KR20220029733A - 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) - Google Patents
응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220029733A KR20220029733A KR1020227003739A KR20227003739A KR20220029733A KR 20220029733 A KR20220029733 A KR 20220029733A KR 1020227003739 A KR1020227003739 A KR 1020227003739A KR 20227003739 A KR20227003739 A KR 20227003739A KR 20220029733 A KR20220029733 A KR 20220029733A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leu
- ser
- val
- glu
- gly
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/37—Factors VIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Abstract
본 발명은
응고 인자 VIII (FVIII), 및 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서, FVIII의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 조성물 중에 상기 폴리펩타이드 대 FVIII의 몰비는 20초과이다.
Description
본 발명은 응고 인자 VIII(FVIII)의 시험관내 안정성을 개선시키기 위한 방법, 특히 응고 인자 VIII(FVIII)의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
인자 VIII (FVIII)는 혈액 응고를 유도하는 반응 캐스케이드에서 조인자로서 작용하는, 혈장내에서 발견되는 단백질이다. 혈중 FVIII 활성의 양의 결핍은 주로 남성에 영향을 미치는 유전적 병태인 혈우병 A로서 공지된 응고 장애를 유발한다. 혈우병 A는 현재 사람 혈장으로부터 유래되고 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된 FVIII의 치료학적 제제로 치료된다. 일반적으로, 상기 제제는 출혈 에피소드에 응답하여 투여되거나(주문형 치료요법) 제어되지 않는 출혈을 예방하기 위해 (예방) 빈번한 규칙적 간격으로 투여된다.
FVIII은 치료학적 제제에서 상대적으로 불안정한 것으로 공지되어 있다. 혈장에서, FVIII는 통상적으로 미성숙한 분해로부터 FVIII를 보호하는 것으로 사료되는 폰 빌레브란트 인자 (VWF)인 또 다른 혈장 단백질과 복합체화된다. 현재 판매되는 FVIII 제제는 흔히 제조 공정 동안에 및 저장 동안에 FVIII를 안정화시키기 위해 알부민 및/또는 고유 VWF의 용도에 의존한다.
알부민 또는 고유 VWF 없이 (또는 상대적으로 저수준의 이들 부형제와 함께) FVIII를 제형화시키기 위한 여러 시도가 보고되었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,565,427호 (EP 0 508 194)는 염화나트륨 및 슈크로스와 같은 부형제에 추가로 특정 조합의 세제 및 아미노산, 구체적으로 아르기닌 및 글리신을 함유하는 FVIII 제제를 기재하고 있다.
미국 특허 제5,763,401호 (EP 0 818 204)는 또한 15-60 mM 슈크로스, 최대 50 mM NaCl, 최대 5 mM 염화칼슘, 65-400 mM 글리신, 및 최대 50 mM 히스티딘을 포함하는 치료학적 FVIII 제형을 기재하고 있다.
미국 특허 제5,733,873호 (EP 627 924)는 0.01-1 mg/ml의 계면활성제를 포함하는 제형을 기재하고 있다. 저농도 또는 고농도의 염화나트륨을 사용하기 위한 또 다른 시도가 또한 보고되었다. 미국 특허 제4,877,608호 (EP 0 315 968)는 상대적으로 저농도의 염화나트륨, 즉, 0.5 mM 내지 15 mM NaCl을 갖는 제형을 기재하고 있다. 한편, 미국 특허 제5,605,884호 (EP 0 314 095)는 상대적으로 고농도의 염화나트륨을 갖는 제형의 용도를 교시하고 있다.
추가로 FVIII 제형은 문헌(참조: WO 2010/054238, EP 1 712 223, WO 2000/48635, WO 96/30041, WO 96/22107, WO 2011/027152, EP 2 361 613, EP 0 410 207, EP 0 511 234, US 5565427, EP 0 638 091, EP 0 871 476, EP 0 819 010, US 5874408, US 2005/0256038, US 2008/0064856, WO 2005/058283, WO 2012/037530 및 WO 2014/026954)에 기재되어 있다.
VWF-유래된 폴리펩타이드, 특히, VWF 단편은 생체내에서 FVIII의 생체이용률(bioavailability)을 개선시키는 것으로 보고되었다. WO 2013/106787 A1은 FVIII 단백질 및 특정 VWF 단편을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다. FVIII 및 VWF-단편의 이들 키메라 이종-이량체는 1:1의 VWF 대 FVIII의 고정된 몰비를 갖는다.
WO 2014/198699 A2 및 WO 2013/083858 A2는 VWF 단편 및 혈우병의 치료시의 이들의 용도를 기술한다. FVIII의 생체이용률은 유사한 몰량의 VWF 단편을 사용한 혈관외 동시-투여(co-administration)시 유의하게 개선될 수 있음이 밝혀졌다. WO 2018/087271 A1 및 WO 2016/188907 A1은 혈우병의 치료 또는 예방을 위한 절단된 VWF 폴리펩타이드를 기재하고 있다. WO 2016/000039 A1, WO 2017/117630 A1 및 WO 2017/117631 A1은 FVIII에 결합할 수 있는 변형된 VWF 폴리펩타이드를 기재한다.
WO 2011/060242 A2는 소정 VWF 단편 및 항체 Fc 영역을 포함하는 융합 폴리 펩타이드를 개시하고, 10:1 이하의 FVIII에 대한 VWF 단편의 특정 몰 비를 제시한다. 상기 Fc-융합 작제물과 관련하여 추가로 어떠한 생체내 데이터가 제공되지 않는다.
문헌[참조: Yee et al. (2014) Blood 124(3):445-452]은 면역글로불린 G1의 Fc 부분에 융합된 D'D3 도메인을 함유하는 VWF 단편이 VWF-결핍 마우스에서 내인성 인자 VIII를 안정화시키는데 충분함을 밝힌다. 따라서, VWF-결핍 마우스에서, FVIII의 내인성 발현율은 증가되거나 내인성으로 발현된 FVIII의 제거율은 감소되었다. 그러나, VWF D'D3-Fc 융합 단백질은 FVIII-결핍 마우스에 주입되는 경우에 현저하게 연장된 생존률을 나타냈지만, VWF D'D3-Fc 융합 단백질은 동시-주입된 FVIII의 생존률을 연장시키지 않았다.
WO 2015/185758 A2는 FVIII 및 하나 이상의 VWF 펩타이드의 복합체를 포함하는 조성물을 기재하고 있고, 여기서, 상기 VWF 펩타이드는 사람 VWF의 적어도 아미노산 764 내지 1035 및 1691 내지 1905(UniProtKB-P04275)를 포함하지만 사람 VWF의 아미노산 2255 내지 2645를 포함하지 않는다. 사람 VWF의 아미노산 764 내지 2128 (“단편 III”)로 이루어진 VWF 단편은 에스. 아우레우스(S. aureus) V-8 프로테아제를 사용한 혈장 유래된 VWF의 분해에 의해 제조되었다. 상기 단편은 콜라겐 III 및 헤파린에 결합한다. 단편 III는 단편 III 단량체 서브유닛을 기준으로 계산하여 5배 몰 과량으로 첨가되는 경우 용액 중에 rFVIII를 안정화시켰다. WO 2015/185758 A2는 아미노산 1691 내지 1905가 부재인 VWF 펩타이드에 대한 안정화 효과를 보여주지 않는다. WO 2015/185758 A2는 20 초과의 임의의 비율의 VWF 펩타이드 대 FVIII을 기재하고 있지 않다.
시험관내에서 FVIII 제제를 안정화시키기 위한 수단 및 방법이 계속적으로 요구되고 있다.
발명의 요약
본 출원의 발명자들은 놀랍게도 VWF의 D’D3 도메인을 포함하는 VWF 단편이 20초과의 몰비의 VWF 단편 대 FVIII에서 시험관내 FVIII의 안정성을 증가시킴을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 하기의 항목 [1] 내지 [80]에 정의된 주요 요지에 관한 것이다:
[1]
응고 인자 VIII (FVIII), 및 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서, 상기 FVIII의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 상기 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 조성물 중에 상기 폴리펩타이드 대 FVIII의 몰비가 20초과인, 용도.
[2]
항목 [1]에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 상기 FVIII의 저장 안정성을 증가시키는, 용도.
[3]
항목 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 조성물이 프로테아제를 포함하지 않는, 용도.
[4]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 야생형 VWF를 포함하지 않는, 용도.
[5]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII가 재조합적으로 제조된 FVIII 또는 혈장 유래된 FVIII인, 용도.
[6]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 50인, 용도.
[7]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 50 초과인, 용도.
[8]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 60인, 용도.
[9]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 75인, 용도.
[10]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 100인, 용도.
[11]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 200인, 용도.
[12]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 300인, 용도.
[13]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 400인, 용도.
[14]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 500인, 용도.
[15]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 600인, 용도.
[16]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 적어도 700인, 용도.
[17]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 10,000 미만인, 용도.
[18]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 20 초과 내지 10,000 미만인, 용도.
[19]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 25 내지 약 9,000인, 용도.
[20]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 50 내지 약 7,500인, 용도.
[21]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 50 초과 내지 약 6,000인, 용도.
[22]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 60 내지 약 5,000인, 용도.
[23]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 75 초과 내지 약 4,000인, 용도.
[24]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 100 내지 약 3,000인, 용도.
[25]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 200 내지 약 2,500인, 용도.
[26]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 300 내지 약 2,000인, 용도.
[27]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 400 내지 약 1,750인, 용도.
[28]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 500 내지 약 1,500인, 용도.
[29]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 600 내지 약 1,250인, 용도.
[30]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 몰비가 약 700 내지 약 1,000인, 용도.
[31]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 용도가 20배 초과의 몰 과량의 상기 폴리펩타이드를 상기 FVIII에 첨가함으로써 상기 FVIII를 안정화시킴을 포함하는, 용도.
[32]
항목 [31]에 있어서, 상기 몰 과량이 적어도 25배, 또는 적어도 50배, 또는 50배 초과, 또는 적어도 60배, 또는 적어도 75배, 또는 적어도 100배, 또는 적어도 200배, 또는 적어도 300배, 또는 적어도 400배, 또는 적어도 500배, 또는 적어도 600배, 또는 적어도 700배인, 용도.
[33]
항목 [31] 또는 [32]에 있어서, 상기 몰 과량이 20배 초과 내지 10,000배 미만, 또는 25배 내지 9,000배, 또는 50배 내지 7,500배, 또는 60배 내지 5,000배, 또는 75배 내지 4,000배, 또는 100배 내지 3,000배, 또는 200배 내지 2,500배, 또는 300배 내지 2,000배, 또는 400배 내지 1,750배, 또는 500배 내지 1,500배, 또는 600배 내지 1,250배, 또는 700배 내지 1,000배인, 용도.
[34]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 동결건조시키고 재구성할 시 FVIII의 수율이 상기 폴리펩타이드가 부재인 대조군 조성물을 동결건조시키고 재구성할 시 FVIII의 수율을 초과하는, 용도.
[35]
항목 [34]에 있어서, 상기 동결 건조된 조성물이 동결 건조 직후 재구성되는, 용도.
[36]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 13% 미만인, 용도.
[37]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 11% 이하인, 용도.
[38]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 10% 이하인, 용도.
[39]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 8% 이하인, 용도.
[40]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 5% 이하인, 용도.
[41]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 3% 미만인, 용도.
[42]
항목 [34] 또는 [35]에 있어서, 동결 건조 공정 시 FVIII 활성의 상실이 2% 이하인, 용도.
[43]
항목 [1] 내지 [33] 중 어느 하나에 있어서, 상기 FVIII 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 동결 건조된 조성물의 25 ℃에서의 저장 동안에 FVIII 활성의 상실이 상기 폴리펩타이드가 부재인 동결 건조된 대조군 조성물의 것 미만인, 용도.
[44]
항목 [43]에 있어서, 상기 저장이 12개월 기간 동안인, 용도.
[45]
항목 [43]에 있어서, 25 ℃에서의 상기 저장 동안에 FVIII 활성의 상실이 20% 미만, 바람직하게 18% 미만, 보다 바람직하게 16% 미만인, 용도.
[46]
항목 [43]에 있어서, 상기 저장이 24개월 기간 동안인, 용도.
[47]
항목 [43]에 있어서, 25 ℃에서의 상기 저장 동안에 FVIII 활성의 상실이 30% 미만, 바람직하게 20% 미만인, 용도.
[48]
항목 [1] 내지 [33] 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1주 동안 25 ℃에서의 저장 후 상기 폴리펩타이드 및 상기 FVIII를 포함하는 액체 조성물 중에 상기 FVIII 활성이 상기 폴리펩타이드가 부재인 대조군 조성물의 것 초과인, 용도.
[49]
항목 [48]에 있어서, 1주 동안 25 ℃에서의 저장 동안에 FVIII 활성의 상실이 10% 미만인, 용도.
[50]
항목 [48]에 있어서, 4주동안 25 ℃에서의 저장 동안에 FVIII 활성의 상실이 20% 미만 또는 15% 미만인, 용도.
[51] 상기 절단된 VWF가 사람 절단된 VWF인, 이전의 항목 중 어느 하나의 용도를 위한 재조합 폴리펩타이드.
[52] 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 용도.
[53]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 1243 내지 2813이 부재인, 용도.
[54] 이전의 항목 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF가 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, (b) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (c) (a) 또는 (b)의 단편 중 어느 하나로 이루어진, 용도.
[55]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1μM 이하의 해리 상수 KD 로 상기 FVIII에 결합하는, 용도.
[56]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1nM 이하의 해리 상수 KD 로 상기 FVIII에 결합하는, 용도.
[57]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 0.1nM 이하의 해리 상수 KD 로 상기 FVIII에 결합하는, 용도.
[58] 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티 (HLEM)을 포함하는, 용도.
[59] 항목 [58]에 있어서, 상기 HLEM이 상기 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열인, 용도.
[60] 항목 [59]에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 트랜스페린 및 이의 단편, 사람 융모성 고나도트로핀의 C-말단 펩타이드, XTEN 서열, 동종-아미노산 반복체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 알부민 및 이의 단편, 아파민, 알파-페토단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건 하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 바람직하게 면역글로불린의 Fc 부분 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질 또는 펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진, 용도.
[61]
항목 [58]에 있어서, 상기 HLEM이 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드에 접합된, 용도.
[62]
항목 [61]에 있어서, 상기 HLEM이 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드의 C-말단에 접합된, 용도.
[63] 구현예 [61] 또는 [62]에 있어서, 상기 HLEM이 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체, 하이알루론산 및 비-단백질성 알부민 결합 리간드, 예를 들어, 지방산 쇄, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
[64]
항목 [58]에 있어서, 상기 HLEM이 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드에 비-공유적으로 연결된, 용도.
[65]
항목 [1] 내지 [60] 중 어느 하나에 있어서, 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드가 상기 폴리펩타이드에 접합된 임의의 HLEM을 포함하지 않는, 용도.
[66] 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 N-글리칸을 포함하는 당단백질이고, 여기서, 상기 N-글리칸 중 적어도 50%, 적어도 75 %, 바람직하게는 적어도 85%가 평균적으로 적어도 하나의 시알산 모이어티를 포함하는, 용도.
[67] 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 이량체로서 존재하거나, 적어도 고비율의 이량체를 갖는, 용도.
[68]
항목 [67]에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 적어도 50%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 이량체로서 존재하는, 용도.
[69]
항목 [67] 또는 [68]에 있어서, 상기 이량체가 동종이량체이고, 상기 이량체를 형성하는 2개의 단량체들이, 상기 절단된 VWF 내의 시스테인 잔기에 의해 형성된 적어도 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 통해 서로 공유결합적으로 연결되어 있는, 용도.
[70] 항목 [69]에 있어서, 상기 하나 이상의 디설파이드 브릿지를 형성하는 상기 시스테인 잔기가 Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, Cys-1227 및 이들의 조합, 바람직하게 Cys-1099와 Cys-1142로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서, 상기 아미노산 넘버링이 서열번호 4를 기준으로 하는, 용도.
[71] 항목 [67] 내지 [70] 중 어느 하나에 있어서, FVIII에 대한 상기 이량체의 친화성이 FVIII에 대한 단량체성 폴리펩타이드의 친화성 초과이고, 상기 단량체성 폴리펩타이드가 이량체성 폴리펩타이드의 단량체성 서브유닛과 동일한 아미노산 서열을 갖는, 용도.
[72]
항목 [67] 내지 [71] 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드의 이량체:단량체의 비율이 적어도 1.5, 바람직하게 적어도 2, 보다 바람직하게 적어도 2.5 또는 적어도 3, 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 20이거나; 상기 폴리펩타이드가 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드를 포함하지 않고/않거나; 상기 폴리펩타이드가 단량체 및/또는 다량체 형태의 폴리펩타이드가 필수적으로 부재인, 용도.
[73] 항목 [67] 내지 [72] 중 어느 하나에 있어서, 상기 이량체 폴리펩타이드가 1μM 미만, 바람직하게 1 nM 미만, 보다 바람직하게 500 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 90 pM 미만 또는 80 pM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 FVIII 결합 친화성을 갖는, 용도.
[74] 항목 [73]에 있어서, 상기 KD가 0.1 pM 내지 500 pM, 0.5 pM 내지 200 pM, 0.75 pM 내지 100 pM의 범위, 또는 가장 바람직하게 1 pM 내지 80 pM의 범위인, 용도.
[75] 이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 야생형 VWF의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 변형된 폴리펩타이드의 FVIII로의 결합 친화성이 바람직하게 상기 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 참조 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 상기 적어도 하나의 치환의 도입에 의해 추가로 증가되는, 용도.
[76] 항목 [75]에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 아미노산 넘버링과 관련하여 서열번호 4의 서열을 참조하여 S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R, S764P/S766L, 및 S764E/S766Y/V1083A로 이루어진 조합 그룹으로부터 선택되는, 용도.
[77]
항목 [76]에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환이 조합 S764E/S766Y 또는 S764E/S766Y/V1083A인, 용도.
[78]
이전의 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 제형인, 용도.
[79]
항목 [78]에 있어서, 상기 제형이 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위해 적합한, 용도.
[80]
항목 [79]에 있어서, 상기 혈액 응고 장애가 혈우병 A인, 용도.
본 발명은
응고 인자 VIII (FVIII), 및 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서, FVIII의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 조성물 중에 상기 폴리펩타이드 대 FVIII의 몰비는 20초과이다.
절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하는 폴리펩타이드는 본원에서 "본 발명의 폴리펩타이드"로서 언급될 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 반감기 연장 모이어티를 포함한다.
비율
하기 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 단량체, 이량체 또는 이의 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 임의의 몰비는, 실제로 단량체로서, 이량체로서 또는 올리고머로서 존재하든 간에 상관없이 본 발명의 폴리펩타이드의 단량체성 서브유닛의 몰 농도의 비율을 언급한다. 비율은 동시 제형화된 FVIII의 몰 농도 상에서 형성된다. 본 출원에서 FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 비율은, 달리 지적되지 않는 경우, FVIII의 양 (몰)으로 나눈, 바람직하게 이량체로서 존재하는 본 발명의 폴리펩타이드에 포함된 단량체 서브유닛의 양(몰)을 언급한다. 비제한적인 예로서, 100 μM의 본 발명의 단량체 폴리펩타이드와 1 μM의 FVIII의 동시-제형화는 100의 비율을 의미한다. 100의 동일 비율은 50 μM의 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드가 1 μM의 FVIII와 동시 제형화되는 경우 수득된다.
FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 몰 비는 20초과, 또는 적어도 25, 또는 적어도 50, 또는 50 초과이거나, 보다 바람직하게 상기 비율은 적어도 60, 또는 적어도 75, 또는 적어도 100이거나, 또는 100 초과, 또는 적어도 200, 가장 바람직하게는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500, 또는 적어도 600, 또는 적어도 700, 또는 적어도 800, 또는 적어도 900, 또는 적어도 1,000, 또는 적어도 1,100, 또는 적어도 1,200, 또는 적어도 1,300, 또는 적어도 1,400, 또는 적어도 1,500, 또는 적어도 1,600, 또는 적어도 1,700, 또는 적어도 1,800, 또는 적어도 1,900, 또는 적어도 2,000, 또는 적어도 2,500, 또는 적어도 3,000, 또는 적어도 5,000, 또는 적어도 8,000 또는 최대 10,000이다. FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 특정 구현예에 따라 10,000의 비율, 5,000의 비율, 2,500의 비율 또는 2,000의 비율을 초과하지 않을 수 있다.
FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 20 내지 10,000, 또는 50 초과 내지 5,000, 또는 50 초과 내지 4,000, 또는 50 초과 내지 3,000, 또는 50 초과 내지 2,000, 또는 50 초과 내지 1,000 범위일 수 있다. 바람직하게는, FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 몰비는 50 내지 2,500, 또는 75 내지 2,000, 또는 100 내지 1,500, 또는 150 내지 1,000 범위이다.
절단된 VWF
본원에 사용된 용어 "폰 빌레브란트 인자"(VWF)는 천연 발생(고유) VWF뿐만 아니라, 적어도 천연 발생 VWF의 FVIII 결합 활성을 보유하는 이들의 변이체, 예를 들면, 1개 이상의 잔기가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 치환된 서열 변이체도 포함한다. FVIII 결합 활성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 FVIII-VWF 결합 검정에 의해 결정된다.
본 발명에 따른 바람직한 VWF는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열로 나타내어지는 사람 VWF이다. 서열번호 4를 암호화하는 cDNA는 서열번호 3에 나타낸다.
야생형 VWF를 암호화하는 유전자는 9kb의 mRNA로 전사되며, 이는 310,000Da의 추정 분자량을 갖는 2813개의 아미노산들의 프레-프로폴리펩티드(pre-propolypeptide)로 해독된다. 상기 프레-프로폴리펩타이드는 N-말단 22개 아미노산 신호 펩타이드, 이어서, 741개 아미노산 프로-폴리펩타이드(서열번호 4의 아미노산 23 내지 763) 및 성숙 서브유닛(서열번호 4의 아미노산 764 내지 2813)을 함유한다. N-말단에서 741개의 아미노산 프로폴리펩티드의 절단은 2050개의 아미노산들로 이루어진 성숙한 VWF를 생성시킨다. 사람 고유 VWF 프레-프로폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타낸다. 달리 지적되지 않는 경우, 본 출원에서 VWF 잔기의 아미노산 넘버링은 VWF 분자, 특히 절단된 VWF가 서열번호 4의 모든 잔기를 포함하지 않는 경우라도 서열번호 4를 참조로 한다.
고유 VWF의 프로폴리펩타이드는 다중 도메인을 포함한다. 상이한 도메인 주석(annotation)을 문헌에서 찾을 수 있다(예를 들면, 문헌[Zhou et al. (2012) Blood 120(2): 449-458). VWF의 고유 프레-프로폴리펩타이드의 하기 도메인 주석이 본 출원에서 적용된다:
D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
서열번호 4를 참조로 하여, 상기 D' 도메인은 아미노산 764 내지 865로 이루어지고; 상기 D3 도메인은 아미노산 866 내지 1242로 이루어진다.
본 발명과 관련하여 “절단된”이라는 특성은 상기 폴리펩타이드가 성숙한 VWF의 전체 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 4의 아미노산 764 내지 2813)을 포함하지 않음을 의미한다. 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 모든 아미노산 764 내지 2813을 포함하지 않지만 전형적으로 이의 단편만을 포함한다. 또한, 절단된 VWF는 VWF 단편으로서 또는 복수의 VWF 단편들로 언급될 수 있다.
통상적으로, 상기 절단된 VWF는 인자 VIII에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 절단된 VWF는 성숙한 형태의 사람 고유 인자 VIII에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 재조합 FVIII에, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 FVIII에, 예를 들어, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단일쇄 인자 VIII에 결합할 수 있다. 인자 VIII로의 절단된 VWF의 결합은 실시예 2에 기재된 바와 같은 FVIII-VWF 결합 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805를 포함하거나 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805로 이루어진다. 본원에 달리 지적되지 않는 경우, 서열 동일성은 참조 서열의 전장(예를 들면, 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805)에 대해 결정된다.
본 발명의 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 766 내지 864를 포함하거나 서열번호 4의 아미노산 776 내지 805로 이루어진다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 (a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242, 또는 (b) 이의 단편으로 이루어지고, 단 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다.
하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 사용하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 핵산은 그 자체가 공지된 기술에 의해 적합한 숙주 세포에 도입된다.
바람직한 구현예에서, 숙주 세포 내의 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 절단된 성숙한 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 핵산은 (a) 서열번호 4의 아미노산 1 내지 1242, 또는 (b) 이의 단편을 암호화하고, 단, 상기 절단된 VWF는 여전히 FVIII에 결합할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 상기 핵산은, 상기 폴리펩타이드 내의 절단된 VWF가 VWF의 아미노산 1 내지 763(예를 들어, 서열번호 4)을 포함하지 않는다 하더라도 VWF의 아미노산 1 내지 763을 또한 암호화하는 서열(예를 들어, 서열번호 4)을 포함한다.
바람직한 구현예에 따른 발명의 재조합 폴리펩타이드의 절단된 VWF는 서열번호 4의 VWF의 아미노산 서열 1 내지 763을 포함할 수 없다.
추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기 절단된 VWF는 각각 서열번호 4를 지칭하는 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다:
특정 구현예에서 상기 절단된 VWF는 성숙한 야생형 VWF에 상대적으로 내부 결실을 갖는다. 예를 들어, A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK 도메인 또는 이들의 조합은 결실될 수 있으며, D' 도메인 및/또는 D3 도메인은 보유된다. 추가의 구현예에 따라, 상기 절단된 VWF에는 도메인 A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6 또는 CK 중 하나 이상은 없다. 추가의 구현예에 따라, 절단된 VWF에는 서열번호 4의 아미노산 1243 내지 2813, 즉, 도메인 A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK가 없다.
추가의 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 혈소판 당단백질 Ibα(GPIbα), 콜라겐 및/또는 인테그린 αIIbβIII(C1 도메인 내의 RGDS 서열)에 대한 결합 부위를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 VWF의 중심 A2 도메인에 위치하는 ADAMTS13에 대한 절단 부위(Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 GPIbα에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, 콜라겐에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, 인테그린 αIIbβIII에 대한 결합 부위를 포함하지 않고/않거나, VWF의 중심 A2 도메인에 위치하는 ADAMTS13에 대한 절단 부위(Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 1691 내지 1905를 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 UniProtKB-P04275로서 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1691 내지 1905를 포함하지 않는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 사람 VWF의 아미노산 1691 내지 1905를 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 혈소판에 대해 낮은 친화성을 갖고, 상기 낮은 친화성은 폴리펩타이드의 GPIbα로의 결합에 대해 KD > 1 μM, 우선적으로 KD > 10 μM의 해리 상수를 특징으로 한다.
또 다른 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 VWF 도메인 A1 및/또는 A3 또는 이의 일부를 함유하지 않고, 콜라겐 I형 및 III형에 대해 낮은 친화성을 갖거나 필수적으로 친화성을 갖지 않고, 상기 낮은 친화성 또는 필수적으로 친화성을 갖지 않은 것은 폴리펩타이드의 콜라겐 I형 및 III형으로의 결합에 대해 해리 상수 KD > 1 μM, 우선적으로 KD > 10 μM을 특징으로 한다. 상기 폴리펩타이드는 그러나 상기 폴리펩타이드에 N- 또는 C-말단으로 융합된 서열번호 4의 아미노산 1238 내지 1268을 갖거나 바람직하게 이들로 이루어진 펩타이드의 하나 이상의 카피물을 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 선행 단락에 언급된 상기 아미노산 서열들 중 하나와 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들 서열로 이루어지고, 단, 상기 절단된 VWF는 FVIII에 결합할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 상기 본 발명의 폴리펩타이드의 2개의 단량체들이 공유결합되어 있는 경우 본 발명에서 "이량체"라고 칭한다. 바람직하게, 상기 공유 결합은 본 발명의 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치한다. 바람직하게는, 2개의 단량체성 서브유닛들은 적어도 1개의 디설파이드 브릿지를 통해, 예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 디설파이드 브릿지에 의해 공유결합된다. 적어도 1개의 디설파이드 브릿지를 형성하는 시스테인 잔기는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치한다. 한 구현예에서, 이들 시스테인 잔기들은 Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225 또는 Cys-1227, 또는 이들의 조합이다. 바람직하게, 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 절단된 VWF 부분 내에 위치된 상기 공유 결합에 추가로 단량체를 연결하는 임의의 추가로 공유 결합을 포함하지 않고, 특히 본 발명의 HLEM 또는 HLEP 부분 내에 위치된 추가의 공유 결합을 포함하지 않는다. 대안적 구현예에 따라, 그러나, 본 발명의 이량체성 폴리펩타이드는 단량체를 연결하는 폴리펩타이드의 HLEM 또는 HLEP 부분에 위치된 공유 결합을 포함할 수 있다.
상기 이량체는 바람직하게 동종-이량체이고, 여기서, 각각의 단량체는 바람직하게 본원에 기재된 바와 같은 HLEM 또는 HLEP를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 상기 절단된 VWF는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 아미노산 764 내지 1227, 또는 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 갖는 2개의 폴리펩타이드들을 포함하거나 또는 이들 폴리펩타이드들로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 아미노산 764 내지 1227 또는 아미노산 764 내지 1242와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이러한 아미노산으로 이루어지고, FVIII에 결합할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 절단된 VWF는 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1099, 아미노산 764 내지 1142, 아미노산 764 내지 1222, 아미노산 764 내지 1225, 아미노산 764 내지 1227 또는 아미노산 764 내지 1242를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
상기 절단된 VWF는 WO 2013/106787 A1, WO 2014/198699 A2, WO 2011/060242 A2 또는 WO 2013/093760 A2에 개시되어 있는 VWF 단편들 중 임의의 하나일 수 있고, 상기 문헌들의 개시내용은 본원에 참조로 인용된다.
추가의 바람직한 구현예에 따라, 상기된 바와 같은 절단된 VWF는 WO 2016/000039 A1에 기재된 바와 같은 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 변형된 버전의 절단된 VWF는 서열번호 4에 따른 야생형 VWF의 D’ 도메인의 아미노산 서열과 비교했을 때, D' 도메인 내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 변형된 버전의 절단된 VWF의 아미노산 서열은 각각의 야생형 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환들을 가질 수 있다. 상기 변형된 절단된 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 4의 D’ 도메인에 비해 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는다. 서열번호 2의 1번 위치에 상응하는 서열번호 4의 764번 위치에서의 S가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 서열번호 2의 3번 위치에 상응하는 서열번호 4의 766번 위치에서의 S는 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것이 또한 바람직하다. 치환의 바람직한 조합은 서열번호 4의 서열을 참조로 하여, S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R 및 S764P/S766L을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 FVIII로의 결합 친화성은 상기 변형을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 표준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 상기 치환에 의해 추가로 증가될 수 있다. 절단된 VWF 내 상기 치환은 동시 투여된 FVIII의 반감기 또는 동시 제형화된 FVIII의 안정성을 증가시키는데 기여할 수 있다.
반감기 연장 모이어티(HLEM)
상기 절단된 VWF에 추가하여, 본 발명의 폴리펩타이드는 소정의 바람직한 구현예들에서 추가로 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 상기 반감기 연장 모이어티는 절단된 VWF에 융합된 이종성 아미노산 서열일 수 있다. 대안적으로, 상기 반감기 연장 모이어티는 펩타이드 결합과 상이할 수 있는 공유 결합에 의해 상기 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드에 화학적으로 접합될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기는 화학적 변형, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(페길화), 당화된 PEG, 하이드록실 에틸 전분(헤실화(HESylation)), 폴리시알산, 엘라스틴-유사 폴리펩타이드, 헤파로산 중합체 또는 하이알루론산과 같은 반감기 연장 모이어티의 부착에 의해 연장된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 화학적 링커를 통해 알부민과 같은 HLEM에 접합된다. 이러한 접합 기술의 원리은 컨주켐 엘엘씨(Conjuchem LLC)에 의한 예시적 방식으로 기재된 바 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,256,253호를 참조한다).
다른 구현예에서, 반감기 연장 모이어티는 반감기 증진 폴리펩타이드(HLEP)이다. 바람직하게, HLEP는 알부민 또는 이의 단편이다. 알부민의 N-말단은 상기 절단된 VWF의 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, 알부민의 C-말단은 상기 절단된 VWF의 N-말단에 융합될 수 있다. 하나 이상의 HLEP들은 VWF의 N-말단 또는 C-말단부에 융합될 수 있고, 단, 이들은 FVIII에 대한 상기 절단된 VWF의 결합 능력을 방해하거나 상실시키지 않는다.
재조합 폴리펩타이드는 추가로 바람직하게 절단된 VWF와 HLEM 사이에 위치한 공유 결합, 또는 절단된 VWF와 HLEM 사이에 위치한 링커 서열을 포함한다.
상기 링커 서열은 하나 이상의 아미노산, 특히 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3(예를 들어, 1, 2 또는 3)개의 아미노산들로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 바람직하게, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. 상기 링커 서열에 존재하는 바람직한 아미노산은 Gly 및 Ser을 포함한다. 상기 링커 서열은 비-면역원성이어야 한다. 바람직한 링커는 번갈아 존재하는 글리신과 세린 잔기로 구성될 수 있다. 적합한 링커는 예를 들어, WO2007/090584에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 절단된 VWF 모이어티와 HLEP 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 사람 단백질 내의 천연 도메인간 링커 또는 서열로서 작용한다. 바람직하게는, 이런 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하여, 이러한 서열에 대해 천연 관용성을 추정할 수 있다. 이의 예는 WO 2007/090584에 제공된다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기재되어 있다.
재조합 폴리펩타이드의 바람직한 구현예에서, 절단된 VWF와 HLEP 사이의 링커는 서열번호 2의 아미노산 서열 480-510을 갖거나 이들로 이루어진 글리신/세린 펩타이드 링커이다.
하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 하기의 구조를 갖는다:
[화학식 1]
tVWF - L1 - H
상기 식 중에서, tVWF는 상기 절단된 VWF이고, L1은 화학 결합 또는 링커 서열이고, H는 HLEM, 특히 HLEP이다.
L1은 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3개(예를 들어,1, 2 또는 3개)의 아미노산들로 이루어진 화학 결합 또는 링커 서열일 수 있고, 이들은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 통상적으로, 상기 링커 서열은 야생형 VWF 내의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. L1에 존재하는 적절한 아미노산의 예로는 Gly 및 Ser이 포함된다. 상기 링커는 비면역원성이어야 하고, 절단불가능한 링커 또는 절단가능한 링커일 수 있다. 절단불가능한 링커는 WO2007/090584 A1호에 예시된 바와 같이 번갈아 존재하는 글리신과 세린 잔기로 구성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 절단된 VWF 모이어티와 알부민 모이어티 사이의 펩타이드성 링커는 펩타이드 서열들로 이루어지고, 이는 사람 단백질 내에서 천연 도메인간 링커 또는 서열로서 작용한다. 바람직하게는, 이런 천연 환경에 있는 이러한 펩타이드 서열은 단백질 표면에 가깝에 위치해 면역계에 접근가능하기 때문에, 이러한 서열에 대해 천연 관용성을 추정할 수 있다. 그 예들은 WO2007/090584호에 제공되어 있다. 절단가능한 링커 서열은 예를 들어, WO 2013/120939 A1호에 기술되어 있다.
바람직한 HLEP 서열은 하기에 기재되어 있다. 마찬가지로, 각 HLEP의 정확한 "N-말단 아미노산"에 대한 융합 또는 정확한 “C-말단 아미노산"에 대한 융합, 또는 각 HLEP의 "N-말단 아미노산” 또는 “C-말단 아미노산"에 대한 융합이 본 발명에 포함되고, 이는 HLEP의 하나 이상의 아미노산에 대한 N-말단 결실을 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 1개 초과의 HLEP 서열, 예를 들어, 2개 또는 3개의 HLEP 서열을 포함할 수 있다. 이러한 다중 HLEP 서열들은 VWF의 C-말단 부분에 탠덤(tandem)식으로, 예를 들면, 연속적인 반복체로서 융합될 수 있다.
반감기 증진 폴리펩타이드 (HLEP)
바람직하게, 반감기 연장 모이어티는 반감기 연장 폴리펩타이드(HLEP)이다. 보다 바람직하게 상기 HLEP는 알부민, 알부민-계열 또는 이의 단편의 구성원, 큰 수역학적 용적을 갖는 용매화된 무작위 쇄(예를 들어, XTEN (문헌참조: Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), 동종-아미노산 반복체 (HAP) 또는 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-페토단백질, 비타민 D 결합 단백질, 트랜스페린 또는 이의 변이체 또는 단편, 사람 융모성 고나도트로핀-β 서브유닛의 카르복실-말단 펩타이드(CTP), 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합할 수 있는 폴리펩타이드, 특히, 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 예를 들어, 생리학적 조건하에서 알부민에, 알부민 계열의 구성원에 또는 이의 단편에 또는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부에 결합할 수 있는 Fc 단편, 폴리펩타이드 또는 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분은 바람직하게 면역글로불린 G1의 Fc 단편, 면역글로불린 G2의 Fc 단편 또는 면역글로불린 A의 Fc 단편이다. HLEP는 추가로 또는 대안적으로 서열번호 4의 아미노산 1238 내지 1268을 갖고, 바람직하게 이들로 이루어진 펩타이드의 하나 이상의 카피물을 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 바람직하게 다중 O-당화된 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 반감기 증진 폴리펩타이드는 응고 인자의 치료학적 활성 또는 생물학적 활성을 안정화시키거나 연장될 수 있는, 특히 본 발명의 폴리펩타이드의 생체내 본원에 기재된 전장 반감기 증진 단백질 또는 반감기를 증가시킬 수 있는 본원에 기재된 전장 반감기 증진 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 10개 이상의 아미노산 길이로 이루어질 수 있거나, 또는 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 100개, 또는 그 이상의 연속된 HLEP 서열의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 HLEP 단편이 해당 HLEP 부재 하에 각 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 25%의 기능적 반감기 연장을 제공하는 한, 각 HLEP의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP 부분은 야생형 HLEP의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적 또는 비보존적인 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이 경우, 그러한 변화는 실질적으로 상기 절단된 VWF의 FVIII-결합 활성을 변화시키지 않는다.
특히, 본 발명에서 제안된 VWF HLEP 융합 작제물은 HLEP의 천연 발생 다형성 변이체 및 HLEP의 단편을 포함할 수 있다. 상기 HLEP는 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비포유동물 HLEP로는 수탉 및 연어가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원의 개시내용의 특정 구현예에 따라, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 일부인 HLEM, 특히, HLEP는 또 다른 용어 “FP”로 특정될 수 있다. 바람직하게, 용어 "FP"는 사람 알부민을 나타낸다.
특정 바람직한 구현예에 따라, 상기 재조합 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 본 발명의 측면에서 융합 단백질은 절단된 VWF 및 HLEP를 암호화하는 적어도 2개의 DNA 서열의 프레임 내 연결에 의해 생성되는 단백질이다. 당업자는 융합 단백질 DNA 서열의 해독이 단일 단백질 서열을 유도함을 이해한다. 추가의 바람직한 구현예에 따른 펩타이드 링커를 암호화하는 DNA 서열의 프레임 내 삽입의 결과로서, 절단된 VWF, 적합한 링커 및 HLEP를 포함하는 융합 단백질이 수득될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 동시 제형화된 FVIII는 임의의 본원에 기재된 HLEM 또는 HLEP 구조물 중 어느 하나도 포함하지 않는다. 특정 다른 구현예에 따라, 동시 제형화된 FVIII는 본원에 기재된 HLEM 또는 HLEP 구조물 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
HLEP로서의 알부민
용어 "사람 혈청 알부민"(HSA) 및 "사람 알부민"(HA)은 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 “알부민" 및 "혈청 알부민"은 보다 광범위하고, 사람 혈청 알부민(및 이의 단편들 및 변이체들) 및 다른 종들의 알부민(및 이의 단편들 및 변이체들)을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같은 "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적 성질(예를 들면, 생물학적 기능)을 갖는, 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 총괄하여 언급한다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 본원의 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 사람 알부민 또는 다른 척추동물 기원의 알부민의 성숙된 형태 또는 이의 단편들, 또는 이러한 분자들의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편들을 언급한다.
본원의 개시내용의 특정 구현예에 따라, 또 다른 용어 "FP"는 HLEP를 동정하고, 특히 HLEP로서 알부민을 한정하기 위해 사용된다.
특히, 본 발명의 제안된 폴리펩타이드는 사람 알부민의 천연 발생 다형성 변이체 및 사람 알부민의 단편를 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 40개, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다.
본 발명의 바람직한 구현예들은 FcRn 수용체에 대한 결합이 증진된, 본 발명의 폴리펩타이드의 HLEP로서 사용된 알부민 변이체를 포함한다. 이러한 알부민 변이체는 절단된 VWF의 야생형 알부민과의 융합과 비교했을 때 상기 절단된 VWF 알부민 변이체 융합 단백질의 보다 긴 혈장 반감기를 유도할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 알부민 부분은 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인, 또는 이들의 보존적 변형을 포함할 수 있다.
IHLEP로서의 면역글로불린
면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc)은 당해 분야에 치료학적 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄의 IgG 불변 영역은 3개의 도메인(CH1-CH3)과 힌지 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 서열은 임의의 포유동물, 또는 그의 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 각각 유도될 수 있다. 항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG 단편들이 HLEP로서 사용될 수도 있다. 치료용 폴리펩타이드 부분은 바람직하게는 항체 또는 펩타이드 링커의 힌지 영역을 통해 IgG 또는 IgG 단편에 연결되며, 이는 심지어 절단될 수도 있다. 수개의 특허 및 특허출원들이 치료용 단백질의 생체내 반감기를 개선하기 위해 면역글로불린 불변 영역에 상기 치료용 단백질을 융합시키는 것에 대하여 기재하고 있다. US 2004/0087778 및 WO 2005/001025는 펩타이드의 반감기를 증가시키고 그렇지 않으면 생체내에서 신속하게 제거되는, 생물학적으로 활성 펩타이드를 갖는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부 또는 Fc 도메인의 융합 단백질을 기재하고 있다. 증진된 생물학적 활성, 연장된 순환성 반감기 및 더 큰 용해도가 달성된 Fc-IFN-β 융합 단백질에 대해서도 기재되었다 (WO 2006/000448 A2호). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질은 기재되어 있고 (WO 2005/063808 A1), G-CSF와 Fc 융합 (WO 2003/076567 A2), 글루카곤-유사 펩타이드-1(WO 2004/000892 A2), 응고 인자(WO 2004/101740 A2) 및 인터류킨-10(미국 특허 제6,403,077호), 이 모두는 반감기 증진 성질을 갖는다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 각종 HLEP는 WO 2013/120939 A1에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 및 시알릴화
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 N-글리칸을 포함하며, 상기 N-글리칸 중 적어도 50%, 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%는, 평균적으로, 적어도 하나의 살리실산 모이어티를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 N-글리칸 중 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는, 평균적으로, 적어도 하나의 살리실산 모이어티를 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 위해 포유동물 세포를 사용하는 경우, 이것은 흔히 α-2,3-연결된 시알릴 그룹을 함유한다. 그러나, 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 α-2,6-연결된 시알릴 그룹을 갖는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 당단백질의 N-글리칸의 시알릴 그룹의 적어도 50%는 α-2,6-연결된 시알릴 그룹이다. 일반적으로, 말단 시알릴 그룹은 α-2,3- 또는 α-2,6-연결을 통해 갈락토스 그룹에 부착될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸은 α-2,3-연결된 시알릴 그룹 보다 더 α-2,6-연결된 시알릴 그룹을 포함할 수 있다. N-글리칸의 시알릴 그룹의 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 α-2,6-연결된 시알릴 그룹일 수 있다. 이들 구현예는 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 위해 사람 기원의 세포주를 사용하거나, 예를 들어, 포유동물 세포에서 사람 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 동시 발현시킴에 의해 수득될 수 있다.
상기 당단백질을 제조하는 적합한 방법은 예를 들어, WO 2016/188905에 기재되어 있다. 따라서, 시알화가 증가된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 상기 세포를 36.0 ℃ 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 추가로, 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 당단백질의 이량체를 제조하거나, 또는 상기 당단백질의 이량체화를 증가시키는 방법이 기재되고, 상기 방법은 (i) 당단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 세포를 36.0 ℃ 미만의 온도에서 배양하는 단계를 포함한다. 추가로, 시알화가 증가된 N-글리칸을 포함하는 당단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있고, 상기 방법은 (i) 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계 및 (ii) 상기 세포를 당단백질 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 적어도 하나의 시알산 그룹을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 N-글리칸 중 50% 미만, 또는 25% 미만, 또는 15% 미만, 또는 12% 미만, 또는 10% 미만, 또는 8% 미만, 또는 6% 미만, 또는 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만 또는 심지어 1% 미만이 아시알로-N-글리칸이고, 즉, 이들은 시알산 그룹이 부재인 N-글리칸이다.
본 발명의 다른 구현예들은 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하고, 여기서 상기 절단된 VWF는 인자 VIII(FVIII)에 결합할 수 있고, 여기서 상기 당단백질은 N-글리칸을 포함하고, 여기서 상기 N-글리칸의 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 바람직하게는 35% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 바람직하게는 29% 미만, 바람직하게는 28% 미만, 바람직하게는 27% 미만, 바람직하게는 26% 미만, 바람직하게는 25% 미만, 바람직하게는 24% 미만, 바람직하게는 23% 미만, 바람직하게는 22% 미만, 바람직하게는 21% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 바람직하게는 19% 미만, 바람직하게는 18% 미만, 바람직하게는 17% 미만, 바람직하게는 16% 미만, 바람직하게는 15% 미만, 바람직하게는 14% 미만, 바람직하게는 13% 미만, 바람직하게는 12% 미만, 바람직하게는 11% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 9% 미만, 바람직하게는 8% 미만, 바람직하게는 7% 미만, 바람직하게는 6% 미만, 바람직하게는 5% 미만이 평균적으로 2개 이상의 말단 및 비-시알릴화된 갈락토스 잔기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예들은 절단된 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 포함하고, 여기서 상기 절단된 VWF는 인자 VIII(FVIII)에 결합할 수 있고, 여기서 상기 절단된 VWF는 N-글리칸을 포함하고, 여기서 상기 N-글리칸의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 바람직하게는 3% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 그리고 바람직하게는 1% 미만이 평균적으로 3개 이상의 말단 및 비-시알릴화된 갈락토스 잔기를 포함한다.
상기된 구현예들은 서로 조합될 수 있다. 상기 언급한 N-글리칸의 임의의 비율, 또는 시알릴화의 정도에 대한 임의의 퍼센트는, 평균 비율 또는 정도로서 이해되며, 즉 이들은 단일 분자가 아니라 분자의 집단에 대하여 언급하고 있는 것이다. 당단백질의 군 내에서 개개의 당단백질 분자의 당화 또는 시알릴화는 일부 이종성을 나타낼 것이라는 것은 명백하다.
이량체
본 발명의 폴리펩타이드는 높은 비율의 이량체를 갖는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 이량체로 존재한다. 하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 약 98%가 이량체로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체:단량체 비율은 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 2, 보다 바람직하게는 적어도 3 또는 적어도 5이다. 가장 바람직하게는 필수적으로 본 발명의 모든 폴리펩타이드는 이량체로 존재한다. 추가로 바람직한 것은 본 발명의 폴리펩타이드가 다량체 형태를 포함하지 않는다는 것이다. 이량체가 단량체에 비해 인자 VIII에 대해 개선된 친화성을 가지기 때문에, 이량체의 사용이 선호될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 이량체 함량 및 단량체에 대한 이량체의 비는 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 인자 VIII로의 친화성은 동일한 인자 VIII 분자에 대한 사람 고유의 VWF의 친화성 보다 크다. 폴리펩타이드의 인자 VIII 친화성은 사람 본래의, 혈장 유래된 또는 재조합 인자 VIII를 언급할 수 있고, 특히 절단되거나 결실된 B-도메인을 갖는 재조합 인자 VIII 분자를 언급할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 5를 특징으로 하는 인자 VIII 분자를 언급할 수 있다.
높은 이량체 비율을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드의 제제는 인자 VIII에 대하여 증가된 친화성을 갖는 것이 밝혀졌다. 증가된 이량체 비율과 다르게, 또는 이와 조합하여, 인자 VIII에 대한 친화성을 증가시키는 인자 VIII 결합 도메인 내에 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩타이드도 본 발명의 바람직한 구현예이다. 적절한 돌연변이는 예컨대, WO 2013/120939 A1호에 개시되어 있다.
폴리펩타이드의 제조
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 사람 고유 VWF (서열번호 3)의 프레-프로 형태의 cDNA 서열(서열번호 3)에 기초하여, 상기 언급된 절단된 절단된 VWF 작제물을 암호화하는 재조합 DNA를 디자인하여 제조할 수 있다.
숙주 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드가 사람의 VWF의 프레-프로 형태의 아미노산 1 내지 763을 포함하지 않는 경우라도, 상기 폴리펩타이드의 세포내 전구체를 암호화하는 핵산(예를 들면, DNA)은 서열번호 4의 아미노산 23 내지 763 또는 바람직하게는 아미노산 1 내지 763과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드의 세포내 전구체를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA)은 서열번호 4의 아미노산 23 내지 763 또는 서열번호 4의 아미노산 1 내지 763을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
DNA가 발현 플라스미드에 정확한 배향으로 삽입된 전체 개방 판독 프레임을 포함하는 작제물을 단백질 발현에 사용할 수 있다. 통상적인 발현 벡터는 플라스미드를 함유하는 세포 내에서 상기 삽입된 핵산에 상응하는 대량의 mRNA의 합성을 지시하는 프로모터를 포함한다. 또한, 이들은 숙주 유기체 내에서 이들의 자가 복제를 가능케 하는 복제 기원의 서열 및 합성된 mRNA가 해독되는 효능을 증가시키는 서열을 포함할 수도 있다. 안정한 장기 벡터는 예를 들어, 바이러스의 조절 요소(예컨대, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 게놈 유래의 OriP 서열)를 사용함으로써 자유롭게 복제하는 독립체로서 유지될 수 있다. 게놈성 DNA에 벡터가 통합된 세포주도 제조될 수 있으며, 이러한 방식으로 유전자 생성물은 지속적으로 생산된다.
통상적으로, 제공되는 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포유동물 숙주 세포에 도입함으로써 수득된다.
세포 배양물 및 당단백질의 발현에 대해 민감한 임의의 숙주 세포를 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물이다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 포유동물 세포의 비-제한적 예로는 BALB/c 마우스 골수종 세포주(NSO/1, ECACC No: 85110503); 사람 망막모세포(PER.C6(CruCell, Leiden, The Netherlands)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장 세포주(293 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243 251, 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 사람 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(HepG2, HB 8065); 마우스 유선 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; PS4 세포; 사람 양수 세포(CAP); 및 사람 간세포암 세포주(Hep G2)가 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포주는 설치류 세포주이고, 특히 CHO 또는 BHK와 같은 햄스터 세포주 또는 사람 세포주이다.
관심 대상의 당단백질의 발현을 달성하기에 충분한 핵산을 포유동물 숙주 세포 내에 도입하는데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al. EP 117,060; 및 EP 117,058]을 참조한다. 포유동물 세포의 경우, 포유동물 세포에 유전자 물질을 도입하는 통상의 방법으로는 Graham 및 van der Erb(Virology, 52:456-457, 1978)의 칼슘 포스페이트 침전법 또는 Hawley-Nelson(Focus 15:73, 1993)의 리포펙타민™(Gibco BRL) 방법이 포함된다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적 양상은 미국 특허 제4,399,216호에 Axel에 의해 기재되어 있다. 포유동물 세포에 유전자 물질을 도입하기 위한 각종 기술에 대해서는, 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988]을 참조한다.
세포는 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양된다. 상기 폴리펩타이드는 당업계의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 회수 및 정제될 수 있다.
인자 VIII
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인자 VIII" 또는 "FVIII"는 사람 고유 인자 VIII의 응고 활성의 적어도 일부를 갖는 분자를 언급한다. 사람 FVIII은 2351개의 아미노산(신호 펩타이드를 포함하는) 및 2332개의 아미노산 (신호 펩타이드 없이)으로 이루어진다. “사람 고유 FVIII"는 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 전장 서열 (아미노산 1-2332)을 갖는 사람 혈장 유래된 FVIII 분자이다. 세부 도메인 구조, A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2는 상응하는 아미노산 잔기들(서열번호 7 참조)를 갖는다: A1 (1-336), a1 (337-372), A2 (373-710), a2 (711-740), B (741-1648), a3 (1649-1689), A3 (1690-2020), C1 (2021-2173) 및 C2 (2174-2332).
FVIII 분자의 응고 활성은 1단계 응고 검정 (예를 들어, 문헌(참조: Lee et al., Thrombosis Research 30, 511 519 (1983))에 기재된 바와 같이) 또는 발색 기질 검정(예를 들어, 제조원(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italy)으로부터의 코어매틱 FVIII 시험 키트)를 사용하여 결정될 수 있다. 이들 활성 검정의 추가의 세부사항은 하기되어 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라 사용되는 FVIII 분자는 사람 고유 FVIII의 몰 비활성의 적어도 10%를 갖는다. 용어 “몰 비활성”은 FVIII의 몰 당 응고 활성을 언급하고, 예를 들어, “IU/몰” FVIII 또는 -보다 간편하게- “IU/p몰” FVIII로 나타낸다.
바람직한 구현예에서, FVIII 분자는 비-천연적으로 존재하는 FVIII 분자이다. 바람직하게, 비-천연적으로 존재하는 FVIII 분자는 재조합적으로 제조되었다. 또 다른 구현예에서, FVIII 분자는 세포 배양물에서 제조되었다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 비-천연적으로 존재하는 FVIII 분자는 혈장-유래된 FVIII의 것과는 상이한 당화 패턴을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 분자는 (i) B-도메인 결실되거나 절단된 FVIII 분자, (ii) 단일쇄 FVIII 분자, (iii) 재조합적으로 생성된 2개의 쇄 FVIII 분자, (iv) 보호 그룹 또는 반감기 연장 모이어티를 갖는 FVIII 분자, (v) 이종성 아미노산 서열에 융합된 FVIII 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질, 및 (vi) 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, FVIII 분자는 혈장-유래된 FVIII 분자이다.
용어 "인자 VIII" 및 "FVIII"는 본원에서 동의어로 사용된다. “본 발명의 의미에서 “인자 VIII 조성물”은 FVIII 및 FVIIIa를 포함하는 조성물을 포함한다. FVIIIa는 전형적으로 소량으로, 예를 들어, 조성물 내 FVIII 단백질의 총양을 참조로 약 1 내지 2%의 FVIIIa로 존재할 수 있다. 단백질용해 절단된 FVIII는 전형적으로 소량 내지 중간 양으로, 예를 들어, 조성물 내 FVIII 단백질의 총양을 참조로 약 1 내지 50%로 존재할 수 있다. "FVIII"는 개체 마다 존재하고 발생할 수 있는 FVIII의 천연 대립형질 변형을 포함한다. FVIII는 널리 공지된 제조 및 정제 방법을 사용하여 혈장 유래되거나 재조합적으로 제조될 수 있다. 당화 정도 및 위치, 티로신 황화 및 다른 해독후 변형은 선택된 숙주 세포 및 이의 성장 조건에 따라 다양할 수 있다.
용어 FVIII는 FVIII 유사체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "FVIII 유사체"는 FVIII 분자 (전장 또는 B-도메인 절단된/결실된)를 언급하고, 여기서, 하나 이상의 아미노산은 서열번호 7과 비교하여, 또는 서열번호 7의 상응하는 부분인 B-도메인 절단된/결실된 FVII 분자에 대해 치환되거나 결실되었다. FVIII 유사체는 천연에 존재하지 않지만 사람 조작에 의해 수득된다.
본 발명의 조성물에 포함되는 인자 VIII 분자는 또한 B-도메인 절단된/결실된 FVIII 분자일 수 있고, 여기서, 나머지 도메인은 서열번호 7의 아미노산 번호 1-740 및 1649-2332에 제시된 바와 같은 서열에 상응한다. 다른 형태의 B-도메인 결실된 FVIII 분자는 추가로 이들의 a3 도메인에 부분 결실을 갖고, 이는 단일쇄 FVIII 분자를 유도한다.
이어서 이들 FVIII 분자는 형질전환된 숙주 세포에서 생성된, 바람직하게 포유동물 기원의 재조합 분자이다. 그러나, B-도메인 결실된 FVIII에서 나머지 도메인 (즉, 3개의 A-도메인, 2개의 C-도메인 및 a1, a2 및 a3 영역)은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 각각의 아미노산 서열 (아미노산 1-740 및 1649-2332)과 약간, 예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%로 상이할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 FVIII 분자는 2개의 쇄 FVIII 분자 또는 단일쇄 FVIII 분자일 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 FVIII 분자는 또한 FVIII의 생물학적 활성 단편, 즉 B-도메인 이외의 다른 도메인(들)이 결실되거나 절단된 FVIII일 수 있지만, 결실된/절단된 형태의 FVIII 분자는 혈액 응고 형성을 지원하는 이의 능력을 보유한다. FVIII 활성은 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 시험관내 평가될 수 있다. 본 발명에 따른 FVIII 활성을 결정하기 위해 바람직한 시험은 발색 기질 검정 또는 1단계 검정이다 (하기 참조). 아미노산 변형(치환, 결실 등)은 예를 들어, 다양한 다른 성분들, 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질(LPR), 다양한 수용체, 다른 응고 인자, 세포 표면 등과 함께 인자 VIII의 결합 능력을 변형시키기 위해, 또는 당화 부위 등을 도입하고/하거나 제거하기 위해 나머지 도메인에 도입될 수 있다. FVIII 활성을 제거하지 않는 다른 돌연변이는 또한 본 발명의 조성물에 사용하기 위해 FVIII 분자/유사체에 수용될 수 있다.
FVIII 유사체는 또한 모계 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기들이 결실되거나 다른 아미노산 잔기들로 치환되고/되거나 추가의 아미노산 잔기들이 모계 FVIII 폴리펩타이드에 부가된 FVIII 분자를 포함한다.
추가로, 인자 VIII 분자/유사체는 예를 들어, 절단된 B-도메인에서 및/또는 분자의 다른 도메인의 하나 이상에서 다른 변형 (“FVIII 유도체”)을 포함할 수 있다. 이들 다른 변형은 예를 들어, 중합체 화합물, 펩타이드 화합물, 지방산 유래된 화합물 등과 같은 인자 VIII 분자에 접합된 다양한 분자 형태에 있을 수 있다.
용어 FVIII는 보호 그룹 또는 반감기 연장 모이어티를 갖는 FVIII 분자를 포함한다. 용어 "보호 그룹"/"반감기 연장 모이어티"는 본원에서 이들 단백질/펩타이드에 접합된 경우 다수의 치료학적 단백질/펩타이드의 생체내 순환 반감기를 증가시킬 수 있는 -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, 또는 하나 이상의 N- 및/또는 O-글리칸 구조와 같은 하나 이상의 아미노산 부위 쇄 관능기에 접착된 하나 이상의 화학적 그룹을 언급하는 것으로 이해된다. 보호 그룹/반감기 연장 모이어티의 예는 다음을 포함한다: 생물적합성 지방산 및 이의 유도체, 하이드록시 알킬 전분(HAS) 예를 들어, 하이드록시 에틸 전분(HES), 폴리(Glyx-Sery)n (호모 아미노산 중합체(HAP)), 하이알루론산(HA), 헤파로산 중합체 (HEP), 포스포릴콜린 기반 중합체(PC 중합체), Fleximer® 중합체 (Mersana Therapeutics, MA, USA), 덱스트란, 폴리-시알산 (PSA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), Fc 도메인, 트랜스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 펩타이드, XTEN® 중합체(Amunix, CA, USA), 알부민 결합 펩타이드, 폰 빌레브란트 인자 단편(vWF 단편), 카복실 말단 펩타이드(CTP 펩타이드, Prolor Biotech, IL), 및 이의 임의의 조합(문헌참조: 예를 들어, McCormick, C.L., A.B. Lowe, and N. Ayres, Water-Soluble Polymers, in Encyclopedia of Polymer Science and Technology. 2002, John Wiley & Sons, Inc.). 유도체화 방식은 중요하지 않고 상기로부터 설명될 수 있다.
용어 FVIII는 글리코-페길화된 FVIII를 포함한다. 본원에서, 용어 "글리코-페길화된 FVIII"는 인자 VIII 분자 (전장 FVIII 및 B-도메인 절단된/결실된 FVIII를 포함하는)를 지정하는 것으로 의도되고, 여기서, 하나 이상의 PEG 그룹(들)은 폴리펩타이드의 폴리사카라이드 측쇄(들)(글리칸(들))을 통해 FVIII 폴리펩타이드에 접착되어 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 FVIII 분자는 이종성 아미노산 서열, 바람직하게, 반감기 연장 아미노산 서열에 융합된 FVIII 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 바람직한 융합 단백질은 Fc 융합 단백질 및 알부민 융합 단백질이다. 용어 "Fc 융합 단백질"은 본원에서 임의의 항체 이소타입으로부터 유래될 수 있는 Fc 도메인에 융합된 FVIII를 포괄하는 것으로 의미된다. IgG Fc 도메인은 흔히 IgG 항체의 상대적으로 긴 순환 반감기로 인해 바람직하다. Fc 도메인은 추가로 변형되어 예를 들어, 보체 결합 및/또 특정 Fc 수용체로의 결합과 같은 특정 이펙터 기능을 조절할 수 있다. FcRn 수용체에 결합하는 능력을 갖는 Fc 도메인과 FVIII의 융합은 일반적으로 wt FVIII의 반감기와 비교하여 융합 단백질의 연장된 순환 반감기를 유도한다. 이어서, 본 발명에 사용하기 위한 FVIII 분자는 또한 예를 들어, FVIII 유사체의 융합 단백질, 페길화된 또는 글리코페길화된 FVIII 유사체 또는 헤파로산 중합체에 접합된 FVIII 유사체와 같은 FVIII 유사체의 유도체일 수 있다. 용어 "알부민 융합 단백질"은 본원에서 알부민 아미노산 서열에 융합된 FVIII 또는 이의 단편 또는 유도체를 포괄하는 것으로 의미된다. 이종성 아미노산 서열은 FVIII의 N- 또는 C-말단에 융합될 수 있거나, 이것은 FVIII 아미노산 서열 내에 내부적으로 삽입될 수 있다. 이종성 아미노산 서열은 이의 개시내용이 본원에 참조로 인용된 WO 2008/077616 A1에 기재된 임의의 “반감기 연장 폴리펩타이드”일 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 FVIII 분자의 예는 예를 들어, WO 2010/045568, WO 2009/062100, WO 2010/014708, WO 2008/082669, WO 2007/126808, US 2010/0173831, US 2010/0173830, US 2010/0168391, US 2010/0113365, US 2010/0113364, WO 2003/031464, WO 2009/108806, WO 2010/102886, WO 2010/115866, WO 2011/101242, WO 2011/101284, WO 2011/101277, WO 2011/131510, WO 2012/007324, WO 2011/101267, WO 2013/083858, 및 WO 2004/067566에 기재된 FVIII 분자를 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 FVIII 분자의 예는 Advate®, Helixate®, Kogenate®, Xyntha®, Adynovate®, Kovaltry®, Nuwiq®, Novoeight®, Eloctate®의 활성 성분 및 WO 2008/135501, WO 2009/007451에 기재된 FVIII 분자 및 WO 2004/067566의 “dBN(64-53)”으로 지정된 작제물을 포함한다. 상기 작제물은 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 조성물에서 인자 VIII의 농도는 전형적으로 10-10,000 IU/mL 범위이다. 상이한 구현예에서, 본 발명의 조성물에서 FVIII 분자의 농도는 10-8,000 IU/mL, 또는 10-5,000 IU/mL, 또는 20-3,000 IU/mL, 또는 50-1,500 IU/mL, 또는 3,000 IU/mL, 또는 2,500 IU/mL, 또는 2,000 IU/mL, 또는 1,500 IU/mL, 또는 1,200 IU/mL, 1,000 IU/mL, 또는 800 IU/mL, 또는 600 IU/mL, 또는 500 IU/mL, 또는 400 IU/mL, 또는 300 IU/mL, 또는 250 IU/mL, 또는 200 IU/mL, 또는 150 IU/mL, 또는 100 IU/mL 범위에 있다.
“국제 단위" 또는 "IU"는 "IU"로 교정된 국제 표준품(international standard preparation)에 대해 교정된 표준을 사용하는 1단계 응고 분석 또는 발색 기질 FVIII 활성 검정과 같은 FVIII 활성 분석에 의해 측정된 FVIII의 혈액 응고 활성(효능)의 측정 단위이다. 1단계 응고 분석은 문헌[N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983)]에 기술된 것들과 같이 당업계에 공지되어 있다. 1단계 검정의 원리: 본 시험은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)-분석의 변형된 버전으로서 실행된다: 인지질 및 표면 활성화제와 혈장의 항온배양은 고유의 혈액 응고 시스템의 인자들의 활성화를 유도한다. 칼슘 이온의 부가는 혈액 응고 캐스케이드(cascade)를 촉발시킨다. 측정가능한 피브린 응괴의 형성까지의 시간이 측정된다. 본 분석은 인자 VIII가 결핍된 혈장의 존재 하에 수행된다. 결핍된 혈장의 응혈 능력은 시험될 샘플 중에 포함된 혈액 응고 인자 VIII에 의해 회복된다. 혈액 응고 시간의 단축은 샘플 중에 존재하는 인자 VIII의 양에 비례한다. 혈액 응고 인자 VIII의 활성은 국제 단위에서 인자 VIII의 공지의 활성을 갖는 표준품과의 직접적 비교에 의해 정량화된다.
또 다른 표준 검정은 발색 기질 검정이다. 발색 기질 검정은 코어매틱 FVIII 시험 키트(Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italy)와 같이 상업적으로 구매할 수 있다. 발색성 검정의 원리: 칼슘 및 인지질의 존재 하에, 인자 X는 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화된다. 이러한 반응은 보조 인자로서의 인자 VIIIa에 의해 자극된다. FVIIIa는 측정하고자 하는 샘플 중의 FVIII로부터의 반응 혼합물 중의 소량의 트롬빈에 의해 형성된다. Ca2+, 인지질과 인자 IXa 및 과량의 인자 X의 최적 농도를 사용하는 경우, 인자 X의 활성화는 인자 VIII의 효능에 비례한다. 활성화된 인자 X는 발색 기질 S-2765로부터 발색단 pNA를 방출한다. 따라서, 405 nm에서 측정된 pNA의 방출은 형성된 FXa의 양에 비례하며, 그에 따라 샘플의 인자 VIII 활성에도 비례한다.
동결-건조 또는 동결건조는 이것이 나타나는 문장에 의해 달리 지적되지 않는 경우 물질 (즉, 활성 약제학적 성분 및 다양한 제형 첨가제 또는 “부형제”)의 용액이 고체로 전환되는 건조 공정을 지칭하기 위해 사용된다. 전형적인 동결-건조 공정은 3개의 단계, “동결”, “1차 건조” 및 “2차 건조”로 이루어진다. 동결 단계에서, 거의 모든 함유된 물은 얼음으로 전환되고, 용질은 고체 (결정 또는 무정형)로 전환된다. 1차 건조 단계에서, 얼음은 물 분자 (얼음) 및 주변 기압 간의 선호될 수 있는 압력 구배를 유지함에 의해 성취되는 직접 승화에 의해 생성물로부터 제거된다. 2차 건조 단계에서, 잔여 수분은 탈착에 의해 생성물로부터 제거된다.
농도(w/v)가 동결-건조된 조성물에 대해 주어지는 경우, 이들은 동결 건조 직전의 용적을 언급한다.
달리 주지되지 않는 경우, 용어 퍼센트는 중량/중량 퍼센트를 나타내고 온도는 섭씨 스케일이다.
FVIII의 안정성
하나의 조성물에 동시 제형화되는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드는 조성물 중에 FVIII 활성의 상실을 억제하거나 감소시킨다. 시간 경과에 따라 또는 특정 가공 단계 동안에 FVIII 제형의 FVIII 활성의 상실은 본 발명의 폴리펩타이드가 부재인 대조군 제형의 것 보다 낮다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “대조군 제형” 또는 “대조군 조성물”은 본 발명의 폴리펩타이드가 소실된 것을 제외하고는 동일한 양의 동일한 성분을 갖는 제형을 언급한다. (i) 본 발명의 폴리펩타이드 및 FVIII를 포함하는 조성물 및 (ii) 대조군 조성물의 FVIII 활성의 상실은 (i) 동일한 조건하에서 동일한 시기 동안 저장 후 및/또는 (ii) 조성물 둘다를 동일한 가공 단계에 적용한 후 측정된다. 가공 단계는 동결 건조 및 임의로 재구성일 수 있다.
하나의 구현예에서, 절단된 VWF를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 액체 조성물 중에 FVIII의 안정성을 증가시킨다. 25 ℃에서 1주 동안 액체 형태로 저장 동안에, FVIII 및 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중에 FVIII 활성의 상실은 바람직하게 10% 미만, 보다 바람직하게 9% 미만, 가장 바람직하게 8% 미만이다. 25 ℃에서 2주 동안 액체 형태로 저장 동안에, FVIII 활성의 상실은 바람직하게 15% 미만이다. 25 ℃에서 3주 동안 액체 형태로 저장 동안에, FVIII 활성의 상실은 바람직하게 17% 미만이다. 25 ℃에서 4주 동안 액체 형태로 저장 동안에, FVIII 활성의 상실은 바람직하게 20% 미만이다. 25 ℃에서 6주 동안 액체 형태로 저장 동안에, FVIII 활성의 상실은 바람직하게 30% 미만이다. FVIII 활성의 상실은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 절단된 VWF를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 동결-건조 동안에 FVIII의 안정성을 증가시킨다. FVIII 및 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 동결 건조시 FVIII 활성의 상실은 바람직하게 15% 미만, 보다 바람직하게 10% 미만, 가장 바람직하게 5% 미만이다.
또 다른 구현예에서, 절단된 VWF를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 동결건조된 조성물 중에 FVIII의 안정성을 증가시킨다. 25℃에서 12개월 동안에 동결건조된 형태로 저장 동안에, FVIII 및 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중에 FVIII 활성의 상실은 바람직하게 16% 미만이다. 25℃에서 18개월 동안에 동결건조된 형태로 저장 동안에, FVIII 및 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중에 FVIII 활성의 상실은 바람직하게 25% 미만이다. 25℃에서 24개월 동안에 동결건조된 형태로 저장 동안에, FVIII 및 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중에 FVIII 활성의 상실은 바람직하게 30% 미만이다.
약제학적 조성물
본원에 기재된 바와 같은 절단된 VWF를 포함하는 폴리펩타이드는 바람직하게 상기 FVIII 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 중에 응고 인자 VIII (FVIII)의 시험관내 안정성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게 제형이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “제형”은 약제학적 제형을 언급한다. 용어 “약제학적 제형” 및 “치료학적 제형”은 달리 지적되지 않는 경우 본원에서 동의어로 사용된다.
상기 제형은 바람직하게 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방을 위해 적합하다. 혈액 응고 장애는 특히 혈우병 A이다.
본 발명의 폴리펩타이드의 치료학적 제형은, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(이들 모두는 본원에서 "담체"로서 지칭함), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비이온성 세제, 산화방지제 및 기타 다양한 첨가제와 함께 목적하는 정도의 순도를 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 혼합함으로써, 저장을 위해 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에 대해 비독성이어야만 한다.
완충제는 생리학적으로 허용되는 조건에 근접하게 하는 범위 내로 pH를 유지하는 것을 도와준다. 이들은 통상적으로 약 2 mM 내지 약 100 mM의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 적절한 완충제로는 유기산 및 무기산 모두 및 이들의 염, 예를 들어, 시트르산염 완충제(예를 들면, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨염 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 석신산염 완충제(예를 들면, 석신산-석신산일나트륨 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-석신산이나트륨 혼합물 등), 타르타르산염 완충제(예를 들면, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마르산염 완충제(예를 들면, 푸마르산-푸마르산나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물 등), 글루콘산염 완충제(예를 들면, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물 등), 옥살산염 완충제(예를 들면, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락트산염 완충제(예를 들면, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등) 및 아세트산염 완충제(예를 들면, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)를 포함한다. 추가로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예를 들어, Tris가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 저지하기 위해 첨가될 수 있고, 통상적으로 0.2% 내지 1%(w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 적합한 보존제로는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드 및 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀 및 3-펜타놀을 포함한다.
때로 "안정화제"로서도 알려져 있는 긴장성 변형제는 액체 조성물의 약제학적으로 허용되는 긴장성, 바람직하게 등장성을 확실히 하기 위해 첨가될 수 있으며, 염화나트륨과 같은 무기염 및 다가 당알콜, 바람직하게는 3가 또는 그 이상의 당알콜, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
안정화제는 벌킹제(bulking agnet)에서부터 치료제를 가용화시키거나 변성 또는 용기 벽으로의 부착을 예방하는 것을 돕는 첨가제까지 기능상 다양할 수 있는 광범위한 카테고리의 부형제를 지칭한다. 통상적인 안정화제는 다가 당알콜(상기 열거됨); 아미노산, 예를 들면, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당알콜, 예를 들면, 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 리비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등(이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함함); 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황함유 환원제, 예를 들면, 글루타티온, 티옥트산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들면, 10개 이하의 잔기의 펩타이드); 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 모노사카라이드, 예컨대, 크실로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 디사카라이드, 예를 들면, 락토스, 말토스, 슈크로스 및 트리사카라이드, 예를 들면, 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들면, 엑스트란일 수 있다. 안정화제는 본 발명의 폴리펩타이드의 중량부 당 0.1 내지 10,000 중량 범위로 존재할 수 있다. 비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)는, 치료제를 가용화시키는 것을 돕기 위해서 뿐만 아니라 교반으로 유도된 응집에 대해 치료학적 단백질을 보호하기 위해서도 첨가될 수 있으며, 또한 제제가 단백질의 변성을 야기하지 않으면서 응력을 받는 전단 표면에 노출되도록 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 플루로닉 폴리올(폴록사머 184, 188 등) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.01 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml의 범위, 또는 약 0.05 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
기타 다양한 부형제로는 벌킹제(예를 들면, 전분), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 산화방지제(예를 들면, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E) 및 공용매를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)의 수성 조성물을 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 추가로:
a.
FVIII 분자;
b.
40 내지 195 mM의 나트륨 염;
c.
히스티딘;
d.
적어도 1 mM의 칼슘 염; 및
e.
계면활성제를 포함하고;
여기서, [His] ≥ 180 mM - 20*[Ca2+]이고, [Ca2+]은 리터 당 밀리몰로 수성 조성물 중에 칼슘 이온의 농도이고, [His]는 리터 당 밀리몰로 수성 조성물 중에 히스티딘의 농도이고, 단, [His] > 0이고; 상기 조성물의 삼투압농도는 600 mOsmol/L이하이다. 수성 조성물 중에 나트륨 염의 농도는 45 내지 95 mM일 수 있다. 히스티딘 [His]의 농도는 5 내지 200 mM일 수 있다. 상기 조성물은 칼슘 이온 [Ca2+]을 포함할 수 있고, 농도는 5 내지 100 mM이다. 상기 조성물은 5 내지 9의 pH를 가질 수 있다. 상기 조성물의 칼슘 염은 바람직하게 염화칼슘 또는 염화나트륨일 수 있다. 상기 조성물은 추가로 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물은 바람직하게 슈크로스일 수 있다. 탄수화물의 농도는 1 내지 20 % (w/w)일 수 있다. 상기 계면활성제의 농도는 0.001 내지 0.2 % (v/v)일 수 있다. 계면활성제는 비-천연적으로 존재하는 계면활성제일 수 있다. 상기 조성물은 추가로 히스티딘 이외의 다른 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 히스티딘 이외의 다른 상기 적어도 하나의 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 류신, 이소류신 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 조성물은 추가로 적어도 하나의 항산화제를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 적어도 하나의 항산화제는 환원된 글루타티온, 메티오닌, 시스테인, 아황산나트륨, 비타민 A, 비타민 E, 아스코르브산, 나트륨 아스코르베이트 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 적어도 하나의 항산화제의 농도는 0.05 내지 100 mM에서 다양할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)에 추가로 염화나트륨, 사카로스, L-아르기닌, 칼슘 이온, 계면활성제 및 시트레이트를 포함한다. 바람직하게, 상기 조성물은 추가로 인자 VIII를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 10-30 mg/mL의 염화나트륨, 3-8 mg/mL의 사카로스, 3-8 mg/mL의 L-Arg x 2H2O, 0.1-0.5 mg/mL의 CaCl2 x 2H2O, 0.5-2 mg/mL의 폴록사머 188, 및 0.5-2 mg/mL의 Na-시트레이트 x 2H2O를 포함한다. 구체적으로 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 18 mg/mL의 염화나트륨, 5.4 mg/mL의 사카로스, 5.4 mg/mL의 L-Arg x 2H2O, 0.3 mg/mL의 CaCl2 x 2H2O, 1.2 mg/mL의 폴록사머 188, 및 1.2 mg/mL의 Na-시트레이트 x 2H2O를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)에 추가로 인자 VIII를 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 L-히스티딘, NaCl, CaCl2, 슈크로스, 폴리소르베이트 80을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)에 추가로 인자 VIII를 포함하고, 여기서, 상기 조성물은 pH 7에서 20mM의 L-히스티딘, 280mM의 NaCl, 3.4mM의 CaCl2, 0.6% w/v의 슈크로스, 0.02% v/v의 폴리소르베이트 80을 포함한다.
본원의 제형은 또한 본 발명의 폴리펩타이드 외에 또는 FVIII 및 본 발명의 폴리펩타이드 외에 추가의 치료학적 제제를 함유할 수 있다.
서열목록에 나타낸 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 표 1에 요약된다.
[표 1]
본 발명의 특정 구현예는 지금 단지 설명을 목적으로 의도된 하기의 실시예를 참조로 기재되고 이전에 기재된 일반론의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
발색 FVIII:C 검정
발색 FVIII:C 검정은 코어마틱 FVIII 시험 키트 (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italy)를 사용하여 수행하였다.
검정 원리: 칼슘 및 인지질의 존재 하에, 인자 X는 인자 IXa에 의해 인자 Xa로 활성화된다. 이러한 반응은 조인자로서의 인자 VIIIa에 의해 자극된다. FVIIIa는 측정하고자 하는 샘플 중의 FVIII로부터의 반응 혼합물 중의 소량의 트롬빈에 의해 형성된다. Ca2+, 인지질과 인자 IXa 및 과량의 인자 X의 최적 농도를 사용하는 경우, 인자 X의 활성화는 인자 VIII의 효능에 비례한다. 활성화된 인자 X는 발색 기질 S-2765로부터 발색단 pNA를 방출한다. 따라서, 405 nm에서 측정된 pNA의 방출은 형성된 FXa의 양에 비례하며, 그에 따라 샘플의 인자 VIII 활성에도 비례한다. 검정은, 자동화 응고 분석기, 둘다 제조원(Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Ludwig-Erhard-Straße 12, 65760 Eschborn, Germany)으로부터 시판되는 베링 응고 타이머(Behring Coagulation Timer (BCT)) 또는 베링 응고 시스템(Behring Coagulation System (BCS)) 상에서 수행되도록 적응시켰다.
실시예 1
D´D3 알부민 융합 단백질 (D´D3-FP)의 생성:
VWF 아미노산 1 내지 1242, 글리신/세린 링커를 암호화하는 cDNA 및 사람 알부민의 cDNA로 이루어진 D'D3-FP에 대한 발현 카세트는 커스텀(custom) 유전자 합성(Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany)에 의해 제조하였다. 플랭킹(flanking) 제한 부위(EcoRI, NotI)를 통해 발현 카세트는 공급된 클로닝 벡터로부터 절제되었고, EcoRI 및 NotI를 이용하여 선형화된 pIRESneo3 벡터(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에 삽입되었다. 수득한 발현 플라스미드는 CMV 프로모터 제어 하에 짧은 링커 암호화 서열을 통해 알부민 암호화 서열에 융합된 VWF 프로펩타이드, D' 및 D3(서열번호 4의 VWF 아미노산 1 내지 1242)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하였다. 암호화 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로서 나타내고, 성숙한 D'D3-FP의 아미노산 서열은 서열번호 2로서 나타낸다.
발현 플라스미드는 XL10 Gold(Agilent Technologies)에서 성장시켰고 표준 프로토콜(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 정제하였다.
CHO K1 세포는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 형질감염시켰고, 500 내지 1000㎍/ml 제네티신(Geneticin)의 존재 하에 무혈청 배지(CD-CHO, Invitrogen)에서 성장시켰다. WO2007/144173에 기재된 바와 같은 PACE/푸린(pFu-797)을 암호화하는 발현 플라스미드를 동시-형질감염시켜 프로펩타이드 절단 효능을 최대화하였다. 단일 세포 유도된 클론을 성장시켰고, 알부민 특이적 효소 면역검정(하기 참조)에 의해 정량된 이들의 D'D3-FP 발현 수율에 따라 선별하였다. D'D3-FP 발효에 대해 최종 선별된 세포주를 T2050-CL3이라고 호칭하였다.
D'D3-FP의 생산은 관류 방식으로 발효 공정을 적용하는 생물반응기(bioreactor)에서 수행하였다. D'D3-함유 폴리펩타이드의 생산을 위한 발효 공정은 세포주 T2050-CL3의 해동으로 시작하였고, 진탕 플라스크에서의 세포 확장 및 마지막으로 Sartorius BioStat B-DCU 5L 생물반응기 및 BioStat STR 50L 단일-사용 생물반응기를 사용한 관류 방식으로의 발효 공정으로 이어졌다. BioSeps 10L 또는 200L(Applikon)은 각각 세포 보유 장치로 사용되었다. 세포 배양 배지는 8mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 PowerCHO3(Lonza BESP1204) 또는 10mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 ProCHO5(Lonza BESP1072)이었다.
진탕 플라스크에서의 씨드 트레인(seed train)은 160rpm의 진탕 속도로 37 ℃, 7.5% CO2에서 수행하였다.
5L 생물반응기에 2.5 x 105 세포/mL의 표적 VCD를 접종하였다. 상기 세포는 8mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 PowerCHO3에서 +37.0℃의 온도, 7.00의 pH에서 그리고 30% 산소 포화도에서 배양하였다. +37.0℃에서 수행된 생물반응기로부터의 최초 수거물을 취득한 후 +34.0℃(평가된 범위 +31.0℃ 내지 +35.0℃)로의 온도 이동(shift)을 수행하였다. pH는 산으로서의 살포된(sparged) CO2 및 염기로서의 NaHCO3를 이용하여 제어하였다. 오버레이 기류 속도(overlay air flow rate)를 0.5L/min으로 설정하였다. 살포 유닛으로서 링 스파저(ring sparger)를 사용하였다. 교반 속도는 다운 풀 방식(down pull mode)의 2배 피치 블레이드 임펠러(2fold pitch blade impeller)를 이용하여 150rpm이었다.
50L 생물반응기에 3.0 x 105 세포/mL의 표적 VCD를 접종하였다. 상기 세포는 10mM의 L-글루타민 및 1μM의 CuSO4를 갖는 ProCHO5 배지에서 +37.0℃의 온도, 6.90의 pH에서 그리고 30% 산소 포화도에서 배양하였다. 최초 1 또는 2회의 수거 후 +34.0℃로의 온도 이동을 수행하였다. pH는 상기와 같이 제어하였고, 오버레이 기류 속도를 2L/min으로 설정하였다. 살포 유닛으로서 마이크로 스파저(micro sparger)를 사용하였다. 교반 속도는 다운 풀 방식(down pull mode)의 2배 피치 블레이드 임펠러(2fold pitch blade impeller)를 이용하여 90rpm이었다.
생물반응기 내의 VCD가 ≥1.0 x 106 세포/mL이었을 때에 관류를 개시하였다. 관류 속도를 1.0용적/용적/일로 설정하였다. BioSep은 5(10)분 실행 시간 및 7(30)W의 전력 입력으로 10초의 역 플러시(back flush)를 이용한 역 플러시 방식으로 작동되었다(괄호 안의 숫자는 50L 생물반응기를 나타낸다). 관류액 및 혈액은 직렬(inline) 여과되었고 +2℃ 내지 +8℃에서 48시간에 걸쳐 백(bag)에 수집하였다. VCD는 2g/L 글루코스의 표적을 갖는 파라미터로서 글루코스 소비를 이용한 혼탁도 프로브를 사용하여 활성 출혈에 의해 제어되었다. 수거물 및 혈액은 직렬 여과되었고 1회용 필터와 1회용 백으로 구성된 수거 시스템은 2일마다 교체되었다.
하기 기재되는 동결 건조 및 안정성 연구를 위한 재료를 제조하기 위해서 D'D3 알부민 융합 단백질 수거물을 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게, 생물반응기로부터의 무세포 수거물은 30kD 막(예를 들어, Pall Centramate OS030T12)을 갖는 TFF 시스템(예를 들어, Pall Centramate 500 S)을 이용하여 30배 농축시켰다. 해당 농축물은 0.75M NaCl 및 5mM EDTA의 최종 농도로 NaCl 및 EDTA로 스파이킹하였고(spiked), 20mM Tris 완충액 pH 7.4를 이용하여 사전-평형화된(pre-equilirated) CaptureSelect 사람 알부민 컬럼(Life Technologies) 상에 밤새 부하하였다. 평형화 완충액으로 상기 컬럼을 세척한 후, 용출 완충액(20mM Tris, 2M MgCl2, pH 7.4)을 이용하여 rD'D3-FP를 용출시켰다. 이어서, 상기 용출물을 10배 농축시켰고, 30kD 컷오프(cut-off)를 갖는 초 원심분리 필터(예를 들면, Amicon. UFC903024)를 이용하여 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4에 대해 투석시켰다. 단량체 부분으로부터 rD'D3-FP 이량체를 분리하기 위해, 해당 재료를 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4로 사전-평형화된 Superdex 200pg 컬럼(GE Healthcare Code: 17-1069-01) 상에 로딩하고 D’D3-FP 이량체를 항유하는 피크 분획물을 모았다. 이량체 및 단량체 피크 분획에 대한 곡선 아래 면적은 이량체 대 단량체 비를 계산하는데 사용하였다. D’D3-FP의 이량체 제제는 하기의 실시예에서 실험을 위해 사용하였다.
rVIII-단일쇄
실시예는 FVIII 분자 (WO 2004/067566에 기재된 작제물 dBN(64-53))을 사용하여 수행하였다. 상기 FVIII 분자는 하기에서 “rVIII-단일쇄(SingleChain)”로서 언급된다.
실시예 2: VWF 단편 이량체 및 단량체에 대한 FVIII의 친화성 측정
실시예 1에 기재된 바와 같은 짧은 링커 서열을 함유하는 VWF 단편 (1-1242) 알부민 융합체 (D´D3-FP)를 생물반응기에서 발현시키고; 상기된 바와 같이 정제하고 단량체 및 이량체를 단리시킨 후, 이들 제제에 대한 FVIII의 친화성을 바이오코어 장비(Biacore instrument (T200, GE Healthcare))를 통해 표면 플라스몬 공명을 통해 평가하였다.
항-알부민 항체(MA1-20124, Thermo Scientific)는 이의 N-말단을 통해 제조원(GE Healthcare)으로부터의 아민 커플링 키트(BR1000-50)에 둘 다 함유된 NHS(N-하이드록시석신이미드) 및 EDC(에탄올아민 하이드로클로라이드)에 의해 활성화된 CM 3 칩에 공유결합으로 커플링시켰다. 고정화를 위해, 3 μg/mL의 항체를 나트륨 아세테이트 완충액(10 mM, pH 5.0)에서 희석시키고 항체 용액을 7분 동안 10 μL/min의 유속으로 칩상에 유동시켰다. 고정화 과정 후, 비-커플링된 덱스트란 필라멘트는 5분 동안 칩 상에 에탄올아민 용액 (1M, pH 8.3)을 유동시킴(10 μL/min의 유속으로)에 의해 포화시켰다. 유동 세포를 포화시키는 것의 목적은 상기 칩에 대한 분석물의 비특이적 결합을 최소화하기 위한 것이었다. 참조 유동 세포는 상기와 동일한 절차를 이용함으로써 에탄올아민으로 빈(empty) 유동 세포를 포화시킴으로써 설정되었다.
이량체성 및 단량체성 D'D3-FP 단백질은 각각 3분 동안 칩 상에 D'D3-FP 단백질(5㎍/mL)을 유동(10㎕/분의 유속)시켜 공유결합으로 커플링된 항-알부민 항체에 고정화하였다.
FVIII에 대한 결합 곡선을 생성하기 위해, 각각의 D'D3-FP 단백질 제제를 전개 완충액(HBS-P+: 0.1M HEPES, 1.5M NaCl 및 0.5% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4; 제품 코드 BR100671, GE Healthcare)에 0.25nM, 0.5nM, 1nM, 3nM 및 4nM의 농도로 희석시켰다. 단일 주기 동력학을 수행함으로써, 각각의 희석액의 상승하는 농도를 갖는 샘플을 2분 동안 칩 상에 유동시키고(유속 30μL/분), 전개 완충액 HBS-P+를 이용한 10분의 해리 시간이 이어졌다. 모든 측정은 2회 실행하였다. 측정 절차를 위한 온도는 +25℃로 조정하였다.
결합 파라미터는 BiaEvaluation 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 곡선 피팅(curve fitting) 방법은 랭뮤어(Langmuir) 방정식에 기초하였다. 상기 계산을 위한 입력 데이터는 분석물 FVIII(rVIII-단일쇄)의 몰량이었고, 최대 RU와 같은 기타 파라미터들 및 기울기는 핏팅된(fitted) 결합 및 해리 곡선으로부터 자동으로 얻어졌다. BioEvaluation 소프트웨어의 출력값은 결합 속도 상수 및 해리 속도 상수이고, 이로부터 친화성 상수가 계산되었다. 상기 결과는 표 2에 나타낸다.
[표 2]
이량체성 D'D3-FP는 rVIII-단일쇄의 보다 신속한 결합 및 보다 느린 해리 둘다로부터 비롯되는 D'D3-FP 단량체(KD = 30 nM)와 비교하여 FVIII에 대해 상당히 (KD = 34 pM) 증가된 친화성을 보여준다.
실시예 3
FVIII + rD’D3-FP 제형의 제조 및 액체 상태로 저장 시 FVIII:C 회수(즉, 발색 검정에 의한 활성)의 평가.
정제된 rVIII-단일쇄는 제조용 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 pg; GE Healthcare, Ref. No.17-1043)에 의한 목적하는 완충액 및 부형제 조성물 (즉, 20 mM L-히스티딘, 280 mM NaCl, 3.4 mM CaCl2, 0.6 % w/v 슈크로스, 0.02 % v/v 폴리소르베이트 80, pH 7)로 제형화하였다. 정제된 rD’D3-FP는 희석에 의한 동일한 완충액 및 부형제 매트릭스로 제형화하였다. 성분 둘다를 함께 혼합하여 표 3에 기재된 바와 같이 목적하는 FVIII 활성 및 rD’D3-FP 농도를 성취하였다. 저장 전에, 제형은 멸균 여과 (Millex GV 1회용 필터 유닛; Millipore, Ref. No. SLGV013SL)하여 미생물 오염에 의해 유도된 잠재적 분해를 회피하였다.
상이한 조성물은 이어서 25 ℃에서 6주의 기간 동안 FVIII:C에서 이들의 회수율에 대해 조사하였다.
FVIII:C의 회수율(수율)은 저장 전 용액 중에 FVIII:C의 양으로 나눈 저장 후 각각의 제형중에 FVIII:C의 양의 퍼센트로서 계산하였다.
[표 3]
실시예 4
FVIII + rD’D3-FP 제형의 제조 및 동결 건조 시 FVIII:C 회수율(즉, 발색 검정에 의한 활성)의 평가.
정제된 rVIII-단일쇄는 제조용 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 pg)에 의한 완충액 및 부형제 조성물 (20 mM L-히스티딘, 280 mM NaCl, 3.4 mM CaCl2, 0.6 % w/v 슈크로스, 0.02 % v/v 폴리소르베이트 80, pH 7)로 제형화하였다. 정제된 rD’D3-FP는 동일한 완충액 및 부형제 매트릭스로 제형화하였다. 성분 둘다를 함께 혼합하여 표 4에 기재된 바와 같이 목적하는 FVIII 활성 및 rD’D3-FP 농도를 성취하였다. 제형은 이어서 분배하고(2.5 mL) 동결 건조시켰다. 상이한 조성물은 이어서 동결 건조 동안 FVIII:C 중 이들의 상실에 대해 조사하였다.
FVIII:C의 % 상실은 재구성된 동결건조물 중에 FVIII:C의 양에 100을 곱하고 동결 건조 전 용액 중에 FVIII:C의 양으로 나누고 100으로부터 공제하여 계산하였다:
FVIII:C의 상실 (%) = 100 - (100 * 동결 건조 후 FVIII:C/동결 건조 전 FVIII:C)
[표 4]
실시예 5:
FVIII + rD’D3-FP 제형의 제조 및 승온에서 장기 저장 시 동결 건조된 샘플 중에 FVIII:C 회수율(즉, 발색 검정에 의한 활성)의 평가.
정제된 rVIII-단일쇄는 제조용 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 pg)에 의한 완충액 및 부형제 조성물 (20 mM L-히스티딘, 280 mM NaCl, 3.4 mM CaCl2, 0.6 % w/v 슈크로스, 0.02 % v/v 폴리소르베이트 80, pH 7)로 제형화하였다. 정제된 rD’D3-FP는 동일한 완충액 및 부형제 매트릭스로 제형화하였다. 성분 둘다를 함께 혼합하여 표 5에 기재된 바와 같이 목적하는 FVIII 활성 및 rD’D3-FP 농도를 성취하였다. 제형은 이어서 바이알에 분배하고(2.5 mL) 동결 건조시켰다. 상이한 조성물은 이어서 동결 건조 후 및 최대 24개월 동안 +25 ℃에서 저장 후 FVIII:C에서 이들의 회수율에 대해 조사하였다.
FVIII:C 회수율(안정성)은 저장 후 여전히 측정될 수 있는 FVIII:C의 퍼센트로서 계산하였다. 동결 건조 후 및 저장 전 결정된 FVIII:C는 계산을 위한 참조로서 사용하였다.
[표 5]
몰비
본 발명에 따른 임의의 몰비는 실제로 단량체 또는 이량체로 존재하던 간에 상관없이 본 발명에 사용된 폴리펩타이드를 함유하는 D’D3의 (단량체성) 서브유닛 및 FVIII의 몰 농도의 비율을 언급한다. 보다 구체적으로, 본원에서 FVIII에 대한 rD’D3-FP의 임의의 비율은 달리 지적되지 않은 경우, 용액 중에 또는 동결 건조된 생성물 중에 (몰 또는 몰/L로) FVIII의 양 또는 농도로 나눈, 용액 중에 또는 동결 건조된 생성물 중에 (몰 또는 몰/L로) rD’D3-FP의 양 또는 농도를 언급한다.
전형적으로, FVIII의 농도는 활성 시험 (FVIII:C)에 의해 측정하고 IU/mL로 나타낸다. rD’D3-FP (알부민과 함께 VWF의 D’D3 도메인의 재조합 융합 단백질)의 농도는 전형적으로 mg/mL로 나타낸다. 이들 값은 하기에 기재된 바와 같이 몰농도로 전환될 수 있다.
계산을 위해 사용되는 rD’D3-FP의 단량체 서브유닛 (당화를 포함하는)의 분자량은 127,000 Da이다. 계산을 위해 사용되는 FVIII (rVIII-단일쇄) (당화를 포함하는)의 분자량은 180,000 Da이고, 계산을 위해 사용되는 이의 비활성은 11,000 IU/mg이다.
[표 6]
SEQUENCE LISTING
<110> CSL Behring Lengnau AG
<120> A truncated von Willebrand Factor (VWF) for increasing the in vitro stability of coagulation factor VIII
<130> 2019_L002_A302
<140> EP19184390.3
<141> 2019-07-04
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5616
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding construct VWF fragment - G/S linker - albumin
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> EcoRI restriction enzyme cleavage site
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(3757)
<223> coding sequence for VWF amino acids 1 to 1242
<220>
<221> misc_feature
<222> (3758)..(3850)
<223> coding sequence for glycine/serine linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (3851)..(5608)
<223> coding sequence for human albumin
<220>
<221> misc_feature
<222> (5609)..(5616)
<223> NotI restriction enzyme cleavage site
<400> 1
gaattcccgc agccctcatt tgcaggggaa gatgattcct gccagatttg ccggggtgct 60
gcttgctctg gccctcattt tgccagggac cctttgtgca gaaggaactc gcggcaggtc 120
atccacggcc cgatgcagcc ttttcggaag tgacttcgtc aacacctttg atgggagcat 180
gtacagcttt gcgggatact gcagttacct cctggcaggg ggctgccaga aacgctcctt 240
ctcgattatt ggggacttcc agaatggcaa gagagtgagc ctctccgtgt atcttgggga 300
attttttgac atccatttgt ttgtcaatgg taccgtgaca cagggggacc aaagagtctc 360
catgccctat gcctccaaag ggctgtatct agaaactgag gctgggtact acaagctgtc 420
cggtgaggcc tatggctttg tggccaggat cgatggcagc ggcaactttc aagtcctgct 480
gtcagacaga tacttcaaca agacctgcgg gctgtgtggc aactttaaca tctttgctga 540
agatgacttt atgacccaag aagggacctt gacctcggac ccttatgact ttgccaactc 600
atgggctctg agcagtggag aacagtggtg tgaacgggca tctcctccca gcagctcatg 660
caacatctcc tctggggaaa tgcagaaggg cctgtgggag cagtgccagc ttctgaagag 720
cacctcggtg tttgcccgct gccaccctct ggtggacccc gagccttttg tggccctgtg 780
tgagaagact ttgtgtgagt gtgctggggg gctggagtgc gcctgccctg ccctcctgga 840
gtacgcccgg acctgtgccc aggagggaat ggtgctgtac ggctggaccg accacagcgc 900
gtgcagccca gtgtgccctg ctggtatgga gtataggcag tgtgtgtccc cttgcgccag 960
gacctgccag agcctgcaca tcaatgaaat gtgtcaggag cgatgcgtgg atggctgcag 1020
ctgccctgag ggacagctcc tggatgaagg cctctgcgtg gagagcaccg agtgtccctg 1080
cgtgcattcc ggaaagcgct accctcccgg cacctccctc tctcgagact gcaacacctg 1140
catttgccga aacagccagt ggatctgcag caatgaagaa tgtccagggg agtgccttgt 1200
cacaggtcaa tcacacttca agagctttga caacagatac ttcaccttca gtgggatctg 1260
ccagtacctg ctggcccggg attgccagga ccactccttc tccattgtca ttgagactgt 1320
ccagtgtgct gatgaccgcg acgctgtgtg cacccgctcc gtcaccgtcc ggctgcctgg 1380
cctgcacaac agccttgtga aactgaagca tggggcagga gttgccatgg atggccagga 1440
cgtccagctc cccctcctga aaggtgacct ccgcatccag catacagtga cggcctccgt 1500
gcgcctcagc tacggggagg acctgcagat ggactgggat ggccgcggga ggctgctggt 1560
gaagctgtcc cccgtctatg ccgggaagac ctgcggcctg tgtgggaatt acaatggcaa 1620
ccagggcgac gacttcctta ccccctctgg gctggcggag ccccgggtgg aggacttcgg 1680
gaacgcctgg aagctgcacg gggactgcca ggacctgcag aagcagcaca gcgatccctg 1740
cgccctcaac ccgcgcatga ccaggttctc cgaggaggcg tgcgcggtcc tgacgtcccc 1800
cacattcgag gcctgccatc gtgccgtcag cccgctgccc tacctgcgga actgccgcta 1860
cgacgtgtgc tcctgctcgg acggccgcga gtgcctgtgc ggcgccctgg ccagctatgc 1920
cgcggcctgc gcggggagag gcgtgcgcgt cgcgtggcgc gagccaggcc gctgtgagct 1980
gaactgcccg aaaggccagg tgtacctgca gtgcgggacc ccctgcaacc tgacctgccg 2040
ctctctctct tacccggatg aggaatgcaa tgaggcctgc ctggagggct gcttctgccc 2100
cccagggctc tacatggatg agagggggga ctgcgtgccc aaggcccagt gcccctgtta 2160
ctatgacggt gagatcttcc agccagaaga catcttctca gaccatcaca ccatgtgcta 2220
ctgtgaggat ggcttcatgc actgtaccat gagtggagtc cccggaagct tgctgcctga 2280
cgctgtcctc agcagtcccc tgtctcatcg cagcaaaagg agcctatcct gtcggccccc 2340
catggtcaag ctggtgtgtc ccgctgacaa cctgcgggct gaagggctcg agtgtaccaa 2400
aacgtgccag aactatgacc tggagtgcat gagcatgggc tgtgtctctg gctgcctctg 2460
ccccccgggc atggtccggc atgagaacag atgtgtggcc ctggaaaggt gtccctgctt 2520
ccatcagggc aaggagtatg cccctggaga aacagtgaag attggctgca acacttgtgt 2580
ctgtcgggac cggaagtgga actgcacaga ccatgtgtgt gatgccacgt gctccacgat 2640
cggcatggcc cactacctca ccttcgacgg gctcaaatac ctgttccccg gggagtgcca 2700
gtacgttctg gtgcaggatt actgcggcag taaccctggg acctttcgga tcctagtggg 2760
gaataaggga tgcagccacc cctcagtgaa atgcaagaaa cgggtcacca tcctggtgga 2820
gggaggagag attgagctgt ttgacgggga ggtgaatgtg aagaggccca tgaaggatga 2880
gactcacttt gaggtggtgg agtctggccg gtacatcatt ctgctgctgg gcaaagccct 2940
ctccgtggtc tgggaccgcc acctgagcat ctccgtggtc ctgaagcaga cataccagga 3000
gaaagtgtgt ggcctgtgtg ggaattttga tggcatccag aacaatgacc tcaccagcag 3060
caacctccaa gtggaggaag accctgtgga ctttgggaac tcctggaaag tgagctcgca 3120
gtgtgctgac accagaaaag tgcctctgga ctcatcccct gccacctgcc ataacaacat 3180
catgaagcag acgatggtgg attcctcctg tagaatcctt accagtgacg tcttccagga 3240
ctgcaacaag ctggtggacc ccgagccata tctggatgtc tgcatttacg acacctgctc 3300
ctgtgagtcc attggggact gcgcctgctt ctgcgacacc attgctgcct atgcccacgt 3360
gtgtgcccag catggcaagg tggtgacctg gaggacggcc acattgtgcc cccagagctg 3420
cgaggagagg aatctccggg agaacgggta tgagtgtgag tggcgctata acagctgtgc 3480
acctgcctgt caagtcacgt gtcagcaccc tgagccactg gcctgccctg tgcagtgtgt 3540
ggagggctgc catgcccact gccctccagg gaaaatcctg gatgagcttt tgcagacctg 3600
cgttgaccct gaagactgtc cagtgtgtga ggtggctggc cggcgttttg cctcaggaaa 3660
gaaagtcacc ttgaatccca gtgaccctga gcactgccag atttgccact gtgatgttgt 3720
caacctcacc tgtgaagcct gccaggagcc gggaggctcg agcgggggat ctggcgggtc 3780
tggaggctct ggagggtcgg gaggctctgg aggctctggg ggatctggcg ggtctggagg 3840
gtcgggatcc gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga 3900
aaatttcaaa gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga 3960
agatcatgta aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga 4020
gtcagctgaa aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt 4080
tgcaactctt cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga 4140
gagaaatgaa tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag 4200
accagaggtt gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa 4260
atacttatat gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt 4320
tgctaaaagg tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg 4380
cctgttgcca aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag 4440
actcaagtgt gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc 4500
tcgcctgagc cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga 4560
tcttaccaaa gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag 4620
ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 4680
atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 4740
gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 4800
aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag 4860
gcatcctgat tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct 4920
agagaagtgc tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt 4980
taaacctctt gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca 5040
gcttggagag tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca 5100
agtgtcaact ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg 5160
ttgtaaacat cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct 5220
gaaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg 5280
cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata 5340
cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc 5400
tgagaaggag agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc 5460
caaggcaaca aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa 5520
gtgctgcaag gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc 5580
tgcaagtcaa gctgccttag gcttataggc ggccgc 5616
<210> 2
<211> 1096
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide encoded by SEQ ID NO:1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(479)
<223> VWF D'3 region (VWF amino acids 764 - 1242)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(100)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (480)..(510)
<223> glycine/serine linker
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (511)..(1095)
<223> human albumin
<400> 2
Xaa Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala
1 5 10 15
Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn
20 25 30
Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys
35 40 45
Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg
50 55 60
Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val
65 70 75 80
Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys
85 90 95
Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His
100 105 110
Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln
115 120 125
Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg
130 135 140
Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys
145 150 155 160
Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp
165 170 175
Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu
180 185 190
Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu
195 200 205
Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln
210 215 220
Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile
225 230 235 240
Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro
245 250 255
Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr
260 265 270
Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile
275 280 285
Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp
290 295 300
Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp
305 310 315 320
Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
325 330 335
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His
340 345 350
Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys
355 360 365
Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr
370 375 380
Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro
385 390 395 400
Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro
405 410 415
Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu
420 425 430
Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys
435 440 445
Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His
450 455 460
Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly
465 470 475 480
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
485 490 495
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Asp
500 505 510
Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu
515 520 525
Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln
530 535 540
Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe
545 550 555 560
Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser
565 570 575
Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg
580 585 590
Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu
595 600 605
Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro
610 615 620
Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp
625 630 635 640
Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
645 650 655
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr
660 665 670
Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys
675 680 685
Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser
690 695 700
Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg
705 710 715 720
Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys
725 730 735
Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
740 745 750
His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
755 760 765
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser
770 775 780
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
785 790 795 800
Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu
805 810 815
Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu
820 825 830
Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg
835 840 845
His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr
850 855 860
Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys
865 870 875 880
Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln
885 890 895
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr
900 905 910
Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln
915 920 925
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val
930 935 940
Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala
945 950 955 960
Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu
965 970 975
Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
980 985 990
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr
995 1000 1005
Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
1010 1015 1020
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr
1025 1030 1035
Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu
1040 1045 1050
Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys
1055 1060 1065
Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly
1070 1075 1080
Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
1085 1090 1095
<210> 3
<211> 8442
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(8442)
<400> 3
atg att cct gcc aga ttt gcc ggg gtg ctg ctt gct ctg gcc ctc att 48
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
ttg cca ggg acc ctt tgt gca gaa gga act cgc ggc agg tca tcc acg 96
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
gcc cga tgc agc ctt ttc gga agt gac ttc gtc aac acc ttt gat ggg 144
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
agc atg tac agc ttt gcg gga tac tgc agt tac ctc ctg gca ggg ggc 192
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
tgc cag aaa cgc tcc ttc tcg att att ggg gac ttc cag aat ggc aag 240
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
aga gtg agc ctc tcc gtg tat ctt ggg gaa ttt ttt gac atc cat ttg 288
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
ttt gtc aat ggt acc gtg aca cag ggg gac caa aga gtc tcc atg ccc 336
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
tat gcc tcc aaa ggg ctg tat cta gaa act gag gct ggg tac tac aag 384
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
ctg tcc ggt gag gcc tat ggc ttt gtg gcc agg atc gat ggc agc ggc 432
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
aac ttt caa gtc ctg ctg tca gac aga tac ttc aac aag acc tgc ggg 480
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
ctg tgt ggc aac ttt aac atc ttt gct gaa gat gac ttt atg acc caa 528
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
gaa ggg acc ttg acc tcg gac cct tat gac ttt gcc aac tca tgg gct 576
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
ctg agc agt gga gaa cag tgg tgt gaa cgg gca tct cct ccc agc agc 624
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
tca tgc aac atc tcc tct ggg gaa atg cag aag ggc ctg tgg gag cag 672
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
tgc cag ctt ctg aag agc acc tcg gtg ttt gcc cgc tgc cac cct ctg 720
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
gtg gac ccc gag cct ttt gtg gcc ctg tgt gag aag act ttg tgt gag 768
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
tgt gct ggg ggg ctg gag tgc gcc tgc cct gcc ctc ctg gag tac gcc 816
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
cgg acc tgt gcc cag gag gga atg gtg ctg tac ggc tgg acc gac cac 864
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
agc gcg tgc agc cca gtg tgc cct gct ggt atg gag tat agg cag tgt 912
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
gtg tcc cct tgc gcc agg acc tgc cag agc ctg cac atc aat gaa atg 960
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
tgt cag gag cga tgc gtg gat ggc tgc agc tgc cct gag gga cag ctc 1008
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
ctg gat gaa ggc ctc tgc gtg gag agc acc gag tgt ccc tgc gtg cat 1056
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
tcc gga aag cgc tac cct ccc ggc acc tcc ctc tct cga gac tgc aac 1104
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
acc tgc att tgc cga aac agc cag tgg atc tgc agc aat gaa gaa tgt 1152
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
cca ggg gag tgc ctt gtc aca ggt caa tca cac ttc aag agc ttt gac 1200
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
aac aga tac ttc acc ttc agt ggg atc tgc cag tac ctg ctg gcc cgg 1248
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
gat tgc cag gac cac tcc ttc tcc att gtc att gag act gtc cag tgt 1296
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
gct gat gac cgc gac gct gtg tgc acc cgc tcc gtc acc gtc cgg ctg 1344
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
cct ggc ctg cac aac agc ctt gtg aaa ctg aag cat ggg gca gga gtt 1392
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
gcc atg gat ggc cag gac gtc cag ctc ccc ctc ctg aaa ggt gac ctc 1440
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
cgc atc cag cat aca gtg acg gcc tcc gtg cgc ctc agc tac ggg gag 1488
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
gac ctg cag atg gac tgg gat ggc cgc ggg agg ctg ctg gtg aag ctg 1536
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
tcc ccc gtc tat gcc ggg aag acc tgc ggc ctg tgt ggg aat tac aat 1584
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
ggc aac cag ggc gac gac ttc ctt acc ccc tct ggg ctg gcg gag ccc 1632
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
cgg gtg gag gac ttc ggg aac gcc tgg aag ctg cac ggg gac tgc cag 1680
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
gac ctg cag aag cag cac agc gat ccc tgc gcc ctc aac ccg cgc atg 1728
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
acc agg ttc tcc gag gag gcg tgc gcg gtc ctg acg tcc ccc aca ttc 1776
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
gag gcc tgc cat cgt gcc gtc agc ccg ctg ccc tac ctg cgg aac tgc 1824
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
cgc tac gac gtg tgc tcc tgc tcg gac ggc cgc gag tgc ctg tgc ggc 1872
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
gcc ctg gcc agc tat gcc gcg gcc tgc gcg ggg aga ggc gtg cgc gtc 1920
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
gcg tgg cgc gag cca ggc cgc tgt gag ctg aac tgc ccg aaa ggc cag 1968
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
gtg tac ctg cag tgc ggg acc ccc tgc aac ctg acc tgc cgc tct ctc 2016
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
tct tac ccg gat gag gaa tgc aat gag gcc tgc ctg gag ggc tgc ttc 2064
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
tgc ccc cca ggg ctc tac atg gat gag agg ggg gac tgc gtg ccc aag 2112
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
gcc cag tgc ccc tgt tac tat gac ggt gag atc ttc cag cca gaa gac 2160
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
atc ttc tca gac cat cac acc atg tgc tac tgt gag gat ggc ttc atg 2208
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
cac tgt acc atg agt gga gtc ccc gga agc ttg ctg cct gac gct gtc 2256
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
ctc agc agt ccc ctg tct cat cgc agc aaa agg agc cta tcc tgt cgg 2304
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
ccc ccc atg gtc aag ctg gtg tgt ccc gct gac aac ctg cgg gct gaa 2352
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
ggg ctc gag tgt acc aaa acg tgc cag aac tat gac ctg gag tgc atg 2400
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
agc atg ggc tgt gtc tct ggc tgc ctc tgc ccc ccg ggc atg gtc cgg 2448
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
cat gag aac aga tgt gtg gcc ctg gaa agg tgt ccc tgc ttc cat cag 2496
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
ggc aag gag tat gcc cct gga gaa aca gtg aag att ggc tgc aac act 2544
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
tgt gtc tgt cgg gac cgg aag tgg aac tgc aca gac cat gtg tgt gat 2592
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
gcc acg tgc tcc acg atc ggc atg gcc cac tac ctc acc ttc gac ggg 2640
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
ctc aaa tac ctg ttc ccc ggg gag tgc cag tac gtt ctg gtg cag gat 2688
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
tac tgc ggc agt aac cct ggg acc ttt cgg atc cta gtg ggg aat aag 2736
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
gga tgc agc cac ccc tca gtg aaa tgc aag aaa cgg gtc acc atc ctg 2784
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
gtg gag gga gga gag att gag ctg ttt gac ggg gag gtg aat gtg aag 2832
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
agg ccc atg aag gat gag act cac ttt gag gtg gtg gag tct ggc cgg 2880
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
tac atc att ctg ctg ctg ggc aaa gcc ctc tcc gtg gtc tgg gac cgc 2928
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
cac ctg agc atc tcc gtg gtc ctg aag cag aca tac cag gag aaa gtg 2976
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
tgt ggc ctg tgt ggg aat ttt gat ggc atc cag aac aat gac ctc acc 3024
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
agc agc aac ctc caa gtg gag gaa gac cct gtg gac ttt ggg aac 3069
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
tcc tgg aaa gtg agc tcg cag tgt gct gac acc aga aaa gtg cct 3114
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
ctg gac tca tcc cct gcc acc tgc cat aac aac atc atg aag cag 3159
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
acg atg gtg gat tcc tcc tgt aga atc ctt acc agt gac gtc ttc 3204
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
cag gac tgc aac aag ctg gtg gac ccc gag cca tat ctg gat gtc 3249
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
tgc att tac gac acc tgc tcc tgt gag tcc att ggg gac tgc gcc 3294
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
tgc ttc tgc gac acc att gct gcc tat gcc cac gtg tgt gcc cag 3339
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
cat ggc aag gtg gtg acc tgg agg acg gcc aca ttg tgc ccc cag 3384
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
agc tgc gag gag agg aat ctc cgg gag aac ggg tat gag tgt gag 3429
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
tgg cgc tat aac agc tgt gca cct gcc tgt caa gtc acg tgt cag 3474
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
cac cct gag cca ctg gcc tgc cct gtg cag tgt gtg gag ggc tgc 3519
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
cat gcc cac tgc cct cca ggg aaa atc ctg gat gag ctt ttg cag 3564
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
acc tgc gtt gac cct gaa gac tgt cca gtg tgt gag gtg gct ggc 3609
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
cgg cgt ttt gcc tca gga aag aaa gtc acc ttg aat ccc agt gac 3654
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
cct gag cac tgc cag att tgc cac tgt gat gtt gtc aac ctc acc 3699
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
tgt gaa gcc tgc cag gag ccg gga ggc ctg gtg gtg cct ccc aca 3744
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
gat gcc ccg gtg agc ccc acc act ctg tat gtg gag gac atc tcg 3789
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
gaa ccg ccg ttg cac gat ttc tac tgc agc agg cta ctg gac ctg 3834
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
gtc ttc ctg ctg gat ggc tcc tcc agg ctg tcc gag gct gag ttt 3879
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
gaa gtg ctg aag gcc ttt gtg gtg gac atg atg gag cgg ctg cgc 3924
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
atc tcc cag aag tgg gtc cgc gtg gcc gtg gtg gag tac cac gac 3969
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
ggc tcc cac gcc tac atc ggg ctc aag gac cgg aag cga ccg tca 4014
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
gag ctg cgg cgc att gcc agc cag gtg aag tat gcg ggc agc cag 4059
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
gtg gcc tcc acc agc gag gtc ttg aaa tac aca ctg ttc caa atc 4104
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
ttc agc aag atc gac cgc cct gaa gcc tcc cgc atc gcc ctg ctc 4149
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
ctg atg gcc agc cag gag ccc caa cgg atg tcc cgg aac ttt gtc 4194
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
cgc tac gtc cag ggc ctg aag aag aag aag gtc att gtg atc ccg 4239
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
gtg ggc att ggg ccc cat gcc aac ctc aag cag atc cgc ctc atc 4284
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
gag aag cag gcc cct gag aac aag gcc ttc gtg ctg agc agt gtg 4329
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
gat gag ctg gag cag caa agg gac gag atc gtt agc tac ctc tgt 4374
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
gac ctt gcc cct gaa gcc cct cct cct act ctg ccc ccc cac atg 4419
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
gca caa gtc act gtg ggc ccg ggg ctc ttg ggg gtt tcg acc ctg 4464
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
ggg ccc aag agg aac tcc atg gtt ctg gat gtg gcg ttc gtc ctg 4509
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
gaa gga tcg gac aaa att ggt gaa gcc gac ttc aac agg agc aag 4554
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
gag ttc atg gag gag gtg att cag cgg atg gat gtg ggc cag gac 4599
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
agc atc cac gtc acg gtg ctg cag tac tcc tac atg gtg acc gtg 4644
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
gag tac ccc ttc agc gag gca cag tcc aaa ggg gac atc ctg cag 4689
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
cgg gtg cga gag atc cgc tac cag ggc ggc aac agg acc aac act 4734
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
ggg ctg gcc ctg cgg tac ctc tct gac cac agc ttc ttg gtc agc 4779
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
cag ggt gac cgg gag cag gcg ccc aac ctg gtc tac atg gtc acc 4824
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
gga aat cct gcc tct gat gag atc aag agg ctg cct gga gac atc 4869
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
cag gtg gtg ccc att gga gtg ggc cct aat gcc aac gtg cag gag 4914
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
ctg gag agg att ggc tgg ccc aat gcc cct atc ctc atc cag gac 4959
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
ttt gag acg ctc ccc cga gag gct cct gac ctg gtg ctg cag agg 5004
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
tgc tgc tcc gga gag ggg ctg cag atc ccc acc ctc tcc cct gca 5049
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
cct gac tgc agc cag ccc ctg gac gtg atc ctt ctc ctg gat ggc 5094
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
tcc tcc agt ttc cca gct tct tat ttt gat gaa atg aag agt ttc 5139
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
gcc aag gct ttc att tca aaa gcc aat ata ggg cct cgt ctc act 5184
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
cag gtg tca gtg ctg cag tat gga agc atc acc acc att gac gtg 5229
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
cca tgg aac gtg gtc ccg gag aaa gcc cat ttg ctg agc ctt gtg 5274
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
gac gtc atg cag cgg gag gga ggc ccc agc caa atc ggg gat gcc 5319
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
ttg ggc ttt gct gtg cga tac ttg act tca gaa atg cat ggg gcg 5364
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
cgc ccg gga gcc tca aag gcg gtg gtc atc ctg gtc acg gac gtc 5409
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
tct gtg gat tca gtg gat gca gca gct gat gcc gcc agg tcc aac 5454
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
aga gtg aca gtg ttc cct att gga att gga gat cgc tac gat gca 5499
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
gcc cag cta cgg atc ttg gca ggc cca gca ggc gac tcc aac gtg 5544
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
gtg aag ctc cag cga atc gaa gac ctc cct acc atg gtc acc ttg 5589
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
ggc aat tcc ttc ctc cac aaa ctg tgc tct gga ttt gtt agg att 5634
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
tgc atg gat gag gat ggg aat gag aag agg ccc ggg gac gtc tgg 5679
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
acc ttg cca gac cag tgc cac acc gtg act tgc cag cca gat ggc 5724
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
cag acc ttg ctg aag agt cat cgg gtc aac tgt gac cgg ggg ctg 5769
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
agg cct tcg tgc cct aac agc cag tcc cct gtt aaa gtg gaa gag 5814
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
acc tgt ggc tgc cgc tgg acc tgc ccc tgc gtg tgc aca ggc agc 5859
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
tcc act cgg cac atc gtg acc ttt gat ggg cag aat ttc aag ctg 5904
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
act ggc agc tgt tct tat gtc cta ttt caa aac aag gag cag gac 5949
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
ctg gag gtg att ctc cat aat ggt gcc tgc agc cct gga gca agg 5994
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
cag ggc tgc atg aaa tcc atc gag gtg aag cac agt gcc ctc tcc 6039
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
gtc gag ctg cac agt gac atg gag gtg acg gtg aat ggg aga ctg 6084
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
gtc tct gtt cct tac gtg ggt ggg aac atg gaa gtc aac gtt tat 6129
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
ggt gcc atc atg cat gag gtc aga ttc aat cac ctt ggt cac atc 6174
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
ttc aca ttc act cca caa aac aat gag ttc caa ctg cag ctc agc 6219
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
ccc aag act ttt gct tca aag acg tat ggt ctg tgt ggg atc tgt 6264
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
gat gag aac gga gcc aat gac ttc atg ctg agg gat ggc aca gtc 6309
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
acc aca gac tgg aaa aca ctt gtt cag gaa tgg act gtg cag cgg 6354
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
cca ggg cag acg tgc cag ccc atc ctg gag gag cag tgt ctt gtc 6399
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
ccc gac agc tcc cac tgc cag gtc ctc ctc tta cca ctg ttt gct 6444
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
gaa tgc cac aag gtc ctg gct cca gcc aca ttc tat gcc atc tgc 6489
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
cag cag gac agt tgc cac cag gag caa gtg tgt gag gtg atc gcc 6534
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
tct tat gcc cac ctc tgt cgg acc aac ggg gtc tgc gtt gac tgg 6579
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
agg aca cct gat ttc tgt gct atg tca tgc cca cca tct ctg gtt 6624
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
tat aac cac tgt gag cat ggc tgt ccc cgg cac tgt gat ggc aac 6669
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
gtg agc tcc tgt ggg gac cat ccc tcc gaa ggc tgt ttc tgc cct 6714
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
cca gat aaa gtc atg ttg gaa ggc agc tgt gtc cct gaa gag gcc 6759
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
tgc act cag tgc att ggt gag gat gga gtc cag cac cag ttc ctg 6804
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
gaa gcc tgg gtc ccg gac cac cag ccc tgt cag atc tgc aca tgc 6849
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
ctc agc ggg cgg aag gtc aac tgc aca acg cag ccc tgc ccc acg 6894
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
gcc aaa gct ccc acg tgt ggc ctg tgt gaa gta gcc cgc ctc cgc 6939
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
cag aat gca gac cag tgc tgc ccc gag tat gag tgt gtg tgt gac 6984
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
cca gtg agc tgt gac ctg ccc cca gtg cct cac tgt gaa cgt ggc 7029
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
ctc cag ccc aca ctg acc aac cct ggc gag tgc aga ccc aac ttc 7074
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
acc tgc gcc tgc agg aag gag gag tgc aaa aga gtg tcc cca ccc 7119
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
tcc tgc ccc ccg cac cgt ttg ccc acc ctt cgg aag acc cag tgc 7164
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
tgt gat gag tat gag tgt gcc tgc aac tgt gtc aac tcc aca gtg 7209
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
agc tgt ccc ctt ggg tac ttg gcc tca acc gcc acc aat gac tgt 7254
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
ggc tgt acc aca acc acc tgc ctt ccc gac aag gtg tgt gtc cac 7299
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
cga agc acc atc tac cct gtg ggc cag ttc tgg gag gag ggc tgc 7344
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
gat gtg tgc acc tgc acc gac atg gag gat gcc gtg atg ggc ctc 7389
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
cgc gtg gcc cag tgc tcc cag aag ccc tgt gag gac agc tgt cgg 7434
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
tcg ggc ttc act tac gtt ctg cat gaa ggc gag tgc tgt gga agg 7479
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
tgc ctg cca tct gcc tgt gag gtg gtg act ggc tca ccg cgg ggg 7524
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
gac tcc cag tct tcc tgg aag agt gtc ggc tcc cag tgg gcc tcc 7569
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
ccg gag aac ccc tgc ctc atc aat gag tgt gtc cga gtg aag gag 7614
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
gag gtc ttt ata caa caa agg aac gtc tcc tgc ccc cag ctg gag 7659
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
gtc cct gtc tgc ccc tcg ggc ttt cag ctg agc tgt aag acc tca 7704
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
gcg tgc tgc cca agc tgt cgc tgt gag cgc atg gag gcc tgc atg 7749
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
ctc aat ggc act gtc att ggg ccc ggg aag act gtg atg atc gat 7794
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
gtg tgc acg acc tgc cgc tgc atg gtg cag gtg ggg gtc atc tct 7839
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
gga ttc aag ctg gag tgc agg aag acc acc tgc aac ccc tgc ccc 7884
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
ctg ggt tac aag gaa gaa aat aac aca ggt gaa tgt tgt ggg aga 7929
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
tgt ttg cct acg gct tgc acc att cag cta aga gga gga cag atc 7974
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
atg aca ctg aag cgt gat gag acg ctc cag gat ggc tgt gat act 8019
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
cac ttc tgc aag gtc aat gag aga gga gag tac ttc tgg gag aag 8064
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
agg gtc aca ggc tgc cca ccc ttt gat gaa cac aag tgt ctg gct 8109
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
gag gga ggt aaa att atg aaa att cca ggc acc tgc tgt gac aca 8154
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
tgt gag gag cct gag tgc aac gac atc act gcc agg ctg cag tat 8199
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
gtc aag gtg gga agc tgt aag tct gaa gta gag gtg gat atc cac 8244
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
tac tgc cag ggc aaa tgt gcc agc aaa gcc atg tac tcc att gac 8289
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
atc aac gat gtg cag gac cag tgc tcc tgc tgc tct ccg aca cgg 8334
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
acg gag ccc atg cag gtg gcc ctg cac tgc acc aat ggc tct gtt 8379
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
gtg tac cat gag gtt ctc aat gcc atg gag tgc aaa tgc tcc ccc 8424
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
agg aag tgc agc aag tga 8442
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 4
<211> 2813
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2600 2605 2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2615 2620 2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2630 2635 2640
Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2645 2650 2655
Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2660 2665 2670
His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys
2675 2680 2685
Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala
2690 2695 2700
Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2705 2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2720 2725 2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2735 2740 2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2750 2755 2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2765 2770 2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2780 2785 2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 5
<211> 1444
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of a single chain factor viii molecule
<400> 5
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln
755 760 765
Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met
770 775 780
Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
785 790 795 800
Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu
805 810 815
Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn
820 825 830
Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
835 840 845
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu
850 855 860
Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu
865 870 875 880
Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser
885 890 895
Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
900 905 910
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe
915 920 925
Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
930 935 940
Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
945 950 955 960
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn
965 970 975
Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe
980 985 990
Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
995 1000 1005
Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
1010 1015 1020
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
1025 1030 1035
Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg
1040 1045 1050
Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile
1055 1060 1065
His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr
1070 1075 1080
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1085 1090 1095
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1100 1105 1110
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
1115 1120 1125
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1130 1135 1140
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1145 1150 1155
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1160 1165 1170
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1175 1180 1185
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1190 1195 1200
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1205 1210 1215
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1220 1225 1230
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1235 1240 1245
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1250 1255 1260
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1265 1270 1275
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1280 1285 1290
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1295 1300 1305
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1310 1315 1320
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1325 1330 1335
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1340 1345 1350
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1355 1360 1365
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1370 1375 1380
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1385 1390 1395
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1400 1405 1410
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1415 1420 1425
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1430 1435 1440
Tyr
<210> 6
<211> 585
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 7
<211> 2332
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 7
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Arg Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655 1660 1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
Claims (21)
- 응고 인자 VIII (FVIII), 및 절단된 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서, 상기 FVIII의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 상기 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 조성물 내 상기 폴리펩타이드 대 상기 FVIII의 몰비가 20 초과인, 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 상기 FVIII의 저장 안정성을 증가시키는, 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물 내 상기 폴리펩타이드 대 상기 FVIII의 몰비가 50 초과인, 용도.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 야생형 VWF를 포함하지 않는, 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII가 재조합적으로 제조된 FVIII이거나 혈장 유래된 FVIII인, 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도가 20배 초과의 몰 과량의 상기 폴리펩타이드를 상기 FVIII에 첨가함으로써 상기 FVIII를 안정화시킴을 포함하는, 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 동결건조시키고 재구성할 시 FVIII의 수율이 상기 폴리펩타이드가 부재인 대조군 조성물을 동결건조시키고 재구성할 시 FVIII의 수율을 초과하는, 용도.
- 제7항에 있어서, 상기 동결 건조된 조성물이 동결 건조 직후 재구성되는, 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 동결 건조된 조성물의 25 ℃에서의 저장 동안에 FVIII 활성의 상실이 상기 폴리펩타이드가 부재인 동결 건조된 대조군 조성물의 것 미만인, 용도.
- 제9항에 있어서, 상기 저장이 12개월 기간 동안인, 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1주 동안 25 ℃에서 저장 후 상기 폴리펩타이드 및 상기 FVIII를 포함하는 액체 조성물 중에 상기 FVIII 활성이 상기 폴리펩타이드가 부재인 대조군 조성물의 것 초과인, 용도.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 1nM 이하의 해리 상수 KD 로 상기 FVIII에 결합하는, 용도.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242를 포함하는, 용도.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 서열번호 4의 아미노산 1243 내지 2813이 부재인, 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가
(a) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242,
(b) 서열번호 4의 아미노산 764 내지 1242와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
(c) (a) 또는 (b)의 단편으로 이루어진, 용도. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단된 VWF가 혈소판 당단백질 Ibα (GPIbα), 콜라겐, 인테그린 αIIbβIII (C1 도메인 내 RGDS 서열)에 대한 결합 부위 및/또는 ADAMTS13에 대한 절단 부위 (Tyr1605-Met1606)를 포함하지 않는, 용도.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 GPIbα를 통한 혈소판에 대해 낮은 친화성을 갖거나 필수적으로 친화성이 부재이고, 상기 낮은 친화성 또는 필수적으로 친수성의 부재가 상기 폴리펩타이드의 GPIbα로의 결합에 대한 해리 상수가 KD > 1 μM, 우선적으로 KD > 10 μM임을 특징으로 하는 용도.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 VWF 도메인 A1 및/또는 A3 또는 이의 일부를 함유하지 않고, 콜라겐 I형 및 III형에 대해 낮은 친화성을 갖거나 필수적으로 친화성이 부재이고, 상기 낮은 친화성 또는 필수적으로 친화성의 부재가 상기 폴리펩타이드의 콜라겐 I형 및 III형으로의 결합에 대한 해리 상수가 KD > 1 μM, 우선적으로 KD > 10 μM을 특징으로 하는, 용도.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 상기 절단된 VWF 및 반감기 연장 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질인, 용도.
- 제19항에 있어서, 상기 반감기 연장 폴리펩타이드가 알부민 또는 이의 단편인, 용도.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 제형인, 용도.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP19184390.3 | 2019-07-04 | ||
EP19184390 | 2019-07-04 | ||
PCT/EP2020/068772 WO2021001522A1 (en) | 2019-07-04 | 2020-07-03 | A truncated von willebrand factor (vwf) for increasing the in vitro stability of coagulation factor viii |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220029733A true KR20220029733A (ko) | 2022-03-08 |
Family
ID=67314593
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020227003739A KR20220029733A (ko) | 2019-07-04 | 2020-07-03 | 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220389082A1 (ko) |
EP (1) | EP3994162A1 (ko) |
JP (1) | JP2022538357A (ko) |
KR (1) | KR20220029733A (ko) |
CN (1) | CN114072420A (ko) |
AU (1) | AU2020300820A1 (ko) |
WO (1) | WO2021001522A1 (ko) |
Family Cites Families (76)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
AU2353384A (en) | 1983-01-19 | 1984-07-26 | Genentech Inc. | Amplification in eukaryotic host cells |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
US5605884A (en) | 1987-10-29 | 1997-02-25 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Factor VIII formulations in high ionic strength media |
CA1329760C (en) | 1987-10-29 | 1994-05-24 | Ted C. K. Lee | Plasma and recombinant protein formulations in high ionic strength media |
US4877608A (en) | 1987-11-09 | 1989-10-31 | Rorer Pharmaceutical Corporation | Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media |
DE69029765T2 (de) | 1989-07-24 | 1997-05-15 | Bayer Ag | Stabilisierung von hochgereinigten Proteinen |
DE4001451A1 (de) | 1990-01-19 | 1991-08-01 | Octapharma Ag | Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix |
DE4111393A1 (de) | 1991-04-09 | 1992-10-15 | Behringwerke Ag | Stabilisierte faktor viii-praeparationen |
AU670793B2 (en) | 1992-04-30 | 1996-08-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Improved solubilization and stabilization of factor VIII complex |
DE69333974T2 (de) | 1992-10-02 | 2006-08-03 | Genetics Institute, LLC, Cambridge | Zusammensetzung, welche den Koagulationsfaktor VIII beinhaltet; Verfahren zu deren Herstellung und die Benutzung eines Oberflächenaktiven Stoffes als Stabilisator |
WO1996018412A1 (en) | 1994-12-12 | 1996-06-20 | Beth Israel Hospital Association | Chimeric cytokines and uses thereof |
GB9501040D0 (en) | 1995-01-19 | 1995-03-08 | Quadrant Holdings Cambridge | Dried composition |
SE9501189D0 (sv) | 1995-03-31 | 1995-03-31 | Pharmacia Ab | Protein formulation |
AT403764B (de) * | 1996-03-15 | 1998-05-25 | Immuno Ag | Stabiler faktor viii/vwf-komplex |
US5763401A (en) | 1996-07-12 | 1998-06-09 | Bayer Corporation | Stabilized albumin-free recombinant factor VIII preparation having a low sugar content |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
CA2634664C (en) | 1999-02-22 | 2011-08-09 | University Of Connecticut | Novel albumin-free factor viii formulations |
US6887470B1 (en) | 1999-09-10 | 2005-05-03 | Conjuchem, Inc. | Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components |
ES2606840T3 (es) | 2001-10-10 | 2017-03-28 | Ratiopharm Gmbh | Remodelación y glicoconjugación de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) |
AU2003210806A1 (en) | 2002-03-05 | 2003-09-22 | Eli Lilly And Company | Heterologous g-csf fusion proteins |
GB0207092D0 (en) | 2002-03-26 | 2002-05-08 | Sod Conseils Rech Applic | Stable pharmaceutical composition containing factor VIII |
US7041635B2 (en) | 2003-01-28 | 2006-05-09 | In2Gen Co., Ltd. | Factor VIII polypeptide |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
DK2298347T3 (en) | 2003-05-06 | 2016-01-11 | Biogen Hemophilia Inc | COAGULATION FACTOR CHEMICAL PROTEINS FOR TREATING A HEMOSTATIC DISORDER |
EA008831B1 (ru) | 2003-06-12 | 2007-08-31 | Эли Лилли Энд Компани | Слитые белки аналогов glp-1 |
SI2298287T1 (en) | 2003-12-19 | 2018-08-31 | Novo Nordisk Health Care Ag | Stabilized compositions of factor VII polypeptides |
CA2551916C (en) | 2003-12-31 | 2014-04-29 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
KR100624013B1 (ko) | 2004-06-25 | 2006-09-19 | 주식회사 녹십자홀딩스 | 동결건조된 알부민 비함유 재조합 사람 혈액응고 제 8인자 제제 |
US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
DK1986612T3 (da) | 2006-02-07 | 2012-10-29 | Shire Human Genetic Therapies | Stabiliserede proteinsammensætninger med en fri thioldel |
TW200806317A (en) | 2006-03-20 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Methods for reducing protein aggregation |
KR20080108147A (ko) | 2006-03-31 | 2008-12-11 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 페질화된 인자 viii |
US7982010B2 (en) | 2006-03-31 | 2011-07-19 | Baxter International Inc. | Factor VIII polymer conjugates |
US7645860B2 (en) | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
US7985839B2 (en) | 2006-03-31 | 2011-07-26 | Baxter International Inc. | Factor VIII polymer conjugates |
PL3896090T3 (pl) | 2006-06-14 | 2022-05-02 | Csl Behring Gmbh | Rozszczepialne proteolitycznie białko fuzyjne zawierające czynnik krzepnięcia krwi |
EP3231440A1 (en) | 2006-12-22 | 2017-10-18 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
KR101503085B1 (ko) | 2006-12-27 | 2015-03-16 | 넥타르 테라퓨틱스 | 방출가능한 연결을 갖는 폰 빌레브란드 인자 및 인자 ⅷ폴리머 컨주게이트 |
EP1988101A1 (en) | 2007-05-04 | 2008-11-05 | Novo Nordisk A/S | Improvement of factor VIII polypeptide titers in cell cultures |
AU2008274195B2 (en) | 2007-07-11 | 2013-09-05 | Novo Nordisk A/S | Purification of factor VIII using a mixed-mode or multimodal resin |
EP2222329A1 (en) | 2007-11-09 | 2010-09-01 | Baxter International Inc. | Modified recombinant factor viii and von willebrand factor and methods of use |
PL2257311T3 (pl) | 2008-02-27 | 2014-09-30 | Novo Nordisk As | Koniugaty cząsteczek czynnika VIII |
CA2738679A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Baxter International Inc. | Modified blood factors comprising a low degree of water soluble polymer |
EP2385825B1 (en) | 2008-11-07 | 2018-10-10 | University of Connecticut | Factor viii formulations |
WO2010102886A1 (en) | 2009-02-19 | 2010-09-16 | Novo Nordisk A/S | Modification of factor viii |
EP2417155B1 (en) | 2009-04-06 | 2013-06-19 | Novo Nordisk A/S | Targeted delivery of factor viii proteins to platelets |
GB0915480D0 (en) | 2009-09-04 | 2009-10-07 | Arecor Ltd | Stable formulation of factor viii |
CA2780542C (en) | 2009-11-13 | 2020-03-24 | Grifols Therapeutics Inc. | Von willebrand factor (vwf)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto |
ES2541369T3 (es) | 2010-02-16 | 2015-07-17 | Novo Nordisk A/S | Factor VIII recombinante modificado |
EP2977055A1 (en) | 2010-02-16 | 2016-01-27 | Novo Nordisk A/S | Factor viii fusion protein |
CN102770449B (zh) | 2010-02-16 | 2016-02-24 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 具有降低的vwf结合的因子viii分子 |
WO2011131510A2 (en) | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Novo Nordisk A/S | Selective modification of proteins |
JP2013532176A (ja) | 2010-07-15 | 2013-08-15 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 安定化させた第viii因子バリアント |
EA032336B1 (ru) | 2010-09-17 | 2019-05-31 | Баксалта Инкорпорейтид | Стабильная водная иммуноглобулиновая композиция и способ стабилизации иммуноглобулиновой композиции |
WO2013093760A2 (en) | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Grifols, S.A. | Compositions, methods, and kits for preparing sialylated recombinant proteins |
SG11201403764XA (en) | 2012-01-12 | 2014-07-30 | Biogen Idec Inc | Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof |
EP2814502B1 (en) | 2012-02-15 | 2017-09-13 | CSL Behring GmbH | Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity |
WO2013160005A1 (en) * | 2012-04-24 | 2013-10-31 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition suitable for treatment of haemophilia |
US20150080309A1 (en) | 2012-04-24 | 2015-03-19 | Nova Nordisk A/S | Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia |
US20160000884A1 (en) | 2012-08-13 | 2016-01-07 | Novo Nordisk A/S | Liquid Factor VIII Formulations |
JP2016522219A (ja) | 2013-06-12 | 2016-07-28 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 血友病の治療に適する化合物 |
AU2015207472B2 (en) * | 2014-01-20 | 2018-11-22 | Octapharma Ag | A process for manufacturing factor VIII having an improved ratio of FVIII:C/FVIII:Ag |
EP3152230B1 (en) | 2014-06-06 | 2019-08-07 | Octapharma AG | Preparation comprising factor viii and von willebrand factor peptides |
WO2016000039A1 (en) | 2014-07-02 | 2016-01-07 | Csl Limited | Modified von willebrand factor |
CN107406493B (zh) * | 2015-03-06 | 2021-08-13 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | 具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子 |
US10772936B2 (en) | 2015-05-22 | 2020-09-15 | CSL Behring Lengnau AG | Methods for preparing modified von Willebrand factor |
ES2774011T3 (es) * | 2015-05-22 | 2020-07-16 | CSL Behring Lengnau AG | Polipéptidos del factor de von Willebrand truncado para tratar la hemofilia |
CA3008448A1 (en) | 2016-01-07 | 2017-07-13 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Mutated von willebrand factor |
RU2018128582A (ru) * | 2016-01-07 | 2020-02-11 | Цсл Беринг Ленгнау Аг | Мутированный укороченный фактор фон виллебранда |
CA3043250A1 (en) * | 2016-11-11 | 2018-05-17 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia |
KR20190073576A (ko) * | 2016-11-11 | 2019-06-26 | 체에스엘 베링 렝나우 아게 | 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방에서 혈관외 투여를 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드 |
AU2018287215A1 (en) * | 2017-06-22 | 2020-02-06 | CSL Behring Lengnau AG | Modulation of FVIII immunogenicity by truncated VWF |
CN107337727A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-11-10 | 国药集团武汉血液制品有限公司 | 一种血源性人凝血因子ⅷ制备方法 |
CN107880112B (zh) * | 2017-12-28 | 2021-05-14 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种人凝血因子viii的制备方法以及人凝血因子viii制品 |
-
2020
- 2020-07-03 CN CN202080048044.5A patent/CN114072420A/zh active Pending
- 2020-07-03 EP EP20734992.9A patent/EP3994162A1/en active Pending
- 2020-07-03 AU AU2020300820A patent/AU2020300820A1/en active Pending
- 2020-07-03 KR KR1020227003739A patent/KR20220029733A/ko unknown
- 2020-07-03 JP JP2021577938A patent/JP2022538357A/ja active Pending
- 2020-07-03 US US17/623,398 patent/US20220389082A1/en active Pending
- 2020-07-03 WO PCT/EP2020/068772 patent/WO2021001522A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022538357A (ja) | 2022-09-01 |
CN114072420A (zh) | 2022-02-18 |
WO2021001522A1 (en) | 2021-01-07 |
EP3994162A1 (en) | 2022-05-11 |
AU2020300820A1 (en) | 2022-03-03 |
US20220389082A1 (en) | 2022-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6573989B2 (ja) | 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド | |
JP2019507587A (ja) | 変異切断型フォンウィルブランド因子 | |
US11564976B2 (en) | Methods for preparing modified von Willebrand Factor | |
EP3538134B1 (en) | Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder | |
AU2017358861B2 (en) | Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia | |
KR20220029733A (ko) | 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) | |
US20220348637A1 (en) | Polypeptides for inducing tolerance to factor viii |