DE69029765T2

DE69029765T2 - Stabilisierung von hochgereinigten Proteinen

Info

Publication number: DE69029765T2
Application number: DE69029765T
Authority: DE
Inventors: Michael H Coan; Vivian W Lee
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1989-07-24
Filing date: 1990-07-11
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: GR3022614T3; ES2097120T3; DK0410207T3; DE69029765D1; EP0410207A3; JPH0358998A; ATE148165T1; CA2021452A1; EP0410207A2; EP0410207B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Kohlenhydraten zur Stabilisierung von Faktor VIII:C und auf Zusammensetzungen, die Faktor VIII:C, der eine Reinheit von mindestens 60 % hat, Arzneimittelträgersubstanzen und Mannit enthalten.
Der Stand der Technik kann als in drei Kategorien aufgeteilt angesehen werden: (1) die Stabilisierung von ungereinigten Proteinen wie z. B. Faktor VIII-Konzentraten; (2) die Stabilisierung von stark gereinigten Proteinen; und (3) andere Verwendungen von Kohlenhydraten wie Dextran oder Sorbit.
(1) Rock, Nr. 4 359 463, offenbart eine Stabilisierung von Faktor VIII-Aktivität in Vollblut oder Blutplasma durch Zusatz eines Antikoagulans, das mit Calcium einen Chelatkomplex bildet, z. B. Saure-Citrat-Dextrose (ACD acid citrate dextrose) oder Citrat-Phosphat-Dextrose (CPD). Heparin wird ebenfalls zugesetzt.
Mathews et al. offenbaren, Nr. 4 743 680, ein Verfahren einer Reinigung von Faktor VIII aus Plasma unter Verwendung einer Chromatographiesäule wie z. B. QAE-Sephadex, Polyelektrolyt- und Aminohexyl-Sepharose-Harze. Zucker, Polyalkohole und Aminosäure verstärken die selektive Bindung von Proteinen an diese Ionenaustauscher-Chromatographie-Medien. In einem Beispiel ist 1 M Sorbit in einem Puffer enthalten, der im Al(OH)&sub3;-Absorptionsschritt der Probe zugesetzt wird (Spalte 5, 1.63). Es können anstelle von Polyalkohol Zucker einschließlich Saccharose, Mannose und Dextran verwendet werden.
Rasmussan et al., Nr. 4 650 858, offenbaren die Herstellung einer hochreinen (50 E/mg) Faktor VIII-Präparation, in der ein PEG-Präzipitationsschritt eingesetzt wird, welcher die Verwendung eines "Einsalzagenzes", z. B. eine Aminosäure oder ein Kohlenhydrat beinhaltet. Geeignete Kohlenhydrate können Zuckeralkohole und Oligosaccharide umfassen.
Thomas, Nr. 4 089 944, offenbart ein Verfahren der Verbesserung der Löslichkeit einer Faktor VII-Zusammensetzung durch Zusatz von 0 bis 5 g Dextrose pro 100 ml einer auf die ursprüngliche Konzentration verdünnten Lösung. Disaccharide und kurzkettige Oligosaccharide (Dextrine) können ebenfalls verwendet werden.
Winkelman, Nr. 4 789 733, offenbaren die Isolierung von Faktor VIII aus Plasma durch Präzipitation mit einem sulfatierten Polysaccharid, mit Heparin. Wie beschrieben, kann auch Dextransulfat verwendet werden.
Schwinn et al., Nr. 4 297 344, offenbaren eine Hitzebehandlung für Plasmaproteine einschließlich Faktor VIII. Eine Aminosäure und ein Monosaccarid, Oligosaccharid oder Zuckeralkohol werden zu einer wäßrigen Lösung gegeben, um das Protein (die Proteine) gegen Wärme zu stabilisieren. 20 bis 60 Gewicht/Gew.% Saccharose sind bevorzugt.
Fernandes et al., Nr. 4 440 679, offenbaren eine Hitzebehandlung von Plasmaproteinen (einschließlich Faktor VIII) in Gegenwart eines Polyols als Stabilisierungsmittel für das Sol. Das bevorzugte "Polyol" ist Saccharose; Polyole mit höherem Molekulargewicht wie z. B. Dextran, Stärke oder Glycogen sind für die Verwendung in den offenbarten Verfahren nicht vorteilhaft (Spalte 6, 1. 44).
Die EP Nr. 077 870 offenbart die Hitzebehandlung von Faktor VIII in Gegenwart von 10 % (Gewicht/Volumen) oder mehr mindestens eines Stabilisators, der aus der aus neutralen Aminosäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden und Zuckeralkoholen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und 10 % oder mehr einer Carbonsäure mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, als Hilfsstabilisator.
Naito et al., Nr. 4 446 134, offenbaren eine Hitzebehandlung von Faktor VIII-Konzentraten mit 10 bis 50 % (Gewicht/Volumen) eines Stabilisators, der aus der aus neutralen Aminosäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden oder Zuckeralkoholen bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Eine Carbonsäure wird als Hilfsstabilisator verwendet.
Ng et al., Thromb. Res. 39:439-447 (1985) offenbaren ein Verfahren der Hitzebehandlung von Faktor VIII in Lösung, welche Saccharose als Stabilisator verwendet.
Foster et al., Vox Sang. 55:81-89 (1988) diskutieren die Stabilität von Faktor VIII während der Verarbeitung von Faktor VIII:C aus Humanplasma. Verluste während der Bearbeitungsschritte wurden durch Zusatz von Calcium minimalisiert. Das Calcium verhinderte eine Inaktivierung von Faktor VIII:C, die durch Natriumcitrat, das während des Fraktionierungsverfahrens zugesetzt wurde, verursacht wurde. Es werden verschiedene Stabilisierungsmittel (z. B. Heparin, Lycin und Zucker) aufgeführt.
Die EP-A2-0 306 968 offenbart die Verwendung von Sorbit, Mannit, Dextrose, Maltose, Glycerin, menschlichem Serumalbumin oder einer Kombination der genannten als Stabilisatoren für rekombinanten menschlichen Faktor VIII: C.
Die EP-A1-0 314 095 offenbart die Stabilisierung von Faktor VIII, der eine Reinheit von mehr als 60 % hat, in einer wäßrigen Lösung, die Natriumund Calciumchlorid, Histidin oder Lysin und wahlweise bis zu 10 % Mannit, Saccharose oder Maltose enthält.
(2) In Bezug auf hochgereinigte, therapeutisch wirksame Proteine wird ganz allgemein davon ausgegangen, daß von rekombinanter DNA abgeleitete Proteine ohne Rücksicht darauf, ob sie von bakteriellen, Hefe- oder Säugetierzellen stammen, wie auch monoklonale Antikörper bis zu mindestens 99%iger Reinheit gereinigt sein müssen, wenn sie zur Verwendung am Menschen bestimmt sind. Im allgemeinen wird menschliches Serumalbumin zugesetzt, um solche gereinigten Proteine vor Denaturierung oder Aggregation, die in hochreiner Lösung auftreten können, zu stabilisieren. Die Verwendung von menschlichem Serumalbumin als Stabilisator hat hinsichtlich der Kosten einen Nachteil. Außerdem ist Albumin in Verbindung mit der Verwendung von therapeutischen Proteinen nicht zufriedenstellend, da dort der wahrgenommene Vorteil einer Verwendung von Proteinen, die aus rekombinanter DNA stammen, anstelle von Proteinen, die aus Plasma stammen, stark vermindert wird, wenn Albumin, das aus Plasma abgeleitet ist, in der endgültigen Formulierung im Behälter enthalten ist.
Plan et al., Nr. 3 992 367, offenbart ein gereinigtes Albumin, das in Gegenwart von Caprylsäure, welche zur Hitzestabilisierung zugesetzt wird, erhitzt wird.
Vemura et al., Nr. 4 361 652, offenbaren die Hitzestabilisierung von Plasminogen, das von Plasma abgeleitet ist, mit anorganischen Salzen wie z. B. NaCl.
Kwan, Nr. 4 496 537, offenbart die Stabilsierung von alpha-Interferon-Präparationen während des Lyophilisierungsschrittes durch den Zusatz von Glycin oder Alanin. 1 bis 10 mg/ml Albumin werden als Stabilisator zugesetzt.
Mon et al., Nr. 4 505 893, offenbaren einen gereinigten Plasminogenaktivator, der mit 1 bis 10 mg/ml Albumin stabilisiert ist.
Murakimi et al., Nr. 4 552 760, offenbaren ein Verfahren zur Stabilisierung eines Gewebe-Plasminogenaktivators durch den Zusatz von Gelatine.
Es ist auch bekannt, daß Albumin Arzneimittel und organische Verbindungen wie z. B. Thromboxan stabilisiert; siehe Folco et al., FEBS Letters 83(2):321-324 (1977). Außerdem ist bekannt, daß hochgereinigte, von Plasma abgeleitete Faktor VIII:C-Produkte mit Albumin stabilisiert werden.
(3) Hinsichtlich der Verwendung von Kohlenhydraten offenbaren Battle et al., Thromb. Haemot. 54(3):697-699 (1985), daß eine Infusion von 500 ml 6%igem Dextran 70 (Molekulargewicht 70.000) bei normalen Erwachsenen zu einer erkennbaren Verminderung bei den vWF-Multimeren führt. Der maximale Effekt trat bei etwa 6 Stunden auf. Bei etwa 6 Stunden war auch die Faktor VIII: C-Aktivität herabgesetzt.
Artusson et al., J. Pharm. Sci. 73(11):1507-1513 (1984), berichten, daß biologisch abbaubare Mikropartikel aus vernetzter Stärke als Träger für Proteine und Arzneimittel mit niedrigem Molekulargewicht verwendet werden können. Die verwendete Stärke war acryloliertes Maltodextrin oder acrylolierte Hydroxyethylstärke. Die Partikel wurden zur Immobilisierung von Kohlenstoff-Anhydrase verwendet; und es wird abschließend festgestellt, daß die Partikel als Arzneimittelträgersystem verwendbar sein können.
Aberg et al., Ann. Surg. 189(2):243-247 (1979), beschreibt eine Untersuchung über die Wirkung einer Infusion von 500 ml 6%igem Dextran 70 auf die Faktor VIII-Aktivität. Die Untersuchung ist ein Versuch, den Mechanismus des Effekts von Dextran auf die Thrombozytenfunktion zu klären. Faktor VIII-Antigenspiegel waren nach einer Dextraninfusion merklich erniedrigt.
Raasch, Am. J. Hosp. Pharm. 36:89-91 (1979), berichtet, daß eine Infusion von Dextran 70 in einigen Fällen zu einer reduzierten Faktor VIII- Aktivität führen kann.
Zusammenfassend wird festgestellt, daß der oben beschriebene Stand der Technik die Verwendung verschiedener Kohlenhydrate offenbart, die zu finalen Proteinlösungen in Zwischenproduktreinheit in Behältern zur Stabilisierung des Proteins während einer Hitzebehandlung gegeben werden. Hoch gereinigte Proteine aus einer Zellkultur werden während des Lyophilisierungsschritts mit Albumin oder Verbindungen wie Gelatine, Glycin, Alanin, NaCl, usw. stabilisiert. Kohlenhydrate mit hohem Molekulargewicht können als Arzneimittelträgerstoffe eingesetzt werden.
Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, eine Verbindung bereitzustellen, die als Stabilisator während der normalen Reinigungsschritte für Faktor VIII:C, der aus einer Zellkultur gewonnen wird, zugesetzt werden kann und die Stabilität, d. h. molekulare Integrität und biologische Aktivität, des gereinigten Proteins aufrechterhalten wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Stabilisators, von dem bekannt ist, daß er für eine intravenöse Verwendung akzeptabel ist, der aber nicht aus einer biologischen Quelle (d. h. Plasma) stammt.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Stabilisators, der während des Reinigungsverfahrens als Teil einer finalen Produktformulierung zurückbehalten werden kann.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer stabilisierten Zusammensetzung, die Faktor VIII:C enthält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung von ausgewählten Kohlenhydraten zur Stabilisierung von Proteinen. Dabei können die oben angegebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung gelöst werden, indem eine Zusammensetzung bereitgestellt wird, die
a) therapeutisch aktiven rekombinanten Faktor VIII:C, der eine Reinheit von mindestens etwa 60 % Gesamtprotein hat;
b) 1 bis 5 % Arzneimittelträgersubstanzen, die aus der aus Glycin, Calciumchlorid und Natriumchlorid bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und
c) etwa 1 bis 50 mg Mannit pro ml Endbehälterlösung enthält.
Ein wichtiger Vorteil bei der Verwendung von Mannit besteht darin, daß erwartet wird, daß Mannit in hohem Maße zur Injektion bei menschlichen Lebewesen geeignet ist.
Mannit, Molekulargewicht 182, kann folgendermaßen dargestellt werden:
Mannit wird in verschiedenen Verfahrensschritten erneut zugesetzt, ist aber relativ billig und weist hohe physiologische Sicherheit und Toxizitätsprofile auf.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der, daß das Protein, das zu stabilisieren ist, hohe molekulare Integrität hat, was zur Herstellung eines meßbaren biologischen Aktivität erforderlich ist. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält als Protein, das zu stabilisieren ist, Faktor VIII:C, dessen Koagulationsfaktor in natürlichem Zustand extrem groß ist (annähernd 300 kD) und das äußerst labil ist und in hochgereinigten Präparationen als Gemisch aus Peptiden mit 40 bis 210 kD nachgewiesen wird. Die Integrität des Faktors VIII:C kann durch Untersuchung dieser Peptidmischung an Gelen beurteilt werden.
Die vorliegende Erfindung faßt die Verwendung von 1 bis 50 mg/ml, vorzugsweise 5 bis 10 mg/ml Mannit als Stabilisator ins Auge.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Rekombinanter Faktor VIII:C (rFVIII) wurde aus BHK-21-Zellen hergestellt, in die cDNA, die menschlichen Faktor VIII kodiert, eingeschleust worden war (Vehar et al., Nature 312:337-342 (1984), Wood et al., Nature 312:330-337 (1984)).
Geklärtes Gewebekulturfluid wurde auf eine DEAE-Sepharosesäule aufgetragen, welche wie folgt äquilibriert, gewaschen und eluiert wurde: Äquilibrierung und Waschen wurde mit 0,02 M Imidazol, 0,01 M CaCl&sub2;, 0,075 M NaCl, pH 6,9 durchgeführt. Elution wurde mit 0,02 M Imidazol, 0,01 CaCl&sub2;, 0,25 M NaCl, pH 6,9 durchgeführt.
Immunabsorption an einem monoklonalen Antikörper (MAb), der rFVIII (C7F7) bindet, wurde mit immobilisiertem C7F7-Antikörper durchgeführt (siehe Eaton et al., Biochemistry 25(2):505-512 (1986), EPO 160 457).
Die Säule wurde wie folgt äquilibriert, gewaschen und eluiert: Äquilibrierung und Waschen wurde mit 0,02 M Imidazol, 0,01 M CaCl&sub2;, 0,5 M NaCl, pH 6,9 durchgeführt. Elution erfolgte mit 0,02 M Imidazol, 1 M CaCl&sub2;, 0,7 M NaCl, pH 6,9.
C7F7-Eluat wurde auf eine Gelfiltrationssäule, Pharmacia, aufgetragen. Äquilibrierung und Waschen wurde mit 0,02 M Imidazol, 0,01 M CaCl&sub2;, 0,05 M NaCl, 0,01 % Tween 80, pH 6,9 durchgeführt.
Diafiltration und Ultrafiltration wurden unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle mit einer YM-30-Membran durchgeführt.
Glycin USP wurde von Sigma Chemical Corp. erhalten; CaCl&sub2; wurde von Fisher Scientific erhalten; NaCl wurde von J. T. Baker, USP erhalten; Albumin war ein pharmazeutisch reines 25%iges Albumin, Plasbumin, Cutter Biological; und Sorbit und Mannit waren analysenrein und wurden von Baker Chemical Co. bezogen.
Dextran 70 ist als die Fraktion von Dextran, einem verzweigten Polysaccharid, das aus Glucoseeinheiten besteht, definiert, die ein durchschnittliches Molekulargewicht von 70.000 hat. (Physician's Desk Reference, 1989, 43. Ausgabe. s. 1630). Dextran 70 wurde von Pharmacia erhalten.
Faktor VIII:C-Aktivität wurde nach dem Einstufen-Gerinnungstest gemessen, wobei der WHO-Mega-Standard verwendet wurde. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Koagulationsaktivität (Gerinnungsaktivität) von Faktor VIII (F.VIII) in 1 ml Normalplasma. Die spezifische Aktivität ist definiert als Aktivitätseinheiten pro Gesamtproteinmasse. Faktor VIII kann bei einer spezifischen Aktivität von 5000 iE/mg als praktisch rein bezeichnet werden. Reinheit kann auch antigenetisch definiert werden. F.VIII kann durch Zusatz der vorliegenden Kohlenhydrate auf mehr als 60 % Reinheit stabilisiert werden.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel erläutert eine Untersuchung verschiedener Verbindungen, die zur Stabilisierung von F.VIII während des Schritts des Gefriertrocknens verwendet werden.
F.VIII aus geklarten Gewebekulturfluid (tcf) wurde von einer DEAE-Ionenaustauschersäule eluiert. Es wurde ein DEAE-Pool erhalten, und das Protein wurde durch einen monoklonalen Anti-F.VIII-Antikörper, der als C7F7 bezeichnet wird, gereinigt (40 ml Säulenvolumen). Diesem Eluat wurde Glycerin bis 15 % zugesetzt. Dann wurde nach einer G-25-Gelfiltration zur Entsalzung (mit einer 600-ml-Säule) der Pool auf einen Gehalt von 0,275 M Glycin eingestellt. Danach wurden drei aliquote Teile zu 45 ml entnommen. Zu dem aliquoten Teil Nummer 1 wurde Albumin in einer Menge von 1 mg/ml zugesetzt. Dies war in jedem Experimentensatz eine Kontrolle oder ein Standard. Die Wiedergewinnung der F.VIII-Lösung durch jeden Schritt wurde auf die Albuminkontrolle bezogen, die auf 1,0 festgesetzt wurde. Dem zweiten Aliquotenteil und/oder einem dritten Aliquotenteil wurde eine Arzneimittelträgersubstanz und/oder eine andere Konzentration, die zu untersuchen waren, zugesetzt. Diese umfaßten Dextran (Molekulargewicht 10.300), Sorbit, Mannit, Dextrose und Methylcellulose. Es gab eine weitere Kontrolle ohne Zusatz.
Dann wurde jeder aliquote Teil von 45 ml durch Ultrafiltration mit einer Rührzelle und YM-30-Membran 3-fach konzentriert. Die 15 ml wurden dann in aliquoten Teilen von 5 ml gefriergetrocknet. Proben, die nach Konzentrierung und nach Gefriertrocknung entnommen wurden, werden in der Tabelle mit der Albuminkontrolle (die als 1,0 angenommen wird) verglichen.
Die Daten in Tabelle 1 unten zeigen, daß kein Zusatz an Stabilisator zu fast keiner Wiedergewinnung führt, und daß Mannit, Sorbit und Dextran alle helfen, die Faktor VIII-Aktivität während des Schritts des Gefriertrocknens zu erhalten. Die erläuterten Stabilisatoren kommen in vorteilhafterweise Albumin gleich. Es sollte noch betont werden, daß diese Resultate auch unter Verwendung von 15 % Glycerin, das auch als Stabilisator angesehen wird, erhalten wurden. Es wurden Resultate erhalten, die denen der Verwendung von Glycerin überlegen waren. TABELLE 1

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel verwendet Dextran 70, das im vorangehenden Beispiel als Gefriertrocknungsstabilisator identifiziert wurde.
60 ml C7F7-Eluat wurden nach DEAE-Chromatographie von geklärtem Gewebekulturfluid wie im vorangehenden Beispiel erhalten. Dem C7F7-Eluat wurde Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15 % zugesetzt. Dieses wurde dann in zwei aliquote Teile geteilt. Einem aliquoten Teil wurde Albumin bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt, dem anderen wurde Dextran 70 bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Jeder aliquote Teil wurde, wie es oben beschrieben ist, auf eine 150-ml-G-25-Gelfiltrationssäule aufgetragen, wobei die Puffer- und Salzkonzentration in einen Wert geändert wurden, der eine F.VIII-Bindung an die nächste C7F7-Säule erlaubte. Jeder Pool aus diese Säule wurde dann auf eine andere 8-ml-C7F7-Säule aufgebracht. Der erste aliquote Teil produzierte 13 ml Eluat. Es wurden 52 µl 25%iges Albumin zugesetzt, was 1 mg/ml Albumin ergab. Der zweite aliquote Teil produzierte 23 ml Eluat; 442 µl 6%iges Dextran 70 wurden zu einer Enddetxtrankonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Zu jedem Eluat wurde Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15 % gegeben. Danach wurde eine zweite G-25-Säule unter Änderung des Puffers derart, daß er mit DEAE-Sepharose verträglich und bindungsfähig war, eingesetzt. Bei der Albuminkontrolle (erster aliquoter Teil) wurden 19 ml Eluat erhalten. Es wurden 0,3 ml 25%iges Albumin zur Erreichung einer Endkonzentration von 4 mg/ml zugesetzt. In gleicher Weise wurden dem Pool, der aus dem zweiten aliquoten Teil resultierte, 1,5 ml 6%iges Dextran zu 21,5 ml Pool unter Erreichung einer Endkonzentration von 4 mg/ml Dextran zugesetzt. Dann wurde jede Probe mit einer YM-30-Membran gegen Puffer mit 5 Volumenänderungen diafiltriert und durch Konzentrierung oder Verdünnung auf 20 ml eingestellt. Dieses Material wurde dann in einem Standardlabor-Gefriertrockner (Virtis Unitrap II bei -70ºC, 0,1 mm Hg) gefriergetrocknet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten angegeben. TABELLE 2
In Tabelle 2 werden die Ausbeuten als Schrittausbeute/Gesamtausbeute angegeben. In jedem Experiment war der Stabilisator mit 1 mg/ml während der Bearbeitung enthalten, wobei sich die Menge auf 4 mg/ml für die Gefriertrocknung erhöhte. Dextran war im Vergleich zu Albumin sowohl während der Bearbeitung als auch während der Gefriertrocknung besser.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel reproduziert das Experiment von Beispiel 2, allerdings mit unterschiedlichen Stabilisatorkonzentrationen.
In diesem Experiment wurden zwei aliquote Teile von 31,5 ml des ersten C7F7-Eluats erhalten und in der 3. DEAE-Eluatstufe entweder mit Dextran oder Albumin behandelt. Dann wurden von dem aliquoten Teil 1 22 ml Eluat mit 0,44 ml 25%igem Albumin unter Erhalt einer Konzentration von 5 mg/ml vermischt. Das Eluat des aliquoten Teils 2 wurde mit 1,73 ml 6%igem Dextran (26 ml Eluat) unter Erhalt einer Konzentration von 4 mg/ml vermischt. Jedes Eluat wurde dann gegen 5 Volumenpuffer diafiltriert, jeweils auf 15 ml konzentriert und gefriergetrocknet. Die Daten sind in Tabelle 3 angegeben. TABELLE 3
Diese Daten zeigen die Vergleichbarkeit von Dextran und Albumin bei 4 mg/ml bzw. 5 mg/ml.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel richtet sich auf finale Formulierungen in einem Behälter.
Die folgende Tabelle 4 zeigt eine typische finale Formulierung in einem Behälter, in der Albumin durch Dextran ersetzt wurde. Es können andere Arzneimittelträgersubstanzen in anderen Konzentrationen verwendet werden. Arzneimittelträgersubstanzen und Stabilisatoren werden in der finalen Massestufe kurz vor dem Einfüllen in den Behälter eingestellt. Die Behälter werden dann gefriergetrocknet. TABELLE 4
Eine andere finale Formulierung in einem Behälter enthält anstelle von Albumin oder Dextran Mannit oder Sorbit mit 5 bis 8 mg/ml. Die finale Formulierung in einem Behälter kann 50 mg/ml Stabilisator enthalten.
Mannit wird für diese Anwendung gegenüber Sorbit bevorzugt, da Sorbit unter Produktion von Fruktose metabolisiert wird und bei einigen Patienten Fruktose-Unverträglichkeit verursachen kann.

BEISPIEL 5

In diesen Untersuchungsreihen wurde Mannit im Zusammenhang mit der Behandlung eines zweiten DEAE-Pools, der sich an einer C7F7-Säule befand, verwendet. Dem Eluat (10 bis 15 ml) wurden 5 mg/ml Mannit zugesetzt. Dieses Eluat wurde auf eine CL6B-Gelfiltrationssäule gegeben, gesammelt, ultrafiltriert und diafiltriert (UF/DF) und gefriergetrocknet. In einigen Experimenten wurde Mannit dem Diafiltrationspuffer und/oder dem CL6B-Waschpuffer zu einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt. Die Resultate sind in der Tabelle 5 unten angegeben. TABELLE 5
Die Resultate werden als Prozente Schrittausbeute/Gesamtausbeute angegeben. Ein Sternchen (*) gibt einen Zusatz von Mannit in diesem Schritt an. Ausbeuten über 100 % resultieren aus Schwankungen bei den Untersuchungen.
Die Resultate zeigen, daß ein Zusatz von Mannit zu dem CL6B-Waschpuffer und dem UF/DF-Puffer für die Verfahrensausbeute wesentlich ist. Ein Zusatz von Mannit zu weiteren Puffern verbessert die Ausbeuten, und ein Zusatz von Mannit zu jedem Folgeschritt verbessert die Ausbeuten über das gesamte Verfahren drastisch. Die Mannitausbeute in diesen Untersuchungsreihen war vergleichbar mit der Ausbeute, die in Vergleichsuntersuchungen, in denen Albumin dem C7F7-Schritt zugesetzt wurde, beobachtet wurden. Untersuchungen mit Sorbit lieferten Resultate, die denen mit Mannit in Beispiel A vergleichbar waren. Repräsentative Ausbeuten mit Sorbit waren: Ausgangsmaterial, 100/100; C7F7, 91/91*; CL6B, 86/77*; UF/DF, 88/68*.

BEISPIEL 6

Ein gereinigter monoklonaler Maus-IgG-Antikörper gegen Tumornekrosefaktor wurde hinsichtlich der molekularen Integrität durch HPLC untersucht. Alle Proben wurden mit Glycin 0,27 M mit pH 4,0 hergestellt.
Die folgende Tabelle zeigt die Molekulargrößenverteilung nach Gefrieren und Auftauen. Die Zahlen sind %-Protein in verschiedenen HPLC-Peaks, die als hohes Molekulargewicht (Aggregate), IgG und niedriges Molekulargewicht (Fragmente) bezeichnet werden. TABELLE 6
Flüssige Kontrollen wurden nicht gefroren. Höchste Monomergehalte (IgG) wurden mit Dextran 5 mg/ml und Sorbit 5 oder 10 mg/ml gefunden. Sorbit oder Dextran hatten in einer Konzentration von 1 mg/ml geringe oder keine Schutzwirkung.
Es ist wichtig, zu betonen, daß alle Proben 0,27 M Glycin enthielten, welches bereits vorher als Stabilisator beschrieben wurde. Bedeutend bessere Resultate wurden erzielt, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen Proben zugesetzt wurden, die bereits Glycin enthielten.

DISKUSSION

Es ist wohl bekannt, das hochgereinigte Proteine äußerst instabil sind. In diesen Beispielen hat das verwendete rF.VIII im Schritt der Immunabsorption im allgemeinen eine spezifische Aktivität von 2000 bis 5000, was einer Reinheit von grob 60 bis 99 % entspricht. Die erfindungsgemäßen Stablisatoren können mit anderen hochgereinigten Proteinen, die biologische Aktivität aufweisen wie z. B. monoklonale Antikörper, verwendet werden. Weitere gereinigte, biologisch aktive Proteine, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, können z. B. die folgenden von rDNA abgeleiteten Proteine umfassen: alpha-, beta- und gamma-Interferon, Plasminogenaktivator des Gewebetyps, Tumornekrosefaktor, menschliches Wachstumshormon, Erythropoietin, koloniestimulierende Faktoren, Faktor IX, Protein C, Superoxiddismutase, IL-2, epidermaler Wachstumsfaktor, usw.
Die hier offenbarten Verfahrensschritte sind nur repräsentative Schritte einer typischen Proteinreinigung, d. h. Anionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Ultrafiltration, usw. Es könnten auch andere Schritte wie z. B. Protein A-Chromatographie (zur Reinigung von IgG's), HPLC, usw. eingesetzt werden. Keine besondere Bedeutung ist mit der Verwendung des eingesetzten monoklonalen Anti-F.VIII:C- C7F7-Immuno-Reinigungsantikörper verknüpft.; es könnten ebenso gut andere MAb's verwendet werden.
Unter den besonderen eingesetzten Stabilisatoren ist Mannit am bevorzugtesten, da erwartet wird, daß es von menschlichen Körpern gut vertragen wird. Dextran oder dgl können bevorzugt werden, da sein hohes Molekulargewicht zuläßt, daß es mit einem interessierenden Protein hohen Molekulargewichts z. B. mit F.VIII:C durch das Reinigungsverfahren getragen wird. F.VIII:C hat in seiner gereinigten Form im allgemeinen einen Molekulargewichtsbereich, in dem 80 bis 90 kD Ketten vorherrschend sind. Damit paßt das verwendete Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 kD fast zu dem Molekulargewicht der Proteinketten, die zu stabilisieren sind.

Claims

1. Zusammensetzung, die

a) therapeutisch wirksamen rekombinanten Faktor VIII:C, der eine Reinheit von mindestens etwa 60 % Gesamtprotein hat;

b) 1 bis 5 % Arzneimittelträgersubstanzen, die aus der aus Glycin, Calciumchlorid und Natriumchlorid bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und

c) etwa 1 bis 50 mg Mannit pro ml Endbehälterlösung enthält.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Faktor VIII:C eine Reinheit von mindestens etwa 99 % hat.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Mannitmenge etwa 5 bis 10 mg/ml Endbehälterlösung ist.

4. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei Stufen enthalten sind, in denen man:

(A) den genannten Faktor VIII:C auf mindestens 60% seiner theoretischen maximalen spezifischen Aktivität reinigt; und

(B) ein Stabilisiermittel zufügt, welches Mannit ist, und zwar in einer solchen Menge, daß die vorhandene Menge des Stabilisiermittels in der endgültigen flüssigen Formulierung 1 bis 50 mg/ml für jede 100 bis 300 Einheiten/ml Endbehälter-Faktor VIII:C-Aktivität beträgt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei man ferner die Zusammensetzung gefriertrocknet.

6. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 4 und 5, wobei das Stabilisiermittel in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/ml zugefügt ist.

7. Verfahren gemäß jedem der Ansprüche 4 und 6, wobei der genannte Faktor VIII:C auf mindestens 99% seiner theoretischen maximalen spezifischen Aktivität gereinigt ist.