DE69719265T2

DE69719265T2 - Medizinische Zusammensetzung die Gewebeplasminogenaktivator und Nikotinamid enthält

Info

Publication number: DE69719265T2
Application number: DE69719265T
Authority: DE
Inventors: Shinichi Furukawa; Hiroshi Mizokami; Kazuyuki Nakashima; Yoshitaka Tajima
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-05
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2017-09-06
Also published as: EP0827751A3; DK0827751T3; EP0827751A2; EP0827751B1; US6139838A; DE69719265D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine medizinische Zusammensetzung, die einen Gewebeplasminogenaktivator (hierin auch als "t-PA" bezeichnet) enthält. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine medizinische Zusammensetzung, die einen t-PA oder einen modifizierten t-PA enthält, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen t-PA oder einen modifizierten Gewebeplasminogenaktivator (hierin auch als "modifizierter t-PA" bezeichnet) und Nicotinamid oder ein Derivat davon enthält.
t-PA aktiviert Plasminogen, damit es Plasmin bildet, das Fibrin auflöst, welches die Hauptkomponente des Proteinsubstrats des Thrombus ist. Die t-PA-Präparate wurden als ein thrombolytisches Mittel entwickelt, das bei der thrombolytischen Behandlung einer Thrombose, die Herzinfarkt und Hirninfarkt verursacht, eine sehr hohe Selektivität hat. Darüber hinaus wurden auch mittels gentechnischer Verfahren verschiedene modifizierte t- PAs produziert, um eine höhere Affinität zu Fibrin und um im Blut eine höhere Halbwertszeit als natürlicher t-PA zu erhalten. Die aus Prokaryonten so produzierten modifizierten t-PAs sind vom nicht glycosylierten Typ, im Gegensatz zum natürlichen t-PA. t-PAs sind im allgemeinen in Wasser extrem schwerlösliche Proteine. Insbesondere sind die modifizierten t- PAs noch schwerer löslich in Wasser als der natürliche t-PA, was ihre Herstellung und die Herstellung von Injektionen oder dergleichen, wobei sie zum Zeitpunkt der Verabreichung an den Patienten in Wasser gelöst werden müssen, sehr schwierig macht, während die modifizierten t-PAs verschiedene Vorteile haben, wie eine Erhöhung der Affinität zu Fibrin und eine Verlängerung der Halbwertszeit im Blut.
Die grundlegende Idee bei der neueren Behandlung von akutem Herzinfarkt ist, daß, wenn die Koronararterien blockiert sind, die Blutzirkulation so schnell wie möglich wiederhergestellt werden muß, um den Schaden am Herzen zu minimieren. Gemäß dieser Idee wird ein Arzneistoff, das mit hoher Konzentration in kurzer Zeit sicher verabreicht werden kann, bevorzugt. Wenn daher aufgrund der Verwendung des modifizierten t-PA, das verschiedene Vorteile hat, die Rezirkulation des Bluts in den Koronararterien in einem frühen Stadium und die Verhinderung der Vergrößerung des blockierten Teils erwartet wird, ist es vorzuziehen, das Präparat mit der hohen t-PA-Konzentration sofort einmal zu verabreichen. Unter diesen Umständen ist die Entwicklung eines t-PA-Präparats, das eine verbesserte Löslichkeit in Wasser, eine hohe Konzentration und eine stabile Proteinstruktur hat, wünschenswert, obwohl die t-PAs, insbesondere die glycosylfreien t-PAs, in Wasser schwerlöslich sind und eine instabile Proteinstruktur haben.
Zusätzlich sind die t-PAs einschließlich der modifizierten t-PAs im allgemeinen instabil gegenüber Hitze. Um solche Verbindungen zu entwickeln, die als Medikamente verwendbar sind, ist ein Verfahren zu ihrer Stabilisierung auch unabdingbar.
In Bezug auf frühere Verfahren zur Solubilisierung von t-PA ist ein Verfahren bekannt, wobei der t-PA durch die Zugabe von Argininhydrochlorid oder einem Salz davon zu t-PA unter neutralen bis schwach alkalischen Bedingungen solubilisiert und stabilisiert wird [vgl. die japanische Patentveröffentlichung aus Einspruchsgründen (hier als "J. P. KOKOKU" bezeichnet Nrs. Hei 6-72105 und 6-99324]. Der Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß die Stabilität der Proteinstruktur von t-PA bei hoher Konzentration unter den neutralen bis schwach alkalischen Bedingungen reduziert ist. In Bezug auf die Löslichkeit sind die Lösungseigenschaften des glycosylfreien t-PA und von modifiziertem glycosylfreiem t-PA verschieden von denen des natürlichen t-PA, und die Wiederauflösung des selbst-assoziierten t-PA durch diese Verfahren war schwierig.
Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Solubilisierung von t-PA durch Kontrolle der Lösung bei einem pH-Wert von 2 bis 5 bekannt (vgl. J. P. KOKOKU Nrs. Sho 63-38327 und Hei 3-69332). Um jedoch das gewünschte Präparat zu erhalten, weist dieses Verfahren noch einige Probleme auf, die gelöst werden müssen, weil gefriergetrockneter t-PA oder eine t-PA- Lösung sich rasch zersetzt und inaktiv wird.
Auf der anderen Hand waren die folgenden Verfahren zur Stabilisierung von t-PA im Stand der Technik bekannt: ein Verfahren, bei dem Albumin zugegeben wird (J. P. KOKOKU Nr. Hei 3-29390), ein Verfahren, bei dem ein Abbauprodukt von Albumin zugegeben wird [nicht geprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung (hier als "J. P. KOKAI" bezeichnet) Nr. Hei 1-221325)] und ein Verfahren, bei dem mit Säure behandelte Gelatine zugegeben wird (J. P. KOKOKU Nr. Hei 5-27607). Es wurde jedoch bestätigt, daß die Wirkungen dieser Verfahren nicht zufriedenstellend waren, wenn die Konzentration von t-PA hoch ist, und daß die Löslichkeit von t-PA in einer Citronensäurepufferlösung, insbesondere bei Zugabe von Albumin, reduziert wird.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verbesserung der Löslichkeit einer Zusammensetzung von t-PA oder modifiziertem t-PA, die niedrige Löslichkeit und Stabilität hat, und auch die Bereitstellung eines medizinischen t-PA- Präparats, das t-PA oder modifiziertes t-PA in der Form einer Lösung enthält, die eine für die klinische Verwendung geeignete Konzentration und auch eine pharmazeutisch ausreichende Stabilität hat.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß überraschenderweise die Löslichkeit eines Präparats, das t-PA oder modifizierten t-PA enthält, deutlich erhöht wird, wenn Nicotinamid oder ein Derivat davon mit eingebaut werden. Es wurde auch gefunden, daß die Stabilität von t-PA in der Zusammensetzung, die Nicotinamid enthält, deutlich verbessert wird, unabhängig von seiner Form (gefriergetrocknet oder flüssig). Dementsprechend wird ein neues Verfahren zur Verbesserung der Löslichkeit von t-PA oder von modifiziertem t-PA bereitgestellt und auch eine Zusammensetzung von t-PA, die t-PA oder modifizierten t-PA und Nicotinamid oder eine Derivat davon enthält.
Fig. 1 zeigt den Einfluß der Citronensäurekonzentration auf die Löslichkeit von t-PA.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete t-PA umfaßt nicht nur den vom Menschen abgeleiteten natürlichen t-PA, sondern auch ein Glycosyl-Derivat von t-PA oder glycosylfreien t-PA, der mittels eines Verfahrens der Gentechnik gewonnen wurde.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendbare modifizierte t-PA wird von t-PA mittels eines Punktmutationsverfahrens oder dergleichen oder durch Verbesserung der biologischen Aktivität von t-PA gewonnen. Jeder modifizierte t-PA ist verwendbar, wenn die Wirkung der Verbesserung der Löslichkeit und die stabilisierende Wirkung der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Die bevorzugten modifizierten t-PAs sind zum Beispiel in den J. P. KOKAI Nrs. Sho 61-243024, 62-24 und 63-133988 und in den nicht geprüften veröffentlichten Japanischen Patentanmeldungen (hier als "JP Kohyo" bezeichnet) Nrs. Sho 63-501335, Hei 2-504102 und Hei 3-500843 offenbart.
Die modifizierten t-PAs, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen die nachstehend aufgelisteten:
(1) modifizierter t-PA; der durch Ersatz von Val an Position 245 von t-PA durch Met erhalten wird,
(2) modifizierter t-PA, der durch Ersatz von Cys an Position 84 von t-PA durch Ser erhalten wird,
(3) modifizierter t-PA, der durch die partielle Deletion der F- und G- Domänen von t-PA und durch Ersatz von Asn an Position 117 durch Glu erhalten wird,
(4) modifizierter t-PA, der durch Deletion der K1-Domäne von t-PA und durch Ersatz von Arg an Position 275 durch Glu erhalten wird, und
(5) modifizierter t-PA, der durch Deletion der F-, G- und K1-Domänen von t-PA erhalten wird.
t-PA oder modifizierter t-PA wird in einer Menge von zum Beispiel 0,005 bis 1 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent und insbesondere 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent verwendet, basierend auf der medizinischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
Die Sicherheit von t-PA oder modifiziertem t-PA wurde durch die bislang erhaltenen klinischen Ergebnisse bestätigt.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Nicotinamid ist ein Faktor einer wasserlöslichen Vitamin B&sub2;-Zusammensetzung und üblicherweise müssen 10 bis 20 mg/Tag oder mehr Nicotinamid von Erwachsenen genommen werden. Nicotinamid wird in der Pharmacopeia von Japan angegeben und wird klinisch für die Verhinderung und Behandlung von Nikotinsäuremangelerkrankung verwendet. In Bezug auf die Toxizität von Nicotinamid wurde berichtet, daß die letale Dosis für Mäuse 2 bis 3 g/kg ist und daß eine massive Dosis an Nicotinamid an Menschen gegeben werden kann, weil keine Toxizität erkennbar ist, selbst wenn 500 mg/Tag an Nicotinamid jeden Tag verabreicht werden.
Die Sicherheit von t-PA selbst wurde durch die bislang erhaltenen klinischen Ergebnisse bestätigt. Somit wird das t-PA-Präparat, das Nicotinamid enthält, als von äußerster Sicherheit eingestuft. Obwohl die bekannten pharmakologischen Wirkungen von Nicotinamid im Wesentlichen denen von Nikotinsäure gleichen, beschleunigt Nicotinamid nicht, anders als Nikotinsäure, die vaskuläre Permeabilität. Somit hat Nicotinamid, was die bisher bekannte pharmakologische Wirkung betrifft, im Wesentlichen keinen Einfluß auf das Blutsystem.
Nicotinamid wird als idealer medizinischer Zusatz betrachtet, frei von Wechselwirkung zwischen seiner eigenen pharmakologischen Wirkung und der von t-PA.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Nicotinamid kann ein Derivat davon sein, ausgewählt aus zum Beispiel N-Alkyl-substituierten Nicotinamiden wie N- MethylNicotinamid und N,N-DiethylNicotinamid (wobei die bevorzugten Alkylsubstituenten zum Beispiel lineare oder verzweigte Alkylgruppen von 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, wünschenswert 1 bis 3 Kohlenstoffatome), Nicotinamidderivaten, die eine Ringsubstituierende Alkylgruppe haben (wobei die bevorzugten Alkylgruppen zum Beispiel lineare oder verzweigte Alkylgruppen von 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind, wünschenswert 1 bis 3 Kohlenstoffatome), wie 1-MethylNicotinamid und IsoNicotinamid. Unter ihnen ist das in der Pharmacopeia von Japan angegebene Nicotinamid eine optimale Ausführungsform.
Nicotinamid oder ein Derivat davon wird in einer Menge von üblicherweise von 0,1 bis 50% (Gew./Vol.; dies soll auch hier zutreffen), vorzugsweise 0,3 bis 5% und praktisch vorzugsweise 1 bis 3%, basierend auf der medizinischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, verwendet. Durch die Verwendung von Nicotinamid oder einem Derivat davon in einer Menge in diesem Bereich kann die Löslichkeit von t-PA oder modifiziertem t-PA verbessert werden.
Die medizinische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann, falls erforderlich, Zusatzstoffe enthalten, die üblicherweise für die Herstellung von Medikamenten verwendet werden, wie ein isotonischer Zusatz, z. B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid; ein Füllmittel, z. B. Mannit oder Albumin; einen Stabilisator; und einen nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff, z. B. Polysorbat 80 (Handelsname: Tween 80), zusätzlich zu t-PA oder modifiziertem t-PA und Nicotinamid oder einem Derivat davon.
Die medizinische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in der Form von einer festen Zusammensetzung, einer wäßrigen Zusammensetzung oder einer in zwei Verpackungen getrennten Herstellung verwendet werden, bei der der t-PA separat von Nicotinamid oder seinem Derivat verpackt wird und aus der die Injektionslösung zum Zeitpunkt der Verabreichung hergestellt wird. Die in zwei Verpackungen getrennte Herstellung umfaßt zum Beispiel eine Kombination von einem Gefäß, das gefriergetrockneten t-PA enthält, und einem Lösungsgefäß, das Nicotinamid oder ein Derivat davon enthält.
Die medizinische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann mittels verschiedener Verfahren produziert werden. Zum Beispiel kann diese medizinische Zusammensetzung durch die Zugabe von Nicotinamid oder einem Derivat davon zu t-PA oder modifiziertem t-PA in einem geeigneten Medium produziert werden. Dieses Medium wird vorzugsweise aus verschiedenen Pufferlösungen ausgewählt. Die Pufferlösungen, die hier verwendet werden können, umfassen zum Beispiel diejenigen, die Tris-Salzsäure, Phosphorsäure, Kohlensäure, Borsäure, Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure oder eine Aminosäure enthalten.
Für die medizinische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird eine Citratpufferlösung, die Citronensäure enthält, bevorzugt, weil sie die solubilisierende Wirkung von Nicotinamid oder seinem Derivat synergistisch verbessert.
Wenn die Citratpufferlösung in die medizinische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebaut wird, ist der Gehalt an Citronensäure (die Gesamtmenge an Citronensäure selbst und Citronensäure in der Form von Citrat) der resultierenden Zusammensetzung vorzugsweise 10 bis 500 mM und in der Praxis besonders bevorzugt 10 bis 50 mM.
Der pH-Wert der medizinischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist üblicherweise 4 bis 6,5, vorzugsweise 5 bis 6. Insbesondere ist gefunden worden, daß bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 6 die Stabilität von t-PA und modifiziertem t-PA verbessert wird und seine Resistenz gegenüber einer Modifikation auf der Ebene der Aminosäuren durch Erhitzen oder Alterung weiter verbessert wird.
Die medizinische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann mittels eines Verfahrens produziert werden, worin eine durch Chromatographie eluierte t-PA enthaltende Fraktion durch zum Beispiel eine Citratpufferlösung, die Nicotinamid oder sein Derivat enthält, ersetzt wird, oder ein Verfahren, worin die t-PA enthaltende Fraktion gegen Wasser dialysiert wird, um einen t-PA-Niederschlag zu bilden, und dann wird der Niederschlag in zum Beispiel einer Citratpufferlösung, die Nicotinamid oder sein Derivat enthält, aufgelöst. Bei einem Solchen Verfahren ist es möglich, letztlich Nicotinamid oder sein Derivat und, falls erforderlich, einen anderen Präparatbaustein wie die Citratpufferlösung in das, wie vorstehend beschrieben, erhaltene Produkt einzubauen und dann die t-PA-Konzentration, wie erwünscht, zu kontrollieren oder die Flüssigkeit unter sterilen Bedingungen gefrierzutrocknen. Insbesondere kann gemäß der vorliegenden Erfindung das gefriergetrockneten t-PA oder modifizierten t-PA in einer Konzentration, die für die klinische Verwendung geeignet ist und die eine pharmazeutisch ausreichende Stabilität hat, enthaltende t-PA-Präparat leicht erhalten werden.
Das gefriergetrocknete Präparat wird durch Gefriertrocknung der t-PA oder modifizierten t-PA enthaltenden Lösung, die, wie vorstehend beschrieben, gewonnen wurde, mittels eines herkömmlichen Verfahrens produziert. Zum Beispiel wird die Lösung durch Filtration oder dergleichen sterilisiert, und dann wird ein gewünschtes Volumen der Lösung in sterile Glasgefäße wie Ampullen oder Fläschchen eingebracht. Die Lösung in den Ampullen oder Fläschchen wird bei einer Temperatur von zum Beispiel -50ºC bis -15ºC eingefroren. Die gefrorene Lösung wird bei einer geeigneten Temperatur (zum Beispiel -50ºC) aufbewahrt, bis die Vakuumtrocknung begonnen wird.
Die gefrorene Lösung kann einfach in vacuo getrocknet werden. Zum Beispiel wird die gefrorene Lösung unter einem partiellem oder vollständigem einem Vakuum von unter 0,01 bis 0,1 Tor für einen Zeitraum getrocknet, der ausreichend zur im Wesentlichen vollständigen Entfernung der gefrorenen Flüssigkeit ist. Die Temperatur für die Vakuumtrocknung ist üblicherweise so, daß die Lösung in im Wesentlichen oder vollständig gefrorenem Zustand gehalten werden kann. Die Anfangstemperatur beim Schritt der Vakuumtrocknung ist üblicherweise -30 bis -40ºC. Da in dem Verfahren das Wasser schrittweise entfernt wird, kann sich die Temperatur schrittweise auf Raumtemperatur erhöhen. Um die Spur an Wasser so weit wie möglich zu entfernen, die am Ende noch verbleibt, ist es vorzuziehen, nach Abschluß der Behandlung die Vakuumtrocknung unter einem starken Vakuum von etwa 0,01 Torr bei Raumtemperatur oder einer leicht darüberliegenden Temperatur weiterzuführen. Das resultierende gefriergetrocknete t-PA-Produkt hat einen Wassergehalt (Feuchtigkeitsgehalt) von vorzugsweise nicht höher als 2,5%. Nach Abschluß der Vakuumtrocknung wird das sterile Glasgefäß, das den gefriergetrockneten t-PA enthält, verschlossen, wobei der reduzierte Druck aufrechterhalten wird oder nachdem Stickstoffgas eingefüllt wurde.
Das gefriergetrocknete medizinische Präparat, das eine hohe Konzentration an t-PA oder modifiziertem t-PA enthält, kann gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft erhalten werden. Eine t-PA enthaltende Lösung, die an einen Patienten verabreicht werden soll, wird durch Rekonstitution von dem gefriergetrockneten medizinischen t-PA-Präparat der vorliegenden Erfindung mit Wasser bei einem neutralem oder sauren pH-Wert hergestellt. Wenn die wäßrige Lösung, von der das gefriergetrocknete medizinische t-PA-Präparat erhalten wurde, im Wesentlichen isotonisch ist, ist das für die Rekonstitution verwendete Wasser vorzugsweise im Wesentlichen isotonisch.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Herstellungsbeispiele und Beispiele weiter erläutert.

Herstellungsbeispiel 1 (Herstellung von modifiziertem t-PA)

Gereinigter, modifizierter t-PA, der durch Deletion der F-, G- und KI-Domänen von t- PA und Ersatz von Arg an Position 275 durch Glu erhalten wurde, wurde mittels eines Verfahrens hergestellt, die in Biotechnology Progress, 10 (5); 472 bis 479 (1994) beschrieben ist. Der gereinigte, modifizierte t-PA wurde gegen gereinigtes Wasser dialysiert und zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde bei -80ºC aufbewahrt.

Herstellungsbeispiel 2 (Herstellung von natürlichem t-PA)

Natürlicher t-PA ("GRTPA", ein Produkt von Tanabe Seiyaku Co., Ltd.), der ein vollständiges Molekül umfaßt, das von rekombinanten CHO-Zellen abgeleitet ist, wurde hergestellt. Der natürliche t-PA wurde gegen gereinigtes Wasser dialysiert und zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde bei -80ºC aufbewahrt. Zum Zeitpunkt der Verwendung wurde er auf eine Konzentration von etwa 8 mg/ml eingestellt und zusammen mit Nicotinamid oder seinem Derivat bei einer vorherbestimmten Konzentration verwendet.

Testbeispiel 1 (Löslichkeitstest 1)

Etwa 8 mg an modifiziertem t-PA, der in Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, wurden in ein Reagenzglas gegeben, und es wurde eine Pufferlösung zugegeben, die eine in der nachstehend aufgeführten Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung hätte. Das erhaltene Gemisch wurde gerührt und zentrifugiert, um einen flüssigen Überstand zu erhalten. Der t-PA in dem flüssigen Überstand aktivierte Plasminogen, um Plasmin zu bilden. Die t-PA-Aktivität wurde durch die Hydrolyse-Aktivität des resultierenden Plasmins auf synthetisches Substrat (S-2288), das für Plasmin spezifisch ist, bestimmt, und dann wurde die Löslichkeit von t-PA auf der Basis einer Standard-t-PA-Probe bekannter Konzentration bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Von Tabelle 1 ist es offensichtlich, daß die Löslichkeit der Nicotinamid enthaltenden medizinischen Zusammensetzung mindestens etwa 50-mal höher ist als die der Arginin (Arg) enthaltenden medizinischen Zusammensetzung. Es ist somit offensichtlich, daß das Nicotinamid in der medizinischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine bemerkenswerte Wirkung auf die Erhöhung der Löslichkeit von modifiziertem t-PA hat.
Wenn der Löslichkeitstest 1 wiederholt wurde, wobei die Konzentration der Citronensäure im Citratpuffer auf 40 mM verändert war, wurden ähnliche Resultate, wie vorstehend beschrieben, erhalten.

Testbeispiel 2 (Löslichkeitstest 2)

Der Löslichkeitstest 1 wurde wiederholt, wobei die Nicotinamidkonzentration in den Proben 3 und 4 wie in der nachstehend gezeigten Tabelle 2 verändert wurde, um die Löslichkeit von t-PA zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Von den in Tabelle 2 gezeigten Resultaten ist offensichtlich, daß die Löslichkeit von modifiziertem t-PA sich erhöht, wenn die Nicotinamidkonzentration in den medizinischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erhöht wird. Von den Resultaten ist auch offensichtlich, daß, wenn mindestens 0,3% Nicotinamid in der Lösung enthalten sind, eine für die praktische klinische Anwendung vollkommen zufriedenstellende Löslichkeit von t-PA erhalten werden kann.

Testbeispiel 3 (Löslichkeitstest)

Die Löslichkeit von modifiziertem t-PA wurde in der gleichen Weise wie in Testbeispiel 1 bestimmt, außer daß die Art der Pufferlösung in dem Gemisch, das 5% Nicotinamid, 1% Mannit und 0,01% Tween 80 enthielt, variiert wurde. Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Von den in Tabelle 3 gezeigten Resultaten ist es offensichtlich, daß, wenn die Citratpufferlösung verwendet wird, die Löslichkeit von t-PA weit mehr erhöht wird, als sie unter Verwendung einer anderen Pufferlösung erhöht wird.

Testbeispiel 4 (Löslichkeitstest 4)

Die Löslichkeit von t-PA wurde in der gleichen Weise wie in Testbeispiel 1 bestimmt, außer daß die Konzentration an Citronensäure in der Citratpufferlösung in der Pufferlösung (2,5% Nicotinamid/1% Mannit/0,01% Tween 80/Citratpuffer, pH 5,6) zum Auflösen von t- PA variiert wurde. Die Resultate sind in Tabelle 4 und Fig. 1 gezeigt. Tabelle 4
Von den Resultaten von Testbeispiel 4 ist es offensichtlich, daß die die Löslichkeit von t-PA erhöhende Wirkung von Nicotinamid sich mit der Konzentration der Quelle für die Citrationen erhöht (Obergrenze: 500 mM)

Testbeispiel 5 (Löslichkeitstest 5)

Der Löslichkeitstest 1 wurde wiederholt, außer daß der modifizierte t-PA durch natürlichen t-PA ersetzt wurde, der in dem Herstellungsbeispiel 2 hergestellt worden war, und daß eine Pufferlösung verwendet wurde, die 40 mM Citronensäure enthielt. Bei dem Test wurde die Veränderung bei der Löslichkeit von natürlichem t-PA mit verschiedenen Konzentrationen von Nicotinamid, die mit der Pufferlösung kombiniert wurden, bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 5 gezeigt. Die grundlegende Pufferlösung, die in dem Test verwendet wurde, hatte die folgende Zusammensetzung:
Zusammensetzung der grundlegenden Pufferlösung: 40 mM Citratpuffer/0,01% Tween 80 (pH 7,2).
Die Pufferlösung wird als "Puffer A" bezeichnet. Tabelle 5
Bemerkung) NA stellt Nicotinamid dar
Von den in Tabelle 5 gezeigten Resultaten ist zu verstehen, daß die Löslichkeit auch von natürlichem t-PA durch die Zugabe von Nicotinamid verbessert wird. Es ist auch zu verstehen, daß die Löslichkeit von natürlichem t-PA im allgemeinen höher ist als die von modifiziertem t-PA.

Testbeispiel 6 (Gefriertrocknungstest 1)

Auf der Basis der bei den Löslichkeitstestbeispielen 1 bis 5 erhaltenen Resultate wurde ein gefriergetrocknetes Präparat von modifiziertem t-PA aus der folgenden Formulierung hergestellt.
Der Niederschlag an modifiziertem t-PA, der in gefrorenem Zustand aufbewahrt wurde, wurde in einer Pufferlösung aufgelöst, die die doppelte Konzentration hatte, um die t- PA-Konzentration auf 3 mg/ml einzustellen. Nach der Filtration und Sterilisation wurde die erhaltene Flüssigkeit in ein Glasröhrchen gegeben und dann mittels der folgenden Schritte gefriergetrocknet:
(1) Nach 2 Stunden Einfrieren bei einer Lagertemperatur von -50ºC und dann 1 Stunde bei -24ºC wurde das gefrorene Produkt 15 Stunden bei -50ºC dem vorläufigen Einfrieren unterworfen.
(2) Die Lagertemperatur wurde unter reduziertem Druck von 0,1 Torr auf -5ºC angehoben, um die primäre Trocknung vorzunehmen.
(3) Nach Abschluß der primären Trocknung wurde die Lagertemperatur auf 30ºC angehoben, um die sekundäre Trocknung vorzunehmen.
Formulierung:
Citratpufferlösung 100 mM
Nicotinamid 1,25%
Mannit 1%
Tween 80 0,01%
modifizierter t-PA 1,5 mg/ml
(pH 5,6)
Das so erhaltene gefriergetrocknete Präparat wurde in Wasser für die Injektion aufgelöst. Bei diesem Schritt wurde das gefriergetrocknete Präparat unmittelbar in Wasser aufgelöst, um eine transparente Lösung zu ergeben. Bei der erhaltenen Injektionslösung blieben die Aktivität des modifizierten t-PA und die normale Proteinstruktur erhalten. Von den Resultaten von Testbeispiel 6 ist es offensichtlich, daß das gefriergetrocknete Präparat an modifiziertem t-PA mit einer hohen Konzentration produziert werden kann.
Derselbe Test wie der vorstehend beschriebene wurde wiederholt, außer daß eine 40 mM Citratpufferlösung verwendet wurde. Es wurden ähnliche Effekte wie die vorstehend beschriebenen erhalten.

Testbeispiel 7 (Stabilitätstest 1 einer gefriergetrockneten Probe)

Die bei Testbeispiel 6 erhaltene gefriergetrocknete Probe wurde bei 60ºC für einen vorbestimmten Zeitraum stehen gelassen, um ihre Stabilität zu überprüfen. Die Stabilität wurde auf der Basis der Verschlechterung der hydrolytischen Aktivität gegenüber einem synthetischen Substrat (S-2288) und der Persistenz des Hauptpeaks bei der Anionenaustauscher (DEAE)-HPLC-Analyse bewertet.
Die hydrolytische Aktivität gegenüber dem synthetischen Substrat wurde gemäß Pharmacopeial Previews, S. 1223, Nov.-Dec. (1990) bestimmt. Bei der Analyse gemäß der Anionenaustauscher-HPLC wurde eine Anionenaustauschersäule (DEAE-5PW; ein Produkt von Tosoh Corporation) und 10 mM Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) als mobile Phase verwendet. Die Gradientenelution wurde mit einem Elutionsmittel durchgeführt, das 0,2 M Natriumchlorid enthielt.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
Von den in Tabelle 6 gezeigten Resultaten kann man sehen, daß Nicotinamid nicht nur bei der Solubilisierung von t-PA wirksam ist, sondern auch bei der Stabilisierung des gefriergetrockneten Zustands. Es ist daher möglich, unter Verwendung der Nicotinamid enthaltenden medizinischen Herstellung ein sehr stabiles Präparat zu produzieren.

Testbeispiel 8 (Stabilitätstest 1 einer flüssigen Herstellung)

Der modifizierte t-PA wurde in dem Nicotinamid enthaltenden Puffer aufgelöst, und die resultierende Lösung wurde bei 40ºC stehen gelassen, um die Stabilität zu überprüfen. Die Stabilität wurde auf die gleiche Weise wie bei Testbeispiel 7 bewertet. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
Von den in Tabelle 7 gezeigten Resultaten kann man sehen, daß die Eigenschaften der Nicotinamid enthaltenden medizinischen Zusammensetzung stabil gehalten werden können, auch wenn die Zusammensetzung in flüssiger Form ist. Es wurde bei der Anionenaustauscher- HPLC-Analyse insbesondere bestätigt, daß das Anwachsen des modifizierten Produkts durch Erhitzen inhibiert wird und der Hauptpeak erhalten bleibt.
Dieser Effekt wurde auch erhalten, wenn die Citratpufferlösung verwendet wurde.
In der vorliegenden Erfindung werden die Löslichkeit und die Stabilität von t-PA unter Verwendung von t-PA in Kombination mit Nicotinamid oder einem Derivat davon verbessert. Somit ist die vorliegende Erfindung wirksam bei der Bereitstellung eines klinisch verwendbaren t-PA-Präparats wie eines gefriergetrockneten t-PA-Präparats.

Claims

1. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung, umfassend einen Gewebeplasminogenaktivator und Nicotinamid oder ein Derivat davon.

2. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Gewebeplasminogenaktivator ein modifizierter Gewebeplasminogenaktivator ist.

3. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei der modifizierte Gewebeplasminogenaktivator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(1) modifiziertem t-PA, erhalten durch Ersetzen von Val in der Position 245 von t-PA durch Met;

(2) modifiziertem t-PA, erhalten durch Ersetzen von Cys in der Position 84 von t-PA durch Ser;

(3) modifiziertem t-PA, erhalten durch teilweise Deletion der F- und G- Domänen von t-PA und Ersetzen von Asn in der Position 117 durch Glu;

(4) modifiziertem t-PA, erhalten durch Deletion der K1-Domäne von t-PA und Ersetzen von Arg in der Position 275 durch Glu; und

(5) modifiziertem t-PA, erhalten durch Deletion der F-, G- und K1-Domänen von t-PA.

4. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Gewebeplasminogenaktivator in einer Menge von 0,005 bis 1 Gewichtsprozent bezogen auf die medizinische Zusammensetzung enthalten ist.

5. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung ach Anspruch 4, wobei der Gewebeplasminogenaktivator in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent bezogen auf die medizinische Zusammensetzung enthalten ist.

6. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Gewebeplasminogenaktivator in einer Menge von 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent bezogen auf die medizinische Zusammensetzung enthalten ist.

7. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nicotinamid oder das Derivat davon in einer Konzentration von 0,1 bis 50% (Gew./Vol.) enthalten ist.

8. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Nicotinamid oder das Derivat davon in einer Konzentration von 0,3 bis 5% (Gew./Vol.) enthalten ist.

9. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, welche zusätzlich Citronensäure enthält.

10. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Citronensäure in einer Konzentration von 10 bis 500 mM enthalten ist.

11. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Citronensäure in einer Konzentration von 10 bis 50 mM enthalten ist.

12. Gewebeplasminogenaktivator enthaltende medizinische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welche ein gefriergetrocknetes Präparat ist.

11. Verfahren zum Lösen eines Gewebeplasminogenaktivators, wobei Nicotinamid oder ein Derivat davon in ein den Gewebeplasminogenaktivator enthaltendes Medium gegeben wird, um die Löslichkeit des Gewebeplasminogenaktivators zu verbessern.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Gewebeplasminogenaktivator ein modifizierter Gewebeplasminogenaktivator ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der modifizierte Gewebeplasminogenaktivator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(3) modifiziertem t-PA, erhalten durch teilweise Deletion der F- und G- Domänen von t-PA und Ersetzen von Asn an der Position 117 durch Glu;

(4) modifiziertem t-PA, erhalten durch Deletion der K1-Domäne von t-PA und Ersetzen von Arg an der Position 275 durch Glu; und

(5) modifiziertem t-PA, erhalten durch Deletion der F-, G- und K1- Domänen von t-PA.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Gewebeplasminogenaktivator in einer Menge von 0,005 bis 1 Gewichtsprozent bezogen auf die medizinische Zusammensetzung enthalten ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Gewebeplasminogenaktivator in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent bezogen auf die medizinische Zusammensetzung enthalten ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei das Nicotinamid oder das Derivat davon in einer Menge von 0,1 bis 50% (Gew./Vol.) zugegeben wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei zusätzlich Citronensäure zugegeben wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Citronensäure in einer Konzentration von 10 bis 500 mM zugegeben wird.