JP2013519636A - コンジュゲートfviiiバリアント - Google Patents
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Abstract
Description
第VIII因子分子:FVIII/第VIII因子は、主として肝細胞によって生成される大きな複合糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含めると2351アミノ酸からなり、相同性によって定義されるいくつかの別々なドメインを含有している。3つのAドメイン、唯一のBドメイン、および2つのCドメインがある。ドメインの順序は、NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHと記載することができる。FVIIIは、B-A3境界で分離された2本の鎖として血漿中を循環する。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって接続される。A3-C1-C2は軽鎖(LC)と呼ばれ、一方、A1-A2-B鎖は重鎖(HC)と呼ばれる。
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
- 天然で遊離のシステイン(遊離のシステインはタンパク質中ではまれな残基である)。但し、システインはかなり疎水性のアミノ酸であるので、しばしば、タンパク質構造中に埋め込まれており、したがって、試薬への接近性が乏しい。
- または、より高い蓋然性において、部位特異的変異導入によって、タンパク質中に導入されたシステイン残基。但し、起こり得るタンパク質構造変化および免疫原性のすべての潜在的な問題が伴う。
本発明との関連における多糖は、グルコース、ガラクトース、スルホ-ガラクトース、N-アセチル-ガラクトース、フコース、フルクトース、キシローズ、アラビノース、グルクロン酸、スルホ-グルクロン酸、イズロン酸、スルホ-イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、スルホ-グルコサミン、ガラクトサミン、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-ガラクトサミン-スルフェート、N-アセチルガラクトサミン-ジスルフェート、N-アセチルガラクトサミン-スルフェート、N-アセチル-ノイラミン酸(Neu5Ac)、スルホ-N-アセチル-ノイラミン酸、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc)、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)のような単量体ユニットからなる、ホモまたはヘテロ多糖を含めた、多糖に基づく重合体である。
略語:
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
HOBt:1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール
THF:テトラヒドロフラン
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
TFA:トリフルオロ酢酸
HC、LC:N8の重鎖および軽鎖
CMP:シチジン一リン酸
GSC:シチジン一リン酸-5'-グリシル-ノイラミン酸
GSC-ONH2:5'-(2-(12-((アミノキシメチルカルボニル)アミノ)-4,7,10-トリオキサドデカノイル)アミノエタノイル)ノイラミン酸シチジン一リン酸
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザ-ベンゾトリアゾール
PSA:ポリシアル酸。ここでは、α2,8ポリシアル酸(コロミン酸)によって例示される。
NAN-CMP:N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸
SEC-MALS:多角度光散乱検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィー
IEX:イオン交換。
CV:カラム容積
概説:市販のコロミン酸を陰イオン交換カラムで分画し、約20kDまたは約45kDのいずれかの分子量を有する画分をプールした。得られた物質を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。酸化PSAをGSC-ヒドロキシルアミン誘導体、5'-(2-(12-((アミノキシメチルカルボニル)アミノ)-4-7-10-トリオキサドデカノイル)アミノエタノイル)-ノイラミン酸シチジン一リン酸とカップリングさせ、GSC-ON=PSA試薬を得た。これが、N-アシアロ(O)-PEG40 N8のST3Gal-III触媒ポリシアル酸付加におけるドナーとして用いられた(したがって、PSAはN-グリカンにカップリングされた)。
12-((Fmoc-アミノキシメチルカルボニル)アミノ)-4-7-10-トリオキサドデカン酸3の合成:
GSC誘導体の合成:(5'-(2-(12-((アミノキシメチルカルボニル)アミノ)-4-7-10-トリオキサドデカノイル)アミノエタノイル)-ノイラミン酸シチジン一リン酸) 6(「GSC-ONH2」)
分子量約20kDaの物質を得るコロミン酸分画:
用いられたコロミン酸は、Sigma-Aldrichから市販されている化合物(大腸菌由来のα2,8ポリシアル酸ナトリウム塩(PSA))であった。より均質な物質(その分子量に関して)を得るために、WO2008/074032に記載のイオン交換カラム上で分画した。約20kDの分子量に対応する画分を後続の実験で用いた。
実施例3で単離された20kD PSA物質の過ヨウ素酸ナトリウム酸化:
PSA重合体の非還元末端のポリオールの過ヨウ素酸ナトリウム酸化を、本質的に文献(例えば:Jainら、BBA (2003) 1622, 42-49)に記載の通りに、一部改変して行った。20kD PSAの溶液(2.24ml H2O中に40mg)に過ヨウ素酸ナトリウム溶液(2.244ml H2O中に0.96mg)を添加した。暗中、23℃で15分間、反応物をインキュベートした。
シアリルトランスフェラーゼST3GalIII基質であるGSC-ON=PSA(20kD)を産生させるための、過ヨウ素酸ナトリウム酸化されたPSA(20kD)の、GSC-ONH2へのカップリング:
溶液:
- 反応バッファー:100mMイミダゾールpH6.8
- GSC-ONH2(実施例X2から):反応バッファー中に8.2mg/ml。
- 過ヨウ素酸酸化されたPSA(20kD):反応バッファー中に175mg/ml
- アニリン(MW=93.13、d=1.0217)
- メチルヒドロキシルアミン塩酸塩:反応バッファー中に58.5mg/ml
反応バッファー中の過ヨウ素酸酸化されたPSA(20kD)溶液(200μl、35mg、1.75μモル)に反応バッファー中のGSC-ONH2溶液(400μl、3.26mg、3.6μモル、約2当量)を添加した。激しい磁気撹拌下での1M HCl(5.5μl)の添加によってpHを6.9に調整した。次いで、アニリン(0.56μl、6nモル)を添加した。黄色がかりわずかに混濁した混合物を25℃でインキュベートした。10〜15分後にいくらかの沈殿が観察された。
GSC-ON=PSA(20kD)との(N)-アシアロ(O)-PEG(40kD)N8のシアリルトランスフェラーゼST3Gal-III触媒反応による(N)-PSA(20kD)-(O)-PEG(40kD)-N8の調製
第1工程:
(O)-PEG(40kD) (N)-アシアロ-N8 N8
この化合物は、特許WO2009/108806 A1に開示の手順に従って合成した。
GSC-ON=PSA(20kD)による(O)-PEG(40kD)(N)-アシアロN8のST3Gal-III触媒PSA化:
溶液:
- 反応バッファー:1.5g/l L-ヒスチジン、3g/lショ糖、18g/l NaCl、0.1g/l Tween 80; 0.25g/l CaCl2、2H2O、pH7.3
- GSC-ON=PSA(20kD):反応バッファー中に0.78mM
- ST3Gal-III:(ラット酵素):1.42mg/ml(1.34U/mg)
- (O)PEG(40kD)-(N)アシアロN8:反応バッファー中に1.76mg/ml
(O)-PEG(40kD)(N)-アシアロN8溶液(272μl、0.48mgタンパク質、2.71nモル)にGSC-ON=PSA溶液(36.5μl、28.5nモル、10.5当量)を添加した。反応バッファー(104μl)を添加した。反応は、酵素(63.2μl、89.6μg、約120mU)の添加によって開始した。反応混合物は、32℃で22時間インキュベートした。
用いられたバッファーは以下の通りであった。
- バッファーA:10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02%Tween 80を含有し、NaClを含まない20mMイミダゾールバッファーpH7.4
- バッファーB、バッファーA+1M NaCl
- 反応バッファー:1.5g/l L-ヒスチジン、3g/lショ糖、18g/l NaCl、0.1g/l Tween 80、0.25g/l CaCl2、2H2O、pH7.3
バッファーA(8ml)中に希釈した後、反応混合物を、製造業者説明書に従ってVivapure Q Mini Mデバイスにおけるイオン交換によって精製した。生成物をバッファーB中に回収した。
- SDS PAGE分析:
回収された生成物を7%Tris酢酸SDSゲル(150V、1時間10分)(Invitrogen)において、還元条件下で流し、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。
分析は、逆相Daiso 300A、250×2.1、5μカラムで行われた。溶出液は:A:H2O/TFA 0.1%およびB:H2O/ACN/TFA(80:20:0.09%)、流速0.25ml/分、カラムオーブンの温度40℃であった。勾配は、30分にわたる、35%から84%までであった。HPLCは、DAD検出器(280nm)と、励起波長が280nmであり、発光波長が348nmである蛍光検出器との2つの検出器を備えていた。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は、下記の表に示されている通りであった。FVIIIの重鎖および軽鎖、ならびに中間体(O)-PEG(40kD)-N8の保持時間を比較のために示す。
最終生成物の活性を、Chromogenixの色素産生アッセイCoA試験SP FVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、80%を超える活性が回収された。
分子量約45kDの物質を得るためのコロミン酸断片化
用いられたコロミン酸は、Sigma-Aldrichから市販されている化合物(α2,8ポリシアル酸ナトリウム塩(PSA))であった。より均質な物質(その分子量に関して)を得るために、それを、バッファーAおよびBを用いて、HiPrep16/10Q FF陰イオン交換カラム(GE Healthcare)上で分画した。
A:10mM トリエタノールアミンpH7.4、25mM NaCl
B:10mM トリエタノールアミンpH7.4、1M NaCl
45kD PSAの過ヨウ素酸ナトリウム酸化
実施例7で得られた物質(「45kD PSA」)の水溶液(0.5ml水中に13.5mg)に、4mM過ヨウ素酸ナトリウム水溶液(167μl、2.24モル当量)を添加した。暗中、周囲温度で15分間、反応物をインキュベートした。
シアリルトランスフェラーゼST3GalIII基質GSC-ON=PSA(45kD)を産生するための、過ヨウ素酸ナトリウム酸化されたPSA(45kD)の、GSC-ONH2へのカップリング:
溶液:
- 反応バッファー:100mMイミダゾールpH6.8
- GSC-ONH2(実施例2から):反応バッファー(6.8にpH調整されている)中に8.3mg/ml
- 過ヨウ素酸酸化された45kDa PSA(実施例Y2から):反応バッファー中に355mg/ml
- 飽和したアニリン水溶液(約0.38M)
- メチルヒドロキシルアミン塩酸塩:反応バッファー中に58.5mg/ml
反応は、本質的に実施例5に記載の通りに行った。詳述は下記に含まれる。反応バッファー中の過ヨウ素酸酸化された45kD PSA(実施例8から)の溶液(92μl, 32.7mg, 0.73μモル)に反応バッファー中のGSC-ONH2(実施例2から)溶液(168μl、1.4mg、1.5μモル、約2当量)を添加した。次いで、アニリンの飽和水溶液(6.8μl、2.58μモル)を添加した。反応混合物を周囲温度でインキュベートした。
GSC-ON=PSA(45kD)を用いた(N-アシアロ)(O)-PEG(40kD)N8のシアリルトランスフェラーゼST3Gal-III触媒反応によるN-PSA(45kD)(O)-PEG(40kD)N8グリカンの調製
第1工程:
(O)-PEG40kD(N)-アシアロN8:
化合物は、特許WO2009/108806 A1に記載された手順に従って合成された。
GSC-ON=PSA(45kD)を用いた(N)-アシアロ(O)-PEG(40kD)(N)-アシアロN8のST3Gal-III触媒PSA化:
溶液:
- 反応バッファー:20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、0.5M NaCl
- アシアロ-[O]-PEG40kD-N8:2.78mg/ml
- GSC-ON=PSA(45kD)反応バッファー中に0.27mM
- ST3Gal-III:(ラット酵素):MBP-SBP-ST3Gal III: 1mg/ml
(N)アシアロ(O)-PEG40kD-N8溶液(325μl、0.9mgタンパク質、5.13nモル)にGSC-ON=PSA(45kD)溶液(190μl、51.3nモル、2.3mg、10当量)を添加した。反応は、酵素(116.3μl、116.3μg)の添加によって開始した。反応混合物を32℃で17時間インキュベートした。
20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween 80、25mM NaClで反応混合物を16mlに希釈し、その後、MonoQ 5/50GL(GE Healthcare)におけるイオン交換によって精製した。用いられたバッファーは以下の通りであった。バッファーA:10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween 80を含有する(NaClを含まない)20mMイミダゾールバッファーpH7.4およびバッファーB:10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween 80、1M NaClを含有する20mMイミダゾールバッファーpH7.4。流速は0.7ml/分であった。カラムを20CVで平衡化した。溶出プロファイルは以下の通りであった:3CVにわたって0%B、5CVにわたって0から20%B、15CVにわたって20%B、15CVにわたって20から100%B、10CVにわたって100%B。UV検出を280nmで行った。分画は周囲温度で行った。最初に酵素を溶出させ、後で小さな肩のあるピークとして生成物を溶出する。主要ピークに相当する画分をプールし、さらに精製し、溶出液として、1.5g/l L-ヒスチジン、3g/lショ糖、18g/l NaCl、0.1g/l Tween 80;0.25g/l CaCl2, 2H2O、pH7.3を含有するバッファーを用いて、サイズ排除カラムSuperdex200 10×300GL(GE Healthcare)においてバッファー交換した。流速は0.5ml/分であった。UV検出を280nmで行った。生成物を主要ピークとして溶出し、その後、ピーク間のベースライン分離を用いて小さなピークを溶出した。主要ピークに相当する画分をプールし、Millipore Amicon Ultra, 50kDカットオフにおける限外濾過によって濃縮した。タンパク質回収率は52%であった。
- SDS PAGE分析:
回収した生成物を、還元条件下、7%Tris酢酸SDSゲル(Invitrogen)において流し(150V、1時間10分)、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。
逆相Daiso 300A、250×2.1、5μカラムで分析を行った。溶出液は、A:H2O/TFA 0.1%、およびB:H2O/ACN/TFA(80:20:0.09%)、流速0.25ml/分であり、カラムオーブンの温度は40℃であった。勾配は、30分にわたる、35%から84%までであった。HPLCは、2つの検出器:DAD検出器(214nm)を備えていた。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は下記の表の通りであった。N8の重鎖および軽鎖、ならびに中間体(O)-PEG(40kD)-N8の保持時間を比較のために示す。
最終生成物の活性は、製造業者の説明書に従って、Chromogenixの色素産生アッセイCoA試験SP FVIIIで測定した。開始N8と比較して、約55%の活性が回収された。
(O)-PSA (N)-PSA-N8型のN8コンジュゲートの合成
概説:(O)-アシアロ(N)-アシアロN8を得るために、N8を脱シアリル化した(アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)由来のシアリダーゼによって触媒される反応)。(O)-アシアロ(N)-アシアロN8を用いたGSC-ON=PSA(実施例5または9)のST3Gal-I触媒反応によって、PSAを(O)-アシアログリカンに移した。イオン交換による精製の後、GSC-ON=PSA試薬を、N-アシアロ(O)-PEG40 N8のST3Gal-III触媒ポリシアル酸付加におけるドナーとして用いた。最後に、NAN-CMPを反応混合物に添加することによって、未反応の残ったガラクトース部分をすべてキャッピングした。
溶液:
- 反応バッファー:20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、0.5M NaCl
- N8:反応バッファー中に5.7mg/ml(8650U/mg)
- シアリダーゼ:アルスロバクター・ウレアファシエンス由来。0.4mg/ml、242U/mg。
- GSC-ON=PSA(20kD): (3g/lショ糖、1.5g/l L-ヒスチジン、18g/l NaCl、0.1g/l Tween 80; 0.25g/l CaCl2;pH7.3)中に25mg/ml
- His-ST3Gal-I;AA46〜343; (50mM Tris pH8、100mM NaCl)中に2.5mg/ml
反応バッファー中のN8の溶液(1.5mg、8.5nモル、263μl)にA.ウレアファシエンスシアリダーゼの溶液(7μl、678mU、1.5U/ml最終濃度)およびST3Gal-I酵素の溶液(108μl、0.27mg)を添加した。GSC-ON=PSA(20kD)の溶液(68μl、1.7mg、約85nモル、約10当量)を添加した。反応混合物を24時間、23℃でインキュベートした。
(20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール)を含有するバッファーで反応混合物を20倍希釈し、イオン交換カラム(MonoQ 5/50GL、GE Healthcare)で精製した。溶出バッファーは、バッファーA:20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、およびバッファーB:1.5M NaClを添加したバッファーAであった。流速は0.35ml/分であった。精製は15℃で行った。検出はUV、280nmで行った。溶出は以下の通りであった:5CVにわたって0から20%B、25CVにわたって20から100%B、5CVにわたって100%B。1ml画分を96ディープウェルプレート内に収集した。関連する画分を、還元条件下のSDS PAGE(7% Tris酢酸SDSゲル)(150V、1時間10分)(Invitrogen)によって、銀染色を用いて分析した。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。主要ピークに相当する画分は、N8(N8の約35%がO-グリコシル化されていない(Thimら、Haemophilia (2010), 16(Suppl 5), 194))および(O)-PSA化N8の混合物を含有する。シアリダーゼまたはST3Gal-I酵素の痕跡は検出することができなかった。
溶液:
- (O)-PSA(20kD)-(N)アシアロN8およびN8(工程1から)の混合物:5.5mgタンパク質/ml
- GSC-ON=PSA(20kD):(3g/lショ糖、1.5g/l L-ヒスチジン、18g/l NaCl、0.1g/l Tween 80;0.25g/l CaCl2;pH7.3)中に25mg/ml。
- ST3Gal-III:(14mM Hepes pH7、140mM NaCl、50%グリセロール)中に(MBP-SBD-ST3Gal-III) 0.33mg/ml。0.54U/ml。Millipore Biomaxカットオフ5kDでの限外濾過によって(約15倍)濃縮。
- NAN-CMP:20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール中に50mg/ml
第1工程で得られた(O)-PSA(20kD)-(N)-アシアロN8およびN8の混合物(210μl、6.4nモル)にGSC-ON=PSA(20kD)の溶液(26μl、32nモル)を添加した。ST3Gal-III酵素溶液(40μl、324mU、198μg)の添加によって、反応を開始させた。反応混合物を32℃でインキュベートした。3時間の反応時間の後、GSC-ON=PSA(20kD)溶液の新しい部分を添加した(20μl、25nモル)。反応混合物を21時間インキュベートした。
上記の反応混合物に、NAN-CMPの溶液(10μl、0.5mg)を添加した。混合物を32℃で2時間インキュベートした。
反応混合物を20mMイミダゾールバッファーpH7.4、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロールで20倍希釈した。
- SDS PAGE分析:
回収した生成物を、還元条件下、7%Tris酢酸SDSゲル(Invitrogen)において流し(150V、1時間10分)、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。
分析は、実施例10に示した通りに行った。
最終生成物の活性をChromogenixの色素産生アッセイCoA試験SP FVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、約55%の活性が回収された。
(N)-PSA-N8型のN8コンジュゲートの合成
概説:(N)-アシアロN8を得るためにウェルシュ菌(Clostridium perfringens)由来のシアリダーゼを用いてN8を脱シアリル化した。GSC-ON=PSA試薬を、N-アシアロ(O)-PEG40 N8のST3Gal-III触媒ポリシアル酸付加におけるドナーとして用いた。最後に、NAN-CMPを反応混合物に添加することによって、未反応の残ったガラクトース部分をすべてキャッピングした。
(N)-PSA(45kD)N8の合成:
第1工程:ウェルシュ菌シアリダーゼによるN8の脱シアリル化:
溶液:
- 反応バッファー:20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、0.5M NaCl。
- シアリダーゼ:0.3mg/ml 200U/ml
- N8:反応バッファー中に5.7mg/ml
N8溶液(350μl、2mg)に反応バッファー(350μl)および酵素溶液(20μl、4U)を添加した。混合物を、23℃で45分間インキュベートした。
反応混合物を(20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、0.15M NaCl)で10倍希釈した。得られた溶液を、Akta Purifier(GE Healthcare)における陰イオン交換カラム(MonoQ5/50GL、GE Healthcare)で精製した。用いられたバッファーは、バッファーA:20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、25mM NaCl、およびバッファーB:1M NaClを含むバッファーAであった。流速は0.5ml/分であり、検出はUV、280nmによって行った。溶出は以下の通りであった:5CVにわたって0から20%B、10CVにわたって20%B、10CVにわたって100%B。溶出液は、最終勾配工程における0.5ml画分で収集した。タンパク質回収率は45%であった。
試薬:
- 反応バッファー: 20mMイミダゾールバッファーpH7.3,10mM CaCl2,0.02%Tween 80,1Mグリセロール、0.5M NaCl。
- [N]-アシアロ-N8: 20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、0.25M NaCl中に2.39mg/ml
- GSC-ON=PSA(45kD): 反応バッファー中に約0.27mM(12.1mg/ml)
- ST3Gal III:(ラット酵素): MBP-SBP-ST3Gal III、1mg/ml、1.2U/mg
[N]-アシアロ-N8の溶液(364μl、0.87mgタンパク質)に、GSC-ON=PSA(45kD)の溶液(183μl、2.22mg)を添加した。酵素(122μl、122μg、146mU)の添加によって反応を開始した。混合物を32℃で終夜インキュベートした。
NAN-CMPの溶液(15μlの反応バッファー中に1.3mg)を添加し、その結果得られた混合物を32℃で1時間インキュベートした。
反応混合物を20mMイミダゾールバッファーpH7.3、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、25mM NaClで10倍希釈し、Akta Purifierシステム(GE Healthcare)における陰イオン交換(MonoQ 5/50GL、GE Healthcare)によって精製した。用いられたバッファーは、バッファーA:20mMイミダゾールバッファーpH7.3,10mM CaCl2,0.02%Tween 80,1Mグリセロール、25mM NaCl、およびバッファーB:1M NaClを含むバッファーAであった。流速は0.7ml/分であり、検出はUV、280nmによって行った。精製を15℃で行った。溶出は以下の通りであった:5CVにわたって0から20%B、15CVにわたって20%B、15CVにわたって20から100%B、10CVにわたって100%B。溶出液は0.5ml画分で収集した。タンパク質回収率は32%であった。
- SDS PAGE分析:
回収した生成物を、還元条件下、7%Tris酢酸SDSゲル(Invitrogen)において流し(150V、1時間10分)、クマシーブルー染色を用いた。タンパク質標準物質は、InvitrogenのHiMark無染色HMWタンパク質標準物質であった。
分析は、実施例10に示した通りに行った。
最終生成物の活性をChromogenixの色素産生アッセイCoA試験SP FVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、約60%の活性が回収された。
(N)-PSA(20kD)N8の合成
合成は、(N)-PSA(45kD) N8の合成と同様に行った。タンパク質回収率は39%であった。
- SDS-PAGE分析:実施例12の通りに行った。
逆相Daiso 300A、250×24,5μカラムで分析を行った。溶出液は、A:H2O/TFA 0.1%、およびB:H2O/ACN/TFA(80:20:0.09%)であり、流速は1ml/分であり、カラムオーブンの温度は40℃であった。勾配は、30分にわたる、35%から84%までであった。HPLCは、2つの検出器:DAD検出器(214nm)を備えていた。生成物の重鎖および軽鎖の保持時間は下記の表の通りであった。N8の重鎖および軽鎖の保持時間を比較のために示す。
最終生成物の活性をChromogenixの色素産生アッセイCoA試験SP FVIIIで測定した。開始FVIIIと比較して、約88%の活性が回収された。
N8のグリコ-コンジュゲートの薬物動態学的特性分析:
rFVIIIバリアントの薬物動態をFVIII欠失マウス(C57BI/6バックグランドを有するFVIIIエキソン16ノックアウト(KO)マウス)で評価した。FVIII-KOマウスは、検出可能なFVIII:Cを有していなかった。おおよその体重25グラムおよび週齢幅16〜28週の雄性および雌性の混合集団(約1:1)を用いた。rFVIII(280IU/kg)の単回i.v.注射をマウスの尾静脈に行った。投与の64時間後までの時点で、コーティングされていないガラス毛細管を用いて眼窩静脈叢から採血した。各マウスから3つの試料を採取し、各時点に2から4つの試料を収集した。血液は直ちにクエン酸ナトリウムで安定化させ、4容のFVIII Coatest SPバッファー(保存剤を含む50mM Tris、150mM NaCl、1% BSA、pH7.3)で希釈し、その後、4000×gで5分間、遠心処理した。希釈血液から得られた血漿は、ドライアイスで凍結させ、-80℃で保持した。FVIII:Cは、製造業者説明書に従ってCoatest SP試薬(Chromogenix)を用いた色素産生アッセイで測定した。薬物動態学的な分析は、WinNonlin Proソフトウェアを用いて非区分化方法(NCA)によって行った。下記の表は半減期(T1/2)の見積りを示す。
別のPEG40kD部分のコンジュゲーションは、その結果得られる化合物Eにいかなる影響も与えない(T1/2=13時間)、
- 一方、(線状)PSA(20kDまたは45kDいずれかの分子量)のコンジュゲーションは、その結果得られる化合物に顕著な影響を与える:化合物FおよびGはそれぞれ17.7時間および19.5時間の半減期を有し、元のN8分子の半減期をそれぞれ2.6倍、2.9倍に延長している(但し、最後のものは活性の半分を失っている)。
シアリルトランスフェラーゼ基質(4-ホルミルベンゾイル)グリシルシアル酸シトシン5'-一リン酸エステル(アルデヒド-GSC、J-1)の調製
アルコキシルアミン官能基化されたヒドロキシエチルデンプン(HES-ONH2)の調製
HES-GSCコンジュゲート(J-3)を得るための、アルコキシルアミン官能基化されたヒドロキシエチルデンプンHES-ONH2(J-2)との、アルデヒド-GSC(J-1)のカップリング
HES-FVIIIコンジュゲートを得るための、HES-GSC基質J-3およびST3Gal-Iを用いた、O-グリカンにおけるHESによるwt Bドメイン欠失型ヒトFVIII(N8)の修飾
HES-GSC(10当量、45mg、50ml、PBSバッファー中に1mg/ml)を濃縮し、Amicon Ultra超限外濾過バイアルを用いて、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、1M NaClにバッファー交換した。最終容積2.2ml。HES-GSC試薬を、N8(4mg、22nmol、5.7mg/ml)、シアリダーゼA.ウレアファシエンス(40μl、130U/ml、0.43mg/ml、5.2U)、およびHis-ST3Gal-I(400μl、2.5mg/ml)と混合し、32℃でインキュベートした。22時間後、SDS PAGE分析によって、HCおよびLC FVIIIバンドの両方よりも高いMWで移動するスメアなバンドとして生成物形成が示された。伝導率を下げるために、反応混合物を、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、25mM NaClのバッファー約50mlで希釈し、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラム:MonoQ 5/50GL、開始バッファー:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、25mM NaCl、溶出バッファー:20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、1M NaCl。所望の生成物を含有する、関連する画分は、3本の主要バンド:完全なLC、強度が非常に低減しているHCバンド、およびHCにコンジュゲートしたHESを表す高MWのスメアなバンドを有するものとして、SDS PAGE分析から同定された。単離され、プールされた画分は、1.11mgの生成物(FVIII A280に基づき、0.275mg/ml)を含有していた。プールされた画分(4ml)を、100μlのCMP-NAN(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、25mM NaClのバッファー中に25mg/ml)およびST3Gal-III(100μl、1.2U/ml)と混合し、32℃で1時間インキュベートした。次いで、反応混合物を、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、25mM NaClのバッファーで希釈し、Vivapure Q, Maxi Mスピンフィルター(Sartorius)にロードした。フィルターを2×15mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、25mM NaClで洗浄し、最初に2×15mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、200mM NaClを用いて(ST3Gal-IIIを除去するために)、次いで、生成物を溶出するために、3×0.5mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1Mグリセロール、pH7.3、1M NaClを用いて溶出した。最初の2つの画分が、それぞれ800μgおよび110μg(FVIII A280に基づく)で、所望の生成物を含有していた。これらの2つの画分をSEC(カラム、Superdex200 10/300 GL、バッファー:ヒスチジン(1.5mg/ml)、CaCl2(0.25mg/ml)、Tween 80(0.1mg/ml)、NaCl(18mg/ml)、ショ糖(3mg/ml))によって別々に精製し、その結果、それぞれ218μgおよび66μgが回収された(FVIII A280に基づく)。HPLCによるタンパク質濃度測定は、収率を、それぞれ130μgおよび40μgとした(280nmにおけるFVIIIの吸光に基づく)。
同時にペグ化およびHES化されたFVIIIコンジュゲートを得るための、HES-GSC基質J-3およびST3Gal-Iを用いた、O-グリカンにおけるHES、ならびにPEG-GSCおよびST3Gal-IIIを用いた、N-グリカンにおけるPEGによる、wt Bドメイン欠失型ヒトFVIII(N8)の修飾
実施例18に従って調製されたコンジュゲートを、水性バッファー中の1ポット反応において、固定されたシアリダーゼ、PEG-GSC、およびST3Gal-IIIで処理する。完全な反応の後に、濾過によってシアリダーゼを除去し、いかなる末端ガラクトースも遮断するために、大過剰のCMP-NANを反応混合物に添加する。完全な反応の後に、生成物をST3Gal-IIIおよびシアリルトランスフェラーゼ基質から分離するために、陰イオン交換およびSECクロマトグラフィーによって、コンジュゲートを精製する。
同時にペグ化およびHES化されたFVIIIコンジュゲートを得るための、HES-GSC基質J-3およびST3Gal-IIIを用いた、N-グリカンにおけるHES、ならびにPEG-GSCおよびST3Gal-Iを用いた、O-グリカンにおけるPEGによる、wt Bドメイン欠失型ヒトFVIII(N8)の修飾
O-グリカンペグ化されたFVIIIは、WO2009/108806A1に従って調製される。水性バッファー中の1ポット反応において、このコンジュゲートを、固定されたシアリダーゼ、実施例17のHES-GSC J-3、およびST3Gal-IIIで処理する。完全な反応の後に、濾過によってシアリダーゼを除去し、いかなる末端ガラクトースも遮断するために、大過剰のCMP-NANを反応混合物に添加する。完全な反応の後に、生成物をST3Gal-IIIおよびシアリルトランスフェラーゼ基質から分離するために、陰イオン交換およびSECクロマトグラフィーによって、コンジュゲートを精製する。
硫酸化PSAの調製
調製は、公表されている手順に従って行う(例えば、Kunouら、Biomacromolecules (2000), 1, 451およびそこに引用されている参考文献)。開始物質は、実施例3および7に記載の通りに得られる、分子量約20kDのPSAまたは分子量約45kDのPSAのいずれかである。
硫酸化PSAの過ヨウ素酸ナトリウム酸化
過ヨウ素酸酸化は、実施例21で得られた硫酸化PSAから開始して、実施例8と同様に行う。
シアリルトランスフェラーゼST3Gal-IIIの基質であるGSC-ON =硫酸化PSAを産生するための、GSC-ONH2への過ヨウ素酸ナトリウム酸化された硫酸化PSAのカップリング
カップリングは、開始化合物として、実施例2からのGSC-ONH2と、実施例22からの酸化された硫酸化PSAとを用いて、実施例9に従って行う。
GSC-ON=硫酸化PSAとの、(N)-アシアロ(O)-PEG(40kD)N8のシアリルトランスフェラーゼST3Gal-III触媒反応による、(N)-硫酸化PSA-(O)-PEG(40kD)N8の調製
化合物は、ST3Gal-IIIの存在下で、アクセプターとして(N)-アシアロ(O)-PEG(40kD)N8を用い、ドナーとしてGSC-ON=硫酸化PSAを用いて、実施例10に従って調製する。
Claims (15)
- 少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートしたFVIIIバリアント。
- 多糖がPSAである、請求項1に記載のFVIIIバリアント。
- 前記バリアントが、末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体またはPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしたBドメイン末端欠失型FVIII分子であり、FVIII活性化が前記O連結重合体の除去をもたらす、請求項1〜2のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。
- 末端欠失型Bドメイン内のO連結オリゴ糖を介してPEG重合体と共有結合によってコンジュゲートしており、N連結オリゴ糖を介して少なくとも1つのPSA重合体と共有結合によってコンジュゲートしている、請求項1〜3のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。
- A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖およびA3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された2〜4つのPSA重合体を含む、請求項4に記載のFVIIIバリアント。
- A1ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPSA重合体を含む、請求項4に記載のFVIIIバリアント。
- A3ドメイン内の1つの二重分枝N連結オリゴ糖に連結された1つまたは2つのPSA重合体を含む、請求項4に記載のFVIIIバリアント。
- PEG重合体のサイズが30〜50kDaである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。
- PSA重合体のサイズが40〜50kDaである、請求項1〜8のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。
- Bドメイン末端欠失型FVIIIバリアントであり、Bドメインが配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のFVIIIバリアント。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントを作製する方法であって、FVIII分子を少なくとも1つのPEG重合体および少なくとも1つの多糖とコンジュゲートする工程を含む方法。
- 請求項11に記載の方法によって取得可能なFVIIIバリアント。
- 請求項1〜10または12のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントと、場合によって1つまたは複数の薬学的に許容できる添加剤とを含む医薬組成物。
- 請求項1〜10のいずれか一項もしくは請求項12に記載のFVIIIバリアントまたは請求項13に記載の医薬組成物の、医薬としての使用。
- 請求項1〜10のいずれか一項もしくは請求項12に記載のFVIIIバリアントまたは請求項13に記載の医薬組成物の、血友病Aを治療するための医薬としての使用。
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