CN102770449B - 具有降低的vwf结合的因子viii分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合。

Description

具有降低的VWF结合的因子VIII分子
发明领域
本发明涉及重组因子VIII (FVIII)分子。特别地，本发明涉及与内源性FVIII相比具有降低的von Willebrand因子(vWF)结合的FVIII分子。本发明还涉及这样的分子的用途以及用于获得这样的分子的方法。
发明背景
A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能异常引起的遗传性出血性疾病。临床表现不是基于初级止血(通常发生血凝块的形成)，而是由于缺乏次级凝血酶形成，凝块不稳定。通过静脉内注射分离自血液或重组产生的凝血因子FVIII治疗该病。
当前的治疗推荐正从传统应要求治疗转向预防。与von Willebrand因子结合的内源性FVIII循环半寿期是12-14小时，因此将进行一周数次的预防治疗以便让患者获得实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和少年，静脉内给药与显著不方便和/或疼痛联系在一起。因此本领域需要新的具有因子VIII活性的因子VIII产品，其优选结构上同源，优选安全并优选具有显著延长的循环半寿期以便降低因子VIII每周给药的次数。此外，本领域中需要相对简单的用于获得和生产这样的分子的方法。
发明概述
本发明涉及一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合。本发明还涉及用于制备这样的分子的方法以及这样的分子的用途。这样的分子具有改变的循环半寿期。
发明详述
附图简述
图1 NNC129-0000-9105和Advate®在FeCl3诱导的FVIII-KO小鼠(n=6-10)损伤模型中的剂量反应关系。*与溶媒处理显著不同。*P < 0.05。
图2 NNC0129-000-9105和Advate® (20 和 280 IU/kg)在FVIII-KO小鼠(n=5-6)的尾巴出血模型中的作用。*与溶媒处理显著不同。*P < 0.05。
定义：
von Willebrand 因子 (vWF) ：vWF是存在于血浆中的大的单体/多聚体糖蛋白，并基本上在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板的α-颗粒)和内皮下结缔组织中产生。它的主要功能是与其他蛋白(特别是因子VIII)结合，且它在血小板与伤口部位粘附中重要。
当在循环中无活性时，因子VIII与vWF结合；当不与vWF结合时，因子VIII迅速降解或被清除。由此可见，降低或废除vWF在FVIII中的结合能力迄今被认为是获得具有延长循环半寿期的因子FVIII变体的高度不合意的方法。
术语“降低的结合vWF的能力”本文意在涵盖其中结合vWF的能力降低至少50% (优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，更优选至少90%和最优选约100%)的因子VIII变体。可通过ELISA样测定来测量FVIII与vWF的结合，或使用表面等离振子共振测量为与固定化vWF的直接结合。在因子VIII中负责与vWF结合的区是如EP0319315中公开的跨越残基1670-1684的区。设想涉及该区域的因子VIII点突变体和/或缺失突变体将改变与vWF结合的能力。根据本发明，特别优选的点突变的实例包括含下述点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680C和E1682T。
WO09156137公开了具有降低的vWF结合的融合蛋白，所述融合蛋白不与侧基(例如PEG)缀合。其中的蛋白关于各种比较测定似乎有用。
因子VIII 分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的大的复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸(包含信号肽)组成，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆中以在B-A3边缘处分开的两条链循环。通过二价金属离子结合将链连接。A1-A2-B链命名为重链(HC)，而A3-C1-C2命名为轻链(LC)。
内源性因子VIII分子体内以具有不同尺寸的B-结构域的分子库循环。可能是体内发生B结构域的逐渐酶促移除，产生具有不同尺寸的B-结构域的分子库。一般认为在位置740上切割(由此移除B-结构域的最后部分)与凝血酶活化一起发生。然而，不能排除其中例如在位置740上的切割位点已被损坏的因子VIII变体可能有活性。
本文使用的“因子VIII”或“FVIII”指，为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如在SEQ ID NO: 1 (氨基酸1-2332)中所示的全长人FVIII分子。在SEQ ID NO: 1中B-结构域跨越氨基酸741-1648。
SEQ ID NO 1：
SEQ ID NO 2:
SEQ ID NO 3:
本发明的因子VIII分子可为B结构域截短的因子FVIII分子，其中残余结构域密切对应于如在SEQ ID NO: 1的氨基酸编号1-740和1649-2332中所示的序列，然而在残基1670-1684之间的vWF结合区内当然有一个或多个改变。然而，本发明的B结构域截短的分子可与如在SEQ ID NO: 1中所示的序列稍不同，意指残余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)可与如在SEQ ID NO: 1 (氨基酸1-740 和 1649-2332)中所示的氨基酸序列稍(例如约1%、2%、3%、4%或5%)不同，因为突变被导入以便降低vWF结合能力。此外，为了改变因子VIII与各种其他组分(例如LPR、各种受体、其他凝血因子、细胞表面、导入和/或废除的糖基化位点等)的结合能力，在分子的其他位置中导入氨基酸修饰(置换、缺失等)似乎可行。
本发明的因子VIII分子具有因子VIII活性，意即在凝血级联中以功能上类似或等价于FVIII的方式起作用，通过在活化的血小板上与FIXa相互作用来诱导FXa形成，并支持血凝块形成的能力。通过本领域中公知的技术(例如凝块分析、内源性凝血酶潜能分析等)，可体外评估该活性。本发明的因子VIII分子具有的FVIII活性是天然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和100%或甚至超过100%。
融合蛋白：融合蛋白/嵌合蛋白是通过将两个以上最初编码单独蛋白的基因连接而产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有来源于各最初蛋白的功能性质的单一多肽。本发明的融合蛋白包含FVIII多肽和至少一种其他多肽。融合蛋白可任选包含至少一个接头。因此，FVIII多肽可不与其他多肽部分直接连接。其他多肽部分可与FVIII多肽链的N端或C端连接，或者插入在FVIII多肽链的内部位置上。
在一个优选实施方案中，将其他多肽部分插入到B结构域缺失的FVIII的B结构域接头中。在另一个优选实施方案中，其他多肽部分在FVIII轻链的N端置换vWF结合a3区。在另一个优选实施方案中，其他多肽部分与FVIII轻链的C端连接。
其他多肽可包含一种或多种氨基酸序列，其来源于例如人血清白蛋白、抗体结合多肽、Fc受体、人FcγRI (CD64)、人绒毛膜促性腺激素、抗体(免疫球蛋白)的Fc部分、转铁蛋白、白蛋白结合多肽或转铁蛋白结合多肽。
B 结构域：因子VIII中的B-结构域跨越SEQ ID NO: 1中的氨基酸741-1648。将B-结构域在若干不同位点上切割，在循环的血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B-结构域的确切功能未知。所知道的是该结构域在凝血级联中对FVIII活性是非必要的。通过以下事实支持该表面上功能的缺失：B结构域缺失/截短的FVIII似乎具有与全长天然FVIII所观察到的性质相同的体内性质。据说至少在无血清的条件下有B-结构域可降低与细胞膜缔合的迹象。
B 结构域截短/ 缺失的因子VIII 分子：将内源性全长FVIII合成为单链前体分子。分泌之前，将前体切割为重链和轻链。可从两种不同的策略产生重组B结构域缺失的FVIII。将无B-结构域的重链和轻链单独合成为两条不同的多肽链(两条链策略)，或将B-结构域缺失的FVIII合成为单一前体多肽链(单一链策略)，其可以与全长FVIII前体相同的方式被切割为重链和轻链。
在B结构域缺失的FVIII前体多肽中，通常通过接头分开重链和轻链部分。为了使在B结构域缺失的FVIII中导入免疫原性表位的风险最小化，接头的序列优选来源于FVIII B结构域。作为最低限度，接头必须包含使B结构域缺失的FVIII前体多肽分为重链和轻链的蛋白酶的识别位点。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648组成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII活化时导致接头移除的凝血酶位点位于重链中。因此，接头的尺寸和氨基酸序列不太可能影响通过凝血酶活化将其从残余FVIII分子中移除。B结构域的缺失对于产生FVIII是有利的。然而，可在接头中包含部分B结构域而不降低生产能力。B结构域对生产能力的负面效应不能归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。
截短的B-结构域可包含若干O-糖基化位点。然而，根据优选的实施方案，分子在截短的B-结构域中包含仅1个、备选地2、3或4个O-连接寡糖。
根据优选的实施方案，截短的B结构域仅包含1个潜在的O-糖基化位点并且亲水聚合物与该O-糖基化位点共价缀合。
可将本发明的B-结构域截短的分子中的O-连接寡糖与O-糖基化位点连接， O-糖基化位点通过重组方法和/或通过截短B-结构域暴露“隐藏的”O-糖基化位点人工产生。在两种情况下，通过设计B-结构域截短的因子VIII氨基酸序列并随后使氨基酸序列经受预测截短的B-结构域中O-糖基化位点可能性的计算机模拟分析，均可制备这样的分子。可在合适的宿主细胞中合成具有这样的糖基化位点的可能性相对高的分子，然后分析糖基化模式并随后选择在截短的B-结构域中具有O-连接糖基化的分子。
因子VIII分子亦包含许多可充当使用酶促或化学缀合法的缀合位点的N-连接寡糖，例如，与唾液酸衍生物组合的唾液酸转移酶或通过选择试剂氧化聚糖来形成用于随后修饰的醛。
为了保证分子是糖基化的，用于产生重组因子VIII蛋白的合适宿主细胞优选为哺乳动物来源。在实践本发明时，细胞为哺乳动物细胞，更优选为建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO (例如，ATCC CCL 61)、COS-1 (例如，ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾 (BHK)和HEK293 (例如，ATCC CRL 1573；Graham 等, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk- ts13 BHK细胞系 (Waechter 和 Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982)，在下文中称为BHK570细胞。BHK570细胞系可以ATCC保藏号CRL 10314从美国典型培养物保藏中心, 12301 Park-lawn Dr., Rockville, MD 20852获得。tk- ts13 BHK细胞系亦可以保藏号CRL 1632从ATCC获得。优选的CHO细胞系是CHO K1细胞系(以保藏号CC161从ATCC获得)以及细胞系CHO-DXB11 和 CHO-DG44。
其他合适的细胞系包括但不限于，大鼠Hep I (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺 (ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)、DUKX细胞 (CHO细胞系) (Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (DUKX细胞亦被称为DXB11细胞)和DG44 (CHO细胞系) (Cell, 33: 405, 1983, 和 Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986)。同样有用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其他细胞的融合物。在一些实施方案中，细胞可为突变体或重组细胞，例如，与所来源的细胞类型相比，表达质量上或数量上不同范围的催化蛋白翻译后修饰的酶(例如，糖基化酶(例如糖基转移酶和/或糖苷酶)，或加工酶(例如前肽)) 的细胞。特别优选DUKX细胞 (CHO细胞系)。
普遍优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
因此，通过截短B-结构域似乎可活化因子VIII B-结构域中的“隐藏的”O-糖基化位点。虽然不希望被任何理论所束缚，但是该现象可归因于截短的B-结构域中被改变的分子的三级结构。因此在截短的B-结构域中可使“隐藏的”O-糖基化位点易受糖基化。该方法的一个优点是提供的重组分子相对于例如变应原性具有有利的安全性。另一个优点可为，由于糖基化位点在B-结构域中的固有丰余度，它可能代表获得在B-结构域中具有O-连接寡糖的B-结构域截短的变体的较简单的方法，因为之前已证明在重组蛋白中工程化人工O-糖基化位点是困难的。
在wt FVIII分子中B-结构域的长度为约907个氨基酸。本发明的分子中截短的B-结构域的长度可变化于约10-约800个氨基酸，例如约10个氨基酸-约700个氨基酸，例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40个氨基酸或20-30个氨基酸。截短的B-结构域可包含重链和/或轻链的片段和/或未在wt FVIII分子中发现的人工导入的序列。术语“B-结构域截短的”和“B-结构域缺失的”可在本文中交换使用。
改变的循环半寿期：本发明的分子相比于野生型因子VIII分子具有改变的循环半寿期，优选具有增加的循环半寿期。循环半寿期优选增加至少10%、优选至少15%、优选至少20%、优选至少25%、优选至少30%、优选至少35%、优选至少40%、优选至少45%、优选至少50%、优选至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、优选至少95%、优选至少100%、更优选至少125%、更优选至少150%、更优选至少175%、更优选至少200%和最优选至少250%或300%。更更优选地，这样的分子具有增加至少400%、500%、600%或甚至700%的循环半寿期。
侧链/ 侧基：本发明的FVIII变体可与侧基通过翻译后修饰或以融合蛋白的形式共价缀合。因此可进行FVIII的一种或多种下述侧基修饰：烷基化、酰基化、酯形成、二硫化物或酰胺形成等。其包括PEG化的FVIII、半胱氨酸-PEG化的FVIII及其变体。本发明的FVIII变体亦可与生物相容性的脂肪酸及其衍生物、亲水聚合物(羟乙基淀粉、聚乙二醇、透明质酸、基于磷酸胆碱的聚合物、fleximer、葡聚糖、聚唾液酸)、多肽(抗体、抗体的抗原结合片段、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽(MacEwan SR, Chilkoti A. Biopolymers. 2010；94:60)、XTEN聚合物(Schellenberger V 等 Nat Biotechnol. 2009；27:1186)、PAS化或HAP化(Schlapschy M 等 Protein Eng Des Sel. 2007 ；20 :273)、白蛋白结合肽(Dennis MS 等 J Biol Chem. 2002, 277:35035))等缀合。
本发明的FVIII可为一种或多种疏水侧基所缀合 – 任选经由接头。在本发明的上下文中具有-(CH2)12-部分的化合物是可能的白蛋白结合剂。由于这样的侧基可能够与白蛋白形成非共价复合体，有时疏水侧基可称为“白蛋白结合剂”，由于修饰的FVIII变体和白蛋白的复合体仅缓慢分解来释放FVIII变体，从而促进修饰的FVIII变体在血流中的循环。使用化学法以及基本上按照如WO03031464中公开的方法的酶促“糖修饰”法，可修饰FVIII。酶促法具有避免使用任何有机溶剂以及通常非常位点特异的优点。
术语“PEG化的FVIII”意指与PEG分子缀合的FVIII。应该理解，PEG分子可与FVIII的任何部分(包括任何氨基酸残基或碳水化合物部分)连接。术语“半胱氨酸-PEG化的FVIII”意指具有与FVIII中导入的半胱氨酸的巯基缀合的PEG分子的FVIII。
PEG是合适的聚合物分子，因为它相比于多糖(例如葡聚糖)仅具有很少的能够交联的反应基。特别地，单官能团PEG，例如甲氧基聚乙二醇 (mPEG)，是令人感兴趣的，因为其偶联化学相对简单(仅一个反应基可用于与多肽上的连接基团缀合)。因此，消除了交联的风险，所产生的多肽缀合物更加均质并且聚合物分子与多肽的反应较容易控制。
为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，以活化形式提供聚合物分子的羟基末端基团，即具有反应官能团。PEG化可针对与多肽上所有可得的连接基团(即这种连接基团暴露在多肽表面)的缀合，或可针对一个或多个特定连接基团，例如N端氨基 (美国专利号5,985,265)、N-和/或O-连接聚糖等。此外，可以一步法或逐步法实现缀合(例如如WO 99/55377中所述)。用于将侧基与O-和/或N-连接聚糖偶联的酶促方法公开于WO03031464。
融合蛋白：融合蛋白/嵌合蛋白，是通过将两个以上最初编码单独蛋白的基因连接而产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有来源于各最初蛋白的功能性质的单一多肽。本发明的FVIII变体的侧链可因此为与FVIII融合的多肽的形式。本发明的FVIII变体可因此与可赋予FVIII延长的半寿期的肽(例如抗体和“Fc融合衍生物”或“Fc融合蛋白”)融合。
Fc融合蛋白在本文中意在涵盖与可来源于任何抗体同种型的Fc结构域融合的FVIII，然而，由于IgG抗体的相对长的循环半寿期，通常将优选IgG Fc结构域。此外，为了调节特定效应子功能(例如补体结合和/或与特定Fc受体结合)，可修饰Fc结构域。具有与FcRn受体结合的能力的FVIII与Fc结构域的融合，将通常得到与wt FVIII蛋白的半寿期相比延长循环半寿期的融合蛋白。在IgG Fc结构域的位置234、235和237中的突变将通常导致与FcγRI 受体(亦可能FcγRIIa和FcγRIII受体)的结合降低。这些突变不改变与FcRn受体的结合，FcRn受体通过内吞再循环途径促进长的循环半寿期。优选地，本发明融合蛋白的修饰的IgG Fc结构域包含一种或多种下述突变，突变将分别导致与特定Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和C1q介导的补体结合降低(A330S和P331S)。
不受理论所束缚，设想为什么它更有效地起作用来将侧基与具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子连接而不是将侧基与具有正常的vWF结合能力的因子VIII分子连接的原因是，侧基的相对尺寸在大的因子VIII/vWF复合体中相对小。假设相对大的侧基在保护游离因子VIII免受清除中更有效地起作用。另外假设FVIII的半寿期与vWF的半寿期相关。具有降低的结合vWF的能力的FVIII分子最可能具有暴露的清除表位，该表位通常被vWF所保护。通过连接侧基，因此假设可恢复该“清除保护”。在其他情况下，通过例如将分子与具有相对长循环半寿期的蛋白、细胞或血小板连接，连接侧基(例如抗体片段)可起作用。
亲水聚合物：本发明的修饰基团/亲水聚合物优选是非天然存在的。在一个实例中，“非天然存在的修饰基团”是聚合物修饰基团，其中至少一种聚合物部分是非天然存在的。在另一实例中，非天然存在的修饰基团是修饰的碳水化合物。选择用修饰基团功能化的位点，使得它不阻止“修饰的糖”被酶促加入到多肽中。“修饰的糖”亦指用修饰基团功能化和为天然或修饰酶(例如糖基转移酶)的底物的任何糖基模拟部分。
将聚合物修饰基团加入到多肽中可改变这样的多肽的性质，例如其生物利用度、生物活性或其体内半寿期。本发明的例示性聚合物包括水溶性聚合物，其可为直链或支链的并可包括一种或多种独立选择的聚合物部分，例如聚亚烷基二醇及其衍生物。本发明的聚合物修饰基团可包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇及其衍生物(PEG、m-PEG)、聚丙二醇及其衍生物(PPG、m-PPG)等。
术语“水溶性”指在水中具有一些可检测度的溶解度的部分。用于检测和/或定量水溶解度的方法在本领域中是公知的。本发明的例示性水溶性聚合物包括肽、糖类、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有混合的序列并可由单一氨基酸(例如，聚赖氨酸)组成。例示性的多糖是聚唾液酸。例示性的聚醚是聚乙二醇，例如m-PEG。聚乙烯亚胺是一种例示性的聚胺，和聚丙烯酸是一种代表性的聚羧酸。
本发明的水溶性聚合物的聚合物骨架可为聚乙二醇(即PEG)。与本发明有关的术语PEG包括任何形式的聚乙二醇，包括烷氧基PEG、双官能团PEG、多臂PEG、分叉的PEG、支链的PEG、侧链的PEG (pendent PEG) (即具有一个或多个相对于聚合物骨架为侧基的官能团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键的PEG。
聚合物骨架可为直链或支链的。支链的聚合物骨架在本领域是公知的。通常，支链的聚合物具有中枢支链核心部分和与中枢支链核心连接的多条线性聚合物链。PEG通常以支链形式使用，其可通过将环氧乙烷加入到各种多元醇(例如甘油、季戊四醇和山梨糖醇)中制备。中枢支链部分亦可来源于若干氨基酸，例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个实例中，支链聚乙二醇可以通式R(-PEG-OH)m表示，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，和m代表臂的数量。多臂PEG分子亦可作为聚合物骨架，例如在美国专利号5,932,462中描述的那些多臂PEG分子，其通过引用以其整体结合到本文中。许多其他聚合物亦适用于本发明。在本发明中可特别使用非肽和水溶性的聚合物骨架。合适聚合物的实例包括但不限于，其他聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇(“PEG”))、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚氧乙基化多元醇、聚烯醇(poly(olefmic alcohol))、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚[α]-羟酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚噁唑啉、聚N-丙烯酰吗啉(例如在美国专利号5,629,384中描述，其通过引用以其整体结合到本文中)以及其共聚物、三元共聚物和混合物。
虽然聚合物骨架的各链的分子量可不同，但是它通常在约100 Da – 约160,000 Da的范围内，例如约5,000 Da – 约100,000 Da。更具体而言，本发明的各缀合的亲水聚合物的尺寸可变化于约500 Da – 约80,000 Da，例如约1000 Da – 约80,000 Da、约2000 Da – 约70,000 Da、约5000 – 约70,000 Da、约5000 – 约60,000 Da、约10,000 – 约70,000 Da、约20,000 – 约60,000 Da、约30,000 – 约60,000 Da、约30,000 – 约50,000 Da或约30,000 – 约40,000 Da。应该理解，这些尺寸代表估量而不是精确测量。根据优选的实施方案，本发明的分子与异质群体的亲水聚合物缀合，例如尺寸为例如10,000、40,000或80,000 Da +/- 约5000、约4000、约3000、约2000或约1000 Da的PEG。
白蛋白结合剂缀合物/ 侧基
已知通过使用白蛋白结合侧链可改善蛋白的体内性质。这样的侧链或白蛋白结合剂可在给药前与蛋白连接，并可例如使蛋白体内稳定或者改进或延伸蛋白的体内半寿期。
白蛋白结合剂可藉此促进衍生物与血流的循环。白蛋白结合剂可具有延伸或延长与其结合的蛋白的作用时间的作用，因为肽衍生物和白蛋白的复合体仅缓慢分解来释放活性药物成分。因此，优选的取代物或侧链，总体上可被称为白蛋白结合部分。
白蛋白结合剂(白蛋白结合部分)可包含与白蛋白结合特别相关并藉此与在血流中延长循环相关的部分，该部分可因此被称为延长部分。与其连接肽的位点相比，延长部分优选位于或靠近白蛋白结合部分的相对端。
在一个优选实施方案中，白蛋白结合剂是或包含能够与白蛋白形成非共价复合体的侧链。白蛋白结合剂可与白蛋白非共价和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与白蛋白特异性结合。从下文所述的方法中可明白，白蛋白结合剂可与环糊精结合。白蛋白结合剂可共价和/或可逆结合环糊精。白蛋白结合剂可特异性结合环糊精。
本文所述的白蛋白结合剂通常是疏水基。
白蛋白结合部分的其他部分(即在延长部分与连接肽的位点中间的部分)，可被称为接头部分、接头或间隔区等。然而，这样的接头的存在是任选的，并因此白蛋白结合部分可与延长部分相同。
在特定实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂性的和/或在生理pH (7.4)下带负电荷。
白蛋白结合部分和/或延长部分可与肽的氨基通过缀合化学(例如通过烷基化、酰基化或酰胺形成)共价连接，或与羟基例如通过酯化、烷基化、肟化共价连接。
在一个优选实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基在酰胺键的形成下共价连接。
为了本发明目的，术语“白蛋白结合部分”、“延长部分”和“接头”包括这些分子的未反应以及反应的形式。意指一种还是另一种形式从该术语使用的上下文看是清楚的。
白蛋白结合部分可为或可包含脂肪酸或脂肪二酸或者其任一的衍生物。
术语“脂肪酸”指具有4-28个碳原子(例如16个碳原子)的脂肪族单羧酸。它优选是未分枝的和/或甚至编号的，且它可为饱和或不饱和的。
术语“脂肪二酸”指，如上文定义但在ω位置中具有另外的羧酸基的脂肪酸。因此脂肪二酸是二羧酸。
命名与本领域中通常一样，例如-COOH以及HOOC- 指羧基；-C6H4-指亚苯基；-CO-以及-OC-指羰基(O=C<)；和C6H5-O-指苯氧基。
在一个优选实施方案中，接头部分，如果存在，具有2-80个C原子，优选5-70个C原子。在另外优选的实施方案中，接头部分，如果存在，具有4-20个杂原子，优选2-40个杂原子，更优选3-30个杂原子。特别优选的杂原子的实例是N-和O-原子。H-原子不是杂原子。
在另一个实施方案中，接头包含至少一个OEG分子和/或至少一个谷氨酸残基，更确切地说相应的基(OEG表示8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，即该基：-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)。
在一个优选实施方案中，接头部分包含通过酰胺键与唾液酸残基连接的二羧基残基。在优选的实例中，二羧基残基具有2-30个C原子，优选4-20个C原子，更优选4-10个C原子。在另外优选的实例中，二羧基残基具有0-10个杂原子，优选0-5个杂原子。
在另一个优选实例中，接头部分包含含有氨基和远端羧基两者的基团，其通过其远端羧基经酰胺键与唾液酸残基连接。在一个优选实施方案中，该基团是OEG基团。
氨基酸谷氨酸(Glu)包含两个羧酸基。它的γ-羧基优选用于与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基，或者与OEG分子的氨基(如果存在)，或者与另一Glu残基的氨基(如果存在)形成酰胺键。Glu的氨基进而与延长部分的羧基，或者与OEG分子的羧基(如果存在)，或者与另一Glu的γ-羧基(如果存在)形成酰胺键。这种方式包含的Glu偶尔简称为“γ-Glu”。
O- 连接寡糖：通过产生蛋白的细胞将N-聚糖和O-聚糖两者与蛋白连接。细胞的N-糖基化机器识别并糖基化氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T 基序)，如同将新生蛋白从核糖体转移至内质网(Kiely 等 1976；Glabe 等 1980)。
同样地，将O-聚糖与氨基酸链中的特定O-糖基化位点连接，但引起O-糖基化的基序比N-糖基化信号异质得多，且我们预测氨基酸序列中的O-糖基化位点的能力仍不够(Julenius 等 2004)。因此人工O-糖基化位点的构建与一些不确定性相关。
在截短的因子VIII B结构域中的O-连接寡糖可因此与天然存在的O-连接糖基化序列或通过重组技术人工构建的O-连接糖基化序列共价连接。
根据本发明的一个优选实施方案，O-连接寡糖与天然存在的O-连接糖基化序列连接，该序列在野生型因子VIII分子中不暴露于糖基化但由于B-结构域的截短变得易受O-糖基化。其实例是B-结构域截短的因子VIII变体，其中B-结构域对应于SEQ ID NO: 1中的氨基酸742-763。似乎可行的是，即使在略微不同之处截短B结构域(即如果截短的B-结构域与742-763接头相比稍微较短(例如短1、2、3、4或5个氨基酸)或较长(例如长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸))，那么在该截短的变体中“隐藏的”O-糖基化位点还是将变成糖基化的。通过截短B-结构域而不是产生人工的O-糖基化位点来活化“隐藏的”O-糖基化位点的该方法具有产生具有有利的安全性特征(即降低的变应原性等)的分子的优点。通过以不同的方法截短分子，在因子VIII B-结构域中的其他O-糖基化位点可同样变成活化的。
唾液酸转移酶：唾液酸转移酶是将唾液酸转移到初生寡糖上的酶。各唾液酸转移酶对特定的糖底物有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸加到唾液酸化糖脂(神经节苷脂)的末端部分上或加到糖蛋白的N-或O-连接糖链上。有约20种不同的唾液酸转移酶，基于它们起作用的受体结构和它们形成的糖键类型可将它们区分。本发明的优选唾液酸转移酶是ST3Gal-I (对O-聚糖特异)和ST3Gal-III (对N-聚糖特异)。因此，可通过例如选择特异性唾液酸转移酶和/或以特定糖基化模式将因子VIII分子工程化，工程化本发明的缀合因子VIII分子的结构。
O- 连接寡糖的糖PEG 化：在生物合成相对早期加入唾液酸残基，可改变和终止O-聚糖的生物合成。特定唾液酸转移酶能够在核心1 GalT作用后作用于GalNAcα-Ser/Thr或早期O-聚糖核心亚型。术语T抗原与Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖的存在相关。这些结构的产生涉及糖基转移酶之间对相同底物的竞争，并因此高尔基体内的糖基转移酶的表达水平和亚细胞分布确定O-聚糖生物合成和多样化中的结构结果。仅Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖受糖PEG化的影响。
然而，通过用唾液酸酶或核心1 GalT或者其组合处理蛋白，可极大增加该结构的可得量。由于糖PEG化过程，唾液酸PEG通过与靶蛋白的Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖键合的α3加入到天然结构中。
其他亲水聚合物亦可与O-连接寡糖连接。用于通过O-聚糖将其他亲水聚合物与FVIII酶促缀合的基本要求是将它们与甘氨酰唾液酸衍生物通过如WO03031464中公开的游离氨基偶联的能力。这可通过本领域技术人员已知的多种偶联化学来实现。活化的生物相容性聚合物的实例包括聚环氧烷，例如不限于聚乙二醇(PEG)、2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱(mPC)聚合物(如在WO03062290中所述)、葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸或特定肽序列的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、肝素、白蛋白、纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉(例如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉)、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、普鲁分支葡聚糖、菊粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸水解产物、其他生物聚合物及其任何等价物。
可将侧基与如例如WO0331464中公开的N-连接寡糖连接。这样的方法经常导致若干侧基与因子VIII分子连接。
药物组合物：药物组合物在本文中优选意在涵盖含有适合于胃肠外给药的本发明的因子VIII分子的组合物，例如即用型无菌水性组合物或可在例如水或水性缓冲液中复溶的干燥无菌组合物。本发明的药物组合物可包含各种药学上可接受的赋形剂、稳定剂等。
这种组合物中的另外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、含油溶媒、蛋白(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然这种另外成分不应该有害地影响本发明药物制剂的总体稳定性。可凭借注射器(任选笔样注射器)通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来进行胃肠外给药。备选地，可凭借输注泵进行胃肠外给药。另外的选择是组合物可为用于以鼻或肺喷雾的形式给予FVIII化合物的溶液剂或混悬剂。作为又一选择，包含本发明FVIII化合物的药物组合物亦可适合于经皮给药(例如通过无针注射或从贴剂(任选是离子渗透贴剂))或经粘膜(例如经口)给药。
本文使用的术语“治疗”指任何有需要的人或其他动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历医生进行的身体检查，医生已给出试验性或明确的诊断，该诊断表明使用所述特定治疗对所述人或其他动物受试者的健康有益。根据受试者健康的现状，所述治疗的时机和效果可因人而异。因此，所述治疗可为预防的、缓和的、针对症状的和/或治愈的。
在第一方面，本发明因此涉及一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合。在一个实施方案中，侧基选自：亲水聚合物、白蛋白结合剂、抗体或其片段、转铁蛋白和白蛋白。
在一个优选实施方案中，因子VIII分子是B-结构域截短的变体且侧基任选与截短的B-结构域共价缀合，由此因子VIII活化导致共价缀合的侧基的移除。在另一个实施方案中，B-结构域截短的分子与亲水聚合物通过截短的B结构域中的O-连接寡糖共价缀合，和其中因子VIII活化导致共价缀合的亲水聚合物的移除。这种O-糖基化位点优选通过截短B-结构域构建。
在又一个优选实施方案中，本发明的分子在残基1680中包含点突变。在另一个优选实施方案中，因子分子在跨越残基1670-1684的区中缺失一个或多个氨基酸。由此可见，本发明的分子可在vWF结合结构域内包含点突变和缺失两者。依据一个特别优选的实施方案，侧基是PEG。
本发明的另一方面涉及一种制备本发明分子的方法，其中所述方法包括将侧基与具有降低的结合vWF的能力的因子VIII分子连接。通过这样的方法可获得或获得的分子亦是本发明的一部分。
本发明的第三方面涉及一种治疗血友病的方法，其包括向有需要的患者给予治疗有效量的本发明的分子。
本发明的第四方面涉及本发明的分子作为药物的用途。
第五方面涉及本发明的分子用于制备治疗血友病的药物的用途。
最后一个方面涉及一种包含本发明的分子的药物组合物。
实施例
实施例1 重组B 结构域截短的O- 糖基化的因子VIII 及其变体( 例如因子VIII(Y1680F) 或因子VIII(Y1680C)) 的产生
细胞系和培养方法
使用因子VIII cDNA，构建哺乳动物表达质粒。质粒编码包含Y1680F突变的B-结构域缺失的因子VIII，因子VIII重链包含全长人因子VIII的氨基酸1-740，和因子VIII轻链包含全长人因子VIII的氨基酸1649-2332。通过包含全长人因子VIII氨基酸741-750和1638-1648的序列的21个氨基酸接头(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR － SEQ ID NO: 4)将重链和轻链序列连接。本文亦可将包含在SEQ ID NO: 4中定义的接头的FVIII变体称为“N8”。由该质粒编码的因子VIII氨基酸序列在SEQ ID NO: 1 (wt) 、SEQ ID NO: 2 (Y1680F) 、SEQ ID NO: 3 (Y1680C)中示出。
用质粒转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞并用二氢叶酸还原酶系统选择，最后得到在无动物组分的培养基中培养的克隆悬浮生产细胞。
该方法中的第一步是将来自工作细胞库小瓶的细胞小瓶接种到化学组分确知并不含动物成分的生长培养基中。最初，融化后，将细胞在方瓶中孵育。融化后1或2天，将细胞转移到摇瓶中，为了保持细胞密度在0.2-3.0 × 106细胞/ml，通过连续稀释扩大培养物体积。下一步是将摇瓶培养物转移到种子生物反应器中。在最后转移到生产生物反应器中前，这里进一步扩大培养物体积。对于所有的接种物扩繁步骤，使用相同的化学成分确知并不含动物组分的培养基。在转移到生产生物反应器中后，用增加产物浓度的组分补充培养基。在生产生物反应器中，将细胞以具有3天循环时间的重复分批方法培养。在收获时，将80-90%的培养物体积转移到收获箱中。然后将残余培养液用新鲜培养基稀释，以便获得最初的细胞密度，然后开始新的生长期。通过离心和过滤澄清收获批产物，并在开始纯化过程前转移到存储箱中。将缓冲液加入到存储箱中的无细胞收获物中以稳定pH。
到生产运行结束时，收集并冷冻细胞，以便制备最终的生产细胞库。针对支原体、无菌性和病毒污染测试该细胞库。
纯化
为了从细胞培养基中分离B-结构域缺失的因子VIII (Y1680F)，使用四步纯化步骤，其包括：在Capto MMC柱上的浓缩步骤、免疫吸附色谱步骤、阴离子交换色谱和最后的凝胶过滤步骤。通常使用下述步骤：将11升无菌过滤的培养基以15 ml/min的流速泵到在缓冲液A (20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、50mM NaCl、0.02% Tween 80，pH = 7.5)中平衡的Capto MMC (GE Healthcare, Sweden)的柱(1.6 × 12 cm)上。将柱用75 ml的缓冲液A洗涤后用75 ml含有1.5 M NaCl的缓冲液A洗涤。将蛋白用20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween 80、2.5 M NaCl、8 M 乙二醇，pH 7.5以1 ml/min的流速洗脱。收集8 ml的流分并在显色测定(参见实施例3)中测定因子VIII活性(FVIII:C)。将包含因子VIII的流分合并，并通常获得大约50 ml的合并物体积。
针对因子VIII的单克隆抗体已被开发(Kjalke Eur J Biochem 234 773, Hansen, J Thromb Haemost 2009； 7, 增刊2: 摘要号 PP-WE-572)。通过进一步表位作图(结果未显示)，发现该抗体F25识别重链远C端序列(氨基酸725-740)。基本上如制造商所述，将F25抗体与NHS活化的Sepharose 4 FF (GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)以每ml的凝胶2.4mg的密度偶联。将来自上一步的合并物用20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween 80，pH = 7.3稀释10倍并以0.5 ml/min的流速装载到用20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、150 mM NaCl、0.02% Tween 80、1 M 甘油 pH = 7.3平衡的F25 Sepharose柱 (1.6 × 9.5 cm)上。将柱用平衡缓冲液洗涤直至UV信号不变然后用20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.65 M NaCl，pH = 7.3洗涤直至UV信号再次不变。将因子VIII用20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween 80、2.5 M NaCl、50% 乙二醇，pH 7.3以1 ml/min的流速洗脱。收集1 ml的流分并测定因子FVIII:C (参见实施例3)。将包含因子VIII的流分合并，并通常获得大约25 ml的合并物体积。
制备缓冲液A (20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02 % Tween 80、1 M 甘油，pH = 7.3)和缓冲液B (20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02 % Tween 80、1 M 甘油、1 M NaCl，pH = 7.3)用于离子交换步骤。用85%缓冲液A/15%缓冲液B以2 ml/min的流速平衡Macro-Prep 25Q Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)柱(1 × 10 cm)。将来自上一步的合并物用缓冲液A稀释10倍并以2 ml/min的流速泵到柱上。将柱用85%缓冲液A/15%缓冲液B以2 ml/min的流速洗涤并用15%缓冲液B – 70%缓冲液B的线性梯度(在120 ml内)以2 ml/min的流速洗脱因子VIII。收集2 ml的流分并如实施例3中所述测定因子VIII活性(FVIII:C)。将包含因子VIII的流分合并，并通常获得大约36 ml的合并物体积。
将来自上一步的合并物装载到Superdex 200, 制备级(GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)柱 (2.6 × 60 cm)上，该柱用20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02 % Tween 80、1 M 甘油、150 mM NaCl，pH = 7.3平衡并以1ml/min洗脱。收集3 ml的流分并测定因子FVIII:C (参见实施例3)。将包含因子VIII的流分合并，并通常获得大约57 ml的合并物体积。将包含因子VIII的合并物在- 80 ℃保存。
使用上文的四步纯化步骤，如通过FVIII:C和ELISA测量结果判断，获得大约15%的总产率。
实施例2 用于PEG 化重组O- 糖基化的因子VIII 的步骤
使用下述步骤将实施例1中获得的重组因子VIII分子与聚乙二醇(PEG)缀合：
为了糖PEG化反应是高效的，要求FVIII浓度 > 5mg/ml。因为FVIII通常在该浓度下不溶，所以进行所选缓冲液组合物的筛查(参见表1)。基于这些考虑，发现包含50 mM MES、50 mM CaCl2、150 mM NaCl、20%甘油，pH 6.0的缓冲液为合适的反应缓冲液。
表1 反应条件对FVIII溶解度和聚集的影响评价
将如上文所述纯化的重组FVIII在反应缓冲液中通过在Poros 50 HQ柱上使用步骤洗脱的离子交换、在Sartorius Vivaspin (PES)过滤器上(10 kDa截止值(cut-off))或在Amicon 10 kDa MWCO PES过滤器上浓缩至6-10 mg/mL的浓度。通过在反应缓冲液(50 mM MES、50 mM CaCl2、150 mM NaCl、20% 甘油、0.5 mM 抗蛋白酶，pH 6.0)中将因子VIII (BDD) (最终约4.7mg/mL)与唾液酸酶(产脲节杆菌(A. ureafaciens)) (159 mU/mL)、CMP-SA-甘油-PEG-40 kDa (参见WO2007/056191) (5 mol.eq.)和MBP-ST3Gal1 (540 mU) (WO 2006102652)混合，开始FVIII的糖PEG化。将反应混合物在32 ℃孵育直至总转化产率为约20-30%。
孵育后将样品用缓冲液A (25 mM Tris、5 mM CaCl2、20 mM NaCl、20% 甘油，pH 7.5)稀释并装载到Source 15Q柱(1 cm id × 6 cm，4.7 mL，1 mL/min，280 nm)上。将结合物质用缓冲液A洗涤并使用缓冲液B (25 mM Tris、5 mM CaCl2、1 M NaCl、20% 甘油，pH 7.5)的步骤梯度洗脱。在约25% 缓冲液B下从柱上洗脱糖PEG化的因子VIII-(O)-SA-甘油-PEG-40 kDa。
为了在唾液酸酶处理期间封闭暴露在N-聚糖上的游离半乳糖部分，将因子VIII-SA-甘油-PEG-40 kDa的合并流分(最终1.0mg/mL)与CMP-SA (2,000 mol eq)和MBP-SBD-ST3Gal3 (WO 2006102652) (400 mU/mL)在反应缓冲液(50 mM MES、20 mM CaCl2、150 mM NaCl、10 mM MnCl2、20% 甘油，pH 6.0)中混合并在32 ℃孵育11小时。
在用50 mM MES、50mM CaCl2、150 mM NaCl、10 % 甘油，pH 6.0平衡的Superdex 200柱(10 cm id × 300 mm；280 nm)上通过凝胶过滤将所产生的加帽的糖PEG化因子VIII-SA-甘油-PEG-40 kDa与cmp-SA和ST3GalIII分开；流速为0.25 mL/min。在38分钟洗脱产物因子VIII-SA-甘油-PEG-40 kDa。收集、等分峰流分并使其经受接着的分析。
O - 聚糖 40 kDa- 糖 PEG- BDD-FVIII Y1680F
在由水中的咪唑(20 mM)、氯化钙(10 mM)、Tween 80 (0.02%)、氯化钠(500 mM)和甘油(1 M)组成的缓冲液(pH 7.3)中融化BDD-FVIII Y1680F (1.18 mg，0.85 mg/ml)。
加入来自产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的唾液酸酶(2.4 U，在20微升缓冲液中)、唾液酸转移酶(His-ST3Gal-I，2.5 mg/ml，6.75 U，125微升，EC 2.4.99.4，WO 2006102652)和胞苷一磷酸N-5’-PEG-甘油-神经氨酸、CMP-SA-甘油-PEG-40 kDa (1.9 mM，41微升缓冲液，78 nmol；参见WO2007/056191)。终体积是1.5 ml。将所产生的混合物在32摄氏度放置24小时。将混合物用缓冲液A (水中的咪唑 (20 mM)、氯化钙 (10 mM)、Tween 80 (0.02%)和甘油 (1 M) (pH 7.3))稀释至20 ml。
将所产生的混合物装载到MonoQ 5/50 GL柱(GE Healthcare Bio-Sciences, Hillerød, Denmark)上。将固定化的物质用缓冲液A (10倍柱体积)洗涤，在这之后使用0-100%缓冲液B (水中的咪唑(20 mM)、氯化钙 (10 mM)、Tween 80 (0.02%)、氯化钠(1 M)和甘油 (1 M) (pH 7.3))的梯度(10 CV 100% A、10 CV 0-20%缓冲液B、10 CV 20% 缓冲液B、25 CV 20 – 100% 缓冲液B和5 CV 100% 缓冲液B)从柱上洗脱。
将收集的物质与胞苷一磷酸N-5’乙酰基-神经氨酸(53 微克)和唾液酸转移酶(MBP-SBD-ST3Gal-III，EC 2.4.99.6，参见WO 2006102652)混合。终体积和浓度分别是2.56 ml和0.46 mg/ml (FVIII)，0.132 mg/ml (MBP-SBD-ST3Gal-III)和54微摩尔 (胞苷一磷酸N-5’乙酰基-神经氨酸)
将混合物在32摄氏度放置1小时，此时将混合物用缓冲液A稀释至20 ml。将所产生的混合物装载到MonoQ 5/50 GL柱(GE Healthcare Bio-Sciences)上。将固定化的物质用缓冲液A洗涤，在这之后使用0-100%的梯度(10 CV 100% A、10 CV 0-20% 缓冲液B、10 CV 20% 缓冲液B、25 CV 20-100%缓冲液B和5 CV 100% 缓冲液B)从柱上洗脱。使用SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，7 % Tris-Acetate、NuPAGE Tris-Acetate运行缓冲液，70分钟，150 V，非还原条件)评估分离的流分中的蛋白含量。
将选择的流分合并并使用Amicon超离心管(Millipore，截止值：50 kDa)浓缩。浓缩后的体积是0.5 ml。将所产生的溶液装载到已用由水中的组氨酸(1.5 g/l)、氯化钙(250 mg/l)、Tween 80 (0.1 g/l)、氯化钠 (18 g/l)和蔗糖(3 g/l)组成的缓冲液(pH 7.0)预平衡的Superose 6 10/300 GL柱(GE Healthcare Bio-Sciences, Hillerød, Denmark；柱体积24 ml)上。使用提及的缓冲液和0.6 ml/min的流速，将混合物的组分在1.5倍柱体积内分成1 ml尺寸的流分。将所选择的流分(0.015 mg/ml，2ml) 合并。
实施例3 用Peg-30K- 马来酰亚胺来PEG 化Y1680C ( 参考US2006/0115876 A1)
试剂：
1) BDD-FVIII N8-Y1680C (MW 178,000)，1200 μl，浓度80 μg/ml，96 μg，0.54 nmol，在缓冲液(20 mM 咪唑 + 10 mM CaCl2 + 0.02% Tween 80 + 1 M NaCl、1 M 甘油，pH 7.3)中
2) 三羧乙基膦 (TCEP，MW 287)：700eq；0.0315 μmMol；9 μg。将1 mg TCEP溶解在1 ml的缓冲液(20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween 80、1 M 甘油，pH 7.3、1 M NaCl)中。使用109 μl该溶液。
3) 30 kDa PEG-马来酰亚胺(来自NOF Corp.的Sunbright Me-300Ma，MW 29300)，10 eq.，180 μg。将4.8 mg 30 kDa PEG-马来酰亚胺溶解在2.4 ml的缓冲液(20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween 80、1 M 甘油，pH 7.3、1 M NaCl)中。使用90 uμl该溶液。
用于VivaP pure旋转柱(强阴离子交换)和Pro-spin (旋转柱)的缓冲液：
缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3
缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3、25mM NaCl
缓冲液C：20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3、50mM NaCl
缓冲液D：20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3、200mM NaCl
缓冲液E：20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3、1M NaCl
在室温融化BDD-FVIIIN8 –Y1680C并在5 ml管中合并。加入109 μl TCEP溶液的量。将混合物在5 ℃孵育30分钟。
然后，移除TCEP。将反应混合物用42ml的20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3稀释，使得盐浓度为31 mM。将溶液装载到Viva pPure Q maxi M (Sartorius，强阴离子交换)上。
平衡：装载10 ml缓冲液A。以2000 g (1500 RCF)旋转2分钟。
样品装载：装载4 × 11 ml稀释的样品。对于各样品，以2000g旋转2分钟。
洗脱缓冲液B (25 mM NaCl)：加入10 ml缓冲液B。以2000g旋转2分钟。
洗脱缓冲液C (50 mM NaCl)：加入10 ml缓冲液C。以2000g旋转2分钟。
洗脱缓冲液D (200 mM NaCl)：加入10 ml缓冲液D。以2000g旋转2分钟。
洗脱缓冲液E (1 M NaCl)：加入2 × 750μl缓冲液E。以2000g旋转1分钟。(重复2X)
在来自用缓冲液E洗脱的第一流分中收集去封闭的蛋白；通过Nanodrop测量为103 μg，137 μg/ml。然后使用NAP-10柱(GE Healthcare)进行缓冲液交换，并将20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3、1 M NaCl作为洗脱液。收集1200 μl包含所有物质的单一流分。
向该流分中加入90 μl的30 kDa PEG-马来酰亚胺溶液。将反应混合物在5 ℃孵育20小时的时间，在这之后，SDS-PAGE凝胶分析显示FVIII LC条带的密度降低，同时存在一条具有增加的分子量的新条带。
然后将反应混合物用42 ml的缓冲液(20 mM 咪唑、10 mM CaCl2CaCl2、0.02% Tween 80、1M甘油，pH 7.3)稀释，装载到Viva pure Q maxi M (强阴离子交换)旋转柱上并用如上所述的缓冲液B-E洗脱。收集67μg蛋白衍生物的量，浓度89 μg/ml，750 μl，将其装载到Superdex 200 10/300柱上并用组氨酸 (1.5 mg/ml)、CaCl2 CaCl2 (0.25 mg/ml)、Tween 80 (0.1 mg/ml)、NaCl (18 mg/ml)、蔗糖 (3 mg/ml)，pH 7洗脱。收集在9.5-12分钟保留时间洗脱的物质，提供单PEG化的BDD-FVIII N8-Y1680C突变体35 μg，14 μg/ml。流分的SDS-PAGE分析显示化合物的正确结构，具有与LC连接的PEG。
使用上述方案，制备了单PEG化的BDD-FVIII Y1680C化合物。在该化合物中，PEG基团与BDD-FVIII中的1680位置连接。该特定修饰引起两种同时的效应：降低的vWF结合和PEG介导的半寿期延长。
实施例4: 在显色测定中测量的FVIII:C
如下使用Coatest SP试剂(Chromogenix)，在显色FVIII测定中评价rFVIII化合物的FVIII活性(FVIII:C)：将rFVIII样品和FVIII标准品(例如，针对来自NIBSC的第7种国际FVIII标准品校准的纯化野生型rFVIII)在Coatest测定缓冲液(50 mM Tris、150 mM NaCl、1 % BSA，pH 7.3，具有防腐剂)中稀释。将50 μl的样品、标准品和缓冲液阴性对照一式两份加入到96孔微量滴定板(Nunc)中。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2以5:1:3 (体积：体积：体积)混合并将75 μl该混合物加入孔中。在室温孵育15分钟后，加入50 μl的因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物，并在加入25 μl 1 M 柠檬酸，pH 3前将反应在室温孵育10分钟。在Spectramax微量滴定板读数仪(Molecular Devices)上测量415 nm的吸光度，其中620 nm的吸光度用作参考波长。从所有样品中减去阴性对照值，并通过针对FVIII浓度绘制的吸光度值的线性回归，制作校正曲线。通过将样品的活性除以由HPLC确定的蛋白浓度，计算比活性。通过将色谱图中对应于轻链的峰下面积积分并与在野生型未修饰rFVIII的平行分析(其中通过氨基酸分析确定浓度)中的相同峰的面积比较，确定样品的浓度。表1中的数据显示，对于O-糖PEG化的rFVIII化合物，维持FVIII:C比活性。
实施例5: 在一期凝固测定中测量的FVIII:C
在如下的一期FVIII凝固测定中进一步评估rFVIII化合物的FVIII:C：将rFVIII样品和FVIII标准品(例如，针对来自NIBSC的第7种国际FVIII标准品校准的纯化野生型rFVIII)在HBS/BSA缓冲液(20 mM hepes、150 mM NaCl，pH 7.4，具有1 % BSA)中稀释至大约10 U/ml后，在包含VWF (Dade Behring)的FVIII-缺乏的血浆中稀释10倍。随后将样品在HBS/BSA缓冲液中稀释。使用单因素程序，在ACL300R或ACL5000仪器(Instrumentation Laboratory)上测量APTT凝固时间。将具有VWF (Dade Behring)的FVIII-缺乏的血浆用作测定血浆，并将SynthASil (HemosILTM，Instrumentation Laboratory)用作PTT试剂。在凝固仪器中，将稀释的样品或标准品在37 ℃与FVIII-缺乏的血浆、PTT试剂混合。测定氯化钙并通过浊度确定至凝固形成的时间。基于FVIII标准品稀释物的凝固形成时间的标准曲线，计算样品中的FVIII:C。表1中的数据显示凝固与显色活性之间的比。
表 1 显色比活性和相对于显色活性的凝固活性
。
实施例6: rFVIII 在FVIII- 和VWF- 缺乏的小鼠中的药代动力学
在FVIII-缺乏的小鼠(具有c57bl/6背景的FVIII外显子16敲除(KO)小鼠，在Taconic m&b饲养)中或在vWF-缺乏的小鼠(具有c57bl/6背景的vWF外显子4 + 5 KO小鼠，在Charles River，Germany饲养)中评估rfviii变体的药代动力学。vWF-KO小鼠具有13%的正常FVIII:C，而FVIII-KO小鼠不具有可检测的FVIII:C。使用具有大约25g重量和16-28周龄的雄性和雌性(大约1:1)的混合物。小鼠在尾静脉接受rFVIII的单次静脉内注射(280 iu/kg)。在给药后直至64小时的时间点，使用无涂层毛细玻璃管从眼眶丛取血。从每只小鼠中取3种样品，并在各时间点收集2-4个样品。将血液立即用柠檬酸钠稳定并在以4000 × g离心5分钟前在4倍体积的FVIII coatest sp缓冲液(参见实施例4)中稀释。将获自稀释血液的血浆在干冰上冷冻并在-80 ℃保存。在如实施例4中所述的显色测定中确定FVIII:C。使用winnonlin专业版4.1软件，通过非房室法(NCA)，进行药代动力学分析。表2显示对药代动力学参数的估计：半寿期(t1/2)，清除率(cl)和平均滞留时间(MRT)。数据显示在PEG化时清除率降低但半寿期和平均滞留时间增加。
BDD-FVIII在vWF KO小鼠中清除迅速(T1/2为0.5小时)，其符合vWF在循环中作为FVIII载体和稳定剂的普遍接受的假设。当用10K-80K糖PEG化的BDD-FVIII静脉内给予vWF KO小鼠时，观察到终末T1/2的增加(在2.7-11小时的范围内)，与BDD-FVIII相比，对应于5-22倍增加(表2)，表明糖PEG化降低FVIII与vWF结合的重要性。这与BDD-FVIII-PEG-vWF结合获得的初步数据一致，初步数据显示随着连接的PEG部分增加BDD-FVIII与vWF的结合降低。
表 2 用不同尺寸的 PEG 进行糖 PEG 化的 FVIII 在静脉内给予 vWF KO 小鼠后基于 ELISA 的药代动力学参数估计
。
令人感兴趣地，与FVIII KO小鼠相比，糖PEG化在vWF KO小鼠中几乎使BDD-FVIII的暴露概况“正常化”。连接的PEG基团越大，FVIII KO和vWF KO小鼠之间的药代动力学差异越小。随着PEG基团的尺寸增加，糖PEG化的BDD-FVIII变体的半寿期之间的比降低。这表明，与未修饰的BDD-FVIII相比，糖PEG化的变体的暴露较少依赖于vWF。当使用没有vWF结合的FVIII变体时，在FVIII KO小鼠中可观察到类似的趋势(表3)。
表 3 用不同尺寸的 PEG 进行糖 PEG 化的 FVIII 在静脉内给予 FVIII KO 小鼠后基于活性的药代动力学参数估计
。
实施例7 没有结合vWF 的能力的FVIII 变体在FeCl3 诱导的A 型血友病小鼠损伤模型中的止血作用
将小鼠用氯胺酮(Ketaminol® Vet. (Intervet)；100 mg/kg)、甲苯噻嗪(Narcoxyl® Vet.注射液(Intervet)；5.6 mg/kg)和阿托品(硫酸阿托品 (Phoenix Pharma)；0.3 mg/kg)的混合物麻醉，并放置在电热垫(37 ℃)上来维持体温。接着暴露颈动脉并在动脉周围放置0.5PSB纳米探针(Nanoprobe)。在诱导FeCl3损伤前5分钟，将测试化合物注射到侧面尾静脉。通过将短暂浸泡在10 % FeCl3溶液中的滤纸(2 × 5 mm)放置在邻近探针的动脉周围并在3分钟后移除，诱导FeCl3损伤。将动脉用0.9% NaCl洗涤三次并最后应用Surgilube (一种声音耦合器)以便排出流动探针中的空气并在移除FeCl3饱和的滤纸后获得优化的血流量测量。如果最初血流量太低(低于0.4 ml/min)或者如果在移除FeCl3后不能测量流量，那么排除小鼠。在移除FeCl3饱和的滤纸后，使用来自AD instruments的软件Chart5 (版本5.5.5.20)，记录血流量(ml/min) 25分钟。
数据分析
除非另有说明，数据以平均值 ± SEM呈现，并使用GraphPad Prism 版本5 (La Jolla, CA, USA)分析。使用单向ANOVA比较两种化合物的作用后，使用Tukey测试用于多重比较。P < 0.05被认为统计上显著。
结果
在FeCl3损伤后，在3.3分钟内阻塞具有正常功能的凝血系统的小鼠(C57BL/6NTac)中的所有血管，其中平均至阻塞时间为2.4 ± 0.2分钟(n=6；图1)。在25分钟观察期内，未阻塞FVIII敲除小鼠(n=6)。NNC 0129-0000-9105剂量依赖地减少至阻塞时间(NNC 0129-0000-9105对应于：在截短的B-结构域中的O-连接聚糖上的F8-500 Y1680F 40 kDa-PEGyleret)。在用5或10 IU/kg处理后，与溶媒处理的动物相比，至阻塞时间显著较短。Advate®观察到相似的作用，Advate®和NNC 0129-0000-9105的作用之间无统计学差异(图1)。
实施例8 没有结合vWF 的能力的FVIII 变体在A 型血友病小鼠尾巴事务性(transaction) 出血模型中的止血作用
将小鼠用戊巴比妥(100 mg/kg, 腹膜内；Nomeco, Roskilde, Denmark)麻醉，并放置在电热垫上来维持体温。通过用锋利的解剖刀切除4 mm的尾巴尖，诱导出血。在切除前10分钟，将尾巴放在包含14 mL盐水(37 ℃)中的试管中，并在切除前5分钟，以5 mL/kg的体积通过尾静脉注射给予测试化合物(20或280 U/kg)。将A型血友病小鼠和具有正常凝血的动物用相同体积的溶媒处理。使动物安乐死后，在30分钟的时间内收集血液。通过定量血红蛋白的量确定失血。因此，通过在4000×离心5分钟分离红细胞。丢弃上清液并将细胞用血红蛋白试剂(ABX Lysebio；HORIBA, ABX, Roedover, Denmark)裂解。通过在4000 × g离心5分钟移除细胞碎片。在550 nm对样品进行读数并从标准曲线中确定血红蛋白的总量(血红蛋白标准品；J.T. Baker 3074； Bie & Berntsen, Roedover, Den-mark)。
数据分析
除非另有说明，数据以平均值 ± SEM呈现，并使用GraphPad Prism 版本5 (La Jolla, CA, USA)分析。使用单向ANOVA比较两种化合物的作用后，使用Tukey测试用于多重比较。P < 0.05被认为统计上显著。
结果
之前已彻底研究了Advate®在FVIII敲除小鼠尾巴出血模型中的剂量反应关系(Documentum ObjectID: 0900c76e80e3e7a5)。200 IU/kg Advate®使失血和出血时间两者正常化，对于失血和出血时间的ED50值分别是39和28 IU/kg。为了测试NNC 0129-0000-9105的止血作用，将20和280 IU/kg与相同剂量的Advate®的作用比较。与溶媒处理动物相比，NNC0129-0000-9105 (20 和 280 IU/kg)显著减少失血和出血时间(图2)。在Advate®和NNC 0129-0000-9105的作用之间未观察到差异。
20 IU/kg的Advate®的作用比根据之前研究(Documentum ObjectID: 0900c76e80e3e7a5)预期的更明显。这最可能是由于Advate®的实际给予活性和一般变化在尾巴出血模型中的不同引起的联合作用。因此，在两种研究中的预期剂量为20 IU/kg，然而，在给予溶液中的FVIII活性(Chromogenix®)分析显示，活性比在当前和之前研究中所预期的分别高20 % (ELN15876-199)和低15%。然而这不能改变研究的总结论，NNC 0129-0000-9105和Advate®具有可比较的作用，因为在当前研究中给予两种化合物呈现可比较的FVIII活性。
实施例9 产生不与vWF 结合的具有血小板结合性质的FVIII 变体
使用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech, Ca)，从分离自表达AP3抗体的杂交瘤细胞的RNA中扩增抗-GPIIa/IIIB抗体AP3 的重链和轻链可变区。用于扩增两条AP3链的可变区的引物是：
重链：
通用引物混合物A (Clontech，CA)：
长的 (0.4 μM)：
5’–ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT–3’ (SEQ ID NO: 5)
短的 (2 μM)：
5’–ctaatacgactcactatagggc–3’ (SEQ ID NO: 6)
引物 69 (10 μM)
5’–gctctagactaacactcattcctgttgaagctcttg-3’ (SEQ ID NO: 7)
轻链
通用引物混合物A (Clontech:
长的 (0.4 μM)：
5’–ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT–3’ (SEQ ID NO: 8)
短的 (2 μM)：
5’–ctaatacgactcactatagggc–3’ (SEQ ID NO: 9)
引物 312 (10 μM)
5’–gtctaccacaacacacgtgac-3’ (SEQ ID NO: 10)
使用用于测序的Zero Blunt® TOPO® PCR克隆试剂盒(- 目录号 K287520，来自Invitrogen, CA)将可变区克隆到pCR4载体中。随后在基于pTT5的表达载体中将可变区亚克隆到鼠IgG1框架中。将编码全长AP3 抗体的两条链在Hek293 6E细胞中瞬时表达。通过FACS分析证实全长抗体与静息血小板的结合。
基于编码AP3抗体轻链和重链可变区的DNA序列，产生AP3 抗体的两条单链抗体形式(AP3 LC-HC scFV 和 AP3 HC-LC scFV) (SEQ 1和SEQ 2)。随后将AP3抗体的两条单链形式亚克隆到基于pTT5的表达载体中。通过FACS分析证实两条单链抗体与静息血小板的GPIIa/IIIB的结合。
使用标准分子生物学方法，通过将AP3 LC-HC scFV或AP3 HC-LC scFV插入到BDD FVIII的氨基酸R761和Q1686之间(分别是SEQ 3和SEQ 4)，在AP3 LC-HC scFV或AP3 HC-LC scFV与B-结构域缺失-a3结构域缺失的FVIII之间制备融合蛋白。
SEQ ID NO 11: AP3-LC-HC scFV-FLAG
SEQ ID NO 12: AP3-HC-LC scFV-FLAG
基于这些构建体，使用标准分子生物学方法，可产生变体AP3 scFv LC-HC C34S S248C。
N-((3-(ω-(3-(2,5- 二氧代-2,5- 二氢吡咯-1- 基) 丙酰基氨基)10 kDa PEG 基) 丙酰基氨基) 乙酰基)-O2-[5’] 胞苷酰- ξ- 神经氨酸的产生
步骤1：
3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酸 2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将3-马来酰亚胺基丙酸 (1.0 g，5.9 mmol)溶解在四氢呋喃 (20 ml)中。随后加入2-琥珀酰亚氨基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU，2.14 g，7.1 mmol)和乙基二异丙胺 (1.24 ml，7.1 mmol)。加入N,N-二甲基甲酰胺 (5 ml)。当变得缓慢时，将反应混合物在室温搅拌。将混合物搅拌2分钟。加入N,N-二甲基甲酰胺 (5 ml)。将混合物在室温搅拌2.5小时。将其用二氯甲烷 (150 ml)稀释并随后用10 %硫酸氢钠水溶液(150 ml)、硫酸氢钠饱和水溶液(150 ml)和水(150 ml)洗涤。将其在硫酸镁上干燥。在真空中移除溶剂。从乙酸乙酯中重结晶粗产物以提供1.20 g 3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酸 2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。
MS：m/z = 289，[M+Na]+要求：289
1H-NMR (CDCl3) δ 2.82 (m，4 H)；3.02 (t，2 H)；3.94 (t，2 H)，6.73 (s，2 H)。
步骤2：
将N-((3-(ω-氨基10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸 (100 mg，0.009 mmol)溶解在四氢呋喃 (2 ml)和二氯甲烷 (10 ml)的混合物中。加入3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酸 2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯 (50 mg，0.18 mmol)的二氯甲烷 (3 ml) 溶液。加入乙基二异丙胺 (0.005 ml，0.028 mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时。加入二氯甲烷 (2 ml)和乙基二异丙胺 (0.5 ml)。加入氨基甲基化的聚苯乙烯树脂(在例如Novabiochem市售，装载0.85 mmol/g，438 mg，0.372 mmol)。将混合物在室温缓慢搅拌1小时。通过过滤移除树脂。在具有25 ℃浴温度的真空中移除溶剂。将残留物溶解在二氯甲烷 (4 ml)中。加入乙醚 (200 ml)。为了使形成的沉淀变老，将混合物在室温放置2小时。通过过滤分离沉淀并在真空中干燥以提供38mg标题化合物。在DMSO-d6中的1H-NMR谱显示马来酰亚胺基的存在。
AP3 scFv LC-HC C34S S248C 与FVIII (NNC 0129-0000-3270) 的缀合
步骤1：
N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸与AP3 scFV C24S S248C的Cys 248的连接
将三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(0.40 mg)的缓冲液(由20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween 80、1 M 甘油组成，已调节至pH 7.35) (0.40 ml)溶液加入到浓度为0.53 mg/ml的AP3 scFv LC-HC C34S S248C (在其C端具有Flag标签，并具有与位置248上的半胱氨酸通过S-S桥连接的额外Cys)溶液(100 mM HEPES和150 mM NaCl，已调节至pH 7.5) (4 ml，2.12 mg，76 nmol)中。将反应混合物在20 ℃轻摇。将混合物分成两部分。将每一部分加入到PD-10柱(GE-Healthcare)上，使用已调节至pH 7.0的25 mM HEPES缓冲液。将柱的洗脱物合并(每一部分3.5 ml)。
将N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸(3.3 mg，305 nmol)的缓冲液(25 mM HEPES，已调节至pH 7.0) (0.43ml)溶液加入到蛋白溶液中。将反应混合物在20 ℃轻摇4小时。将混合物放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在10 ℃以4000 rpm经受超速离心10分钟。将混合物在冰箱中保存直至纯化。
为了纯化，融化混合物。以1 ml/min的流速使用具有床尺寸直径为16 mm且长度为60 cm的Superdex 200凝胶，并使用已调节至pH 8.0的25 mM TRIS和150 mM NaCl的缓冲液，使其经受尺寸排阻色谱。将包含所需产物的流分合并以提供1.61 mg 所需蛋白。SDS-PAGE凝胶与预期一致。
步骤2：
将B-结构域缺失的FVIII (其在重链的C端上具有残留的B-结构域序列SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR) (1 mg，5.64 mmol)的缓冲液(由20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、150 mM NaCl、0.02% Tween 80和1 M 甘油组成，已调节至pH 7.35) (0.018 ml)溶液放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。加入N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸与AP3 scFV C24S S248C的Cys 248的连接产物(1.29 mg，34 nmol)在25 mM TRIS和150 mM NaCl溶液(已调节至pH 8.0) (0.680 ml)中的溶液，并随后加入已调节至pH 6.07的由20 mM组氨酸、10 mM CaCl2、10 % 甘油、0.02% Tween80、500 mM NaCl组成的缓冲液(3 ml)。使混合物在10 ℃以4000 rpm经受超速离心20分钟。残余体积对于FVIII是0.800 ml或1.25 mg/ml。随后加入来自产脲节杆菌的唾液酸酶溶液(0.43 mg/ml，302 U/mg，0.0049 ml，0.645 U)和ST3-Gal-I溶液(2.5 mg/ml，0.105 mg，0.042 ml)。将反应混合物在32 ℃轻摇1分钟，并之后在32 ℃放置18小时。将其在冰箱中保存直至纯化。
将反应混合物融化。将其分为两部分，以0.30 ml/min的流速使用具有床尺寸直径为10 mm且长度为300 mm的Superose 6凝胶，并使用已调节至pH 7.35的由20 mM咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween80、150 mM NaCl和1 M甘油组成的缓冲液作为洗脱液，使每一部分经受尺寸排阻色谱。将包含所需产物的两次运行的所有流分合并。将它们放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中并使其在10 ℃以4000 rpm经受超速离心18分钟。
随后加入CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP NeuNac，1.5 mg，2597 nmol)的缓冲液(由20 mM咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween80、150 mM NaCl和1 M甘油组成，已调节至pH 7.35) (0.100 ml)溶液和0.33 mg/ml的ST3Gal-III (0.10 ml，0.033 mg)溶液。将反应混合物以300 rpm轻摇，并之后在冰箱保存直至纯化。
将反应混合物分成两部分。将每一部分通过0.00045 mm过滤器过滤。在用CNBr活化后，将它们装载到具有床尺寸直径为5 mm且长度为5 cm的已连接F25抗体的琼脂糖柱上。F25是抗FVIII的已知抗体。装载后，将柱用已调节至pH 7.35的由20 mM咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween80、150 mM NaCl和1 M甘油组成的缓冲液以0.6 ml/min的流速洗涤3 CV。之后将其用已调节至pH 7.35的 由20 mM咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween80和650 mM NaCl组成的缓冲液以0.6 ml/min的流速洗涤3 CV。最后，将化合物用已调节至pH 7.35的缓冲液(由50%v/v 乙二醇/水溶液中的20 mM咪唑、10 mM CaCl2、0.02% Tween80、2.5M NaCl组成)以0.1 ml/min的流速在6 CV内洗脱。将包含所需产物的两次运行的流分合并。将它们放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在10 ℃以4000 rpm经受超速离心14分钟。使用已调节至pH 7的由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl2、0.01% Tween80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液，以0.50 ml/min的流速在具有床尺寸直径为10 mm且长度为30 cm的Superose 6材料上，使剩余的溶液经受尺寸排阻色谱。将包含所需合适纯度的化合物流分合并，并将它们放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在9 ℃以4000 rpm经受超速离心12分钟。使用14.46的摩尔吸光度，发现产量0.0176 mg的AP3 scFv LC-HC C34S S248C与FVIII的缀合物。在非还原条件下的SDS-PAGE凝胶分析与预期一致。
N-((3-(ω-(4- 甲酰基苯甲酰基氨基)10 kDa PEG 基) 丙酰基氨基) 乙酰基)-O2-[5’] 胞苷酰-ξ- 神经氨酸的产生
步骤1
N-((3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸 (NNC 0129-0000-3219)
将N-(氨基乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸(18 mg，0.029 mmol)溶解在已调节至pH 8.9的由50 mM TRIS组成的缓冲液(4 ml)中。检查当前pH并通过加入0.1 N 盐酸调节至pH 8.9。加入THF (16 ml)。加入3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa PEG基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如在Rapp Polymere GmbH市售，总计200 mg，0.019 mmol)最终量的大约一半。将反应混合物在室温搅拌。1小时后，加入3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa PEG基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的另一半。将反应混合物在室温搅拌16小时。在具有25 ℃的浴温度的真空中移除THF。将剩余的混合物过滤，并使用25 mM碳酸氢铵缓冲液，以7 ml/min的流速使用具有床尺寸直径为26 mm且长度为10 cm的G25凝胶，使其经受尺寸排阻色谱。将包含所需化合物的流分合并，并冻干以提供453 mg包含N-((3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸的物质。
在DMSO-d6中进行的1H-NMR谱显示胞苷酰部分以及芴基-9-基甲氧基羰基部分的存在。将该物质在冰箱中保存。
用1g 3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa PEG基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和90 mg O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸重复该反应。使用30-50%的混合物(由50 mM 碳酸氢铵水溶液中的5 mM 碳酸氢铵水性乙腈溶液组成)梯度，在直径为2 cm的HPLC C4柱上进行纯化。将包含所需化合物的流分收集并冻干以提供288 mg所需的化合物。1H-NMR谱对应于在上文所述的实验中发现的1H-NMR谱。
步骤2：
N-((3-(ω-氨基10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸 (NNC 0129-0000-3227)
将N-((3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸 (453 mg)溶解在N,N-二甲基甲酰胺 (12 ml)中。加入哌啶(1.25 ml)。将透明溶液在室温搅拌20分钟。加入乙醚(200 ml)。为了使形成的沉淀变老，将混合物在室温放置1.5小时。通过过滤分离沉淀。将其溶解在二氯甲烷 (4 ml)中。加入乙基二异丙胺(1 ml)。加入乙醚(250 ml)。为了使形成的沉淀变老，将混合物在室温放置16小时。通过过滤分离沉淀并在真空中干燥。在DMSO-d6中的1H-NMR谱显示无9H-芴-9-基甲氧基羰基的信号，然而可发现分配给胞苷酰部分的信号。将该物质在冰箱中保存。
步骤3：
4-甲酰基苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将三乙基胺(2.04 ml，14.65 mmol)和2-琥珀酰亚氨基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU，4.44g，14.65 mmol)依次加入到4-甲酰基苯甲酸 (2.0 g，13.3 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺 (30 ml)溶液中。将反应混合物在室温搅拌16小时。将其用乙酸乙酯(150 ml)稀释并用10% 硫酸氢钠水溶液(100 ml)洗涤。将水相用乙酸乙酯 (2 × 30 ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50 ml)和水(50 ml)的混合物洗涤。将合并的有机层在硫酸镁上干燥。在真空中移除溶剂。从乙酸乙酯中重结晶粗产物以提供1.89 g 4-甲酰基苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。
1H-NMR (CDCl3)。δ 2.95 (s，4 H)；8.04 (d，2 H)，8.32 (d，2 H)；10.15 (s，1 H)。
步骤4：
将N-((3-(ω-氨基 10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸(42 mg，0.004 mmol)溶解在二氯甲烷 (2 ml)中。将乙基二异丙胺(0.002 ml，0.012 mmol)加入到溶液中。加入4-甲酰基苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(19.32 mg，0.078 mmol)的二氯甲烷(0.5 ml)溶液。将反应混合物在室温搅拌16小时。在具有25 ℃浴温度的真空中移除溶剂。将残留物悬浮在25 mM碳酸氢铵水溶液(15 ml)中。通过过滤移除不溶性物质。将其分为5部分。使用25 mM碳酸氢铵缓冲液，用7 ml/min的流速在直径为26 mm且长度为10 cm的柱上使用G25使每一部分经受尺寸排阻色谱。将包含所需物质的所有流分合并并冻干。在DMSO-d6中的1H-NMR谱显示醛部分和胞苷酰部分两者的存在。将获得的物质在冰箱中保存。
阿昔单抗与FVIII 在O- 聚糖上的缀合 (NNC 0129-0000-3279)
步骤1：
N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸与阿昔单抗的一个N端缀合
将市售阿昔单抗溶液 (ProReo，10 mg，215 nmol，在2 mg/ml 商业缓冲溶液中)放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。加入已调节至pH 7.4的由25 mM HEPES组成的缓冲液(5 ml)。在10 ℃以4000 rpm进行超速离心10分钟。加入已调节至pH 7.4的由25 mM HEPES组成的缓冲液(10 ml)。在10 ℃以4000 rpm进行超速离心10分钟。加入已调节至pH 7.4的由25 mM HEPES组成的缓冲液(10 ml)。在10 ℃以4000 rpm进行超速离心10分钟。将0.65 ml剩余溶液放置在塑料反应器中。加入已调节至pH 7.4的由25 mM HEPES组成的缓冲液(3.85 ml)。加入N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸(14 mg，1290 nmol)的缓冲液(由25 mM HEPES组成，已调节至pH 7.0) (1.5 ml)溶液。将反应混合物在20 ℃以300 rpm 轻摇3分钟。加入新鲜制备的1.0 M 氰基硼氢钠水(0.025 ml)溶液。将反应混合物在20 ℃以300 rpm 轻摇。1小时后，加入另一部分氰基硼氢钠溶液(0.025 ml)。1小时后，加入另一部分氰基硼氢钠溶液(0.025 ml)。1小时后，加入另一部分氰基硼氢钠溶液。将溶液在20 ℃以300 rpm 轻摇16小时。将反应混合物放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在18 ℃以4000 rpm经受超速离心10分钟。将0.360 ml的剩余溶液过滤，并使用已调节至pH 8.0的25 mM TRIS、150 mM NaCl的缓冲液作为洗脱液，以1 ml/min的流速在具有床尺寸为16 mm ×60 cm的Superdex200凝胶上使其经受尺寸排阻色谱。将包含所需产物的流分合并为两批。将每一批放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在10 ℃以4000 rpm经受超速离心10分钟，分别产生2.67 mg和3.27 mg。在Nanodrop ®分光光度计上使用10.94的摩尔吸光度用于定量。通过SDS-PAGE对产物的分析与对N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸与阿昔单抗的一个N端缀合物的预期一致。
步骤2：
阿昔单抗与FVIII的O-聚糖的缀合
将已调节至pH 7.35的由20 mM组氨酸、10 mM CaCl2、150 mM NaCl、0.02% Tween80和1 M甘油组成的缓冲液(2.5 ml)加入到B-结构域缺失的FVIII (其在重链的C端上具有残留的B-结构域序列SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR) (5.7 mg/ml，1 mg，5.6 nmol)的缓冲液(由20 mM 咪唑、10 mM CaCl2、150 mM NaCl、0.02% Tween 80和1 M 甘油组成，已调节至pH 7.35)溶液中。加入N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰基氨基)10 kDa PEG基)丙酰基氨基)乙酰基)-O2-[5’]胞苷酰-ξ-神经氨酸与阿昔单抗的一个N端的缀合物(2.3 mg，39.5 nmol)的缓冲液(由25 mM TRIS、150 mM NaCl组成，已调节至pH 8.0) (0.323 ml)溶液。将溶液放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在10 ℃以4000 rpm经受超速离心20分钟。加入已调节至pH 7.35的由20 mM组氨酸、10 mM CaCl2、150 mM NaCl、0.02% Tween80和1 M甘油组成的缓冲液(2 ml)。使溶液在10 ℃以4000 rpm经受超速离心30分钟，剩下具有体积为1.4 ml的溶液。随后加入产脲节杆菌的唾液酸酶溶液(0.4 mg/ml，242 U/mg，0.0066 ml)和ST3Gal-I溶液(2.5 mg/ml，0.042 ml)。将反应混合物在32 ℃轻摇15分钟。然后将反应混合物在32 ℃静置20.5小时。将反应混合物放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使其在10 ℃以4000 rpm经受超速离心15分钟。使0.300 ml的剩余溶液经受尺寸排阻色谱，以0.5 ml/min的流速使用具有床尺寸为10 mm × 300 mm的Superose 6材料，并使用已调节至pH 7的由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl2、0.01% Tween80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液作为洗脱液。将包含所需产物的流分合并，并放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。加入已调节至pH 6.07的由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl2、10% 甘油、0.02% Tween80、500 mM NaCl组成的缓冲液(2.5 ml)。使溶液在10 ℃以4000 rpm经受超速离心15分钟。加入已调节至pH 6.07的由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl2、10% 甘油、0.02% Tween80、500 mM NaCl组成的缓冲液(1.5 ml)。使溶液在10 ℃以4000 rpm经受超速离心15分钟。将0.220 ml的剩余溶液放置在塑料反应器中。加入市售CMP NeuNAc (1.73 mg，2800 nmol)的缓冲液(由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl2、10% 甘油、0.02% Tween80、500 mM NaCl，已调节至pH 6.07) (0.173 ml)溶液。将反应混合物在32 ℃以300 rpm轻摇1小时。以0.5 ml/min的流速使用具有床尺寸为10 mm × 300 mm的Superose 6材料，并使用已调节至pH 7的由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl2、0.01% Tween80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液作为洗脱液，使其经受尺寸排阻色谱。将包含所需产物的流分合并，并放置在具有10 kDa截止值的Amicon超速离心设备中。使合并物在10 ℃以4000 rpm经受超速离心5分钟以提供0.275 ml的0.0358 mg阿昔单抗与FVIII在O-聚糖上的缀合产物的溶液。在Nanodrop ®分光光度计上使用13.15的摩尔吸光度用于定量。SDS-PAGE分析与对阿昔单抗与FVIII在O-聚糖上的缀合产物的SDS-PAGE预期一致。

Claims (10)

1.一种重组因子VIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力，且其中所述分子与至少一种侧基共价缀合，该重组因子VIII分子是序列如SEQ ID NO：1所示的B-结构域截短的因子VIII分子的变体，且该重组因子VIII分子仅包含Y1680F或Y1680C突变。
2.权利要求1的分子，其中所述侧基选自以下的一种或多种：亲水聚合物、白蛋白结合剂、抗体或其片段和白蛋白。
3.权利要求1-2中任一项的分子，其中侧基与截短的B-结构域共价缀合，且其中因子VIII活化导致共价缀合的侧基的移除。
4.权利要求3的分子，其中所述分子与亲水聚合物通过截短的B结构域中的O-连接寡糖共价缀合，且其中因子VIII活化导致共价缀合的亲水聚合物的移除。
5.权利要求4的分子，其中所述O-连接寡糖与通过截短B-结构域而产生的O-糖基化位点连接。
6.权利要求1-2中任一项的分子，其中所述侧基是PEG。
7.一种制备权利要求1-6中任一项的分子的方法，其中所述方法包括将侧基与具有降低的结合vWF的能力的因子VIII分子连接。
8.一种分子，其由权利要求7的方法获得。
9.权利要求1-6和8中任一项的分子用于制备治疗血友病的药物的用途。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-6和8中任一项的分子。
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