一部にこれらの機能的な配列を含有しているポリ
ペプチドを包含するものである。
【００１０】t−ＰＡの「２本鎖開裂部位」は、少くと
も、２７５位のアルギニン残基を含有する。しかしなが
ら、２７５位の残基と隣接する、あるいは、２７５位付
近の数個の残基内の種々のアミノ酸もまた、プラスミノ
ゲン活性化因子をその二本鎖形に変換する酵素によって
認識され得る領域の一部であると思われる。従って、こ
の領域内であって、２７５位以外の位置のアミノ酸が置
換されることにより、２本鎖形への変換に抵抗し得る突
然変異プラスミノゲン活性化因子を得ることができる。
も、２７５位のアルギニン残基を含有する。しかしなが
ら、２７５位の残基と隣接する、あるいは、２７５位付
近の数個の残基内の種々のアミノ酸もまた、プラスミノ
ゲン活性化因子をその二本鎖形に変換する酵素によって
認識され得る領域の一部であると思われる。従って、こ
の領域内であって、２７５位以外の位置のアミノ酸が置
換されることにより、２本鎖形への変換に抵抗し得る突
然変異プラスミノゲン活性化因子を得ることができる。
【００１１】本明細書では特に、「一本鎖プラスミノゲ
ン活性化因子突然変異体」という語句は、２本鎖形への
変換に抵抗性を有するプラスミノゲン活性化因子を指す
ものとする。これは、二本鎖活性化部位における１また
は複数個のアミノ酸の置換に基づくことを特徴とする。
修飾された結果、その様な活性化部位は認識されなくな
り、通常、プラスミノゲン活性化因子を二本鎖形に変換
する酵素によって認識されなくなる。
ン活性化因子突然変異体」という語句は、２本鎖形への
変換に抵抗性を有するプラスミノゲン活性化因子を指す
ものとする。これは、二本鎖活性化部位における１また
は複数個のアミノ酸の置換に基づくことを特徴とする。
修飾された結果、その様な活性化部位は認識されなくな
り、通常、プラスミノゲン活性化因子を二本鎖形に変換
する酵素によって認識されなくなる。
【００１２】トリプシンおよびキモトリプシンとの類似
性に基づき、セリンプロテアーゼ類における二本鎖形成
において重要な点を考慮し、t−ＰＡの場合は、２７６
位に遊離のα−アミノ基が存在することが重要と思われ
る。２７５位のargにおいて開裂されると、２７６位の
α−アミノ基が遊離の状態になり、ポリペプチド鎖と、
t−ＰＡの活性なセリン領域で反応が自由に行われるよ
うになる。従って、本発明は、分子全体としての活性全
てを消失させることなしに、前記の如きα−アミノ基と
プロテアーゼ活性部位との相互作用を妨げ得る全ての突
然変異を包含するものである。
性に基づき、セリンプロテアーゼ類における二本鎖形成
において重要な点を考慮し、t−ＰＡの場合は、２７６
位に遊離のα−アミノ基が存在することが重要と思われ
る。２７５位のargにおいて開裂されると、２７６位の
α−アミノ基が遊離の状態になり、ポリペプチド鎖と、
t−ＰＡの活性なセリン領域で反応が自由に行われるよ
うになる。従って、本発明は、分子全体としての活性全
てを消失させることなしに、前記の如きα−アミノ基と
プロテアーゼ活性部位との相互作用を妨げ得る全ての突
然変異を包含するものである。
【００１３】基本の(元々の)ＤＮＡに突然変異を誘発
し、本発明の突然変異体を調製するために利用し得る様
々な方法がある。その内、本明細書において特に好まし
い例示の方法は、突然変異を起こそうとする領域をコー
ドしている配列を含む、天然のt−ＰＡ遺伝子のフラグ
メントを複製可能な形のファージＭ１３mp８に挿入して
Ｍ１３mp８ＰＡを組立てることを含む。次いで、挿入し
たt−ＰＡ配列と相補的であるが、置換すべきアミノ酸
をコードしている１またはそれ以上のヌクレオチドトリ
プレットを含んでいる合成オリゴヌクレオチドを一本鎖
形のＭ１３mp８ＰＡにアニールし、二本鎖領域を形成す
る。この領域は、ＤＮＡポリメラーゼＩによる、残りの
相補鎖の形成におけるプライマーとなる。複製、同定の
後、この突然変異t−ＰＡ配列を更に修飾するか、ある
いは、突然変異t−ＰＡポリペプチドを発現させるため
の原核性または真核性ベクターの組立てに用いることが
できる。
し、本発明の突然変異体を調製するために利用し得る様
々な方法がある。その内、本明細書において特に好まし
い例示の方法は、突然変異を起こそうとする領域をコー
ドしている配列を含む、天然のt−ＰＡ遺伝子のフラグ
メントを複製可能な形のファージＭ１３mp８に挿入して
Ｍ１３mp８ＰＡを組立てることを含む。次いで、挿入し
たt−ＰＡ配列と相補的であるが、置換すべきアミノ酸
をコードしている１またはそれ以上のヌクレオチドトリ
プレットを含んでいる合成オリゴヌクレオチドを一本鎖
形のＭ１３mp８ＰＡにアニールし、二本鎖領域を形成す
る。この領域は、ＤＮＡポリメラーゼＩによる、残りの
相補鎖の形成におけるプライマーとなる。複製、同定の
後、この突然変異t−ＰＡ配列を更に修飾するか、ある
いは、突然変異t−ＰＡポリペプチドを発現させるため
の原核性または真核性ベクターの組立てに用いることが
できる。
【００１４】上記の一般的な方法を用い、２７５／２７
６および／または２７７／２７８二本鎖開裂部位以外の
位置でt−ＰＡを突然変異させ、本発明の範囲に含まれ
る突然変異t−ＰＡ誘導体を生産することができる。そ
の様な他の部位は、通常、アルギニンまたはリジンに、
イソロイシン、セリンまたはアラニンが続くトリプシン
様開裂部位等の酵素的な加水分解を受け易いポリペプチ
ド配列である。その様なトリペプシン様開裂部位内の１
またはそれ以上のアミノ酸の置換によって、トリプシン
様プロテアーゼによる加水分解に抵抗する突然変異t−
ＰＡが得られる。発現および精製の工程中で、さらに、
医薬としてインビボに投与した場合に、これらの有する
酵素的分解に対する抵抗性に基づき、本発明のt−ＰＡ
は、突然変異していないt−ＰＡに比べて生物学的な活
性を失ない難いことになる。ヒトt−ＰＡ内のその様な
トリプシン様開裂部位には、例えば、アルギニン−アラ
ニン(４０−４１位)、アルギニン−セリン(２７−２８
位)およびアルギニン−セリン(４６２−４６３位)が含
まれる。
６および／または２７７／２７８二本鎖開裂部位以外の
位置でt−ＰＡを突然変異させ、本発明の範囲に含まれ
る突然変異t−ＰＡ誘導体を生産することができる。そ
の様な他の部位は、通常、アルギニンまたはリジンに、
イソロイシン、セリンまたはアラニンが続くトリプシン
様開裂部位等の酵素的な加水分解を受け易いポリペプチ
ド配列である。その様なトリペプシン様開裂部位内の１
またはそれ以上のアミノ酸の置換によって、トリプシン
様プロテアーゼによる加水分解に抵抗する突然変異t−
ＰＡが得られる。発現および精製の工程中で、さらに、
医薬としてインビボに投与した場合に、これらの有する
酵素的分解に対する抵抗性に基づき、本発明のt−ＰＡ
は、突然変異していないt−ＰＡに比べて生物学的な活
性を失ない難いことになる。ヒトt−ＰＡ内のその様な
トリプシン様開裂部位には、例えば、アルギニン−アラ
ニン(４０−４１位)、アルギニン−セリン(２７−２８
位)およびアルギニン−セリン(４６２−４６３位)が含
まれる。
【００１５】Ａ．一般論 本発明の突然変異t−ＰＡは、１)第１番目のアミノ酸に
メチオニンを含有させ(ＡＴＧ開始シグナルコドンを構
造遺伝子の上流に挿入する方法を用いてその様にす
る)、または、２)メチオニンが細胞内または細胞外で開
裂される場合には、そのものが正常状態で有している第
１番目のアミノ酸を含有させ、または、３)そのものが
普通に有するシグナルポリペプチド以外のシグナルポリ
ペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプチドであっ
て、細胞内または細胞外環境で特異的に開裂され得るシ
グナルポリペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプ
チドと一緒に調製し、または、４)余分な、不要のポリ
ペプチドを開裂除去する必要がない成熟型で、発現さ
れ、調製される。どの方法によっても、得られた種々の
突然変異したヒトt−ＰＡを回収し、これを、心筋梗
塞、発作、肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、抹消動脈閉
塞その他の血栓性症状等の種々の血管状態、あるいは疾
患に対する治療に適合し得る程度に精製することができ
る。
メチオニンを含有させ(ＡＴＧ開始シグナルコドンを構
造遺伝子の上流に挿入する方法を用いてその様にす
る)、または、２)メチオニンが細胞内または細胞外で開
裂される場合には、そのものが正常状態で有している第
１番目のアミノ酸を含有させ、または、３)そのものが
普通に有するシグナルポリペプチド以外のシグナルポリ
ペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプチドであっ
て、細胞内または細胞外環境で特異的に開裂され得るシ
グナルポリペプチドまたはコンジュゲートしたポリペプ
チドと一緒に調製し、または、４)余分な、不要のポリ
ペプチドを開裂除去する必要がない成熟型で、発現さ
れ、調製される。どの方法によっても、得られた種々の
突然変異したヒトt−ＰＡを回収し、これを、心筋梗
塞、発作、肺動脈塞栓症、深部静脈血栓症、抹消動脈閉
塞その他の血栓性症状等の種々の血管状態、あるいは疾
患に対する治療に適合し得る程度に精製することができ
る。
【００１６】ヒト突然変異t−ＰＡは機能的にフイブリ
ンと結合し、インビトロまたはインビボにおいて、プラ
スミノゲンを変化させて、フイブリン血餅の可溶化作用
を有するプラスミンを与える様、触媒し得るものと定義
される。
ンと結合し、インビトロまたはインビボにおいて、プラ
スミノゲンを変化させて、フイブリン血餅の可溶化作用
を有するプラスミンを与える様、触媒し得るものと定義
される。
【００１７】「発現ベクター」という語句は、自身が含有
しているＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡを発現させるた
めの他の配列と機能的(操作可能)に結合しているＤＮＡ
配列を発現させることができ、宿主生物内で、エピソー
ムとして、あるいは染色体ＤＮＡの一部として複製可能
なベクターを包含する。
しているＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡを発現させるた
めの他の配列と機能的(操作可能)に結合しているＤＮＡ
配列を発現させることができ、宿主生物内で、エピソー
ムとして、あるいは染色体ＤＮＡの一部として複製可能
なベクターを包含する。
【００１８】「組換え宿主細胞」という語句は、組換えＤ
ＮＡ技術を用いて組立てられた発現ベクターで形質転換
された細胞を指す。
ＮＡ技術を用いて組立てられた発現ベクターで形質転換
された細胞を指す。
【００１９】Ｂ．宿主細胞培養およびベクター 本明細書で開示したベクターは広範な範囲に及ぶ原核性
および真核性生物の宿主細胞内で用いるのに適する。大
腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４４６)は特に
有用である。その他の微生物株、例えば大腸菌Ｂおよび
大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ Ｎo．３１５３７)も用い
ることができる。これらの例は、当然例示にすぎず、限
定的なものではない。
および真核性生物の宿主細胞内で用いるのに適する。大
腸菌Ｋ１２株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４４６)は特に
有用である。その他の微生物株、例えば大腸菌Ｂおよび
大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ Ｎo．３１５３７)も用い
ることができる。これらの例は、当然例示にすぎず、限
定的なものではない。
【００２０】原核生物に加えて、酵母培養等の真核性生
物も用いることができる。多核生物からの細胞培養は、
今日選択される宿主である。原則として、その様な細胞
培養はすべて有効である。しかしながら、脊椎動物由来
の細胞に大きい関心が寄せられており、これらの細胞を
培養(組織培養)して増殖させる方法は、再現性のある方
法となっている[組織培養(Ｔissue Ｃulture)、アカデ
ミック・プレス(Ａcademic Ｐress)、クルスおよびパ
ターソン(Ｋruse and Ｐatterson)編(１９７３)]。そ
の様な有用な宿主セルラインには、ＶＥＲＯおよびＨe
Ｌa細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣(ＣＨＯ)セ
ルライン、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣ
Ｋセルラインが含まれる。
物も用いることができる。多核生物からの細胞培養は、
今日選択される宿主である。原則として、その様な細胞
培養はすべて有効である。しかしながら、脊椎動物由来
の細胞に大きい関心が寄せられており、これらの細胞を
培養(組織培養)して増殖させる方法は、再現性のある方
法となっている[組織培養(Ｔissue Ｃulture)、アカデ
ミック・プレス(Ａcademic Ｐress)、クルスおよびパ
ターソン(Ｋruse and Ｐatterson)編(１９７３)]。そ
の様な有用な宿主セルラインには、ＶＥＲＯおよびＨe
Ｌa細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣(ＣＨＯ)セ
ルライン、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣ
Ｋセルラインが含まれる。
【００２１】以下に記載する実施例においては、trpプ
ロモーター系を使用して大腸菌を用い、また、プロモー
ターとしてＳＶ４０複製起源を含有している発現ベクタ
ーを使用してＣＨＯ細胞を用いた。しかしながら当該技
術者ならば他の原核性あるいは真核性宿主細胞培養を用
い得ることを理解できる。
ロモーター系を使用して大腸菌を用い、また、プロモー
ターとしてＳＶ４０複製起源を含有している発現ベクタ
ーを使用してＣＨＯ細胞を用いた。しかしながら当該技
術者ならば他の原核性あるいは真核性宿主細胞培養を用
い得ることを理解できる。
【００２２】Ｃ．方法 １．トランスフェクション 強固な細胞壁障害を持っていない細胞を宿主細胞として
用いる場合には、グラハム(Ｇraham)ら、ピロロジイ(Ｖ
ivology)５２ ５４６(１９７８)の示したりん酸カルシ
ウム沈降法によってトランスフェクションを行う。しか
しながら、核注入またはプロトプラスト融合を利用する
こともできる。原核性細胞または実質的な細胞壁構築物
を有する細胞を用いる場合には、コーエン(Ｃohen)ら、
プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．)(ＵＳＡ)６９ ２１１０(１９７２)の記載した塩化
カルシウム法が、トランスフェクションにとって好まし
い方法である。
用いる場合には、グラハム(Ｇraham)ら、ピロロジイ(Ｖ
ivology)５２ ５４６(１９７８)の示したりん酸カルシ
ウム沈降法によってトランスフェクションを行う。しか
しながら、核注入またはプロトプラスト融合を利用する
こともできる。原核性細胞または実質的な細胞壁構築物
を有する細胞を用いる場合には、コーエン(Ｃohen)ら、
プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．)(ＵＳＡ)６９ ２１１０(１９７２)の記載した塩化
カルシウム法が、トランスフェクションにとって好まし
い方法である。
【００２３】２．ベクターの組立て 所望の暗号配列およびコントロール配列を含有している
好適なベクターを組立てるには、自体既知の標準的なラ
イゲーション(結合)法を用いる。単離したプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントを切り開き、修復して再結合
(ライゲート)させ、所望のプラスミドを組立てるのに望
ましい形にする。
好適なベクターを組立てるには、自体既知の標準的なラ
イゲーション(結合)法を用いる。単離したプラスミドま
たはＤＮＡフラグメントを切り開き、修復して再結合
(ライゲート)させ、所望のプラスミドを組立てるのに望
ましい形にする。
【００２４】Ｄ．実施例 １．t−ＰＡ突然変異誘発のためのＭ１３mp８ＰＡＢgl
ＩＩの組立て ヒトt−ＰＡのＤＮＡは、プラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６
(pＥＴＰＦＲとも呼称)およびＰＡ２５Ｅ１０から得ら
れた。これら２個のt−ＰＡプラスミドの調製法は、Ｅ
ＰＯ出願公開Ｎo．０９３６１９(前掲)に記載されてい
る。プラスミドＰＡ２５Ｅ１０は、t−ＰＡ遺伝子の後
部５０８アミノ酸をコードしている配列と、３'非翻訳
領域の７７２塩基対を含有している。このプラスミドを
ＳacＩおよびＢglＩＩで消化して得た７４４塩基対フラ
グメントを記述の標準的手法により単離した。t−ＰＡ
の既知の配列および図１に示した制限地図から分る様
に、このフラグメントは、t−ＰＡのアミノ酸４１１か
ら５２７に対するコドン、並びに３'非翻訳領域の一部
を含んでいる。
ＩＩの組立て ヒトt−ＰＡのＤＮＡは、プラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６
(pＥＴＰＦＲとも呼称)およびＰＡ２５Ｅ１０から得ら
れた。これら２個のt−ＰＡプラスミドの調製法は、Ｅ
ＰＯ出願公開Ｎo．０９３６１９(前掲)に記載されてい
る。プラスミドＰＡ２５Ｅ１０は、t−ＰＡ遺伝子の後
部５０８アミノ酸をコードしている配列と、３'非翻訳
領域の７７２塩基対を含有している。このプラスミドを
ＳacＩおよびＢglＩＩで消化して得た７４４塩基対フラ
グメントを記述の標準的手法により単離した。t−ＰＡ
の既知の配列および図１に示した制限地図から分る様
に、このフラグメントは、t−ＰＡのアミノ酸４１１か
ら５２７に対するコドン、並びに３'非翻訳領域の一部
を含んでいる。
【００２５】プラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６は、t−ＰＡ
の全構造遺伝子、および３'非翻訳領域の一部を含んで
いる。このプラスミドをＳacＩおよびＢglＩＩで消化
し、生成した１,２３０塩基対フラグメントを単離し
た。このフラグメントは、成熟型t−ＰＡの最初の４１
０アミノ酸に関するコドンを含有している。
の全構造遺伝子、および３'非翻訳領域の一部を含んで
いる。このプラスミドをＳacＩおよびＢglＩＩで消化
し、生成した１,２３０塩基対フラグメントを単離し
た。このフラグメントは、成熟型t−ＰＡの最初の４１
０アミノ酸に関するコドンを含有している。
【００２６】これらのフラグメントを標準的な方法でラ
イゲートさせ、ＢglＩＩで消化した。成熟t−ＰＡの全
配列と３'非翻訳領域の一部に関するコドンを含む１,９
７４塩基対フラグメントを単離した。二本鎖Ｍ１３mp８
[メッシング(Ｍessing)ら、「巨大分子組換えＤＮＡに関
する第３回クリーブランド・シンポジウム(ＴhirdＣlev
eland Ｓymposium on Ｍacromolecules Ｒecombina
ntＤＮＡ)」、Ａ．ウオルトン(Ａ．Ｗalton)編、エルセ
ビアー(Ｅlsevier)アムステルダム(１９８１)p．１４
３]をＢamＨＩで消化し、ＢglＩＩ消化t−ＰＡとアニー
ルさせ、Ｍ１３mp８ＰＡＢglＩＩを組立てた。この二本
鎖の、複製可能なＭ１３mp８ＰＡＢglＩＩで大腸菌ＪＭ
１０１細胞(ＡＴＣＣ Ｎo．３３８７６)を形質転換し
た。このファージでトランスフェクトされた大腸菌ＪＭ
１０１細胞から一本鎖形および二本鎖(ＲＦ)形のＭ１３
mp８ＰＡＢglＩＩを単離することができる。一本鎖形の
Ｍ１３mp８ＰＡＢglＩＩを、t−ＰＡの特定部位におけ
る(部位特異的)突然変異誘発に用いた。
イゲートさせ、ＢglＩＩで消化した。成熟t−ＰＡの全
配列と３'非翻訳領域の一部に関するコドンを含む１,９
７４塩基対フラグメントを単離した。二本鎖Ｍ１３mp８
[メッシング(Ｍessing)ら、「巨大分子組換えＤＮＡに関
する第３回クリーブランド・シンポジウム(ＴhirdＣlev
eland Ｓymposium on Ｍacromolecules Ｒecombina
ntＤＮＡ)」、Ａ．ウオルトン(Ａ．Ｗalton)編、エルセ
ビアー(Ｅlsevier)アムステルダム(１９８１)p．１４
３]をＢamＨＩで消化し、ＢglＩＩ消化t−ＰＡとアニー
ルさせ、Ｍ１３mp８ＰＡＢglＩＩを組立てた。この二本
鎖の、複製可能なＭ１３mp８ＰＡＢglＩＩで大腸菌ＪＭ
１０１細胞(ＡＴＣＣ Ｎo．３３８７６)を形質転換し
た。このファージでトランスフェクトされた大腸菌ＪＭ
１０１細胞から一本鎖形および二本鎖(ＲＦ)形のＭ１３
mp８ＰＡＢglＩＩを単離することができる。一本鎖形の
Ｍ１３mp８ＰＡＢglＩＩを、t−ＰＡの特定部位におけ
る(部位特異的)突然変異誘発に用いた。
【００２７】 ２．部位特異的突然変異誘発のためのプライマーの合成 ヒトt−ＰＡ構造遺伝子を部位特異的突然変異誘発に付
し、種々の位置にアミノ酸置換を有するt−ＰＡ(複数)
を発現する様、修飾した。合成オリゴヌクレオチドは、
例えば、クレアら[プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ(ＵＳＡ)
７５ ５７６５(１９７８)]の固相ホスホトリエステル
法により調製された。その様な特定部位における突然変
異誘発のために以下の合成プライマーを調製した。 天然のアミノ酸配列 275 279 Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly 天然のＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA G プライマー1B8 Gly ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GGT ATC AAA GGA G プライマー2C9 Glu ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G プライマー4A10 Gly Ile ＤＮＡ配列 G TTT GGT ATC ATC GGA GGG CTC TT プライマー3A7 Gly Ile ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GGT ATC ATC GGA G プライマー4B3 Glu Ile ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GAA ATC ATC GGA G
し、種々の位置にアミノ酸置換を有するt−ＰＡ(複数)
を発現する様、修飾した。合成オリゴヌクレオチドは、
例えば、クレアら[プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ(ＵＳＡ)
７５ ５７６５(１９７８)]の固相ホスホトリエステル
法により調製された。その様な特定部位における突然変
異誘発のために以下の合成プライマーを調製した。 天然のアミノ酸配列 275 279 Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly 天然のＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA G プライマー1B8 Gly ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GGT ATC AAA GGA G プライマー2C9 Glu ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G プライマー4A10 Gly Ile ＤＮＡ配列 G TTT GGT ATC ATC GGA GGG CTC TT プライマー3A7 Gly Ile ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GGT ATC ATC GGA G プライマー4B3 Glu Ile ＤＮＡ配列 G CCT CAG TTT GAA ATC ATC GGA G
【００２８】天然のt−ＰＡのアミノ酸配列および遺伝
子配列は、最初の２列に記載されている。プライマー
は、指摘した残基において、天然の遺伝子配列と異って
いる。対応するアミノ酸置換体は、このアミノ酸をコー
ドしているトリプレットの上方に示されている。
子配列は、最初の２列に記載されている。プライマー
は、指摘した残基において、天然の遺伝子配列と異って
いる。対応するアミノ酸置換体は、このアミノ酸をコー
ドしているトリプレットの上方に示されている。
【００２９】３．部位特異的突然変異誘発 以下に、合成プライマーの突然変異配列を含有する種の
t−ＰＡクローンの組立て方法を示す。ここでは、アデ
ルマン(Ａdelman)ら[「ＤＮＡ」２、１８３(１９８３)]の
一般的な方法を用いた。各クローンの全組立て模式図を
図８に示した。Ｍ１３ＲＦ１Ｂ８、Ｍ１３ＲＦ２Ｃ９お
よびＭ１３ＲＦ４Ａ１０は、前記の、唯１個のアミノ酸
に突然変異を有するプライマーを用いて組立てられた。
単一の標準Ｍ１３ＲＦ４Ａ１０(２７７位に突然変異を
有する)をプライマー３Ａ７または４Ｂ３とアニールさ
せることにより、Ｍ１３ＲＡ３Ａ７およびＭ１３ＲＦ４
Ｂ３が、それぞれ得られた。これら突然変異t−ＰＡ遺
伝子の精製Ｍ１３ＲＦ ＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０１細
胞を用いて得られた。次いで、突然変異t−ＰＡ ＤＮ
Ａ配列を含有するフラグメントを用いて、突然変異t−
ＰＡのための発現ベクターを組立てた。
t−ＰＡクローンの組立て方法を示す。ここでは、アデ
ルマン(Ａdelman)ら[「ＤＮＡ」２、１８３(１９８３)]の
一般的な方法を用いた。各クローンの全組立て模式図を
図８に示した。Ｍ１３ＲＦ１Ｂ８、Ｍ１３ＲＦ２Ｃ９お
よびＭ１３ＲＦ４Ａ１０は、前記の、唯１個のアミノ酸
に突然変異を有するプライマーを用いて組立てられた。
単一の標準Ｍ１３ＲＦ４Ａ１０(２７７位に突然変異を
有する)をプライマー３Ａ７または４Ｂ３とアニールさ
せることにより、Ｍ１３ＲＡ３Ａ７およびＭ１３ＲＦ４
Ｂ３が、それぞれ得られた。これら突然変異t−ＰＡ遺
伝子の精製Ｍ１３ＲＦ ＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０１細
胞を用いて得られた。次いで、突然変異t−ＰＡ ＤＮ
Ａ配列を含有するフラグメントを用いて、突然変異t−
ＰＡのための発現ベクターを組立てた。
【００３０】合成オリゴヌクレオチド５０mgを、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ８Ｕを含有する、５０mＭトリ
ス−ＨＣl(pＨ７．５)、１０mＭＭgＣl2、１０mＭジチ
オトレイトール、および１mＭ ＡＴＰの混液１０μl
中、３７℃で３０分間、ホスホリル化(りん酸化)した。
プローブとして用いるために、ＡＴＰの代りに６０mＣi
[γ32−Ｐ]−ＡＴＰ(３００μＣi／nmol)を用い、合成
オリゴヌクレオチド４０ngを上記の如くにしてホスホリ
ル化することにより、約５０〜６０×１０6cpm／(２４
量体４００ng)を得た。ヘテロ二本鎖を形成させるため
に、一本鎖Ｍ１３mp８ＰＡＢglＩＩ１０ngを、りん酸化
したプライマー１０ngとＥcoＲＩ消化Ｍ１３mp８ＰＡＢ
glＩＩＲＦの大きいフラグメント５０ngとを含む、１０
mＭトリス−ＨＣl(pＨ７．５)、１０mＭ ＭgＣl2、１m
Ｍジチオトレイトールの混合物４０μl中で、９５℃に
おいて１０分間加熱し、次いで室温まで徐々に冷却した
(３０分)。２mＭ ＡＴＰ、０．２５mＭづつのdＧＴ
Ｐ、dＴＴＰ、dＣＴＰおよびdＡＴＰ、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩラージフラグメント５Ｕ、およびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ４００単位を含有するリガーゼバッファー１
０μlを加えてプライマー延長を開始させた。１２℃で
１時間経過した後、反応混合物を大腸菌ＪＭ１０１細胞
にトランスフォーム(導入)した。
リヌクレオチドキナーゼ８Ｕを含有する、５０mＭトリ
ス−ＨＣl(pＨ７．５)、１０mＭＭgＣl2、１０mＭジチ
オトレイトール、および１mＭ ＡＴＰの混液１０μl
中、３７℃で３０分間、ホスホリル化(りん酸化)した。
プローブとして用いるために、ＡＴＰの代りに６０mＣi
[γ32−Ｐ]−ＡＴＰ(３００μＣi／nmol)を用い、合成
オリゴヌクレオチド４０ngを上記の如くにしてホスホリ
ル化することにより、約５０〜６０×１０6cpm／(２４
量体４００ng)を得た。ヘテロ二本鎖を形成させるため
に、一本鎖Ｍ１３mp８ＰＡＢglＩＩ１０ngを、りん酸化
したプライマー１０ngとＥcoＲＩ消化Ｍ１３mp８ＰＡＢ
glＩＩＲＦの大きいフラグメント５０ngとを含む、１０
mＭトリス−ＨＣl(pＨ７．５)、１０mＭ ＭgＣl2、１m
Ｍジチオトレイトールの混合物４０μl中で、９５℃に
おいて１０分間加熱し、次いで室温まで徐々に冷却した
(３０分)。２mＭ ＡＴＰ、０．２５mＭづつのdＧＴ
Ｐ、dＴＴＰ、dＣＴＰおよびdＡＴＰ、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩラージフラグメント５Ｕ、およびＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ４００単位を含有するリガーゼバッファー１
０μlを加えてプライマー延長を開始させた。１２℃で
１時間経過した後、反応混合物を大腸菌ＪＭ１０１細胞
にトランスフォーム(導入)した。
【００３１】ライゲーション混合物１０μlとコンピテ
ントＪＭ１０１細胞２００μlとを混合し、氷上で３０
分間、次いで３７℃で５分間インキュベートすることに
より、形質転換を行った。次いで、２ＹＴトップ寒天
(アガー)３．５mlと混和ＪＭ１０１細胞３００μl、Ｉ
ＰＴＧ１０μl(２００mＭ)およびＸgal５０μlを５５℃
において混合し、形質転換された細胞を加えた後、薬物
不含のＬＢを入れた９cmのペトリ皿上で平板培養した。
ントＪＭ１０１細胞２００μlとを混合し、氷上で３０
分間、次いで３７℃で５分間インキュベートすることに
より、形質転換を行った。次いで、２ＹＴトップ寒天
(アガー)３．５mlと混和ＪＭ１０１細胞３００μl、Ｉ
ＰＴＧ１０μl(２００mＭ)およびＸgal５０μlを５５℃
において混合し、形質転換された細胞を加えた後、薬物
不含のＬＢを入れた９cmのペトリ皿上で平板培養した。
【００３２】無着色のプラークを拾い上げ、２ＹＴ培地
１０．０μlの入ったマイクロタイター(微量力価定)デ
イッシュに移した。接種されたマイクロタイター液を直
径１５cmのＬＢ寒天平板上にスタンプし(押し付け)、２
ＹＴトップ寒天８ml中のＪＭ１０１細胞菌６００μlを
重層して３７℃で一夜インキュベートした。形成された
プラークを物理的な接触(１分間)により、ニトロセルロ
ース・ディスクに移した。このニトロセルロース・ディ
スクを０．５Ｍ ＮaＯＨおよび１．５Ｍ ＮaＣlで３
分間処理した後、３Ｍ ＮaＣl−０．５ＭトリスＨＣl
(pＨ７．５)で１５分間処理して洗浄し(２回)、次い
で、２×ＳＳＣで１５分間洗浄処理した。プレハイブリ
ダイゼーションミックスは、１０mＭトリス(pＨ７．
５)、５mＭ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮaＣl、１×デンハ
ート(Ｄenhardt)０．５％ＮＰ４０、１００μＭＡＴ
Ｐ、１mＭピロりん酸ナトリウム、１mＭりん酸ナトリウ
ムおよび５０μg／ml大腸菌tＲＮＡを含有している。１
×デンハートは、１l当り、フイコール(Ｆicoll)２００
mg、ポリビニルピロリドン２００mg、ウシ血清アルブミ
ン(ＢＳＡ:フラクションＶ)２００mgを含有している。
真空中において、８０℃で９０分間、ディスクを焼い
た。次いで、ディスクを、ペトリ皿中でプレハイブリダ
イゼーション液６mlと一緒に３時間インキュベートし、
次いで、５×１０6cpmの標識プライマーを加え、一夜ハ
イブリダイズさせた。４９℃において、０．４×ＳＳＣ
を用い、選択的な洗浄を行い、ディスクを風乾した後、
Ｘ線フイルムに露出させた。次いで、陽性にハイブリダ
イズしたクローンを、ジデオキシ配列決定により、分析
した[アルデマン(前掲)参照]。
１０．０μlの入ったマイクロタイター(微量力価定)デ
イッシュに移した。接種されたマイクロタイター液を直
径１５cmのＬＢ寒天平板上にスタンプし(押し付け)、２
ＹＴトップ寒天８ml中のＪＭ１０１細胞菌６００μlを
重層して３７℃で一夜インキュベートした。形成された
プラークを物理的な接触(１分間)により、ニトロセルロ
ース・ディスクに移した。このニトロセルロース・ディ
スクを０．５Ｍ ＮaＯＨおよび１．５Ｍ ＮaＣlで３
分間処理した後、３Ｍ ＮaＣl−０．５ＭトリスＨＣl
(pＨ７．５)で１５分間処理して洗浄し(２回)、次い
で、２×ＳＳＣで１５分間洗浄処理した。プレハイブリ
ダイゼーションミックスは、１０mＭトリス(pＨ７．
５)、５mＭ ＥＤＴＡ、０．９Ｍ ＮaＣl、１×デンハ
ート(Ｄenhardt)０．５％ＮＰ４０、１００μＭＡＴ
Ｐ、１mＭピロりん酸ナトリウム、１mＭりん酸ナトリウ
ムおよび５０μg／ml大腸菌tＲＮＡを含有している。１
×デンハートは、１l当り、フイコール(Ｆicoll)２００
mg、ポリビニルピロリドン２００mg、ウシ血清アルブミ
ン(ＢＳＡ:フラクションＶ)２００mgを含有している。
真空中において、８０℃で９０分間、ディスクを焼い
た。次いで、ディスクを、ペトリ皿中でプレハイブリダ
イゼーション液６mlと一緒に３時間インキュベートし、
次いで、５×１０6cpmの標識プライマーを加え、一夜ハ
イブリダイズさせた。４９℃において、０．４×ＳＳＣ
を用い、選択的な洗浄を行い、ディスクを風乾した後、
Ｘ線フイルムに露出させた。次いで、陽性にハイブリダ
イズしたクローンを、ジデオキシ配列決定により、分析
した[アルデマン(前掲)参照]。
【００３３】４．大腸菌pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０
trpＲ内で突然変異t−ＰＡを発現させるためのベクター
の組立て 種々の突然変異t−ＰＡＤＮＡ配列のための発現ベクタ
ーとして用いるために、プラスミドpＸＡＰＰＡ１８３'
△×１０trpＲプラスミドを組立てた。このプラスミド
の全組立て模式図は添付の図９〜図１６に示されてい
る。得られたプラスミドは図１５及び図１６に示されて
いる。このプラスミドはtrpＲリプレッサー遺伝子を含
有しており、また、プラスミドの増幅を阻害するpＢＲ
３２２ＤＮＡを欠失している。この欠失はＸＡＰ欠失と
して知られており、サットクリッフ(Ｓutcliff)、コー
ルド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・オン・ク
オンテイテイテイブ・バイオロジイ(Ｃold Ｓpring
Ｈarber Ｓymposium on Ｑuantitative・Ｂiology)
Ｖol．４３ ７７(１９７９)、コールド・スプリング・
ハーバー・プレス、が開示した様に、pＢＲ３２２のＡv
aＩ制限部位からＰvuＩＩ制限部位までの６４１塩基対
のpＢＲ３２２ＤＮＡ配列が除去されることを意味す
る。trpＲリプレッサーは、プラスミドのコピー数増加
に起因して、t−ＰＡ発現が、未成熟なままで脱抑制さ
れることを補償するよう、作用する。pＸＡＰＰＡ１８
３'△×１０trpＲの組立てにおける中間体プラスミドp
ＰＡ１８の組立て模式図は図９に示されている。このプ
ラスミドは、全てのプレーt−ＰＡ構造遺伝子と、５'お
よび３'非翻訳領域とを含有している。このプラスミド
はまた、特徴的に、t−ＰＡ遺伝子に伴なうtrpプロモー
ター、並びにアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
の付与に係る配列を含有している。
trpＲ内で突然変異t−ＰＡを発現させるためのベクター
の組立て 種々の突然変異t−ＰＡＤＮＡ配列のための発現ベクタ
ーとして用いるために、プラスミドpＸＡＰＰＡ１８３'
△×１０trpＲプラスミドを組立てた。このプラスミド
の全組立て模式図は添付の図９〜図１６に示されてい
る。得られたプラスミドは図１５及び図１６に示されて
いる。このプラスミドはtrpＲリプレッサー遺伝子を含
有しており、また、プラスミドの増幅を阻害するpＢＲ
３２２ＤＮＡを欠失している。この欠失はＸＡＰ欠失と
して知られており、サットクリッフ(Ｓutcliff)、コー
ルド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・オン・ク
オンテイテイテイブ・バイオロジイ(Ｃold Ｓpring
Ｈarber Ｓymposium on Ｑuantitative・Ｂiology)
Ｖol．４３ ７７(１９７９)、コールド・スプリング・
ハーバー・プレス、が開示した様に、pＢＲ３２２のＡv
aＩ制限部位からＰvuＩＩ制限部位までの６４１塩基対
のpＢＲ３２２ＤＮＡ配列が除去されることを意味す
る。trpＲリプレッサーは、プラスミドのコピー数増加
に起因して、t−ＰＡ発現が、未成熟なままで脱抑制さ
れることを補償するよう、作用する。pＸＡＰＰＡ１８
３'△×１０trpＲの組立てにおける中間体プラスミドp
ＰＡ１８の組立て模式図は図９に示されている。このプ
ラスミドは、全てのプレーt−ＰＡ構造遺伝子と、５'お
よび３'非翻訳領域とを含有している。このプラスミド
はまた、特徴的に、t−ＰＡ遺伝子に伴なうtrpプロモー
ター、並びにアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
の付与に係る配列を含有している。
【００３４】pＰＡ１８の組立てのために、４個のプラ
スミド、即ち、pＦＩＦtrp６９、pＨＫＹ１０、ptＰＡt
rp１２およびpＰＡ２５Ｅ１０を用いた。プラスミドpＦ
ＩＦtrp６９はゲッデル(Ｇoeddel)ら、ヌクレイックア
シッズ・リサーチ(ＮucleicＡcids Ｒesearch)８ ４
０５７(１９８０)により開示された。プラスミドpＨＫ
Ｙ１０は、米国特許出願Ｎo．６８５,５２１(１９８４
年１２月２４日出願)に開示されており、これは、米国
特許Ｎo．３０７,４７３(１９８１年１０月１日出願)お
よびＮo．１３３,２９６(１９８０年３月２４日出願)
(ヨーロッパ特許出願公開Ｎo．００３６７７６)と一連
の出願である。プラスミドptＰＡtrp１２およびpＰＡ２
５Ｅ１０はペニカ(Ｐennica)ら、ネイチャー(Ｎature)
３０１ ２１４(１９８３)およびＥＰＯ公開Ｎo．０９
３,６１９(前掲)に開示されている。
スミド、即ち、pＦＩＦtrp６９、pＨＫＹ１０、ptＰＡt
rp１２およびpＰＡ２５Ｅ１０を用いた。プラスミドpＦ
ＩＦtrp６９はゲッデル(Ｇoeddel)ら、ヌクレイックア
シッズ・リサーチ(ＮucleicＡcids Ｒesearch)８ ４
０５７(１９８０)により開示された。プラスミドpＨＫ
Ｙ１０は、米国特許出願Ｎo．６８５,５２１(１９８４
年１２月２４日出願)に開示されており、これは、米国
特許Ｎo．３０７,４７３(１９８１年１０月１日出願)お
よびＮo．１３３,２９６(１９８０年３月２４日出願)
(ヨーロッパ特許出願公開Ｎo．００３６７７６)と一連
の出願である。プラスミドptＰＡtrp１２およびpＰＡ２
５Ｅ１０はペニカ(Ｐennica)ら、ネイチャー(Ｎature)
３０１ ２１４(１９８３)およびＥＰＯ公開Ｎo．０９
３,６１９(前掲)に開示されている。
【００３５】通常、プラスミドpＦＩＦtrp６９をＰstＩ
とＸbaＩで消化し、図９中、フラグメント１と表示され
ている９５０塩基対のフラグメントを得る。プラスミド
ptＰＡtrp１２を、ＸbaＩとＮarＩで消化した。この消
化により、図９中、フラグメント４と表示されている３
４０塩基対の配列を単離した。プラスミドpＰＡ２５Ｅ
１０をＮarＩとＢglＩＩで消化した。この消化により、
図９中、フラグメント３と表示されている１６０４塩基
対フラグメントを単離した。プラスミドpＨＫＹ１０を
ＰstＩとＢglＩＩで消化し、図９中、フラグメント２と
表示されている２９００塩基対フラグメントを生成させ
た。これらの４フラグメントをライゲート(結合)させ、
得られたＤＮＡを用いて大腸菌細胞を形質転換し、pＰ
Ａ１８を得た。
とＸbaＩで消化し、図９中、フラグメント１と表示され
ている９５０塩基対のフラグメントを得る。プラスミド
ptＰＡtrp１２を、ＸbaＩとＮarＩで消化した。この消
化により、図９中、フラグメント４と表示されている３
４０塩基対の配列を単離した。プラスミドpＰＡ２５Ｅ
１０をＮarＩとＢglＩＩで消化した。この消化により、
図９中、フラグメント３と表示されている１６０４塩基
対フラグメントを単離した。プラスミドpＨＫＹ１０を
ＰstＩとＢglＩＩで消化し、図９中、フラグメント２と
表示されている２９００塩基対フラグメントを生成させ
た。これらの４フラグメントをライゲート(結合)させ、
得られたＤＮＡを用いて大腸菌細胞を形質転換し、pＰ
Ａ１８を得た。
【００３６】プラスミドpＰＡ１８を単離し、Ｓau３Ａ
消化に付した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ(kle
now)フラグメントで処理し、制限部位をうめた。この非
環式プラスミドをＳacＩで処理し、図１０及び図１１
中、フラグメント５と表示されている３８９塩基対配列
を単離した。プラスミドpＰＡ１８を、ＳacＩおよびＢa
mＨＩで消化した。この消化により、ベクターフラグメ
ント６が単離された。プラスミドpＢＲ３２２[ボイヤー
(Ｂoyer)ら、「ジーン」２ ９５(１９７７)]をＥcoＲＩ
で消化し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントで処理した。この開放−末端ＤＮＡ配列をＢ
amＨＩで消化し、図１０及び図１１中、フラグメント７
と表示されている３７５塩基対配列を得た。フラグメン
ト５、６および７を結合させ、得られた生成物で大腸菌
を形質転換し、プラスミドpＰＡ１８ ３'△を得た。こ
のプラスミドは、t−ＰＡ遺伝子の３'非翻訳領域の一部
が除去されている外は、pＰＡ１８と同等である。
消化に付した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ(kle
now)フラグメントで処理し、制限部位をうめた。この非
環式プラスミドをＳacＩで処理し、図１０及び図１１
中、フラグメント５と表示されている３８９塩基対配列
を単離した。プラスミドpＰＡ１８を、ＳacＩおよびＢa
mＨＩで消化した。この消化により、ベクターフラグメ
ント６が単離された。プラスミドpＢＲ３２２[ボイヤー
(Ｂoyer)ら、「ジーン」２ ９５(１９７７)]をＥcoＲＩ
で消化し、次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントで処理した。この開放−末端ＤＮＡ配列をＢ
amＨＩで消化し、図１０及び図１１中、フラグメント７
と表示されている３７５塩基対配列を得た。フラグメン
ト５、６および７を結合させ、得られた生成物で大腸菌
を形質転換し、プラスミドpＰＡ１８ ３'△を得た。こ
のプラスミドは、t−ＰＡ遺伝子の３'非翻訳領域の一部
が除去されている外は、pＰＡ１８と同等である。
【００３７】このプラスミドpＰＡ１８ ３'△をＰstＩ
とＮarＩで消化し、図１２中、フラグメント８と表示さ
れている３１３塩基対フラグメントを生成させた。この
フラグメントはアミノ酸８から１０９までをコードして
いる。合成オリゴヌクレオチドフラグメント９は、式: ５'ＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧＣＡ ＴＴＡＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡ ５' で示される配列を有する。
とＮarＩで消化し、図１２中、フラグメント８と表示さ
れている３１３塩基対フラグメントを生成させた。この
フラグメントはアミノ酸８から１０９までをコードして
いる。合成オリゴヌクレオチドフラグメント９は、式: ５'ＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧＣＡ ＴＴＡＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＧＴＴＣＡＡＴＡＡ ５' で示される配列を有する。
【００３８】この合成ＤＮＡをフラグメント８のＰstＩ
部位に結合させ、成熟t−ＰＡ分子の第７番目のアルギ
ニンコドンを再生すると共に、最初の６個のアミノ酸コ
ドンを得た。加えて、成熟t−ＰＡアミノ酸暗号配列の
残基１の５'側に隣接している合成Ｎ−末端メチオニン
コドンの５'側にリボソーム結合部位が位置している。
このオリゴヌクレオチドの５'末端にはＸbaＩ制限部位
が存在している。従って、フラグメント８を、合成オリ
ゴヌクレオチドフラグメント９の存在下でライゲートさ
せ、この混合物をＸbaＩおよびＮarＩで消化することに
より、フラグメント１０(図１２)が得られた。
部位に結合させ、成熟t−ＰＡ分子の第７番目のアルギ
ニンコドンを再生すると共に、最初の６個のアミノ酸コ
ドンを得た。加えて、成熟t−ＰＡアミノ酸暗号配列の
残基１の５'側に隣接している合成Ｎ−末端メチオニン
コドンの５'側にリボソーム結合部位が位置している。
このオリゴヌクレオチドの５'末端にはＸbaＩ制限部位
が存在している。従って、フラグメント８を、合成オリ
ゴヌクレオチドフラグメント９の存在下でライゲートさ
せ、この混合物をＸbaＩおよびＮarＩで消化することに
より、フラグメント１０(図１２)が得られた。
【００３９】プラスミドpＰＡ１８ ３'△をＮarＩとＳ
acＩで消化し、９００塩基対配列のフラグメント１１
(図１３及び図１４)を生成させた。同じプラスミドをＳ
acＩとＸbaＩで消化し、ベクターフラグメント１２(図
１３及び図１４)を生成させた。フラグメント１０、１
１および１２をライゲートして大腸菌の形質転換に用
い、pＰＡ１８ ３'△×１０を単離した。米国特許出願
Ｎo．５３８,７３０(１９８３年１０月３日出願、Ｅpo
公開Ｎo．１３６９０７)に開示されているＰＦＭＢtrp
Ｒから、ＸＡＰ欠失とtrpＲリプレッサー遺伝子を含有
しているＤＮＡ配列を単離した。簡単に述べると、この
プラスミドは、当業者既知の以下に示す３つのプラスミ
ドから組立てられた。phＧＨ１０７:ＥＰＯ公開Ｎo．０
２２４２に記載(１９８１年１月１４日公開)されてお
り、このプラスミドは、誘導可能なlacプロモーターの
供給源として使用された。ptrpＲ３:ローダー(Ｒoeade
r)ら、モレキュラー・ジェネテイックス(Ｍolecular
Ｇenetics)１７６、３６１(１９７９)に記載されてお
り、このプラスミドは、trpリプレッサーの暗号配列の
供給源として使用された。pＦＭＢ１:ＥＰＯ公開Ｎo．
００６８６９３(１９８３年１月５日公開)に記載されて
おり、このプラスミドは、Ａ２４株由来のＦＭＤ抗原の
暗号配列の供給源として用いられた。
acＩで消化し、９００塩基対配列のフラグメント１１
(図１３及び図１４)を生成させた。同じプラスミドをＳ
acＩとＸbaＩで消化し、ベクターフラグメント１２(図
１３及び図１４)を生成させた。フラグメント１０、１
１および１２をライゲートして大腸菌の形質転換に用
い、pＰＡ１８ ３'△×１０を単離した。米国特許出願
Ｎo．５３８,７３０(１９８３年１０月３日出願、Ｅpo
公開Ｎo．１３６９０７)に開示されているＰＦＭＢtrp
Ｒから、ＸＡＰ欠失とtrpＲリプレッサー遺伝子を含有
しているＤＮＡ配列を単離した。簡単に述べると、この
プラスミドは、当業者既知の以下に示す３つのプラスミ
ドから組立てられた。phＧＨ１０７:ＥＰＯ公開Ｎo．０
２２４２に記載(１９８１年１月１４日公開)されてお
り、このプラスミドは、誘導可能なlacプロモーターの
供給源として使用された。ptrpＲ３:ローダー(Ｒoeade
r)ら、モレキュラー・ジェネテイックス(Ｍolecular
Ｇenetics)１７６、３６１(１９７９)に記載されてお
り、このプラスミドは、trpリプレッサーの暗号配列の
供給源として使用された。pＦＭＢ１:ＥＰＯ公開Ｎo．
００６８６９３(１９８３年１月５日公開)に記載されて
おり、このプラスミドは、Ａ２４株由来のＦＭＤ抗原の
暗号配列の供給源として用いられた。
【００４０】trpリプレッサー配列を得るには、ptrpＲ
３をＨaeＩＩＩで処理して６％アクリルアミドゲルによ
り、３３４塩基対のフラグメントを単離し、単離したフ
ラグメントを、式: ５'ＣＣＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧ で示される配列を有する１６量体のＥcoＲＩリンカーと
ライゲートさせた。
３をＨaeＩＩＩで処理して６％アクリルアミドゲルによ
り、３３４塩基対のフラグメントを単離し、単離したフ
ラグメントを、式: ５'ＣＣＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＧ で示される配列を有する１６量体のＥcoＲＩリンカーと
ライゲートさせた。
【００４１】ベクターバックボーンとlacプロモーター
を得るために、phＧＨ１０７をＥcoＲＩで消化した後、
細菌性アルカリ性ホスファターゼで処理した。次いで、
lacＵＶ５を含有している大きいベクターフラグメント
をＴ４リガーゼを用いて修復したtrpＲプラスミドとラ
イゲートさせ、このライゲーション・ミックスを用いて
大腸菌を形質転換した。プラスミドＤＮＡを形質転換体
から単離し、所望のプラスミド(ptrpＲ／hＧＨ１０７と
命名)の存在を確認した[メッシング(Ｍessing)ら、ニユ
ークレイック・アシッズ・リサーチ９、３０９(１９８
１)]。
を得るために、phＧＨ１０７をＥcoＲＩで消化した後、
細菌性アルカリ性ホスファターゼで処理した。次いで、
lacＵＶ５を含有している大きいベクターフラグメント
をＴ４リガーゼを用いて修復したtrpＲプラスミドとラ
イゲートさせ、このライゲーション・ミックスを用いて
大腸菌を形質転換した。プラスミドＤＮＡを形質転換体
から単離し、所望のプラスミド(ptrpＲ／hＧＨ１０７と
命名)の存在を確認した[メッシング(Ｍessing)ら、ニユ
ークレイック・アシッズ・リサーチ９、３０９(１９８
１)]。
【００４２】ptrpＲ／hＧＨ１０７をＥcoＲＩで部分消
化し、クレノウで平滑末端化した後、ＰvuＩＩで処理し
てlacプロモーター／trpリプレッサーオペロン(５３０b
pフラグメント)を得た。pＦＭＢ１をＰvuＩＩで部分消
化し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いてベクターフ
ラグメントを単離することにより、trpプロモーターの
コントロール下にある、ＦＭＢ暗号配列を含有してい
る、発現ベクターのバックボーンを得た。ptrpＲ／hＧ
Ｈ１０７フラグメントをpＦＭＢ１のＰvuＩＩ消化物と
混合し、Ｔ４リガーゼでライゲートさせた。次いで、ラ
イゲーション混合物を用いて大腸菌株２９４を形質転換
し、得られた形質転換体をプラスミドの供給源として使
用した。得られたプラスミドpＦＭＢ／trpＲをミニスク
リーンにより立証し、また、ＡvaＩ−ＰvuＩＩ消化によ
って挿入体の方向性を証明した。プラスミドpＦＭＢ／t
rpＲをＮdeＩとＢamＨＩで消化した。trpＲリプレッサ
ーを含有しているフラグメントを単離した。プラスミド
pＰＡ１８ ３'△×１０をＮdeＩおよびＢamＨＩで消化
した。主要なベクターフラグメントを単離した。このベ
クターフラグメントとpＦＭＢtrpＲ由来のtrpＲリプレ
ッサーフラグメントとをライゲートさせ、得られたＤＮ
Ａ混合物を用いて大腸菌を形質転換し、この形質転換体
からプラスミドpＸＡＰＡ１８ ３'△×１０trpＲを単離
した(図１５及び図１６参照)。
化し、クレノウで平滑末端化した後、ＰvuＩＩで処理し
てlacプロモーター／trpリプレッサーオペロン(５３０b
pフラグメント)を得た。pＦＭＢ１をＰvuＩＩで部分消
化し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いてベクターフ
ラグメントを単離することにより、trpプロモーターの
コントロール下にある、ＦＭＢ暗号配列を含有してい
る、発現ベクターのバックボーンを得た。ptrpＲ／hＧ
Ｈ１０７フラグメントをpＦＭＢ１のＰvuＩＩ消化物と
混合し、Ｔ４リガーゼでライゲートさせた。次いで、ラ
イゲーション混合物を用いて大腸菌株２９４を形質転換
し、得られた形質転換体をプラスミドの供給源として使
用した。得られたプラスミドpＦＭＢ／trpＲをミニスク
リーンにより立証し、また、ＡvaＩ−ＰvuＩＩ消化によ
って挿入体の方向性を証明した。プラスミドpＦＭＢ／t
rpＲをＮdeＩとＢamＨＩで消化した。trpＲリプレッサ
ーを含有しているフラグメントを単離した。プラスミド
pＰＡ１８ ３'△×１０をＮdeＩおよびＢamＨＩで消化
した。主要なベクターフラグメントを単離した。このベ
クターフラグメントとpＦＭＢtrpＲ由来のtrpＲリプレ
ッサーフラグメントとをライゲートさせ、得られたＤＮ
Ａ混合物を用いて大腸菌を形質転換し、この形質転換体
からプラスミドpＸＡＰＡ１８ ３'△×１０trpＲを単離
した(図１５及び図１６参照)。
【００４３】 ５．t−ＰＡ突然変異体のための大腸菌発現ベクター 大腸菌内でt−ＰＡおよびt−ＰＡ突然変異体を発現させ
るのに用いられるベクター、pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×
１０trpＲを図１５及び図１６に示す。図から分る様
に、天然のt−ＰＡ構造遺伝子の発現はtrpプロモーター
によってコントロールされている。ＸbaＩ、ＮarＩおよ
びＳacＩ制限部位に注意が寄せられた。プラスミドpＸ
ＡＰＰＡ１８ ３'×１０trpＲをＮarＩとＸbaＩで消化
した。３４０塩基対からなるフラグメント１(図１５及
び図１６)を単離した。pＸＡＰＰＡ１８３'△×１０trp
ＲをＸbaＩとＳacＩで消化して生成された大きいフラグ
メントを単離することにより、ベクターフラグメントで
ある、フラグメント２(図１５及び図１６)を得た。フラ
グメント３(９００bp)は、部位特異的突然変異の誘発
(図８)によって得られた各突然変異t−ＰＡクローン類
のＲＦＤＮＡをＮarＩおよびＳacＩで消化することによ
り、得られた。フラグメント１およびフラグメント２
と、各フラグメント３とをライゲートすることにより、
別々の突然変異t−ＰＡ類を発現するベクター類を組立
て、これらを用いて大腸菌を形質転換し、各大腸菌突然
変異t−ＰＡ発現ベクターを単離した。各ベクターを次
に示す。 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ １Ｂ８ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ２Ｃ９ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ４Ａ１０ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ３Ａ７ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ４Ｂ３
るのに用いられるベクター、pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×
１０trpＲを図１５及び図１６に示す。図から分る様
に、天然のt−ＰＡ構造遺伝子の発現はtrpプロモーター
によってコントロールされている。ＸbaＩ、ＮarＩおよ
びＳacＩ制限部位に注意が寄せられた。プラスミドpＸ
ＡＰＰＡ１８ ３'×１０trpＲをＮarＩとＸbaＩで消化
した。３４０塩基対からなるフラグメント１(図１５及
び図１６)を単離した。pＸＡＰＰＡ１８３'△×１０trp
ＲをＸbaＩとＳacＩで消化して生成された大きいフラグ
メントを単離することにより、ベクターフラグメントで
ある、フラグメント２(図１５及び図１６)を得た。フラ
グメント３(９００bp)は、部位特異的突然変異の誘発
(図８)によって得られた各突然変異t−ＰＡクローン類
のＲＦＤＮＡをＮarＩおよびＳacＩで消化することによ
り、得られた。フラグメント１およびフラグメント２
と、各フラグメント３とをライゲートすることにより、
別々の突然変異t−ＰＡ類を発現するベクター類を組立
て、これらを用いて大腸菌を形質転換し、各大腸菌突然
変異t−ＰＡ発現ベクターを単離した。各ベクターを次
に示す。 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ １Ｂ８ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ２Ｃ９ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ４Ａ１０ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ３Ａ７ pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲ ４Ｂ３
【００４４】これらのプラスミドを、野性型t−ＰＡ発
現ベクターpＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲと同様
に、大腸菌Ｗ３１１０fhuＡ−の形質転換に用いた。
現ベクターpＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲと同様
に、大腸菌Ｗ３１１０fhuＡ−の形質転換に用いた。
【００４５】大腸菌Ｗ３１１０fhuＡ−は、ファージ耐
性菌であって、fhuＡ遺伝子に伴なうＤＮＡ配列の欠失
または逆転(位)を有することを特徴としている。要する
に、大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)を、テトラ
サイクリン耐性を付与し得る、転送可能な(トランスポ
ーザブル)因子、Ｔn１０を含有しているラムダバクテリ
オファージにより、形質導入する。Ｔn１０形質導入Ｗ
３１１０を、ファージ感染に対する抵抗性に基づいて選
択する。ファージ耐性株をプールし、バクテリオファー
ジＰ１に感染させる。得られたリゼイトを用いて大腸菌
ＡＴ９８２[ブクハリ(Ｂukhari)ら、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー１０５、８４４(１９７１)]に形質
導入する。ＡＴ９８２株はfhuＡ遺伝子に接近した位置
にＤap突然変異を有している。従って、ＡＴ９８２株を
Ｐ１リゼイトで形質導入し、テトラサイクリン耐性であ
って、ＤＡＰ機能を再生している形質導入体を選択する
ことにより、トランスポゾンＴn１０がfhuＡ遺伝子内に
位置していることが示される。テトラサイクリン耐性で
あって、ＤＡＰ機能を再生している株は、大腸菌Ｗ３１
１０にバクテリア・ファージＰ１を形質導入するための
ＤＮＡの供給源である。テトラサイクリン耐性とファー
ジ耐性を示す形質導入されたＷ３１１０株を選択する。
次いで、これらの株を、ファージ感染に対する抵抗性と
テトラサイクリン感受性への逆転に基づいて選択する
[ナロイ(Ｎaloy)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジイ、１４５、１１１０(１９８１)]。このテトラサイ
クリン感受性への逆転は、Ｔ１ファージ感染に対する抵
抗性の保持と相まって、fhuＡ遺伝子に伴なっているＤ
ＮＡ配列が欠失されたか、非可逆的に逆転されたことを
示唆している。この様にして組立てられた株が大腸菌Ｗ
３１１０fhuＡ-である。
性菌であって、fhuＡ遺伝子に伴なうＤＮＡ配列の欠失
または逆転(位)を有することを特徴としている。要する
に、大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)を、テトラ
サイクリン耐性を付与し得る、転送可能な(トランスポ
ーザブル)因子、Ｔn１０を含有しているラムダバクテリ
オファージにより、形質導入する。Ｔn１０形質導入Ｗ
３１１０を、ファージ感染に対する抵抗性に基づいて選
択する。ファージ耐性株をプールし、バクテリオファー
ジＰ１に感染させる。得られたリゼイトを用いて大腸菌
ＡＴ９８２[ブクハリ(Ｂukhari)ら、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー１０５、８４４(１９７１)]に形質
導入する。ＡＴ９８２株はfhuＡ遺伝子に接近した位置
にＤap突然変異を有している。従って、ＡＴ９８２株を
Ｐ１リゼイトで形質導入し、テトラサイクリン耐性であ
って、ＤＡＰ機能を再生している形質導入体を選択する
ことにより、トランスポゾンＴn１０がfhuＡ遺伝子内に
位置していることが示される。テトラサイクリン耐性で
あって、ＤＡＰ機能を再生している株は、大腸菌Ｗ３１
１０にバクテリア・ファージＰ１を形質導入するための
ＤＮＡの供給源である。テトラサイクリン耐性とファー
ジ耐性を示す形質導入されたＷ３１１０株を選択する。
次いで、これらの株を、ファージ感染に対する抵抗性と
テトラサイクリン感受性への逆転に基づいて選択する
[ナロイ(Ｎaloy)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジイ、１４５、１１１０(１９８１)]。このテトラサイ
クリン感受性への逆転は、Ｔ１ファージ感染に対する抵
抗性の保持と相まって、fhuＡ遺伝子に伴なっているＤ
ＮＡ配列が欠失されたか、非可逆的に逆転されたことを
示唆している。この様にして組立てられた株が大腸菌Ｗ
３１１０fhuＡ-である。
【００４６】転送可能な因子Ｔn１０をＷ３１１０に挿
入するのに用いた、Ｔn１０含有ファージは以下の様に
して組立てられた。出発物質は、ラムダcＩ８５７b２２
１０am２９である。このファージは当業者にとって既知
であり[クレックナー(Ｋleckner)、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー１１６、１２５(１９７
７)]、ラムダの良く知られた３種の突然変異体から標準
的な方法で組立てられた。このラムダファージのリゼイ
トを、当業者既知の方法で操作し、Ｔn１０トランスポ
ゾンを担持させておいたアンバー・サプレッサー(抑圧)
大腸菌Ｃ６００(ＡＴＣＣ Ｎo．２３７２４)に関して調
製した[クレックナーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー１１６、１２５(１９７７)]。この
リゼイトを用い、アンバーサプレッサーとcＩ８５７遺
伝型を持ったラムダプロファージを含有する大腸菌Ｃ６
００(ラムダcＩ８５７)に感染させた。テトラサイクリ
ン耐性コロニーを、ブロス中、３２℃、次いで４２℃で
９０分間、増殖させることによって熱誘導し、テトラサ
イクリン耐性コロニーのリゼイトを調製した。このリゼ
イトを大腸菌Ｃ６００上にプレートし、レプリカ平板法
に付した。大腸菌Ｃ６００上に現われたプラークを大腸
菌Ｃ６００と、異種免疫プロファージ・ラムダimm４３
４を含有している大腸菌Ｗ３１０２sup+(ラムダimm４３
４)[クレックナーら、ジェネティックス９０、４２７
(１９７８)]との上でレプリカ平板法に付した。異種免
疫株上に現われたプラークをテトラサイクリン平板上に
プレートした。これらの平板上に現われたプラークはテ
トラサイクリン耐性を形質導入することができ、これら
を、上記の大腸菌Ｗ３１１０fhuＡ−の調製法に適用す
ることができる。
入するのに用いた、Ｔn１０含有ファージは以下の様に
して組立てられた。出発物質は、ラムダcＩ８５７b２２
１０am２９である。このファージは当業者にとって既知
であり[クレックナー(Ｋleckner)、ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー１１６、１２５(１９７
７)]、ラムダの良く知られた３種の突然変異体から標準
的な方法で組立てられた。このラムダファージのリゼイ
トを、当業者既知の方法で操作し、Ｔn１０トランスポ
ゾンを担持させておいたアンバー・サプレッサー(抑圧)
大腸菌Ｃ６００(ＡＴＣＣ Ｎo．２３７２４)に関して調
製した[クレックナーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー１１６、１２５(１９７７)]。この
リゼイトを用い、アンバーサプレッサーとcＩ８５７遺
伝型を持ったラムダプロファージを含有する大腸菌Ｃ６
００(ラムダcＩ８５７)に感染させた。テトラサイクリ
ン耐性コロニーを、ブロス中、３２℃、次いで４２℃で
９０分間、増殖させることによって熱誘導し、テトラサ
イクリン耐性コロニーのリゼイトを調製した。このリゼ
イトを大腸菌Ｃ６００上にプレートし、レプリカ平板法
に付した。大腸菌Ｃ６００上に現われたプラークを大腸
菌Ｃ６００と、異種免疫プロファージ・ラムダimm４３
４を含有している大腸菌Ｗ３１０２sup+(ラムダimm４３
４)[クレックナーら、ジェネティックス９０、４２７
(１９７８)]との上でレプリカ平板法に付した。異種免
疫株上に現われたプラークをテトラサイクリン平板上に
プレートした。これらの平板上に現われたプラークはテ
トラサイクリン耐性を形質導入することができ、これら
を、上記の大腸菌Ｗ３１１０fhuＡ−の調製法に適用す
ることができる。
【００４７】天然のt−ＰＡおよび突然変異tlＰＡは、
適当なt−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡプラスミドによっ
て形質転換された細胞の培養物(１０l)から得られた。
トリプトファン欠損培地を用いて発現を誘導した。
適当なt−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡプラスミドによっ
て形質転換された細胞の培養物(１０l)から得られた。
トリプトファン欠損培地を用いて発現を誘導した。
【００４８】６．哺乳類細胞内でのt−ＰＡ突然変異体
の発現ベクター プラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６[pＥＴＰＦＲとも称され
る。ＥＰＯ出願公開Ｎo．９３６１９(前掲)参照。]を図
１７に示す。天然のt−ＰＡ構造遺伝子の発現は、ＳＶ
４０Ｔ−抗原の初期プロモーターのコントロール下にあ
る。このプロモーターは、ＤＨＦＲ遺伝子の発現をもコ
ントロールする。ＢglＩＩ、ＢstＸＩおよびＢstＥＩＩ
制限部位に注意が払われた。pＰＡＤＨＦＲ−６をＢgl
ＩＩとＢstＥＩＩで消化し、生成した大きいフラグメン
トを単離することにより、フラグメント１(図１７)を得
た。pＰＡＤＨＦＲ−６をＢglＩＩとＢstＸＩとで消化
し、４００塩基対のt−ＰＡフラグメントを単離するこ
とにより、フラグメント２(図１７)を得た。各突然変異
t−ＰＡクローンから得たＲＦＤＮＡをＢstＸＩとＢst
ＥＩＩで消化することにより、図１７のフラグメント３
に相当する、所望の突然変異を含む１,１４１塩基対のt
−ＰＡフラグメントを得た。フラグメント１およびフラ
グメント２を、各フラグメント３とライゲートさせた。
このＤＮＡ混合物を用いて、大腸菌を形質転換した。各
形質転換体から以下の真核性発現ベクターが得られた。 pＰＡＤＨＦＲ−６ １Ｂ８ pＰＡＤＨＦＲ−６ ２Ｃ９ pＰＡＤＨＦＲ−６ ４Ａ１０ pＰＡＤＨＦＲ−６ ３Ａ７ pＰＡＤＨＦＲ−６ ４Ｂ３
の発現ベクター プラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６[pＥＴＰＦＲとも称され
る。ＥＰＯ出願公開Ｎo．９３６１９(前掲)参照。]を図
１７に示す。天然のt−ＰＡ構造遺伝子の発現は、ＳＶ
４０Ｔ−抗原の初期プロモーターのコントロール下にあ
る。このプロモーターは、ＤＨＦＲ遺伝子の発現をもコ
ントロールする。ＢglＩＩ、ＢstＸＩおよびＢstＥＩＩ
制限部位に注意が払われた。pＰＡＤＨＦＲ−６をＢgl
ＩＩとＢstＥＩＩで消化し、生成した大きいフラグメン
トを単離することにより、フラグメント１(図１７)を得
た。pＰＡＤＨＦＲ−６をＢglＩＩとＢstＸＩとで消化
し、４００塩基対のt−ＰＡフラグメントを単離するこ
とにより、フラグメント２(図１７)を得た。各突然変異
t−ＰＡクローンから得たＲＦＤＮＡをＢstＸＩとＢst
ＥＩＩで消化することにより、図１７のフラグメント３
に相当する、所望の突然変異を含む１,１４１塩基対のt
−ＰＡフラグメントを得た。フラグメント１およびフラ
グメント２を、各フラグメント３とライゲートさせた。
このＤＮＡ混合物を用いて、大腸菌を形質転換した。各
形質転換体から以下の真核性発現ベクターが得られた。 pＰＡＤＨＦＲ−６ １Ｂ８ pＰＡＤＨＦＲ−６ ２Ｃ９ pＰＡＤＨＦＲ−６ ４Ａ１０ pＰＡＤＨＦＲ−６ ３Ａ７ pＰＡＤＨＦＲ−６ ４Ｂ３
【００４９】これらのプラスミドを、非−突然変異t−
ＰＡ発現ベクターpＰＡＤＨＦＲ−６と同様に用い、Ｄ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした[グラハ
ム(Ｇraham)ら、ヴイロロジイ(Ｖirology)５２、４５６
(１９７３)、およびＥＰＯ公開Ｎo．０９３６１９参
照]。培養物を、濃度の高いメトトレキセートにさらす
ことにより、天然および突然変異t−ＰＡの発現を増幅
することができる。
ＰＡ発現ベクターpＰＡＤＨＦＲ−６と同様に用い、Ｄ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした[グラハ
ム(Ｇraham)ら、ヴイロロジイ(Ｖirology)５２、４５６
(１９７３)、およびＥＰＯ公開Ｎo．０９３６１９参
照]。培養物を、濃度の高いメトトレキセートにさらす
ことにより、天然および突然変異t−ＰＡの発現を増幅
することができる。
【００５０】例えば、グラハムらのりん酸カルシウム沈
降法[ヴイロロジイ５２、４５６(１９７３)]を用い、プ
ラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９およびpＰＡＤＨＦＲ
−６１Ｂ８により、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をトランス
フェクトすることができる[ウーラブおよびチャッシン
(Ｕrlab and Ｃhasin)ＰＮＡＳ７７、４２１９(１９
８０)]。
降法[ヴイロロジイ５２、４５６(１９７３)]を用い、プ
ラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９およびpＰＡＤＨＦＲ
−６１Ｂ８により、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をトランス
フェクトすることができる[ウーラブおよびチャッシン
(Ｕrlab and Ｃhasin)ＰＮＡＳ７７、４２１９(１９
８０)]。
【００５１】いずれの場合においても、選択培地(ヒポ
キサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培地、即
ち、−ＨＧＴ培地)中に生じたコロニーをプールし、さ
らに−ＨＧＨ培地で増殖させる。これらの細胞を、２５
０nＭメトトレキセート中、１００mmの平板当り２×１
０5細胞の割合でプレートし、プラスミド配列の増幅に
関して選択する。２５０nＭメトトレキセート中で増殖
した５個のクローンを平板から抽出したところ、これら
全てがt−ＰＡを培地中に分泌していることが分った。
これらのクローンを以後の研究に充てた。
キサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培地、即
ち、−ＨＧＴ培地)中に生じたコロニーをプールし、さ
らに−ＨＧＨ培地で増殖させる。これらの細胞を、２５
０nＭメトトレキセート中、１００mmの平板当り２×１
０5細胞の割合でプレートし、プラスミド配列の増幅に
関して選択する。２５０nＭメトトレキセート中で増殖
した５個のクローンを平板から抽出したところ、これら
全てがt−ＰＡを培地中に分泌していることが分った。
これらのクローンを以後の研究に充てた。
【００５２】Ｅ．測定(アッセイ)法 １．突然変異t−ＰＡおよびt−ＰＡの精製 上記の如く、哺乳類細胞中で発現された様々なt−ＰＡ
類が細胞培養の培地中に分泌された。この様なt−ＰＡ
類を含む培地をそのまま、後述する種々の測定に用いる
か、あるいは、それらの測定法に適用する前に下記の精
製工程の１またはそれ以上に付し、t−ＰＡまたは突然
変異t−ＰＡの純度を高めた。
類が細胞培養の培地中に分泌された。この様なt−ＰＡ
類を含む培地をそのまま、後述する種々の測定に用いる
か、あるいは、それらの測定法に適用する前に下記の精
製工程の１またはそれ以上に付し、t−ＰＡまたは突然
変異t−ＰＡの純度を高めた。
【００５３】突然変異t−ＰＡを含むＣＨＯ細胞の培地
を、リッケン(Ｒijken)ら[ビオシミカ・エ・ビオフイジ
カ・アクタ(Ｂiochim．＆ Ｂiophys．Ａcta．)５８
０、１４０(１９７９)]の方法に従い、塩化亜鉛で活性
化したキレート化セファロース(Ｓepharose)(ファルマ
シア)により、バッチ抽出し[樹脂１０〜２０(ml)／培地
(l)]、フィルター上に収集した。樹脂をカラムに注入
し、０．０２Ｍりん酸ナトリウム(pＨ８．０)、０．２
５Ｍ ＮaＣl、０．０１％ＴＷＥＥＮ８０、およびアプ
ロチニン１０mg／lを含んだバッファー中で洗浄した。
５０mＭイミダゾールを含有する同じバッファーでt−Ｐ
Ａを溶離した。t−ＰＡプールを、０．０２Ｍりん酸ナ
トリウム(pＨ８)、０．２５Ｍ ＮaＣlおよび０．０１
％ＴＷＥＥＮ８０中で透析し、リジン・セファロース樹
脂[ラドクリッフエ(Ｒadcliffe)ら、アーク・バイオケ
ム・バイオフィス(Ａrch．Ｂiochem．Ｂinphys)１８
９、１８５(１９７８)および、アレン(Ａllen)ら、トロ
ンボシス・ヘモスタシス(ＴhrombosisＨeamostasis)４
５、４３(１９８１)]に適用するか、または、ベンザミ
ジン・セファロース樹脂[ビコースカ(Ｂykowska)ら、ビ
オシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ、７０３ １１３
(１９８２)]に適用した。亜鉛キレート樹脂の場合に
は、０．０２Ｍりん酸ナトリウム(pＨ８)、１Ｍ ＮaＣ
lおよび０．０１％ＴＷＥＥＮ８０で簡単に洗浄した
後、０．５Ｍアルギニンを含む同一のバッファーでt−
ＰＡまたは突然変異t−ＰＡを溶離した。ベンザミジン
セファロースは、透析バッファーで洗浄した後、１Ｍグ
アニジンを含む透析バッファーで溶離した。得られたタ
ンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、純度９０
％以上であることが示された。上記の精製法の外、固定
化したモノクローナル抗体を用いる方法[ニールセン(Ｎ
ielsen)ら、ＥＭＢＯＪ．２、１１５(１９８３)参照]を
も使用できる。
を、リッケン(Ｒijken)ら[ビオシミカ・エ・ビオフイジ
カ・アクタ(Ｂiochim．＆ Ｂiophys．Ａcta．)５８
０、１４０(１９７９)]の方法に従い、塩化亜鉛で活性
化したキレート化セファロース(Ｓepharose)(ファルマ
シア)により、バッチ抽出し[樹脂１０〜２０(ml)／培地
(l)]、フィルター上に収集した。樹脂をカラムに注入
し、０．０２Ｍりん酸ナトリウム(pＨ８．０)、０．２
５Ｍ ＮaＣl、０．０１％ＴＷＥＥＮ８０、およびアプ
ロチニン１０mg／lを含んだバッファー中で洗浄した。
５０mＭイミダゾールを含有する同じバッファーでt−Ｐ
Ａを溶離した。t−ＰＡプールを、０．０２Ｍりん酸ナ
トリウム(pＨ８)、０．２５Ｍ ＮaＣlおよび０．０１
％ＴＷＥＥＮ８０中で透析し、リジン・セファロース樹
脂[ラドクリッフエ(Ｒadcliffe)ら、アーク・バイオケ
ム・バイオフィス(Ａrch．Ｂiochem．Ｂinphys)１８
９、１８５(１９７８)および、アレン(Ａllen)ら、トロ
ンボシス・ヘモスタシス(ＴhrombosisＨeamostasis)４
５、４３(１９８１)]に適用するか、または、ベンザミ
ジン・セファロース樹脂[ビコースカ(Ｂykowska)ら、ビ
オシミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ、７０３ １１３
(１９８２)]に適用した。亜鉛キレート樹脂の場合に
は、０．０２Ｍりん酸ナトリウム(pＨ８)、１Ｍ ＮaＣ
lおよび０．０１％ＴＷＥＥＮ８０で簡単に洗浄した
後、０．５Ｍアルギニンを含む同一のバッファーでt−
ＰＡまたは突然変異t−ＰＡを溶離した。ベンザミジン
セファロースは、透析バッファーで洗浄した後、１Ｍグ
アニジンを含む透析バッファーで溶離した。得られたタ
ンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、純度９０
％以上であることが示された。上記の精製法の外、固定
化したモノクローナル抗体を用いる方法[ニールセン(Ｎ
ielsen)ら、ＥＭＢＯＪ．２、１１５(１９８３)参照]を
も使用できる。
【００５４】２．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) t−ＰＡタンパク質またはt−ＰＡ突然変異体タンパク質
を含んだ培地試料を減圧濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウ
ム(ＳＤＳ)試料バッファーで希釈した。指示された如
く、１０mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)を加えてタン
パク質ジスルフイドを減少させた。レムリ(Ｌaemmli)の
方法[レムリ、ネイチャー２２７、６８０(１９７０)]に
従い、１０％または７〜１７％ポリアクリルアミド溶解
ゲルを用い、不連続なＳＤＳ電気泳動を行った。血漿試
料の分析には、レムリのバッファー系と一緒に、４％〜
１０％ＳＤＳポリアクリルアミド・グラデイエント・溶
解ゲルを用いた。分子量既知のタンパク質の移動度との
比較により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく分子量を概
算した。
動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ) t−ＰＡタンパク質またはt−ＰＡ突然変異体タンパク質
を含んだ培地試料を減圧濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウ
ム(ＳＤＳ)試料バッファーで希釈した。指示された如
く、１０mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)を加えてタン
パク質ジスルフイドを減少させた。レムリ(Ｌaemmli)の
方法[レムリ、ネイチャー２２７、６８０(１９７０)]に
従い、１０％または７〜１７％ポリアクリルアミド溶解
ゲルを用い、不連続なＳＤＳ電気泳動を行った。血漿試
料の分析には、レムリのバッファー系と一緒に、４％〜
１０％ＳＤＳポリアクリルアミド・グラデイエント・溶
解ゲルを用いた。分子量既知のタンパク質の移動度との
比較により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく分子量を概
算した。
【００５５】３．気泡放出血餅溶解 気泡放出血餅溶解法(バブル・リリーズ・クロット・リ
シス・アッセイ)により、組換え(非−突然変異)t−ＰＡ
および、本発明の突然変異t−ＰＡ(突然変異t−ＰＡ)の
フイブリン血餅溶解活性を調べた。
シス・アッセイ)により、組換え(非−突然変異)t−ＰＡ
および、本発明の突然変異t−ＰＡ(突然変異t−ＰＡ)の
フイブリン血餅溶解活性を調べた。
【００５６】簡単に述べると、トロンビン(シグマ・ケ
ミカルＣo．)を約１０００単位／mlの割合で蒸留水に溶
かした。このストック溶液を、０．０６Ｍ−塩基性りん
酸ナトリウム、０．０６Ｍ二塩基性りん酸ナトリウム、
２００mg／lナトリウム・アジドおよび０．０１％ＴＷ
ＥＥＮ８０を含むアッセイ・バッファーで１:３０に希
釈した。トロンビン希釈液(３０〜４０単位／ml)０．５
mlと種々の濃度のt−ＰＡ(１６ng／ml〜１×１０6ng／m
l)の内、いずれか０．５mlとを入れた一連の試験管、並
びに適当な対照または、適当に希釈した未知試料を入れ
た試験管を用意した。第２の試験管群として、プラスミ
ノゲン(１．０mg／ml)２０μl、およびフイブリノゲン
(１mg／ml)１．０mlおよび４０メッシュ以上の中空ガラ
ス製微小球(３Ｍカンパニー)１０μlを入れたものを用
意した。
ミカルＣo．)を約１０００単位／mlの割合で蒸留水に溶
かした。このストック溶液を、０．０６Ｍ−塩基性りん
酸ナトリウム、０．０６Ｍ二塩基性りん酸ナトリウム、
２００mg／lナトリウム・アジドおよび０．０１％ＴＷ
ＥＥＮ８０を含むアッセイ・バッファーで１:３０に希
釈した。トロンビン希釈液(３０〜４０単位／ml)０．５
mlと種々の濃度のt−ＰＡ(１６ng／ml〜１×１０6ng／m
l)の内、いずれか０．５mlとを入れた一連の試験管、並
びに適当な対照または、適当に希釈した未知試料を入れ
た試験管を用意した。第２の試験管群として、プラスミ
ノゲン(１．０mg／ml)２０μl、およびフイブリノゲン
(１mg／ml)１．０mlおよび４０メッシュ以上の中空ガラ
ス製微小球(３Ｍカンパニー)１０μlを入れたものを用
意した。
【００５７】上記の試験管および諸薬を、この測定の最
終段階に至るまで、氷上に保持した。トロンビン−t−
ＰＡまたはトロンビン−突然変異t−ＰＡ溶液のいずれ
か一方２００μlを、プラスミノゲン、フイブリノゲ
ン、および微小球を含む試験管に順次加え、１５秒間旋
回撹拌(ボルテックス)した後、３７℃の水浴中に入れ
た。各試験管内には、３０秒以内に血餅が形成された。
t−ＰＡ添加から反応終点までの所要時間を測定した。
終点を、測定中に、微小球が表面へ上昇した時点と定め
た。特定の試料の血栓崩壊活性の値は、t−ＰＡ標準曲
線を参照して決定された。比活性は、ラジオイムノアッ
セイにより測定したt−ＰＡまたは突然変異t−ＰＡの量
に基づいて算出された。
終段階に至るまで、氷上に保持した。トロンビン−t−
ＰＡまたはトロンビン−突然変異t−ＰＡ溶液のいずれ
か一方２００μlを、プラスミノゲン、フイブリノゲ
ン、および微小球を含む試験管に順次加え、１５秒間旋
回撹拌(ボルテックス)した後、３７℃の水浴中に入れ
た。各試験管内には、３０秒以内に血餅が形成された。
t−ＰＡ添加から反応終点までの所要時間を測定した。
終点を、測定中に、微小球が表面へ上昇した時点と定め
た。特定の試料の血栓崩壊活性の値は、t−ＰＡ標準曲
線を参照して決定された。比活性は、ラジオイムノアッ
セイにより測定したt−ＰＡまたは突然変異t−ＰＡの量
に基づいて算出された。
【００５８】４．インビトロにおける血餅溶解測定 インビトロの血餅溶解系を用い、組換えt−ＰＡおよび
突然変異t−ＰＡの測定を行った。ヒト血液を、抗凝固
剤として３．１３％クエン酸ナトリウムを用いて採取
し、遠心して細胞分画を除いた。各血漿１mlに、０．５
ＭＣaＣl2５０μl、ウシ−トロンビン(１００単位／ml)
２５μlおよびヒト125Ｉ−フイブリノゲン(１００,００
０cpm／１０μl)１０μlを加えた。この血漿ミックスを
内径４mmのシリコン管に吸上げ、３７℃で１時間インキ
ュベートした。管のセグメント(小片、１cm)を切り、血
餅を除いた。この血餅を、０．３ＭＮaＣl、０．０２Ｍ
クエン酸ナトリウム(pＨ５)および０．０１％ＴＷＥＥ
Ｎ８０から成るバッファーに入れた。血餅を、１時間当
り４回、調製したてのバッファーで洗浄した。最後の洗
液中の放射性活性は、血餅中の放射性活性の約１０％を
越すことはなかった。各血餅を血漿２．５ml中に入れ
た。血漿試料２５０μlをとり、Ｏ点とした。t−ＰＡま
たは突然変異t−ＰＡ試料を容量１００μlづつ加えた。
１,２,３および４時間目に試料(２５０μl)を採取し、
その放射性活性を測定した。t−ＰＡ活性を１ml中に
５、１０、２０および４０単位含有する標準試料につい
ても同時に行った。各試料採取後の容量変化を補正した
後、溶解％を算出した。
突然変異t−ＰＡの測定を行った。ヒト血液を、抗凝固
剤として３．１３％クエン酸ナトリウムを用いて採取
し、遠心して細胞分画を除いた。各血漿１mlに、０．５
ＭＣaＣl2５０μl、ウシ−トロンビン(１００単位／ml)
２５μlおよびヒト125Ｉ−フイブリノゲン(１００,００
０cpm／１０μl)１０μlを加えた。この血漿ミックスを
内径４mmのシリコン管に吸上げ、３７℃で１時間インキ
ュベートした。管のセグメント(小片、１cm)を切り、血
餅を除いた。この血餅を、０．３ＭＮaＣl、０．０２Ｍ
クエン酸ナトリウム(pＨ５)および０．０１％ＴＷＥＥ
Ｎ８０から成るバッファーに入れた。血餅を、１時間当
り４回、調製したてのバッファーで洗浄した。最後の洗
液中の放射性活性は、血餅中の放射性活性の約１０％を
越すことはなかった。各血餅を血漿２．５ml中に入れ
た。血漿試料２５０μlをとり、Ｏ点とした。t−ＰＡま
たは突然変異t−ＰＡ試料を容量１００μlづつ加えた。
１,２,３および４時間目に試料(２５０μl)を採取し、
その放射性活性を測定した。t−ＰＡ活性を１ml中に
５、１０、２０および４０単位含有する標準試料につい
ても同時に行った。各試料採取後の容量変化を補正した
後、溶解％を算出した。
【００５９】５．色素原法(クロモゲニック・アッセイ) Ｓ−２２８８ :t−ＰＡは、カビ(Ｋabi)合成トリペプチ
ド色素原基質、Ｓ２２８８[ヘレナ・ラボラトリイズ(Ｈ
elena Ｌaboratories)、ビューモント、テキサス]を用
いて直接測定することができる。この測定は、t−ＰＡ
と１mＭＳ−２２８８(終濃度)とを０．０１２ＭＮaＣl
および０．０１％ＴＷＥＥＮ８０とを含む０．０５Ｍト
リス(pＨ７．４)中で３７℃において１０分間インキュ
ベートすることにより、行われた。反応混合物０．５ml
に氷酢酸５０μlを加えて反応を止めた。活性は、４０
５nmにおける吸収に基づき、以下の、業者によって標準
化されている等式を用いて算出された。
ド色素原基質、Ｓ２２８８[ヘレナ・ラボラトリイズ(Ｈ
elena Ｌaboratories)、ビューモント、テキサス]を用
いて直接測定することができる。この測定は、t−ＰＡ
と１mＭＳ−２２８８(終濃度)とを０．０１２ＭＮaＣl
および０．０１％ＴＷＥＥＮ８０とを含む０．０５Ｍト
リス(pＨ７．４)中で３７℃において１０分間インキュ
ベートすることにより、行われた。反応混合物０．５ml
に氷酢酸５０μlを加えて反応を止めた。活性は、４０
５nmにおける吸収に基づき、以下の、業者によって標準
化されている等式を用いて算出された。
【数１】
【００６０】Ｓ−２２５１:t−ＰＡによるプラスミノゲ
ンの活性化を、プラスミンに特異的なＫabi特異的トリ
ペプチド色素原基質、Ｓ−２２５１(ヘレナ・ラボラト
リイズ)を用いて測定した。試料の一部をプラスミノゲ
ン０．７mg／ml(０．０１２ＭＮaＣl含有０．０５Ｍト
リス、pＨ７．４)０．１０mlおよびヒトフイブリノゲン
２０mg／ml(０．０１２Ｍ ＮaＣl含有０．０５Ｍトリ
スＨＣl、pＨ７．４)０．０２mlと混合し、容量を０．
１５mlに調節した。この混合物を３７℃で１０分間イン
キュベートし、Ｓ２２５１(上記バッファー中１．０mＭ
溶液)０．３５mlを加え、更に３７℃で５または１０分
間反応を続けた。氷酢酸５０μlを加えて反応を終了さ
せ、４０５nmにおける吸収を測定した。活性の定量化
は、結果を、Ｓ−２２８８アッセイによって予め標定さ
れた組換え天然t−ＰＡ試料から得た結果と比較して行
った。これは、当初、プラスミノゲンが古くなることに
よって４０５nmにおける吸収が日々に異なり、また、プ
ラスミノゲンおよびフイブリノゲンを沈降させる方法が
異なることによっても吸収が変化するので、必須であっ
た。この可変性は、大量のヒトプラスミノゲン(glu−プ
ラスミノゲン)物質の一部を順次、凍結乾燥する方法で
調製することにより、完全に減少された。各部分を−２
０℃で保存した。使用に先立ち、再溶解したプラスミノ
ゲン製品を０℃に保存するが、この時間は４時間以上で
あってはならない。フイブリノゲンによるt−ＰＡ活性
の刺激は、フイブリノゲンを除いた同一の反応混合物中
に高濃度のフイブリノゲンを入れた混液の活性との比較
に基づき、測定された。フイブリンが不溶性であるため
に、このアッセイにはフイブリノゲンが用いられた。高
濃度のフイブリノゲンによる刺激は予測される不溶性フ
イブリンによる刺激と似ていると考えられる。
ンの活性化を、プラスミンに特異的なＫabi特異的トリ
ペプチド色素原基質、Ｓ−２２５１(ヘレナ・ラボラト
リイズ)を用いて測定した。試料の一部をプラスミノゲ
ン０．７mg／ml(０．０１２ＭＮaＣl含有０．０５Ｍト
リス、pＨ７．４)０．１０mlおよびヒトフイブリノゲン
２０mg／ml(０．０１２Ｍ ＮaＣl含有０．０５Ｍトリ
スＨＣl、pＨ７．４)０．０２mlと混合し、容量を０．
１５mlに調節した。この混合物を３７℃で１０分間イン
キュベートし、Ｓ２２５１(上記バッファー中１．０mＭ
溶液)０．３５mlを加え、更に３７℃で５または１０分
間反応を続けた。氷酢酸５０μlを加えて反応を終了さ
せ、４０５nmにおける吸収を測定した。活性の定量化
は、結果を、Ｓ−２２８８アッセイによって予め標定さ
れた組換え天然t−ＰＡ試料から得た結果と比較して行
った。これは、当初、プラスミノゲンが古くなることに
よって４０５nmにおける吸収が日々に異なり、また、プ
ラスミノゲンおよびフイブリノゲンを沈降させる方法が
異なることによっても吸収が変化するので、必須であっ
た。この可変性は、大量のヒトプラスミノゲン(glu−プ
ラスミノゲン)物質の一部を順次、凍結乾燥する方法で
調製することにより、完全に減少された。各部分を−２
０℃で保存した。使用に先立ち、再溶解したプラスミノ
ゲン製品を０℃に保存するが、この時間は４時間以上で
あってはならない。フイブリノゲンによるt−ＰＡ活性
の刺激は、フイブリノゲンを除いた同一の反応混合物中
に高濃度のフイブリノゲンを入れた混液の活性との比較
に基づき、測定された。フイブリンが不溶性であるため
に、このアッセイにはフイブリノゲンが用いられた。高
濃度のフイブリノゲンによる刺激は予測される不溶性フ
イブリンによる刺激と似ていると考えられる。
【００６１】 ６．インビボ阻害物質−コンプレックス法(アッセイ) 組換えt−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡの、天然に存在す
るt−ＰＡ活性に対する阻害物質との反応性をインビト
ロで測定した。一般的な方法として、t−ＰＡおよび突
然変異t−ＰＡを、ヨードビーズ(Ｉodobeads)[ピアス・
ケミカル(Ｐierce Ｃhemical)co．]を用いて125Ｉでヨ
ー素化し、約２×１０6cpm／μgの放射性比活性を有す
るt−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡを調製した。インビト
ロでコンプレックスを形成させるには、放射性標識t−
ＰＡ(１μg)を、採取したてのクエン酸処理−ヒト全血
(５００μl)に加えた。試料を室温でインキュベートし
た後、一部を２％ＳＤＳ中に希釈することにより、反応
を止めた。試料を４〜１０％ポリアクリルアミド・グラ
デイエントＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分析した。オート
ラジオグラフィーにより、コンプレックスを検出した。
るt−ＰＡ活性に対する阻害物質との反応性をインビト
ロで測定した。一般的な方法として、t−ＰＡおよび突
然変異t−ＰＡを、ヨードビーズ(Ｉodobeads)[ピアス・
ケミカル(Ｐierce Ｃhemical)co．]を用いて125Ｉでヨ
ー素化し、約２×１０6cpm／μgの放射性比活性を有す
るt−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡを調製した。インビト
ロでコンプレックスを形成させるには、放射性標識t−
ＰＡ(１μg)を、採取したてのクエン酸処理−ヒト全血
(５００μl)に加えた。試料を室温でインキュベートし
た後、一部を２％ＳＤＳ中に希釈することにより、反応
を止めた。試料を４〜１０％ポリアクリルアミド・グラ
デイエントＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分析した。オート
ラジオグラフィーにより、コンプレックスを検出した。
【００６２】７．フイブリン結合法(フイブリン・バイ
ンデイング・アッセイ) リッケンら(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ２５７、２９２０(１９８２)]の方法の改良法
でフイブリン結合を行った。被険t−ＰＡ試料(５００n
g)を、０．０５Ｍトリス(pＨ７．４)、０．１２ＭＮaＣ
l、０．０１％ＴＷＥＥＮ８０、１mg／mlヒト血清アル
ブミンおよび種々の濃度のプラスミノゲン不含フイブリ
ノゲン(０,０．１,０．５および１．０mg／ml)を含む溶
液に加えた。反応混合物の最終容量は１mlである。試料
を３７℃で５分間インキュベートした後、トロビン１単
位を加えた。試料を３７℃で１時間インキュベートし
た。ガラス棒で血餅を除去し、上清中に残存している非
−結合t−ＰＡの量を測定した。データーをフイブリノ
ゲン濃度に対するt−ＰＡ結合％としてプロットした(図
１９)。
ンデイング・アッセイ) リッケンら(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ２５７、２９２０(１９８２)]の方法の改良法
でフイブリン結合を行った。被険t−ＰＡ試料(５００n
g)を、０．０５Ｍトリス(pＨ７．４)、０．１２ＭＮaＣ
l、０．０１％ＴＷＥＥＮ８０、１mg／mlヒト血清アル
ブミンおよび種々の濃度のプラスミノゲン不含フイブリ
ノゲン(０,０．１,０．５および１．０mg／ml)を含む溶
液に加えた。反応混合物の最終容量は１mlである。試料
を３７℃で５分間インキュベートした後、トロビン１単
位を加えた。試料を３７℃で１時間インキュベートし
た。ガラス棒で血餅を除去し、上清中に残存している非
−結合t−ＰＡの量を測定した。データーをフイブリノ
ゲン濃度に対するt−ＰＡ結合％としてプロットした(図
１９)。
【００６３】８．インビボ血餅溶解 コレン(Ｃollen)らのインビボ血餅溶解モデル[ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション(Ｊ．
Ｃlim．Ｉnvest．)７１、３６８(１９８３)]を用いた。
雄性ニュージーランド・シロウサギ(２．５〜３．０kg)
をケタミン麻酔し、頚静脈にカテーテルを挿入し、その
付近の連結小血管を結紮した。可逆的結紮法で約２cmの
頚静脈を単離し、このセグメント(切片)の近位側から遠
位側へ糸を渡し、該セグメントを食塩トロンビン溶液で
洗浄した後、125Ｉヒトフイブリノゲンを含有する、ウ
サギの鮮血を満たした。３０分後、血餅を横切って血液
は流れ続けていた。t−ＰＡの静脈内注入を、初期投与
量として全用量の１０％を注入することで開始した。注
入は４時間にわたって行われた。注入終了の３０分後、
血餅を収穫し、数えた。放射性活性の回収を定性対照に
用い、最初の血餅中に存在していた放射性活性量の概算
値の正確さを確認するために、血液試料、尿、綿棒およ
び注射器についても計算した。
ル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション(Ｊ．
Ｃlim．Ｉnvest．)７１、３６８(１９８３)]を用いた。
雄性ニュージーランド・シロウサギ(２．５〜３．０kg)
をケタミン麻酔し、頚静脈にカテーテルを挿入し、その
付近の連結小血管を結紮した。可逆的結紮法で約２cmの
頚静脈を単離し、このセグメント(切片)の近位側から遠
位側へ糸を渡し、該セグメントを食塩トロンビン溶液で
洗浄した後、125Ｉヒトフイブリノゲンを含有する、ウ
サギの鮮血を満たした。３０分後、血餅を横切って血液
は流れ続けていた。t−ＰＡの静脈内注入を、初期投与
量として全用量の１０％を注入することで開始した。注
入は４時間にわたって行われた。注入終了の３０分後、
血餅を収穫し、数えた。放射性活性の回収を定性対照に
用い、最初の血餅中に存在していた放射性活性量の概算
値の正確さを確認するために、血液試料、尿、綿棒およ
び注射器についても計算した。
【００６４】Ｆ．測定の結果 二本鎖活性化部位、残基２７０〜２７９に以下の配列を
有するt−ＰＡ突然変異体が、大腸菌およびチャイニー
ズ・ハムスターの卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)内で発現され
た。 ２７５ ２７９ 天然 −Ａrg−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｇly− (ＲＩＫＧＧ) １Ｂ８ −Ｇly−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｇly− (ＧＩＫＧＧ) ２Ｃ９ −Ｇlu−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｇly− (ＥＩＫＧＧ)
有するt−ＰＡ突然変異体が、大腸菌およびチャイニー
ズ・ハムスターの卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)内で発現され
た。 ２７５ ２７９ 天然 −Ａrg−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｇly− (ＲＩＫＧＧ) １Ｂ８ −Ｇly−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｇly− (ＧＩＫＧＧ) ２Ｃ９ −Ｇlu−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｇly− (ＥＩＫＧＧ)
【００６５】 １．ウェスタン・ブロッツおよびチモグラフィー ＣＨＯ細胞内で発現されたＥＩＫＧＧ突然変異体および
ＧＩＫＧＧ突然変異体を、還元または非還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルによって導かれるウェスタンブロッツ法で分
析した。天然のt−ＰＡは、グリコシル化の程度の差に
より、分子量５２,０００および５０,０００ダルトンの
２本のバンドとして現われた。非−還元ＳＤＳ−ＰＡＧ
ＥにおけるＥＩＫＧＧ突然変異体は、分子量約５０,０
００ダルトンの位置に、１本の主要な免疫反応性バンド
を示した。しかしながら、非−還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おけるＧＩＫＧＧ突然変異体のウェスタンブロッツは分
子量５５,０００ダルトンを示していた。ＧＩＫＧＧ突
然変異体の見掛け上の分子量と、天然のt−ＰＡの分子
量との差異は、その炭水化物構造の立体配座が天然のt
−ＰＡと異っていることを示すものと思われる。arg２
７５におけるタンパク質の開裂は、以下の還元により
(このことによってプロテアーゼ鎖とクリングル鎖とが
分離する)低分子量のt−ＰＡを分析することにより、検
出される。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのチモグラフは、
これらの試料中のプラスミノゲン活性化因子の活性が、
一本鎖形t−ＰＡの免疫反応性バンドの分子量(約６０,
０００)の位置にあることを示している。二本鎖形t−Ｐ
Ａの電気泳動における移動度は、分子量約３０,０００
ダルトンと一致している。この方法により、一本鎖形の
突然変異t−ＰＡタンパク質が、形質転換された細胞の
培地中に存在していることが証明された。
ＧＩＫＧＧ突然変異体を、還元または非還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルによって導かれるウェスタンブロッツ法で分
析した。天然のt−ＰＡは、グリコシル化の程度の差に
より、分子量５２,０００および５０,０００ダルトンの
２本のバンドとして現われた。非−還元ＳＤＳ−ＰＡＧ
ＥにおけるＥＩＫＧＧ突然変異体は、分子量約５０,０
００ダルトンの位置に、１本の主要な免疫反応性バンド
を示した。しかしながら、非−還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おけるＧＩＫＧＧ突然変異体のウェスタンブロッツは分
子量５５,０００ダルトンを示していた。ＧＩＫＧＧ突
然変異体の見掛け上の分子量と、天然のt−ＰＡの分子
量との差異は、その炭水化物構造の立体配座が天然のt
−ＰＡと異っていることを示すものと思われる。arg２
７５におけるタンパク質の開裂は、以下の還元により
(このことによってプロテアーゼ鎖とクリングル鎖とが
分離する)低分子量のt−ＰＡを分析することにより、検
出される。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのチモグラフは、
これらの試料中のプラスミノゲン活性化因子の活性が、
一本鎖形t−ＰＡの免疫反応性バンドの分子量(約６０,
０００)の位置にあることを示している。二本鎖形t−Ｐ
Ａの電気泳動における移動度は、分子量約３０,０００
ダルトンと一致している。この方法により、一本鎖形の
突然変異t−ＰＡタンパク質が、形質転換された細胞の
培地中に存在していることが証明された。
【００６６】Ｓ−２２５１法(アッセイ) Ｓ−２２５１法による天然、並びに突然変異ＥＩＫＧＧ
t−ＰＡの分析結果を表Ｉに示す。これらの値は、測定
の変動性を減少するために、測定中にglu−プラスミノ
ゲンを用いる前に得たものである。天然に存在している
t−ＰＡ配列ＲＩＫＧＧは、Ｓ２２８８法に基づき、フ
イブリノゲンの存在下、無作為な(任意の)比活性を示す
ものと帰属された。このt−ＰＡ標準を、各ＥＩＫＧＧt
−ＰＡ突然変異体と一緒に測定し、結果の規格化を図っ
た。
t−ＰＡの分析結果を表Ｉに示す。これらの値は、測定
の変動性を減少するために、測定中にglu−プラスミノ
ゲンを用いる前に得たものである。天然に存在している
t−ＰＡ配列ＲＩＫＧＧは、Ｓ２２８８法に基づき、フ
イブリノゲンの存在下、無作為な(任意の)比活性を示す
ものと帰属された。このt−ＰＡ標準を、各ＥＩＫＧＧt
−ＰＡ突然変異体と一緒に測定し、結果の規格化を図っ
た。
【００６７】ＥＩＫＧＧt−ＰＡ突然変異体は、精製の
程度に関係なく、Ｓ２２５１＋フイブリノゲン法に於い
て、組換えt−ＰＡよりも大きい比活性を有することが
分る。
程度に関係なく、Ｓ２２５１＋フイブリノゲン法に於い
て、組換えt−ＰＡよりも大きい比活性を有することが
分る。
【表１】 表 Ｉ 突 然 Ｓ−２２５１＋ Ｓ−２２５１− フイブリノゲン 突然変異 変異体 フイブリノゲン フイブリノゲン 刺 激 RIKGG1 native (250,000)4 25,000 10.0 EIKGG1 ２Ｃ９ 1,000,000 3.400 290.0 EIKGG2 ２Ｃ９ 420,000 3,100 134.0 EIKGG3 ２Ｃ９ 520,000 7,000 74.0 １．亜鉛キレート・リジン−アガロースを用いて精製。 ２．亜鉛キレートおよびベンザミジン・アガロースを用
いて精製。 ３．精製せずに測定。 ４．帰属された活性値。
いて精製。 ３．精製せずに測定。 ４．帰属された活性値。
【００６８】表ＩＡのデーターは、高質度の凍結乾燥gl
u−プラスミノゲンを用いて得られた。より再現性の高
い方法において、フイブリノゲン存在下、Ｓ−２２５１
法におけるＥＩＫＧＧ突然変異体の活性は等しいことが
分った。フイブリノゲン不存在下では、突然変異体の活
性は依然として天然物のそれよりも低く(表Ｉおよび表
ＩＡ)、特異性の大きいことが証明された。
u−プラスミノゲンを用いて得られた。より再現性の高
い方法において、フイブリノゲン存在下、Ｓ−２２５１
法におけるＥＩＫＧＧ突然変異体の活性は等しいことが
分った。フイブリノゲン不存在下では、突然変異体の活
性は依然として天然物のそれよりも低く(表Ｉおよび表
ＩＡ)、特異性の大きいことが証明された。
【００６９】
【表２】 表 ＩＡ 突 然 Ｓ−２２５１＋ Ｓ−２２５１− フイブリノゲン 突然変異 変異体 フイブリノゲン フイブリノゲン 刺 激 RIKGG1 native (250,000)2 17,600 14 EIKGG1 ２Ｃ９ ２４８，０００ ５００
５００ １．亜鉛キレート・リジンアガロースを用いて精製。 ２．帰属された活性。
５００ １．亜鉛キレート・リジンアガロースを用いて精製。 ２．帰属された活性。
【００７０】２．気泡放出血餅溶解法およびインビトロ
での血餅溶解法 組換えｔ−ＰＡおよび精製ＥＩＫＧＧt−ＰＡ突然変異
体の比活性を測定するために、気泡放出血餅溶解法を用
いた。上記の方法で、これら各t−ＰＡ類の活性を測定
した。t−ＰＡおよびＥＩＫＧＧ突然変異体t−ＰＡの濃
度は、放射線免疫検定法で求めた。測定結果および比活
性を表ＩＩに
での血餅溶解法 組換えｔ−ＰＡおよび精製ＥＩＫＧＧt−ＰＡ突然変異
体の比活性を測定するために、気泡放出血餅溶解法を用
いた。上記の方法で、これら各t−ＰＡ類の活性を測定
した。t−ＰＡおよびＥＩＫＧＧ突然変異体t−ＰＡの濃
度は、放射線免疫検定法で求めた。測定結果および比活
性を表ＩＩに
【表３】 表 ＩＩ 活 性 タンパク質 試料 Ｉ．Ｄ． Ｕ／ml 濃度mg／ml 比活性 １ EIKGG＊ 8440 0.088 95,909 ２ EIKGG＊ 7698 0.088 87,477 ３ t-PA＊＊ 5640 0.088 64,090 １) 凍結−解凍(１回)。 ２) 凍結−解凍(４回)。 ＊ 亜鉛キレートおよびベンザミジン−アガロースで精
製。 ＊＊ 亜鉛キレートおよびリジン−アガロースで精製。
製。 ＊＊ 亜鉛キレートおよびリジン−アガロースで精製。
【００７１】この気泡放出血餅溶解法の結果は、一本鎖
t−ＰＡ突然変異体、特に、ＥＩＫＧＧ突然変異t−ＰＡ
の比活性が、組換えt−ＰＡよりも５０％以上高いこと
を証明するのである。凍結と解凍を繰返すことにより、
ＥＩＫＧＧt−ＰＡ突然変異体の比活性が僅かに減少さ
れると思われる。しかしながら、それでもなお、突然変
異t−ＰＡの比活性は、組換えt−ＰＡのそれよりも高く
維持される。
t−ＰＡ突然変異体、特に、ＥＩＫＧＧ突然変異t−ＰＡ
の比活性が、組換えt−ＰＡよりも５０％以上高いこと
を証明するのである。凍結と解凍を繰返すことにより、
ＥＩＫＧＧt−ＰＡ突然変異体の比活性が僅かに減少さ
れると思われる。しかしながら、それでもなお、突然変
異t−ＰＡの比活性は、組換えt−ＰＡのそれよりも高く
維持される。
【００７２】３．インビボでの阻害物質−コンプレック
ス法(アッセイ) 血漿プロテアーゼ阻害物質によるプロテアーゼ類の不活
化の機構は、血清プロテアーゼの不活化に関して、よく
研究されている。生成されたコンプレックス（複合体）
は変性に対して安定であるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動法によって評価することができる。この方法では、
放射性標識t−ＰＡを血漿または全血に加え、３７℃で
インキュベートする。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次い
でオートラジオグラフィーにかける。遊離のt−ＰＡよ
りも大きい分子量(Ｍr)位置における放射性標識を検出
することにより、形成されたt−ＰＡプロテアーゼ阻害
物質とのコンプレックスの量が求められる。ラットの血
液中で分析したところ、t−ＰＡは、Ｍr２００,０００
以上のコンプレックスをゆっくり、形成することが分っ
た。数時間のインキュベーションの後、これらのコンプ
レックス中に、７０％以上の放射性標識が検出された。
これに反して、突然変異t−ＰＡはこの様なコンプレッ
クスを形成しなかった。即ち、オートラジオグラフィー
で検出した放射性標識の大部分は、遊離の、不活化され
ていない酵素の位置に止まっていた。ヒト血液中で同様
な実験を行うと(図１８)、t−ＰＡはここでも同様なコ
ンプレックスを形成すると共に、Ｍrが１００,０００〜
２００,０００のコンプレックスをも形成した。ラット
の血液を用いた場合と同様に、突然変異体t−ＰＡと阻
害物質とは、Ｍr２００,０００以上のコンプレックスを
殆んど形成しなかった。しかし、Ｍr値１００,０００〜
２００,０００の、プロテアーゼ阻害物質コンプレック
スは存在していた。これらの結果は、突然変異体が、分
子量２００,０００以上のコンプレックスを形成する様
なプロテイナーゼ阻害物質によっては不活化されないこ
とを示すものである。t−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡ両
者の、分子量１００,０００〜２００,０００のコンプレ
ックス形成における反応性には種特異性が認められた。
ス法(アッセイ) 血漿プロテアーゼ阻害物質によるプロテアーゼ類の不活
化の機構は、血清プロテアーゼの不活化に関して、よく
研究されている。生成されたコンプレックス（複合体）
は変性に対して安定であるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動法によって評価することができる。この方法では、
放射性標識t−ＰＡを血漿または全血に加え、３７℃で
インキュベートする。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次い
でオートラジオグラフィーにかける。遊離のt−ＰＡよ
りも大きい分子量(Ｍr)位置における放射性標識を検出
することにより、形成されたt−ＰＡプロテアーゼ阻害
物質とのコンプレックスの量が求められる。ラットの血
液中で分析したところ、t−ＰＡは、Ｍr２００,０００
以上のコンプレックスをゆっくり、形成することが分っ
た。数時間のインキュベーションの後、これらのコンプ
レックス中に、７０％以上の放射性標識が検出された。
これに反して、突然変異t−ＰＡはこの様なコンプレッ
クスを形成しなかった。即ち、オートラジオグラフィー
で検出した放射性標識の大部分は、遊離の、不活化され
ていない酵素の位置に止まっていた。ヒト血液中で同様
な実験を行うと(図１８)、t−ＰＡはここでも同様なコ
ンプレックスを形成すると共に、Ｍrが１００,０００〜
２００,０００のコンプレックスをも形成した。ラット
の血液を用いた場合と同様に、突然変異体t−ＰＡと阻
害物質とは、Ｍr２００,０００以上のコンプレックスを
殆んど形成しなかった。しかし、Ｍr値１００,０００〜
２００,０００の、プロテアーゼ阻害物質コンプレック
スは存在していた。これらの結果は、突然変異体が、分
子量２００,０００以上のコンプレックスを形成する様
なプロテイナーゼ阻害物質によっては不活化されないこ
とを示すものである。t−ＰＡおよび突然変異t−ＰＡ両
者の、分子量１００,０００〜２００,０００のコンプレ
ックス形成における反応性には種特異性が認められた。
【００７３】４．フイブリン結合 t−ＰＡの一本鎖形および二本鎖形が、略等しいフイブ
リン親和性を有することは既に報告されている[リッケ
ンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
２５７、２９２０(１９８２)]。本明細書に記載した測
定法によると、二本鎖形t−ＰＡとの比較において、一
本鎖形t−ＰＡは、フイブリンに対し、著しく高い親和
性を示した(図１９)。
リン親和性を有することは既に報告されている[リッケ
ンら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
２５７、２９２０(１９８２)]。本明細書に記載した測
定法によると、二本鎖形t−ＰＡとの比較において、一
本鎖形t−ＰＡは、フイブリンに対し、著しく高い親和
性を示した(図１９)。
【００７４】５．インビボにおける血餅溶解 図２０は、t−ＰＡ(o)およびＥＩＫ突然変異体(o)の相
対的な用量−応答曲線を示すグラフである。これらのデ
ーターは、各群５匹づつのウサギに関する平均値＋／−
ＳＥＭで示されている。５０％溶解点の２本の曲線間の
距離を測定し、ＥＩＫ形のt−ＰＡの能力は、非突然変
異形(ＲＩＫ)のt−ＰＡの２．４倍以上であると見積ら
れた。統計上有意な差は、用量０．２５mg／kgにおいて
得られた(Ｐ＜０．０１)。
対的な用量−応答曲線を示すグラフである。これらのデ
ーターは、各群５匹づつのウサギに関する平均値＋／−
ＳＥＭで示されている。５０％溶解点の２本の曲線間の
距離を測定し、ＥＩＫ形のt−ＰＡの能力は、非突然変
異形(ＲＩＫ)のt−ＰＡの２．４倍以上であると見積ら
れた。統計上有意な差は、用量０．２５mg／kgにおいて
得られた(Ｐ＜０．０１)。
【００７５】Ｇ．結論 以上の結果に基づき、以下の２つの理由から、t−ＰＡ
の２７５位における突然変異体は、天然形のt−ＰＡよ
りも有効と思われる。 １)特異性の増大:t−ＰＡ機能の測定結果は、より活性
およびまたは特異的なタンパク質(活性／特異性タンパ
ク質)であることを示している。 ２)インビボにおける血漿性阻害物質との結合性の低下:
その様な突然変異体のインビボにおける阻害は、ある種
のプロテアーゼ阻害物質による不活化を示すものであ
る。従って、活性な、コンプレックスを形成していない
形のt−ＰＡが循環されることになり、従って、血餅溶
解機能が増大されたt−ＰＡが循環されるのである。
の２７５位における突然変異体は、天然形のt−ＰＡよ
りも有効と思われる。 １)特異性の増大:t−ＰＡ機能の測定結果は、より活性
およびまたは特異的なタンパク質(活性／特異性タンパ
ク質)であることを示している。 ２)インビボにおける血漿性阻害物質との結合性の低下:
その様な突然変異体のインビボにおける阻害は、ある種
のプロテアーゼ阻害物質による不活化を示すものであ
る。従って、活性な、コンプレックスを形成していない
形のt−ＰＡが循環されることになり、従って、血餅溶
解機能が増大されたt−ＰＡが循環されるのである。
【００７６】科学文献における一本鎖形t−ＰＡの酵素
的特性に関する報告は逆である。t−ＰＡの機能をより
良く理解するには、それとホモローガスなタンパク質を
考察すると良い。セリンプロテアーゼ類、トリプシンお
よびキモトリプシンに関して、広範な研究が行われてい
る。t−ＰＡのプロテアーゼ領域はこれらのタンパク質
と非常によく似ており、従って、同様の方法で機能する
ものと思われる。トリプシンおよびキモトリプシンに関
して決定された機能的な機構に基づき、t−ＰＡの２７
５番目のアルギニン位置における開裂を阻止すると、プ
ロテアーゼ領域の機能上の特徴のみが影響を受けると予
想された。従って、突然変異体のフイブリン親和性の増
大は驚くべきことである。
的特性に関する報告は逆である。t−ＰＡの機能をより
良く理解するには、それとホモローガスなタンパク質を
考察すると良い。セリンプロテアーゼ類、トリプシンお
よびキモトリプシンに関して、広範な研究が行われてい
る。t−ＰＡのプロテアーゼ領域はこれらのタンパク質
と非常によく似ており、従って、同様の方法で機能する
ものと思われる。トリプシンおよびキモトリプシンに関
して決定された機能的な機構に基づき、t−ＰＡの２７
５番目のアルギニン位置における開裂を阻止すると、プ
ロテアーゼ領域の機能上の特徴のみが影響を受けると予
想された。従って、突然変異体のフイブリン親和性の増
大は驚くべきことである。
【００７７】関連する機能(類)(特異性の増大、プロテ
アーゼ阻害物質との結合性の欠如、フイブリンとの親和
性の増加、あるいはこれらの組合わせ)を考慮しないに
しても、インビボでの、ブロックされた静脈に対する溶
解能力に関する試験において、突然変異体は、天然のt
−ＰＡの約２．５倍もの高い活性を示した。既に述べた
様に、一本鎖形t−ＰＡは、血餅の部分で二本鎖形に変
換されることが示された。その様な変換によって、一本
鎖形が有する長所は全て破壊されてしまうことになる。
生理的プロテアーゼによって２本鎖に変換され得る突然
変異形のt−ＰＡのみが、血餅の部位で一度、その長所
を保持し続けることができる。
アーゼ阻害物質との結合性の欠如、フイブリンとの親和
性の増加、あるいはこれらの組合わせ)を考慮しないに
しても、インビボでの、ブロックされた静脈に対する溶
解能力に関する試験において、突然変異体は、天然のt
−ＰＡの約２．５倍もの高い活性を示した。既に述べた
様に、一本鎖形t−ＰＡは、血餅の部分で二本鎖形に変
換されることが示された。その様な変換によって、一本
鎖形が有する長所は全て破壊されてしまうことになる。
生理的プロテアーゼによって２本鎖に変換され得る突然
変異形のt−ＰＡのみが、血餅の部位で一度、その長所
を保持し続けることができる。
【００７８】本発明の好ましい態様を記載したが、当業
者ならば、本明細書中で開示した態様に種々の修飾を施
すことができ、また、それらの修飾も本発明の範囲内に
あることを理解できる。
者ならば、本明細書中で開示した態様に種々の修飾を施
すことができ、また、それらの修飾も本発明の範囲内に
あることを理解できる。
【００７９】
【図１】 ヒトt−ＰＡ並びにその５'および３'非翻訳
領域のＤＮＡおよびプレt−ＰＡをコードしている配列
の制限地図である。
領域のＤＮＡおよびプレt−ＰＡをコードしている配列
の制限地図である。
【図２】 図２、図３、図４、図５、図６および図７
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
【図３】 図２、図３、図４、図５、図６および図７
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
【図４】 図２、図３、図４、図５、図６および図７
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
【図５】 図２、図３、図４、図５、図６および図７
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
【図６】 図２、図３、図４、図５、図６および図７
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
【図７】 図２、図３、図４、図５、図６および図７
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
は、プレ−t−ＰＡおよびその５'−および３'−非翻訳
領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列１２Ｈ２k１０Ｈ
である。
【図８】 ２７５位に突然変異を有するクローン類の組
立て模式図である。
立て模式図である。
【図９】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立て
模式図である。
模式図である。
【図１０】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１１】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１２】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１３】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１４】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１５】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１６】 pＸＡＰＰＡ１８ ３'△×１０trpＲの組立
て模式図である。
て模式図である。
【図１７】 プラスミドpＰＡＤＨＦＲ−６の制限部位
を示す模式図である。
を示す模式図である。
【図１８】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、オートラジ
オグラフィーで検出した放射性標識t−ＰＡ(左側)およ
びＥＩＫＧＧt−ＰＡ(右側)と血漿プロテアーゼ阻害物
質とのコンプレックスの形成を示す映像の模写図であ
る。
オグラフィーで検出した放射性標識t−ＰＡ(左側)およ
びＥＩＫＧＧt−ＰＡ(右側)と血漿プロテアーゼ阻害物
質とのコンプレックスの形成を示す映像の模写図であ
る。
【図１９】 一本鎖t−ＰＡ、二本鎖t−ＰＡおよび一本
鎖突然変異t−ＰＡとフイブリンとの結合活性を示すグ
ラフである。
鎖突然変異t−ＰＡとフイブリンとの結合活性を示すグ
ラフである。
【図２０】 インビボでのＥＩＫおよびrt−ＰＡの血餅
溶解作用の用量−応答曲線を示すグラフである。
溶解作用の用量−応答曲線を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＣＢ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】 部位特異的突然変異により２７５位のア
ミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、
そして／または２７７位のアミノ酸がリジン以外のアミ
ノ酸で置換されている、組換え宿主細胞によって生産さ
れるヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体をコ
ードしているＤＮＡ。 - 【請求項２】 部位特異的突然変異により２７５位のア
ミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、
そして／または２７７位のアミノ酸がリジン以外のアミ
ノ酸で置換されている、組換え宿主細胞によって生産さ
れるヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体をコ
ードしているＤＮＡを形質転換体宿主細胞内で発現させ
得る複製可能な発現ベクター。 - 【請求項３】 部位特異的突然変異により２７５位のア
ミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、
そして／または２７７位のアミノ酸がリジン以外のアミ
ノ酸で置換されている、組換え宿主細胞によって生産さ
れるヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体をコ
ードしているＤＮＡを形質転換体宿主細胞内で発現させ
得る複製可能な発現ベクターで形質転換された微生物。 - 【請求項４】 部位特異的突然変異により２７５位のア
ミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸で置換されており、
そして／または２７７位のアミノ酸がリジン以外のアミ
ノ酸で置換されている、組換え宿主細胞によって生産さ
れるヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体をコ
ードしているＤＮＡを形質転換体宿主細胞内で発現させ
得る複製可能な発現ベクターで形質転換された哺乳動物
細胞。 - 【請求項５】 哺乳動物細胞がチャイニーズ・ハムスタ
ーの卵巣セルラインである請求項４記載の細胞。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72546885A | 1985-04-22 | 1985-04-22 | |
| US725468 | 1985-04-22 | ||
| US84669786A | 1986-04-01 | 1986-04-01 | |
| US846697 | 1986-04-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61094382A Division JPH0740940B2 (ja) | 1985-04-22 | 1986-04-22 | 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277071A JPH06277071A (ja) | 1994-10-04 |
| JP2529816B2 true JP2529816B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=27111150
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61094382A Expired - Lifetime JPH0740940B2 (ja) | 1985-04-22 | 1986-04-22 | 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 |
| JP6019382A Expired - Lifetime JP2529816B2 (ja) | 1985-04-22 | 1994-02-16 | 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61094382A Expired - Lifetime JPH0740940B2 (ja) | 1985-04-22 | 1986-04-22 | 新規なヒト組織プラスミノゲン活性化因子突然変異体 |
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| EP (1) | EP0199574B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0740940B2 (ja) |
| AT (1) | ATE68825T1 (ja) |
| AU (1) | AU596356B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341580C (ja) |
| DD (1) | DD258026A5 (ja) |
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| GR (1) | GR861037B (ja) |
| HU (1) | HU206520B (ja) |
| IE (1) | IE58574B1 (ja) |
| IL (1) | IL78571A (ja) |
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| NZ (1) | NZ215920A (ja) |
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| JPS6087751A (ja) * | 1983-10-20 | 1985-05-17 | House Food Ind Co Ltd | レトルト豆腐の製造法 |
| EP0201153A3 (en) * | 1985-02-09 | 1987-10-07 | Beecham Group Plc | Modified enzyme and process for its preparation |
| HUT41632A (en) * | 1985-03-06 | 1987-05-28 | Survival Technology | Process for preparing agents for the enhancement of protein absorption |
| US5736134A (en) * | 1985-04-22 | 1998-04-07 | Genentech, In.C | Tissue plasminogen activator variants |
| US5756093A (en) * | 1985-04-22 | 1998-05-26 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator variants |
| GB2173804B (en) * | 1985-04-22 | 1989-07-05 | Genentech Inc | Human tissue plasminogen activator mutants, methods and intermediates therefor, and compositions using such mutants |
| US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| EP0227462B1 (en) * | 1985-12-23 | 1992-04-01 | Chiron Corporation | Novel peptide plasminogen activators |
| DK43387A (da) * | 1986-01-29 | 1987-07-30 | Beecham Group Plc | Fibrinolytisk enzym |
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| US5837518A (en) * | 1986-01-31 | 1998-11-17 | Genetics Institute, Inc. | Thrombolytic proteins |
| US5071972A (en) * | 1986-01-31 | 1991-12-10 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding novel thrombolytic proteins |
| JP2527454B2 (ja) * | 1986-01-31 | 1996-08-21 | ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド | 新しい血栓溶解タンパク質 |
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