CN105153313A - 因子viii融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及经修饰的凝血因子。具体地讲，本发明涉及缀合的因子VIII分子，所述因子VIII分子与诸如抗体结合蛋白或Fc结构域等多肽融合。
Description
本申请是申请日为2011年2月10日，申请号为201180009864.4的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及经修饰的凝血因子。特别是，本发明涉及与非同源多肽融合的因子VIII分子，所述多肽为例如抗体结合多肽，例如Fc受体或Fc结构域。本发明还涉及所述分子的用途以及所述分子的生产方法。
发明背景
A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障碍所致的一种遗传性出血性疾病。临床表现不在于最初的止血，即血块的形成正常发生，但血块因缺乏相继的凝血酶形成而不稳定。该病通过静脉内注射从血液中分离的或重组产生的凝血因子FVIII而得以治疗。
目前的治疗推荐由传统的按需治疗向预防转变。与冯维勒布兰德因子(von Willebrandt Factor)结合的内源FVIII的循环半衰期是12-14小时，因此预防性治疗应一周进行数次，以使患者获得几乎无症状的生活。IV给予对于许多人，尤其是儿童和年轻人而言伴随明显的不便和/或痛苦。
在具有显著延长的循环半衰期的因子VIII变体的开发中已经采用多种方法。很多这类方法都涉及到将因子VIII与亲水性聚合物例如PEG (聚乙二醇)缀合在一起。
因此本领域需要具有因子VIII活性的新的因子VIII产品，其包括一种或多种以下特征：优选在结构上是同源的，优选为安全的，优选为生物可降解的，并优选具有显著延长的循环半衰期，以减少每周给予因子VIII的次数。本领域同样需要用于提供这类分子的相对简单的方法。
发明概述
本发明涉及重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是融合蛋白。本发明还涉及所述分子的制备方法以及所述分子的用途。所述分子优选具有改良的循环半衰期。
发明描述
定义
融合蛋白：融合蛋白/嵌合蛋白，是通过原本编码分开的蛋白质的两种以上基因结合而产生的蛋白质。该融合基因经翻译而得到具有来源于每个原有蛋白质的功能特性的单个多肽。可将本发明的因子VIII分子与另一多肽融合。优选地，因子VIII融合蛋白将具有比非融合因子VIII分子更长的循环半衰期。
可将很多种融合配偶体与FVIII部分结合起来。这些融合配偶体可通过不同机制改变融合蛋白相对于野生型FVIII的性能。
推定多种融合配偶体通过与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是免疫球蛋白Fc结构域、人血清白蛋白(hSA)和转铁蛋白或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与FcRn相互作用而延迟FVIII的多肽结合的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表2。尽管因为IgG抗体的相对长的循环半衰期而通常优选IgG Fc结构域，但“Fc融合衍生物”或“Fc融合蛋白”在本文中意指包括与可来源于任何抗体同种型的Fc结构域融合的本发明FVIII变体。Fc结构域还可经修饰以调节某些效应子功能，例如补体结合和/或与某些Fc受体结合。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合，通常将会导致融合蛋白的循环半衰期延长(与wt FVIII的半衰期相比)。在IgG Fc结构域中234、235和237位的突变通常将会导致与FcγRI受体的结合减少，还可能导致与FcγRIIa和FcγRIII受体的结合减少。这些突变不改变与FcRn受体的结合，其通过内吞再循环途径而促进了长循环半衰期。优选地，本发明的融合蛋白经修饰的IgG
Fc结构域包含一个或多个以下突变，所述突变将会分别导致对某些Fc受体的亲和力下降(L234A、L235E和G237A)以及C1q-介导的补体结合降低(A330S和P331S)。
然而，本发明也包含这样的FVIII变体：其与例如与新生儿Fc受体的结合特性发生改变的Fc结构域融合。如果例如Fc结构域变体具有增加的与例如新生儿Fc受体的亲和力，可能融合蛋白的体内循环半衰期将得到进一步延长。据信调节Fc结构域与新生儿Fc受体的亲和力的人IgG中氨基酸置换的实例是T250Q、M252Y、S254T、T256E、P257I、T307A、Q311I和M428L (残基编号按照EU索引)。
推定其它融合配偶体通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是Fc受体，例如FcγRI (CD64)或FcRn或这些蛋白的组成部分。由与推定通过与免疫球蛋白相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表3。
推定某些融合配偶体通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是低密度脂蛋白受体家族Fc受体成员，例如低密度脂蛋白受体相关蛋白或这些蛋白的组成部分，例如重复簇5
(CR5)、6 (CR6)和/或7 (CR7)。由与推定通过减少与清除受体的相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表4。
推定其它融合配偶体通过与血小板相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是与血小板表面上的蛋白质例如GPIIIa结合的单链(SC)抗体。在SC抗体中，源自免疫球蛋白重链的多肽序列可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的N-端。该顺序称为HC-LC。源自免疫球蛋白重链的多肽序列也可位于源自免疫球蛋白轻链的多肽序列的C-端。这后一种顺序称为LC-HC。由与推定通过与血小板相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表5。
推定一些融合配偶体通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的体内清除。推定通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是单链抗血清白蛋白抗体(SC抗HSA)和白蛋白结合多肽例如ABD035多肽。白蛋白结合多肽可重复若干次，例如4次重复，正如在4XABD035融合配偶体中所示。由与推定通过与血清白蛋白相互作用而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表6。
推定其它融合配偶体通过保护(shielding)而延迟FVIII的体内清除。推定通过保护而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是具有非疏水性氨基酸段例如序列A
(seq A)的多肽或充满弹性蛋白样多肽(ELP)例如ELP60的多肽。由与推定通过保护而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表7。
推定某些融合配偶体通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的a3区(野生型人FVIII的氨基酸1649-1689)或a3区的部分，因此给FVIII添加一个或多个额外的a3区。由与推定通过调节与vWF的亲和力而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表8。
推定某些融合配偶体通过尚待确定的机制而延迟FVIII的体内清除。推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是生长激素结合蛋白(GHBP)、凝血因子IX
(FIX)部分、vWF部分、vWF结合蛋白、绒毛膜促性腺激素部分和凝血因子X(FX)部分。源自FIX的融合配偶体的非限制性实例是人FIX的氨基酸298-342
(FIX298-342)和人FIX的氨基酸47-125
(FIX47-125)。源自vWF的融合配偶体的非限制性实例是人vWF的氨基酸1-272 (vWF1-272)、人vWF的氨基酸1-1390 (vWF1-1390)和人vWF的氨基酸497-716 (vWF497-716)。源自绒毛膜促性腺激素的融合配偶体的非限制性实例是人绒毛膜促性腺激素β-链的C-端28个氨基酸(hCG C-端)。源自FX的融合配偶体的非限制性实例是人FX活化肽(F10AP)。由与推定通过尚待确定的机制而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表9。
推定某些融合配偶体通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的体内清除。推定通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的融合配偶体的非限制性实例是FVIII的C2结构域，因此给FVIII添加一个或多个额外C2结构域。由与推定通过调节与脂质的亲和力而延迟FVIII的多肽连接的FVIII部分组成的融合蛋白的非限制性实例见表10。
Fc 受体：Fc受体是识别和结合抗体的Fc部分的细胞表面受体。根据其结构、细胞分布和与IgG的亲和力，将Fc受体分为3类：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FCγRIII (CD16)。依据本发明，与因子VIII分子融合的Fc受体可以是全长或部分长度的Fc受体、及其任何变体(变体包括氨基酸取代、缺失和添加)。如果它们是部分长度的，则应保留与抗体结合的能力。
冯维勒布兰德因子 (vWF) ：vWF是存在于血浆中并在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板α-颗粒)和内皮下结缔组织中组成性地产生的一种大的单聚/多聚糖蛋白。其主要功能是与其它蛋白、尤其是与因子VIII结合，并且它在血细胞粘附于受伤部位中是重要的。
因子VIII与vWF结合的同时在循环中失活；因子VIII当未与vWF结合时快速降解或被清除。因此由此断定，迄今已认为降低或消除FVIII的vWF结合能力在获取具有延长循环半衰期的因子FVIII变体中是非常不希望的途径。
术语“与vWF的结合能力降低”在本文中意指包括因子VIII变体，其中与vWF的结合能力降低至少50%，优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、和最优选约100%。FVIII与vWF的结合可通过ELISA样测定来检测或使用表面等离振子共振来测定为与固定化vWF的直接结合。在因子VIII中负责与vWF结合的区域是跨越残基1670-1684的区域，其公开于EP0319315。设想涉及该区域的因子VIII点突变和/或缺失突变(deltion
mutatant)将会改变与vWF结合的能力。本发明特别优选的点突变的实例包括包含一个或多个以下点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
因子 VIII 分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的一种大而复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、1个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆内以在B-A3边界分开的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC)，而A3-C1-C2称为轻链(LC)。
内源因子VIII分子在体内作为具有不同大小的B结构域的分子库而循环。在体内可能发生的是对B结构域的逐步酶切除，产生具有不同大小的B结构域的分子库。通常认为在740位的切割(B结构域的最后部分正是因此而被切除)的发生与凝血酶激活相关。然而，这并不能排除因子VIII变体(其中例如在740位的切割位点已经受损)可具有活性。
本文所用的“因子VIII”或“FVIII”是指作为内源性凝血途径的成员并对凝血而言至关重要的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如SEQ ID NO. 1 (氨基酸1-2332)所示的全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648
。
本发明的因子VIII分子可以是B结构域截短的因子FVIII分子，其中剩余结构域基本对应于SEQ ID NO 1中氨基酸编号1-740和1649-2332所示序列，尽管在残基1670-1684之间的vWF结合区内可能也有例如一个或多个改变。然而，本发明的B结构域截短的分子可与SEQ
ID NO 1所示序列具有微小差异，意即剩余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)与SEQ ID NO 1所示氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)可具有微小差异，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异或约1%、2%、3%、4%或5%差异，这是因为可引入突变以降低例如vWF结合能力这一事实。此外，可能在分子的其它位置导入氨基酸修饰(取代、缺失等)，以改变因子VIII与多种其它组分(例如LRP、多种受体、其它凝血因子、细胞表面)的结合能力，引入和/或消除糖基化位点等。
本发明的因子VIII分子具有因子VIII活性，意即以下能力：在凝血级联中以与FVIII功能类似或等同的方式起作用，通过与被激活的血小板上的FIXa相互作用而诱导FXa的形成，并支持血块的形成。该活性可通过本领域熟知的技术在体外评估，所述技术为例如凝血分析、内源凝血酶潜在性分析等。本发明的因子VIII分子具有FVIII活性，其为天然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、和100%或甚至超过100%。
B 结构域：因子VIII中的B结构域跨越SEQ ID NO 1的氨基酸741-1648。B结构域在若干不同位点被切割，在循环血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B结构域的准确功能尚未知晓。已经知道的是该结构域对于凝血级联中的FVIII活性而言并非必要。这种明显的功能缺乏得到以下事实支持：B结构域缺失的/截短的FVIII看来具有与在全长天然FVIII中所见的相同的体内性能。话虽如此，据显示B结构域可减少与细胞膜的缔合，至少在无血清条件下是如此。
B 结构域截短的 / 缺失的因子 VIII 分子：将内源全长FVIII合成为单链前体分子。分泌之前，将前体切割成重链和轻链。可由2种不同策略产生重组B结构域缺失的FVIII。将无B结构域的重链以及轻链分别合成为两种不同多肽链(两链策略)或者将B结构域缺失的FVIII合成为单条前体多肽链(单链策略)，其按照与全长FVIII前体相同的方式切割为重链和轻链。
在B结构域缺失的FVIII前体多肽中，重链和轻链部分通常被接头间隔开来。为了尽量减小在B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性表位的风险，接头序列优选源自FVIII B结构域。至少，接头必须包含蛋白酶识别位点，所述酶将B结构域缺失的FVIII前体多肽分离为重链和轻链。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648构成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII激活时导致接头去除的凝血酶位点位于重链上。因此，接头的大小和氨基酸序列不大可能影响其经由凝血酶激活而从剩余FVIII分子上切除。B结构域的缺失对于FVIII的产生是有利的。然而，B结构域的部分可包括在接头中而不降低产率。B结构域对产率的负面效应并不归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。
截短的B结构域可含有若干O-糖基化位点。然而，依据一个优选的实施方案，所述分子在截短的B结构域中包含仅1个、备选2、3或4个O联寡糖。
依据一个优选的实施方案，截短的B结构域包含仅1个可能的O-糖基化位点并且侧链例如PEG或白蛋白结合剂与该O-糖基化位点共价缀合。
可将在本发明的B结构域截短的分子中的O联寡糖连接到O-糖基化位点，所述位点通过重组方式和/或通过经由B结构域截短而将“隐藏的”O-糖基化位点暴露而人工产生。在这两种情况下，可通过设计B结构域截短的因子VIII的氨基酸序列并随后对所述氨基酸序列进行计算机(in silico)分析，预测截短的B结构域中O-糖基化位点的概率，从而制备所述分子。可在合适宿主细胞中合成有相对高概率具有所述糖基化位点的分子，然后分析糖基化模式并随后选择在截短的B结构域中具有O联糖基化的分子。
所述因子VIII分子也含有大量N联寡糖并且它们每个都可同样作为用于连接疏水性侧基的锚。
用于产生本发明的重组因子VIII融合蛋白的合适宿主细胞优选是哺乳动物来源的，以确保所述分子被糖基化。在实施本发明时，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选已确立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO、COS-1、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293细胞系。其它合适的细胞系包括但不限于大鼠Hep I、大鼠Hep II、TCMK、人肺、DUKX细胞(CHO细胞系)。还可使用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合物。在某些实施方案中，所述细胞可以是突变的或重组的细胞，例如与其所来源的细胞类型相比表达在质量或数量上不同的酶谱的细胞，所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如糖基化酶例如糖基转移酶和/或糖苷酶，或加工酶例如前肽)。DUKX细胞(CHO细胞系)是特别优选的。
目前优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在wt FVIII分子中B结构域的长度为约908个氨基酸。在本发明分子中截短的B结构域的长度可在约10-约800个氨基酸的范围内变化，例如约10个氨基酸-约700个氨基酸，例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40个氨基酸、或20-30个氨基酸。所述截短的B结构域可包含重链和/或轻链的片段和/或wt FVIII分子中不存在的人工导入序列。术语“B结构域截短的”和“B结构域缺失的”在本文中可互换使用。
改良的循环半衰期：与野生型因子VIII分子相比，本发明的分子具有改变的循环半衰期，优选增加的循环半衰期。循环半衰期优选增加至少10%，优选至少15%，优选至少20%，优选至少25%，优选至少30%，优选至少35%，优选至少40%，优选至少45%，优选至少50%，优选至少55%，优选至少60%，优选至少65%，优选至少70%，优选至少75%，优选至少80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%，优选至少100%，更优选至少125%，更优选至少150%，更优选至少175%，更优选至少200%，和最优选至少250%或300%。甚至更优选地，所述分子具有的循环半衰期增加至少400%，500%，600%，或甚至700%。
亲水性聚合物：本发明的侧基优选是非天然存在的亲水性聚合物，其包含至少一个非天然存在的聚合部分。在另一实例中，非天然存在的修饰基团是经修饰的碳水化合物。
示例性的本发明亲水性聚合物包括水溶性聚合物，其可以是直链或支链并且可包含一个或多个独立选择的聚合部分，例如聚(亚烷基二醇)及其衍生物。本发明的聚合修饰基团可包括水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)及其衍生物(PEG, m-PEG)、聚(丙二醇)及其衍生物(PPG, m-PPG)等。
本发明水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇) (即PEG)。本发明相关的术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、分叉PEG、分支PEG、垂悬PEG (即具有挂在聚合物主链上的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)、或其中具有可降解键的PEG。
聚合物主链可以是直链或支链的。支链聚合物主链是本领域公知的。通常，支链聚合物具有中央分支核心部分和与该中央分支核心连接的多个直链聚合物链。常使用支链形式的PEG，其可通过将氧化乙烯加成到不同多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨醇中而制备。中央分支部分也可源自若干氨基酸，例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个实例中，支链聚(乙二醇)可以通式表示为R(-PEG-OH)m，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，m代表臂的数目。多臂PEG分子，例如美国专利号5,932,462 (其通过引用全部结合到本文中)中描述的那些，也可用作聚合物主链。
许多其它聚合物也适合本发明。非肽和水溶性的聚合物主链特别可用于本发明。合适聚合物的实例包括但不限于其它聚(亚烷基二醇)、例如聚(丙二醇) ("PPG")、乙二醇和丙二醇等的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇(olefmic alcohol))、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚([α]-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)(例如美国专利号5,629,384 (其通过引用全部结合到本文中)中描述的)，及其共聚物、三元共聚物和混合物。
尽管所述聚合物主链每条链的分子量可变化，但典型的范围为约100 Da-约160,000
Da，例如约5,000 Da-约100,000
Da。更具体地讲，每种本发明缀合的亲水性聚合物的大小可在以下范围内变化：约500
Da-约80,000 Da，例如约1000
Da-约80,000 Da；约2000
Da-约70,000 Da；约5000-约70,000 Da；约5000-约60,000 Da；约10,000-约70,000 Da；约20,000-约60,000 Da；约30,000-约60,000 Da；约30,000-约50,000 Da；或约30,000-约40,000 Da。应当知道，这些大小代表估计值，而并非准确测量值。依据一个优选的实施方案，将本发明的分子与亲水性聚合物的异质群体缀合，所述聚合物为例如大小如下的PEG：例如10,000、40,000或80,000 Da +/-约5000、约4000、约3000、约2000或约1000 Da。
侧链 / 侧基：也可将本发明的因子VIII分子与并非亲水性聚合物的侧基缀合。本发明的侧链可以例如选自以下列出的一种或多种：脂肪酸及其衍生物(有时也称为“白蛋白结合剂”)、肽等。本发明的疏水性侧基优选是生物可降解的。此外，可有不止一个疏水性侧基与单个因子VIII分子缀合，例如有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。此外由此得出还可将本发明的因子VIII分子与一个或多个疏水性侧基以及一个或多个疏水性侧基、肽侧基等缀合。
因此，单个本发明的因子VIII分子可包含侧基，例如亲水性和疏水性/肽类侧基。然而，将该分子与不同类型侧基缀合伴随着另外的努力，因此这种解决方案可变得在实践中相对不实用。本发明的分子因此优选仅包含1种侧链(例如亲水性侧链/疏水性侧链)。
然而，迄今为止，并不认为因子VIII同疏水性侧基的缀合是同亲水性基团的缀合的具有吸引力的备选。一种解释可能是预期到需要采用使用有机溶剂的费力和/或苛刻的化学方法。另一种解释可能是预期通常相对小的疏水性分子不能有效地将缀合的(大)因子VIII分子与例如白蛋白结合并因此可能保护分子免于清除。
白蛋白结合剂缀合物
已知可通过使用白蛋白结合侧链来改善这种蛋白质的体内性能。这种侧链或白蛋白结合剂可在给予之前连接到所述蛋白质上并且例如可以在体内稳定所述蛋白质或改进或延长所述蛋白质的体内半衰期。
因此白蛋白结合剂可促进衍生物在血流中循环。白蛋白结合剂可具有延长或延迟与之结合的蛋白质的作用时间的效果，这是因为以下事实：肽衍生物和白蛋白的复合物仅缓慢崩解以释放活性药物成分。因此，优选的取代基或侧链作为整体可称为白蛋白结合部分。
白蛋白结合剂(白蛋白结合部分)可包含与白蛋白结合以及因此在血流中循环的延长特别相关的部分，所述部分因此可称为延长部分。延长部分优选位于白蛋白结合部分相比于其与肽的连接点的相反一端或附近。
在一个优选的实施方案中，白蛋白结合剂是或包含能够与白蛋白形成非共价复合物的侧链。白蛋白结合剂可与白蛋白非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与白蛋白特异性结合。根据下述方法可以清楚的是，白蛋白结合剂可结合到环糊精。白蛋白结合剂可与环糊精非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与环糊精特异性结合。
本文所述的白蛋白结合剂通常是疏水性基团。
白蛋白结合部分的其它部分，即介于延长部分和与肽的连接点之间的部分，可称为接头部分、接头、间隔物等。然而，这类接头的存在是任选的，因此白蛋白结合部分可与延长部分相同。
在特别的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂的，和/或在生理pH (7.4)下带负电荷。
白蛋白结合部分和/或延长部分可通过缀合化学例如烷基化、酰化或形成酰胺而与肽的氨基共价连接；或通过例如酯化、烷基化、肟化而与羟基共价连接。
在一个优选的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯在形成酰胺键的条件下与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基共价连接(该过程称为酰化)。
除非另有说明，否则当谈及蛋白质酰化时，应当理解为氨基与糖蛋白上的唾液酸残基连接。
对于本发明的目的，术语“白蛋白结合部分”、“延长部分”和“接头”包括这些分子的未反应形式以及反应形式。是否意指一种形式或其它形式，根据其中使用术语的上下文是清楚的。
白蛋白结合部分可以是或可包括脂肪酸或脂肪二酸或其衍生物或其任一种。
术语“脂肪酸”是指具有4-28个碳原子、例如16个碳原子的脂族一羧酸。其优选是无支链的，和/或偶数个的，并且它可以是饱和或不饱和的。
术语“脂肪二酸”是指如上定义的、但在ω位置上具有额外羧酸基团的脂肪酸。因此，脂肪二酸是二羧酸。
命名按照本领域常用的命名，例如-COOH以及HOOC-，是指羧基；-C6H4-是亚苯基；-CO-以及-OC-，是指羰基(O=C<)；和C6H5-O-是指苯氧基。
在一个优选的实施方案中，所述接头部分，如果存在的话，具有2-80个C原子、优选5-70个C原子。在额外优选的实施方案中，所述接头部分，如果存在的话，具有4-20个杂原子，优选2-40个杂原子，更优选3-30个杂原子。杂原子的特别优选的实例是N原子和O原子。H原子不是杂原子。
在另一个实施方案中，所述接头包含至少一个OEG分子、和/或至少一个谷氨酸残基，或相应的基团(OEG是指8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，即以下基团：-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-)。
在一个优选的实施方案中，所述接头部分包含通过酰胺键与唾液酸残基连接的二羧基残基。在优选的实例中，所述二羧基残基具有2-30个C原子，优选4-20个C原子，更优选4-10个C原子。在另外的优选实例中，所述二羧基残基具有0-10个杂原子，优选0-5个杂原子。
在另一个优选的实例中，所述接头部分包含同时含有氨基和远端羧基的基团，所述基团通过其远端羧基经由酰胺键与唾液酸残基连接。在一个优选的实施方案中，该基团是OEG基团。
氨基酸谷氨酸(Glu)包含2个羧酸基团。其γ-羧基优选用于与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基、或与OEG分子的氨基(如果有的话)、或与另一Glu残基的氨基(如果有的话)形成酰胺键。Glu的氨基进而与延长部分的羧基、或与OEG分子的羧基(如果有的话)、或与另一Glu的γ-羧基(如果有的话)形成酰胺键。这种包含Glu的方式偶尔简称为“γ-Glu”。
不受理论的束缚，设想之所以将疏水性侧基与具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子连接，而不是将这类侧基与具有正常vWF结合能力的因子VIII分子连接可能有利的原因在于：侧基的相对大小在大的因子VIII/vWF复合物中是相对小的。假定相对大的侧基在保护游离因子VIII不被清除中起更有效的作用。还假定FVIII的半衰期与vWF的相关。与vWF结合能力降低的FVIII分子最有可能具有暴露的清除表位，所述清除表位通常已被vWF保护。因而假定通过连接侧基，该“清除保护”可被恢复。在其它情况下，侧基例如抗体片段的连接可通过例如将所述分子与具有相对长循环半衰期的蛋白、细胞或血小板连接而起作用。
O- 联寡糖：N-聚糖和O-聚糖都通过产生蛋白质的细胞而与该蛋白连接。当初生蛋白质从核糖体向内质网移动时，细胞的N-糖基化机构识别氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T基序)并使之糖基化(Kiely等，1976；Glabe等，1980)。
同样，O-聚糖连接到氨基酸链中的特异性O-糖基化位点，但触发O-糖基化的基序与N-糖基化信号相比要异质得多，并且我们对氨基酸序列中O-糖基化位点的预测能力尚不充分(Julenius等，2004)。因此，人工O-糖基化位点的构建有一些不确定性。
疏水性侧基的连接：可使用化学方法进行因子FVIII分子与疏水性侧基的缀合。然而，使用酶促方法具有很多潜在优势。根据本发明优选的酶促方法，可经化学方法制备[疏水性延长基团]-唾液酸基-CMP底物。使用唾液酸转移酶，可经酶促方法将该底物转移到因子FVIII上存在的聚糖上。本发明的发明人已经出乎意料地证明无需添加任何有机溶剂就可进行这种酶促方法。使用有机溶剂有很多的不利条件，例如丧失生物活性、环境问题、确保完全除去有机溶剂所采取的额外步骤等。也有可能可避免加入环糊精，环糊精是一种去垢剂，也可造成生物功能的损失。在酶促缀合过程中，添加甘油，例如5-30%甘油，优选10-20%甘油，可能是有利的。甘油的存在似乎例如在冷冻/融解过程中稳定因子VIII分子，并且它还可防止形成因子VIII结晶。因此，在缀合过程完成之后，无需除去酶促缀合期间所存在的甘油。
唾液酸转移酶：唾液酸转移酶是将唾液酸转移到初生寡糖上的酶。每种唾液酸转移酶对特定的糖底物具有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸添加到唾液酸化糖脂(神经节苷脂)的末端部分或添加到糖蛋白的N-联糖链或O-联糖链上。存在大约20种不同唾液酸转移酶，其可根据它们所作用的受体结构和它们所形成的糖键类型而区分。本发明优选的唾液酸转移酶是ST3Gal-I
(对O-聚糖具有特异性)和ST3Gal-III (对N-聚糖具有特异性)。因此有可能通过例如选择特异性唾液酸转移酶和/或改造具有特定糖基化模式的因子VIII分子，对本发明的缀合的因子VIII分子的结构进行改造。
药物组合物：药物组合物在本文优选意指包括包含本发明因子VIIII分子的适于胃肠外给药用的组合物，例如即用型无菌含水组合物或可在例如水或含水缓冲液中重构的干燥的无菌组合物。本发明的组合物可包含多种药学上可接受的赋形剂、稳定剂等。
在这类组合物中的额外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这类额外成分当然不应对本发明药物制剂的总体稳定性有不利影响。胃肠外给药可通过使用注射器任选笔样注射器经由皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射而进行。或者，胃肠外给药可通过输注泵的方式而进行。进一步的选项是组合物，其可以是以鼻或肺部喷雾的形式给予FVIII化合物的溶液剂或混悬剂。作为再一个进一步的选项，含有本发明FVIII化合物的药物组合物也可适于透皮给药，例如通过无针注射或贴剂(任选离子电渗贴剂)，或透黏膜给药例如口腔给药。
本文所用的术语“治疗”是指对有需要的任何人类或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历医师的体检，所述医师已经做出试验性或确定性诊断，表明使用所述特定治疗对所述人类或其它动物受试者的健康而言是有益的。所述治疗的时机和目的可依据受试者的健康现状而因不同个体而异。因此，所述治疗可以是预防性的、治标的、针对症状的和/或治愈性的。
第一方面，本发明涉及重组因子VIII分子，其中所述因子VIII分子是包含因子VIII分子和融合配偶体的融合蛋白。在第一实施方案中，所述融合配偶体置换了因子VIII分子的a3结构域。因此，因子FVIII的小的a3结构域可被融合配偶体全部或部分置换。在第二实施方案中，所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。B结构域可以是全长B结构域，但在一个优选的实施方案中，B结构域是显著截短的。因此在融合配偶体的N-末端和C-末端有至少3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸来自B结构域。在另一个优选的实施方案中，所述融合配偶体插入到或位于因子FVIII的C2结构域的C-末端。
在第三实施方案中，本发明的因子VIII分子与抗体结合分子例如Fc受体融合。抗体结合分子的实例列于下表中。在第四实施方案中，因子VIII分子与具有与人血清白蛋白结合的能力的分子融合。在另一个实施方案中，因子VIII与转铁蛋白融合。其实例也在下文提供。在第五实施方案中，因子VIII分子与具有与血小板结合的能力的分子融合，这类分子的具体实例同样在下文提供。在再一个实施方案中，因子VIII分子与具有与因子VIII清除受体结合的能力的分子融合。
在第六实施方案中，本发明的因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。优选地，这类因子VIII分子在跨越SEQ ID NO1的氨基酸1670-1684的区域内包含突变(氨基酸的取代、缺失或添加)。最优选地，这类因子VIII分子包含一个以下点突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
在第七实施方案中，本发明的分子与侧基缀合。该侧基可选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。优选地，侧基是PEG基团、脂肪酸衍生物或多肽。优选地，使用酶促方法将这类侧基连接到分子上，所述方法为例如WO0331464中所公开的技术，其中O-联聚糖和/或N-联聚糖用作接头。
本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体置换因子VIII分子的A3结构域。
在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fc受体。在另一个实施方案中，所述Fc受体是FcγRI。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中，所述Fc结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或O-联聚糖连接到融合蛋白。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或O-联聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中B结构域包含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ
ID NO 2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插入到因子VIII的B结构域中。
在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fc受体。在另一个实施方案中，所述Fc受体是FcγRI。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中，所述Fc结构域是具有降低的效应子功能和/或增加对的新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或O-联聚糖与融合蛋白连接。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或O-联聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域包含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ
ID NO 2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
本发明的另一方面涉及与融合配偶体融合的FVIII分子，其中所述融合配偶体插入到因子FVIII的C2结构域的C-末端。
在一个实施方案中，所述融合配偶体是白蛋白。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fc受体。在另一个实施方案中，所述Fc受体是FcγRI。在另一个实施方案中，所述融合配偶体是Fc结构域。在另一个实施方案中，所述Fc结构域是具有降低的效应子功能和/或增加的对新生儿Fc受体的亲和力的突变Fc结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白与侧基缀合。在另一个实施方案中，所述侧基通过N-联聚糖和/或O-联聚糖连接到融合蛋白。在另一个实施方案中，所述侧基通过唾液酸连接到N-联聚糖和/或O-联聚糖。在另一个实施方案中，所述侧基选自以下列出的一种或多种：亲水性聚合物、肽和疏水性侧基。在另一个实施方案中，所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域包含SEQ ID NO 2所示的序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白在包含SEQ
ID NO 2所示氨基酸序列的截短的B结构域中包含与O-联聚糖连接的侧基。在另一个实施方案中，因子VIII分子具有降低的vWF结合能力。在另一个实施方案中，具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子包含选自以下列出的突变：Y1680F、Y1680R、Y1680N、和E1682T、和Y1680C。
另一方面涉及本发明分子的制备方法，其中所述方法包括在合适条件下温育编码所述分子的宿主细胞。因此，本发明也涉及包含编码本发明分子的核酸序列的核酸分子以及表达载体和宿主细胞。经由这类方法获取的或可经由这类方法获取的分子同样是本发明的一个方面。
另一方面涉及本发明分子作为药物的用途。
另一方面涉及本发明分子用于治疗血友病、优选A型血友病的用途。
另一方面涉及包含本发明的分子和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明的另一方面涉及血友病的治疗方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明分子。
实施例
实施例
1
FVIII
构架和融合配偶体
本发明的融合蛋白由与来自另一蛋白的多肽(融合配偶体)连接的FVIII蛋白(FVIII部分)组成。
融合蛋白的FVIII部分可以是具有FVIII活性的任何蛋白。FVIII部分可以是B结构域缺失的/截短的(BDD) FVIII蛋白，其中FVIII B结构域部分已从该蛋白上切除。可构成融合蛋白的FVIII部分的FVIII构架的非限制性实例见表1。F8-500是一种BDD人FVIII蛋白。从N-端开始，F8-500由FVIII信号肽(氨基酸-19至-1)、后接无B结构域的FVIII HC (氨基酸1-740)、21个氨基酸的接头(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR)
(SEQ ID NO 2)和FVIII LC (野生型人FVIII的氨基酸1649-2332)组成。21个氨基酸的接头序列源自FVIII的B结构域并由全长野生型人FVIII的氨基酸741-750和1638-1648组成。
F8-500-Δa3由无a3区的F8-500组成。在F8-500-Δa3中，将野生型人FVIII的氨基酸1647-1687从F8-500中除去。因此，氨基酸1645-1648处的弗林蛋白酶位点已被破坏。然而，合并的弗林蛋白酶和凝血酶位点是由在F8-500-Δa中的R1645-H1646-P1688-R1689氨基酸段所产生的。a3区对于FVIII与vWF的结合而言是重要的并因此与野生型FVIII相比，降低了F8-500-Δa3对vWF的亲和力。
F8-500-His由具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此F8-500-His的接头序列是SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 3) 。
F8-500-Δa3-His由无a3区、但具有插入到F8-500接头的His标签的F8-500组成。因此，在F8-500-Δa3-His中，野生型人FVIII氨基酸1647-1687已从F8-500中除去并且接头序列是SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 4) 。
F8-500-Y1680F和F8-500-Y1680C由F8-500组成，其中全长野生型人FVIII的氨基酸1680已从酪氨酸分别变为苯丙氨酸和半胱氨酸。这两个氨基酸置换降低了FVIII对vWF的亲和力。此外，Y1680C氨基酸置换引入游离半胱氨酸，其可用作将延长部分与融合蛋白缀合的柄(handle)。
可将融合配偶体与融合蛋白的FVIII部分的若干位置连接。用于连接融合配偶体的FVIII上的位置的非限制性实例是在介于FVIII HC和LC之间的B结构域或B结构域衍生的接头中的位置，在a3的位置，和在FVIII LC的C-端。
实施例
2
编码
FVIII
构架和融合蛋白的表达载体的构建
FVIII和融合配偶体间的融合都涉及用于扩增融合配偶体的PCR。将限制位点加入到所用的PCR引物的末端。限制酶用于克隆融合配偶体cDNA或合成DNA为FVIII cDNA。
在F8-500的B结构域中的融合发生在aa750和aa1638之间。在B结构域内或其侧翼的限制位点AvrII、NruI、AgeI和MluI用于插入编码融合配偶体的DNA。
对于在FVIII轻链羧基端的融合，修饰F8-500编码构建体。通过定点诱变消除内部BamHI位点(aa
604-606)并将编码柔性(GGGS)6接头的DNA插入到编码区3’。将一个新的BamHI位点引入编码接头的DNA的3’端，以便于将C-端融合配偶体克隆到BamHI位点和NotI位点之间。然后，插入融合配偶体DNA。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-(GGGS)6-X。类似于(GGGS)6接头，将最小GS-接头(BamHI限制位点)插入到F8-500编码区3'端。BamHI限制位点(GGATCC)形成GS (甘氨酸-丝氨酸)的两个密码子。来自该构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-GS-X。没有任何接头的情况下与F8-500的C-端的融合如下进行：通过用延伸引物PCR扩增融合物，所述延伸引物在5'端带有F8-500编码区最后的109 bp和在PCR产物的3'端具有NotI限制位点。XbaI限制位点存在于离F8-500终止密码子的104-109 bp处。XbaI限制酶和NotI限制酶用于克隆无接头的融合配偶体。来自后面这些构建体的融合蛋白在表2-12中称为F8-500-C2-连接的-X。
为了在a3位置插入融合配偶体编码DNA并由此在编码蛋白中用融合配偶体置换a3，将SacII限制位点引入a3编码区的3’。因此，融合配偶体编码DNA可通过插入AgeI位点和SacII位点之间或者AvrII位点和SacII位点之间而引入。
hFc (SEQ
ID NO 5)
mFc (SEQ ID NO 6)
人血清白蛋白(HSA) (SEQ ID NO 7)
转铁蛋白(SEQ ID NO 8)
hFcγRI (CD64) (SEQ ID NO 9)
FcRn (SEQ ID NO 10)
FcRn-H166K (SEQ ID NO 11)
LRP-CR5-6 (SEQ ID NO 12)
LRP-CR6-7 (SEQ ID NO 13)
LRP-CR6 (SEQ ID NO 14)
SC抗GPIIIa-1-HC-LC (SEQ ID NO 15)
接头-SC抗GPIIIa-1-HC-LC
(SEQ ID NO 16)
SC抗GPIIIa-2-HC-LC (SEQ ID NO 17)
SC抗GPIIIa-2-LC-HC (SEQ ID NO 18)
ABD035 (SEQ ID NO 19)
序列A (SEQ ID NO 20)
ELP80 (SEQ ID NO 21)
额外的a3 (SEQ ID NO 22)
GHBP (SEQ ID NO 23)
FIX298-342 (SEQ ID NO 24)
FIX47-125 (SEQ ID NO 25)
vWF1-272 (SEQ ID NO 26)
vWF1-1390 (SEQ ID NO 27)
vWF497-716-R545A (SEQ ID NO 28)
vWF结合蛋白(SEQ ID NO 29)
hCG C-端(SEQ ID NO 30)
F10AP (SEQ ID NO 31)
。
实施例
3
FVIII
构架和融合蛋白的瞬时表达
密度为0.9-1.1 x 106的HKB11细胞用质粒0.7 mg/l和转染剂293Fectin (Invitrogen) 1.4 ml/l的混合物转染。通过将质粒和转染剂分别稀释在OPTIMEM (Invitrogen)中，混合这两种溶液，并将混合物在室温下温育20分钟，来制备转染混合物。将混合物加入到细胞悬液中并将悬液在振荡器培养箱中在36.5℃和5% CO2中温育5天。将细胞培养收获物在0.22 µm膜滤器上过滤。按照实施例5所述，从细胞培养收获物中纯化FVIII构架和融合蛋白。
实施例
4
表达融合蛋白的稳定的细胞
适应无血清的CHO-DUKX-B11细胞用编码F8-500-白蛋白-Δa3融合蛋白的表达质粒转染。转染后的细胞用二氢叶酸还原酶系统选择并通过有限稀释而克隆。通过ELISA和显色活性测定来筛选产生FVIII的克隆。选择克隆JsJH009用于扩大规模(upscaling)。将细胞移至生物反应器。按照实施例5所述，从细胞培养收获物中纯化F8-500-白蛋白-Δa3融合物。
实施例
5
FVIII
构架和融合蛋白的纯化
给柱填装树脂VIIISelect (GE Healthcare)，其尺寸为：直径1.6cm和床高4cm (8mL)；并将柱用20mM咪唑+10mM CaCl2+0.01%吐温80 (Tween80)+250mM NaCl, pH7.3以500cm/h平衡。将按照实施例3所述制备的培养物滤液上柱，然后先用平衡缓冲液洗涤柱子，再用20mM咪唑+10mM CaCl2+0.01%吐温80+1.5M NaCl, pH7.3洗涤柱子。结合的FVIII用20mM咪唑+10mM CaCl2+0.01%吐温80+2.5 M NaCl+6.5M丙二醇,
pH7.3，以90cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+10mM CaCl2
+ 0.01%吐温80, pH7.3 1:10稀释，然后上样到填装有F25-Sepharose的柱上(Thim等, Haemophilia, 2009)。柱尺寸为直径1.6cm和床高2cm，柱体积4mL。使用前，柱子用20mM咪唑+ 10mM CaCl2
+ 0.01%吐温80 + 150mM NaCl + 1M甘油, pH7.3，以180cm/h平衡。上样后，先用平衡缓冲液洗涤柱子，再用20mM咪唑+
10mM CaCl2 + 0.01%吐温80 + 650mM NaCl,
pH7.3洗涤柱子。结合的FVIII用 20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0.01%吐温80 + 2.5M NaCl + 50%(v/v)乙二醇,
pH7.3，以30cm/h等度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+ 10mM CaCl2
+ 0.01%吐温80, pH7.3 1:15稀释，除了缺失a3结构域的FVIII-变体之外，其在相同缓冲液中1:45稀释。将稀释的合并液上样到填装有Poros
50HQ (PerSeptive Biosystem)的柱子上，柱尺寸为直径0.5cm和床高5cm，柱体积1mL。使用前，柱子用20mM咪唑+ 10mM CaCl2
+ 0.01%吐温80 + 50mM NaCl + 1M甘油, pH7.3，以300cm/h平衡。柱子用平衡缓冲液洗涤，然后用从平衡缓冲液至以下溶液的在5个柱体积内的线性梯度洗脱：20mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0.01%吐温80 + 1M NaCl + 1M甘油,
pH7.3。合并含有FVIII的流分并将合并液贮存于-80°直至使用。典型纯化的收率表见表11。
基本上如上所述地纯化具有HIS-标签的FVIII变体，然而第二纯化步骤(F25-sepharose)替换为装有2个柱体积1M NiSO4的螯合Sepharose
FF (GE Healtcare)。柱尺寸为直径0.5cm和床高5cm，柱体积1mL。使用之前，柱子用30mM咪唑+ 10mM CaCl2
+ 0.01%吐温80 + 1.5M NaCl, pH7.3 ，以180cm/h的流速平衡。上样后，柱子用30倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，然后用在5个柱体积内到250mM咪唑+ 10mM CaCl2 + 0.01%吐温80 + 1.5M NaCl, pH7.3的线性梯度洗脱。合并含有FVIII的流分并用20mM咪唑+ 10mM CaCl2
+ 0.01%吐温80, pH7.3 1:30稀释。最终的纯化步骤(Poros 50HQ)如上所述地进行。
实施例
6
通过显色测定而测量的细胞培养收获物中的
FVIII:C
在显色 FVIII测定中，使用Coatest
SP试剂(Chromogenix)如下评价细胞培养收获物(上清液部分)中的rFVIII 化合物的FVIII活性(FVIII:C)：rFVIII样品和FVIII标准品(Coagulation
reference, Technoclone)在Coatest测定缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7.3，含防腐剂)中稀释。将50 µl样品、标准品和缓冲液阴性对照加入到96孔微量滴定板(Spectraplates
MB, Perkin Elmer)。所有样品都以1:100、1:400、1:1600和1:6400稀释再测定。将来自 Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2按照5:1:3
(体积比)混合，并取75 µl加入到孔中。在室温下温育15 min之后，加入50 µl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物并将反应物在室温下温育5 min，然后加入25 µl 1 M柠檬酸, pH 3。在Envision微量滴定板读板器(Perkin Elmer)上，测定在405 nm处吸光度和在用作参考波长的620 nm处的吸光度。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样品活性除以经ELISA测得的蛋白质浓度而计算比活。结果见表1-10。
实施例
7
FVIII
构架和融合蛋白的纯化
融化溶于由以下成分组成的缓冲液的按照实施例5所述纯化的F8-500-白蛋白-Δa3 (13 mg, 6.5 mg/ml)：含咪唑(20
mM)、氯化钙(10 mM)、吐温80
(0.02 %)、氯化钠(500 mM)和甘油(1 M)的水(pH 7.3)。
加入9微克来自产脲节杆菌(Arthrobacter
ureafaciens)的唾液酸酶(1.9 U, 在7微升缓冲液中)、280微克唾液酸转移酶(在112微升中, His-ST3Gal-I,
2.5 mg/ml, EC 2.4.99.4, WO 2006102652)和59毫克胞苷一磷酸N-5’-PEG-甘油-神经氨酸(在290微升中, 参见WO2007/056191)，并用HCl
(1M)将pH调节到6.9。终体积为2.7 mL。然后让所得混合物在22-25摄氏度(室温)下静置22小时。
糖聚乙二醇化(glycopegylation)之后，混合物用缓冲液A (含Tris (25 mM)、氯化钙(10
mM)、吐温80 (0.02 %)和甘油(1 M)的水，pH 7.5)稀释至50 ml。将稀释混合物上样到Source30Q柱(GE Healthcare Bio-Sciences, Hillerød, Denmark, 柱体积1.1 mL)。然后用缓冲液A (4倍柱体积)洗涤固定化材料，再用0-100 %缓冲液B (含Tris (25 mM)、氯化钙(10 mM)、吐温80 (0.02 %)、氯化钠(0.7 M)和甘油(1 M)的水, pH 7.5)的梯度从柱中洗脱。梯度：8 CV 5-10 %缓冲液B, 13.5 CV 10-100 %缓冲液B和3 CV 100%缓冲液B。
将早期洗脱的2.5 mL峰流分与1.2毫克胞苷一磷酸N-5’乙酰基-神经氨酸(在12微升中)和62微克唾液酸转移酶(在52微升中, MBP-SBD-ST3Gal-III, EC 2.4.99.6, 参见WO 2006102652)混合。
让所得混合物在22-25摄氏度(室温)下静置22小时，然后上样到Superdex200pg柱(GE
Healthcare Bio-Sciences, Hillerød, Denmark；柱体积120
ml)。然后用由以下成分组成的缓冲液洗脱产物：含L-组氨酸(1.5 g/L)、L-甲硫氨酸(55 mg/L)、氯化钙(250 mg/L)、吐温80 (0.1 g/L)、氯化钠(18
g/L)和蔗糖(1.5 g/L)的水, pH
6.9。分离并合并最初的含产物的流分(12 mL)；产物浓度为大约0.06 mg/mL。
最终，通过在Amicon Centriprep YM-50 (截止值：50
kDa)中离心而浓缩产物。浓缩后体积为1.7 mL，含有0.35 mg/mL糖聚乙二醇化的F8-500-白蛋白-Δa3 (纯度>90%)。该化合物在表12中称为40K-PEG-O-F8-500-白蛋白-Δa3。
实施例
8
通过显色测定而测量的纯化样品中的
FVIII:C
如下在显色FVIII测定中，使用Coatest
SP试剂(Chromogenix)评价纯化rFVIII 化合物(按照实施例5所公开的方法而分离)的FVIII活性(FVIII:C)：rFVIII样品和FVIII标准品(例如根据NIBSC的第7届国际FVIII标准品而标定的纯化野生型rFVIII)在Coatest测定缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7.3，含防腐剂)中稀释。将50 µl样品、标准品和缓冲液阴性对照一式两份加入到96孔微量滴定板(Nunc)中。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl2按照5:1:3 (体积比)混合，并取75 µl加入到孔中。在室温下温育15 min之后，加入50 µl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物并将反应物在室温下温育10 min，然后加入25 µl
1 M柠檬酸, pH 3。在Spectramax微量滴定板读板器(Molecular Devices)上，测定在415
nm处吸光度和在用作参考波长的620 nm处的吸光度。从所有样品中减去阴性对照值并通过吸光度值对FVIII浓度作图的线性回归来制作标定曲线。通过样品活性除以经HPLC测得的蛋白质浓度而计算比活。对于HPLC，通过对在对应于轻链的色谱图中的峰下面积进行积分而求出样品浓度，并与野生型rFVIII的平行分析中同样的峰的面积进行比较，其中通过氨基酸分析测定浓度。结果见表1-10。
实施例
9
通过一步法凝血测定而测量的纯化样品中的
FVIII:C
如下在一步法FVIII凝血测定中进一步评价rFVIII化合物的FVIII:C：rFVIII样品和FVIII标准品(例如根据NIBSC的第7届国际FVIII标准品而标定的纯化野生型rFVIII)在HBS/BSA缓冲液(20 mM hepes、150 mM NaCl、pH
7.4，含1 % BSA)中稀释至大约 10
U/ml，再在含VWF而缺乏FVIII的血浆(Dade Behring)中稀释10倍。样品随后在HBS/BSA缓冲液中稀释。在ACL300R或ACL5000仪器(Instrumentation
Laboratory)上，使用单因子程序，测定APTT凝血时间（clot time）。含VWF而缺乏FVIII的血浆(Dade Behring)用作测定血浆，且SynthASil, (HemosILTM, Instrumentation
Laboratory)用作aPTT试剂。在凝血仪器中，在37℃，将稀释的样品或标准品与缺乏FVIII的血浆、aPTT试剂混合。加入(assed)氯化钙并用浊度确定血块形成的时间。根据FVIII标准品稀释液的血块形成时间的标准曲线来计算样品中的FVIII:C。结果见表1-10。
实施例
10
在
FVIII
缺陷型和
VWF
缺陷型小鼠中
FVIII
构架和融合蛋白的药代动力学
在FVIII缺陷型小鼠(具有C57Bl/6背景的FVIII外显子16敲出(KO)小鼠，在Taconic M&B繁育)或在vWF缺陷型小鼠(具有C57Bl/6 背景的vWF外显子4 + 5 KO小鼠，在Charles River,
Germany繁育)中评价rFVIII变体的药代动力学。vWF-KO小鼠具有13%的正常FVIII:C (参见实施例6)，而FVIII-KO小鼠没有可检测的FVIII:C。使用近似体重为25克，年龄范围在16-28周龄的雄性和雌性的混合群体(大约1:1)。小鼠在尾静脉接受rFVIII (280 IU/kg)的单次静脉注射。在给药后直到64小时的时间点，使用无包被毛细玻璃管，从眼窝丛处采血。每只小鼠采3份样品，每一时间点采2-4份样品。用柠檬酸钠立即稳定血液并在4倍体积FVIII
Coatest SP缓冲液(参见实施例6)中稀释，然后在4000 × g离心5分钟。将得自稀释血液的血浆在干冰上冷冻并保存于-80℃。按照实施例6所述，在显色测定中检测FVIII:C。通过无房室（non-compartmental）法(NCA)，使用WinNonlin Pro 4.1版软件，进行药代动力学分析。结果见表12。用融合蛋白的半衰期除以无融合配偶体的FVIII构架的半衰期，求出融合蛋白的延长倍数。
实施例
11
与血小板结合的融合蛋白的分析
可通过流式细胞术测定融合蛋白的血小板结合。可纯化外周血血小板，或可使用全血。血小板可被激活或静止。将血小板与融合蛋白温育15-30
min。融合蛋白可直接用荧光团标记或用荧光标记的第二抗体检测。
可加入不干扰融合蛋白结合的荧光标记的血小板特异性抗体，以评价与融合蛋白结合的颗粒是否真的是血小板。温育之后，洗涤细胞以除去融合蛋白，然后在流式细胞仪上分析样品。流式细胞仪检测未标记的细胞和与细胞结合的荧光标记的分子，并且因此可用于特异性地分析融合蛋白与血小板(或其它细胞)结合的程度。
可例如通过加入过量的未标记抗体(当使用直接标记的融合蛋白时)，评价结合特异性。可例如通过加入过量的膜联蛋白 V或FVIII，评价FVIII部分与血小板的结合。
可如下评价通过静止血小板对融合蛋白的内在化：例如通过将血小板与直接标记的融合蛋白一起温育，再与抗体一起温育，所述抗体猝灭来自表面结合(即非内在化的)融合蛋白的信号。然后仅内在化的融合蛋白才可被流式细胞术检测到。可假定被激活的血小板将会在血块形成部位释放内在化融合蛋白。
实施例
12
在
GPIIIa
转基因小鼠中
GPIIIa
靶向的融合蛋白的药代动力学
GPIIIa靶向的融合蛋白与血小板上的人GPIIb/IIIa (整联蛋白a2b3)受体结合，但它不能识别鼠GPIIb/IIIa，这防止使用野生型小鼠用于药代动力学分析。可在表达人GPIIIa的转基因小鼠中分析GPIIIa靶向的融合蛋白的药代动力学特性，所述人GPIIIa与鼠GPIIb关联，这使融合蛋白能够与该受体结合。将融合蛋白经静脉内注射到GPIIIa转基因小鼠，并在注射之后的不同时间点(例如0.5、24、72、288小时)采血。可通过ELISA的方式定量测定注射的融合蛋白(游离的和/或与血小板结合的)，或可将融合蛋白放射性标记或荧光标记并检测。
表
1.
可构成融合蛋白
FVIII
部分的
BDD FVIII
构架
* 显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高值可代表ELISA检测不良)
表
2.
与
FcRn
相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
3.
与免疫球蛋白相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
4.
具有降低与清除受体的相互作用的能力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
5.
与血小板结合的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
6.
与血清白蛋白相互作用的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
7.
保护分子避免清除受体的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
8.
具有经调节的
vWF
亲和力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
9.
其它融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
10.
具有经调节的脂质亲和力的融合蛋白
*显色测定/凝血测定
**在细胞培养收获物中测定(高的值可代表ELISA检测不良)
表
11.
实施例
5
所述的纯化过程的典型收率
表
12. FVIII
构架和融合蛋白在
FVIII
缺陷型或
vWF
缺陷型小鼠中的体内半衰期
*显色测定/ELISA。
CPCH1562663D 序 列
表
<110> 诺沃—诺迪斯克有限公司
<120> 因子VIII融合蛋白
<130> 7920
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2332
<212> PRT
<213> 人类(homo sapiens)
<400> 1
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1
5
10
15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20
25
30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35
40
45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50
55
60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65
70
75
80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85
90
95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100
105
110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115
120
125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130
135
140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145
150
155
160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165
170
175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180
185
190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195
200
205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210
215
220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225
230
235
240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245
250
255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260
265
270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275
280
285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290
295
300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305
310
315
320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325
330
335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340
345
350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355
360
365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370
375
380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385
390
395
400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405
410
415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420
425
430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435
440
445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450
455
460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465
470
475
480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485
490
495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500
505
510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515
520
525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530
535
540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545
550
555
560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565
570
575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580
585
590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595
600
605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610
615
620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625
630
635
640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645
650
655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660
665
670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675
680
685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690
695
700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705
710
715
720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725
730
735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740
745
750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755
760
765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770
775
780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785
790
795
800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805
810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820
825
830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835
840
845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850
855
860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865
870
875
880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885
890
895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900
905
910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915
920
925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930
935
940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945
950
955
960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965
970
975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980
985
990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser
Ala
995
1000
1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile
Glu
1010
1015
1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr
Glu
1025
1030
1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met
Asp
1040
1045
1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys
Thr
1055
1060
1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu
Gly
1070
1075
1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe
Lys
1085
1090
1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr
His
1100
1105
1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys
Gln
1115
1120
1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn
Phe
1130
1135
1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe
Thr
1145
1150
1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg
Asn
1160
1165
1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr
His
1175
1180
1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu
Thr
1190
1195
1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val
Thr
1205
1210
1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr
Arg
1220
1225
1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val
Leu
1235
1240
1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys
Lys
1250
1255
1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu
Glu
1265
1270
1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala
Cys
1280
1285
1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val
Thr
1295
1300
1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu
Glu
1310
1315
1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser
Thr
1325
1330
1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu
Thr
1340
1345
1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln
Ser
1355
1360
1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln
Ala
1370
1375
1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro
Ser
1385
1390
1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn
Ser
1400
1405
1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly
Val
1415
1420
1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn
Leu
1430
1435
1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg
Glu
1445
1450
1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr
Lys
1460
1465
1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys
Thr
1475
1480
1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln
Lys
1490
1495
1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His
Leu
1505
1510
1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala
Ile
1520
1525
1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu
Arg
1535
1540
1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu
Asp
1550
1555
1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys
Glu
1565
1570
1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe
Lys
1580
1585
1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn
His
1595
1600
1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile
Glu
1610
1615
1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser
Gln
1625
1630
1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg
Thr
1640
1645
1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr
Ile
1655
1660
1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu
Asp
1670
1675
1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His
Tyr
1685
1690
1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser
Ser
1700
1705
1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val
Pro
1715
1720
1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
Phe
1730
1735
1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly
Leu
1745
1750
1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met
Val
1760
1765
1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
Ser
1775
1780
1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro
Arg
1790
1795
1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp
Lys
1805
1810
1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys
Lys
1820
1825
1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val
His
1835
1840
1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr
Leu
1850
1855
1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala
Leu
1865
1870
1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr
Glu
1880
1885
1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met
Glu
1895
1900
1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn
Gly
1910
1915
1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp
Gln
1925
1930
1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn
Ile
1940
1945
1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys
Lys
1955
1960
1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val
Phe
1970
1975
1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg
Val
1985
1990
1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr
Leu
2000
2005
2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met
Ala
2015
2020
2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln
Tyr
2030
2035
2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly
Ser
2045
2050
2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys
Val
2060
2065
2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln
Gly
2075
2080
2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile
Ile
2090
2095
2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly
Asn
2105
2110
2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser
Ser
2120
2125
2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg
Tyr
2135
2140
2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu
Arg
2150
2155
2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro
Leu
2165
2170
2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala
Ser
2180
2185
2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys
Ala
2195
2200
2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln
Val
2210
2215
2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr
Met
2225
2230
2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu
Thr
2240
2245
2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp
Gly
2255
2260
2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val
Phe
2270
2275
2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu
Asp
2285
2290
2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser
Trp
2300
2305
2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu
Ala
2315
2320
2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 21个氨基酸的FVIII B结构域接头
<400> 2
Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
1
5
10
15
Lys Arg His Gln Arg
20
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> F8-500-His接头
<400> 3
Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser His His His His His His
1
5
10
15
Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg
20
25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> F8-500-α a3 His接头
<400> 4
Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser His His His His His His
1
5
10
15
Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg
20
25
<210> 5
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hFc
<400> 5
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Glu Pro Ser
1
5
10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20
25
30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35
40
45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50
55
60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val
65
70
75
80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85
90
95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100
105
110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115
120
125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130
135
140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145
150
155
160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165
170
175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
180
185
190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195
200
205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210
215
220
<210> 6
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> mFc
<400> 6
Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Ala Glu Gly Glu
1
5
10
15
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
20
25
30
Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
35
40
45
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val Leu
50
55
60
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Gln Ser Thr Leu Arg
65
70
75
80
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
85
90
95
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
100
105
110
Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
115
120
125
Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu
130
135
140
Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp
145
150
155
160
Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val
165
170
175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu
180
185
190
Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
195
200
205
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
210
215
220
Gly Lys
225
<210> 7
<211> 585
<212> PRT
<213> 人类
<400> 7
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1
5
10
15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20
25
30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35
40
45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50
55
60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65
70
75
80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85
90
95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100
105
110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115
120
125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130
135
140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145
150
155
160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165
170
175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180
185
190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195
200
205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210
215
220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225
230
235
240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245
250
255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260
265
270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275
280
285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290
295
300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305
310
315
320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325
330
335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340
345
350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355
360
365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370
375
380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385
390
395
400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405
410
415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420
425
430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435
440
445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450
455
460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465
470
475
480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485
490
495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500
505
510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515
520
525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530
535
540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545
550
555
560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565
570
575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580
585
<210> 8
<211> 678
<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala
1
5
10
15
Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser
20
25
30
Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys
35
40
45
Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala
50
55
60
Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val
65
70
75
80
Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Ala
85
90
95
Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu Arg
100
105
110
Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp Asn
115
120
125
Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys Pro
130
135
140
Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys
145
150
155
160
Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly Cys
165
170
175
Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys
180
185
190
Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr
195
200
205
Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu
210
215
220
Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp Cys
225
230
235
240
His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met Gly
245
250
255
Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu His
260
265
270
Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro His
275
280
285
Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys Val
290
295
300
Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Thr
305
310
315
320
Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu Ala Pro Thr Asp
325
330
335
Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His His Glu Arg Leu
340
345
350
Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys Ile Glu Cys Val
355
360
365
Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile Met Asn Gly Glu
370
375
380
Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr Ile Ala Gly Lys
385
390
395
400
Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn Lys Ser Asp Asn
405
410
415
Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val Ala Val Val Lys
420
425
430
Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys Gly Lys Lys Ser
435
440
445
Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly
450
455
460
Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp Glu Phe Phe Ser
465
470
475
480
Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser Leu Cys Lys Leu
485
490 495
Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn Asn Lys Glu Gly
500
505
510
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Lys Gly Asp
515
520
525
Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn Thr Gly Gly Lys
530
535
540
Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys Asp Tyr Glu Leu
545
550
555
560
Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu Tyr Ala Asn Cys
565
570
575
His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr Arg Lys Asp Lys
580
585
590
Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln His Leu Phe Gly
595
600
605
Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu Phe Arg Ser Glu
610
615
620
Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys Leu Ala Lys Leu
625
630
635
640
His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys
645
650
655
Ala Val Gly Asn Leu Arg Lys Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Glu Ala
660
665
670
Cys Thr Phe Arg Arg Pro
675
<210> 9
<211> 273
<212> PRT
<213> 人类
<400> 9
Gln Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val
1
5
10
15
Ser Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His
20
25
30
Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr
35
40
45
Gln Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp
50
55
60
Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro
65
70
75
80
Ile Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser
85
90
95
Arg Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp
100
105
110
Lys Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala
115
120
125
Phe Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn
130
135
140
Ile Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg
145
150
155
160
Tyr Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala
165
170
175
Pro Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu
180
185
190
Val Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu
195
200
205
Gln Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg
210
215
220
Asn Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser
225
230
235
240
Gly Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys
245
250
255
Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr
260
265
270
Pro
<210> 10
<211> 274
<212> PRT
<213> 人类
<400> 10
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1
5
10
15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20
25
30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
35
40
45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50
55
60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65
70
75
80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85
90
95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100
105
110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115
120
125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130
135
140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145
150
155
160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165
170
175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
180
185
190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195
200
205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210
215
220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225
230
235
240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245
250
255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys
260
265
270
Ser Ser
<210> 11
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FcRn-H166K
<400> 11
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1
5
10
15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20
25
30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
35
40
45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50
55
60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65
70
75
80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85
90
95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100
105
110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115
120
125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130
135
140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145
150
155
160
His Arg Leu Arg Glu Lys Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165
170
175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
180
185
190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195
200
205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210
215
220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225
230
235
240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245
250
255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys
260
265
270
Ser Ser
<210> 12
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> LRP-CR5-6
<400> 12
Thr Cys Pro Pro Asn Gln Phe Ser Cys Ala Ser Gly Arg Cys Ile Pro
1
5
10
15
Ile Ser Trp Thr Cys Asp Leu Asp Asp Asp Cys Gly Asp Arg Ser Asp
20
25
30
Glu Ser Ala Ser Cys Ala Tyr Pro Thr Cys Phe Pro Leu Thr Gln Phe
35
40
45
Thr Cys Asn Asn Gly Arg Cys Ile Asn Ile Asn Trp Arg Cys Asp Asn
50
55
60
Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Ala Gly Cys Ser His
65
70
75
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<213> 人工
<220>
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<400> 13
Thr Cys Phe Pro Leu Thr Gln Phe Thr Cys Asn Asn Gly Arg Cys Ile
1
5
10
15
Asn Ile Asn Trp Arg Cys Asp Asn Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser
20
25
30
Asp Glu Ala Gly Cys Ser His Ser Cys Ser Ser Thr Gln Phe Lys Cys
35
40
45
Asn Ser Gly Arg Cys Ile Pro Glu His Trp Thr Cys Asp Gly Asp Asn
50
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60
Asp Cys Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Thr His Ala Asn Cys Thr Asn Gln
65
70
75
80
Ala Thr Arg
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<213> 人工
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Thr Cys Phe Pro Leu Thr Gln Phe Thr Cys Asn Asn Gly Arg Cys Ile
1
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15
Asn Ile Asn Trp Arg Cys Asp Asn Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser
20
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30
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35
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1
5
10
15
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20
25
30
Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Met Gly Leu
35
40
45
Ile Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50
55
60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp
65
70
75
80
Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Leu Pro
85
90
95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Lys Leu Gly Gly Gly Gly
100
105
110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Val Gln Leu
115
120
125
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
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140
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150
155
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165
170
175
Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala
180
185
190
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195
200
205
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215
220
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230
235
240
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<213> 人工
<220>
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Met Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu
1
5
10
15
Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
20
25
30
Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Met Gly Leu
35
40
45
Ile Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50
55
60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp
65
70
75
80
Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Leu Pro
85
90
95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Lys Leu Gly Gly Gly Gly
100
105
110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Val Gln Leu
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120
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Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu
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170
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185
190
Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser
195
200
205
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220
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250
255
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<213> 人工
<220>
<223> SC抗GPIIIa-2-HC-LC
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1
5
10
15
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20
25
30
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40
45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Asn Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50
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60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65
70
75
80
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105
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150
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190
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195
200
205
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210
215
220
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<213> 人工
<220>
<223> SC抗GPIIIa-2-LC-HC
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5
10
15
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25
30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Cys Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35
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45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50
55
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70
75
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105
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<220>
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1
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10
15
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40
45
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 序列A
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Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu
1
5
10
15
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
20
25
30
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
35
40
45
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
50
55
60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
65
70
75
80
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
85
90
95
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala
100
105
110
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
115
120
125
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
130
135
140
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala
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150
155
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170
175
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180
185
190
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195
200
205
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
210
215
220
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230
235
240
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250
255
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260
265
270
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280
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290
295
300
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310
315
320
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340
345
350
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
355
360
365
Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
370
375
380
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385
390
395
400
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405
410
415
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420
425
430
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
435
440
445
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
450
455
460
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
465
470
475
480
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
485
490
495
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
500
505
510
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
515
520
525
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala
530
535
540
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
545
550
555
560
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565
570
575
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580
585
590
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595
600
605
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610
615
620
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
625
630
635
640
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
645
650
655
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
660
665
670
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
675
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Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
690
695
700
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710
715
720
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740
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750
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
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765
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro
770
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Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
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800
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
805
810
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Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
820
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Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
835
840
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Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
850
855
860
Gly
865
<210> 21
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> ELP80
<400> 21
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly
1
5
10
15
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
20
25
30
Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
35
40
45
Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly
50
55
60
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
65
70
75
80
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
85
90
95
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
100
105
110
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
115
120
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Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
130
135
140
Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
145
150
155
160
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
165
170
175
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val
180
185
190
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
195
200
205
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210
215
220
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225
230
235
240
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
245
250
255
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
260
265
270
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro
275
280
285
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
290
295
300
Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
305
310
315
320
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly
325
330
335
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
340
345
350
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
355
360
365
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
370
375
380
Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
385
390
395
400
<210> 22
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 额外的a3
<400> 22
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1
5
10
15
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
20
25
30
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg
35
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<210> 23
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> GHBP
<400> 23
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1
5
10
15
Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu
20
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50
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85
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100
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145
150
155 160
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195
200
205
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210
215
220
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225
230
235
<210> 24
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FIX298-342
<400> 24
Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Ala Arg Val
1
5
10
15
Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro
20
25
30
Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe
35
40
45
<210> 25
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FIX47-125
<400> 25
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1
5
10
15
Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe
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50
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60
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65
70
75
80
<210> 26
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> vWF1-272
<400> 26
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1
5
10
15
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20
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Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
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Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
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85
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95
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100
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110
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Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225
230
235
240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245
250
255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260
265
270
<210> 27
<211> 1390
<212> PRT
<213> 人类
<400> 27
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1
5
10
15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20
25
30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35
40
45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50
55
60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65
70
75
80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85
90
95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100
105
110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115
120
125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130
135
140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145
150
155
160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165
170
175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180
185
190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195
200
205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210
215
220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225
230
235
240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245
250
255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260
265
270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275
280
285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290
295
300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305
310
315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325
330
335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340
345
350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355
360
365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370
375
380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385
390
395
400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405
410
415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420
425
430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435
440
445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450
455
460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu
465
470
475
480
Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val
485
490
495
Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu
500
505
510
Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala
515
520
525
Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu
530
535
540
Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
545
550
555
560
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu
565
570
575
Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala
580
585
590
Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys
595
600
605
Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser
610
615
620
Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly
625
630
635
640
Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His
645
650
655
Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn
660
665
670
Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp
675
680
685
Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro
690
695
700
Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu
705
710
715
720
Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val
725
730
735
Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn
740
745
750
Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly
755
760
765
Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr
770
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780
Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
785
790
795
800
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly
805
810
815
Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly
820
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830
Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro
835
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845
Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro
850
855
860
Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly
865
870
875
880
Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg
885
890
895
Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu
900
905
910
Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp
915
920
925
Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe
930
935
940
Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile
945
950
955
960
Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr
965
970
975
Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu
980
985
990
Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile
Gly
995
1000
1005
Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met
His
1010
1015
1020
Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val
Thr
1025
1030
1035
Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala
Arg
1040
1045
1050
Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg
Tyr
1055
1060
1065
Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp
Ser
1070
1075
1080
Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met
Val
1085
1090
1095
Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe
Val
1100
1105
1110
Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly
Asp
1115
1120
1125
Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln
Pro
1130
1135
1140
Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp
Arg
1145
1150
1155
Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys
Val
1160
1165
1170
Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys
Thr
1175
1180
1185
Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn
Phe
1190
1195
1200
Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys
Glu
1205
1210
1215
Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro
Gly
1220
1225
1230
Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser
Ala
1235
1240
1245
Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn
Gly
1250
1255
1260
Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val
Asn
1265
1270
1275
Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu
Gly
1280
1285
1290
His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu
Gln
1295
1300
1305
Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys
Gly
1310
1315
1320
Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp
Gly
1325
1330
1335
Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr
Val
1340
1345
1350
Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln
Cys
1355
1360
1365
Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro
Leu
1370
1375
1380
Phe Ala Glu Cys His Lys Val
1385
1390
<210> 28
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> vWF497-716-R545A
<400> 28
Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu
1
5
10
15
Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala
20
25
30
Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu
35
40
45
Ala Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
50
55
60
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu
65
70
75
80
Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala
85
90
95
Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys
100
105
110
Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser
115
120
125
Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly
130
135
140
Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His
145
150
155
160
Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn
165
170
175
Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp
180
185
190
Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro
195
200
205
Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly
210
215
220
<210> 29
<211> 269
<212> PRT
<213> 人类
<400> 29
Asn Pro Glu Leu Lys Asp Phe Asn Glu Glu Glu Gln Leu Lys Cys Asp
1
5
10
15
Leu Glu Leu Asn Lys Leu Glu Asn Gln Ile Leu Met Leu Gly Lys Thr
20
25
30
Phe Tyr Gln Asn Tyr Arg Asp Asp Val Glu Ser Leu Tyr Ser Lys Leu
35
40
45
Asp Leu Ile Met Gly Tyr Lys Asp Glu Glu Arg Ala Asn Lys Lys Ala
50
55
60
Val Asn Lys Arg Met Leu Glu Asn Lys Lys Glu Asp Leu Glu Thr Ile
65
70
75
80
Ile Asp Glu Phe Phe Ser Asp Ile Asp Lys Thr Arg Pro Asn Asn Ile
85
90
95
Pro Val Leu Glu Asp Glu Lys Gln Glu Glu Lys Asn His Lys Asn Met
100
105
110
Ala Gln Leu Lys Ser Asp Thr Glu Ala Ala Lys Ser Asp Glu Ser Lys
115
120
125
Arg Ser Lys Arg Ser Lys Arg Ser Leu Asn Thr Gln Asn His Lys Pro
130
135
140
Ala Ser Gln Glu Val Ser Glu Gln Gln Lys Ala Glu Tyr Asp Lys Arg
145
150
155
160
Ala Glu Glu Arg Lys Ala Arg Phe Leu Asp Asn Gln Lys Ile Lys Lys
165
170
175
Thr Pro Val Val Ser Leu Glu Tyr Asp Phe Glu His Lys Gln Arg Ile
180
185
190
Asp Asn Glu Asn Asp Lys Lys Leu Val Val Ser Ala Pro Thr Lys Lys
195
200
205
Pro Thr Ser Pro Thr Thr Tyr Thr Glu Thr Thr Thr Gln Val Pro Met
210
215
220
Pro Thr Val Glu Arg Gln Thr Gln Gln Gln Ile Ile Tyr Asn Ala Pro
225
230
235
240
Lys Gln Leu Ala Gly Leu Asn Gly Glu Ser His Asp Phe Thr Thr Thr
245
250
255
His Gln Ser Pro Thr Thr Ser Asn His Thr His Asn Asn
260
265
<210> 30
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> hCG C-端
<400> 30
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1
5
10
15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20
25
<210> 31
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> F10AP
<400> 31
Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile
1
5
10
15
Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro
20
25
30
Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn
35
40
45
Asn Leu
50
Claims (15)
1.一种重组FVIII分子，其中所述FVIII分子是融合蛋白，其包含FVIII分子和融合配偶体，其中所述融合配偶体是Fc受体。
2.权利要求1的分子，其中所述Fc受体选自FcγRI和FcγRII。
3.权利要求2的分子，其中所述Fc受体是FcγRI。
4.前述任一项权利要求的分子，其中所述分子与侧基缀合。
5.前述任一项权利要求的分子，其中所述侧基选自下述一种或多种：亲水聚合物、肽和疏水性侧基。
6.权利要求5的分子，其中所述侧基是亲水性聚合物。
7.权利要求6的分子，其中所述亲水性聚合物是PEG。
8.权利要求6的分子，其中所述亲水性聚合物是非天然存在的修饰的糖。
9.前述任一项权利要求的分子，其中所述FVIII分子具有降低的vWF结合能力。
10.权利要求9的分子，其中所述FVIII分子包含 Y1680F点突变。
11.前述任一项权利要求的分子，其中所述Fc受体插入FVIII的B结构域。
12.前述任一项权利要求的分子，其中所述融合配偶体插入FVIII中C2结构域的C末端中。
13.前述任一项权利要求的分子，其中所述FVIII分子是B结构域截短的分子，其中所述B结构域在截短的B结构域中仅包含一个O-聚糖。
14.权利要求1-13中任一项的分子在制备用于治疗血友病的药物中的用途。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的分子。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106279437A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-01-04 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN108623695A (zh) * | 2017-03-24 | 2018-10-09 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2019219049A1 (zh) * | 2018-05-18 | 2019-11-21 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | 改进的fviii融合蛋白及其应用 |
| CN110950964A (zh) * | 2018-09-26 | 2020-04-03 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 突变型单链人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN113166271A (zh) * | 2018-05-18 | 2021-07-23 | 郑州晟斯生物科技有限公司 | 具有延长半衰期的融合多肽缀合物 |
| US11123438B2 (en) | 2016-08-19 | 2021-09-21 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Linker peptide for constructing fusion protein |
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| MX357403B (es) * | 2012-01-12 | 2018-07-09 | Bioverativ Therapeutics Inc | Polipeptidos de factor viii quimericos y usos de los mismos. |
| NZ628014A (en) * | 2012-02-15 | 2016-09-30 | Biogen Ma Inc | Recombinant factor viii proteins |
| CN104487452A (zh) | 2012-02-15 | 2015-04-01 | 阿穆尼克斯运营公司 | 因子viii组合物及其制备和使用方法 |
| WO2013160005A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition suitable for treatment of haemophilia |
| US20150080309A1 (en) * | 2012-04-24 | 2015-03-19 | Nova Nordisk A/S | Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia |
| DK2882450T3 (da) | 2012-07-11 | 2020-02-24 | Bioverativ Therapeutics Inc | Faktor viii-kompleks med xten og von willebrand-faktorprotein samt anvendelser deraf |
| JP6618892B2 (ja) | 2013-04-23 | 2019-12-11 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 細菌バイオフィルムの遺伝的リプログラミング |
| EP3033097B1 (en) | 2013-08-14 | 2021-03-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor viii-xten fusions and uses thereof |
| US10702608B2 (en) | 2013-09-08 | 2020-07-07 | Kodiak Sciences Inc. | Factor VIII zwitterionic polymer conjugates |
| CN106456718A (zh) | 2014-01-10 | 2017-02-22 | 比奥根Ma公司 | 因子viii嵌合蛋白及其用途 |
| WO2015132724A1 (en) * | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Pfizer Inc. | Improved muteins of clotting factor viii |
| US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
| EP3177317B1 (en) | 2014-08-04 | 2020-03-18 | CSL Limited | Factor viii formulation |
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| BR112017018468A2 (pt) | 2015-03-06 | 2018-04-17 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | fator de von willebrand modificado com meia-vida aumentada |
| US20180258435A1 (en) | 2015-04-06 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Biosynthetic amyloid-based materials displaying functional protein sequences |
| WO2016198521A1 (en) * | 2015-06-10 | 2016-12-15 | Novo Nordisk A/S | Fviii fusion proteins |
| CN104926946B (zh) * | 2015-07-13 | 2021-09-17 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用 |
| EA201890423A1 (ru) | 2015-08-03 | 2018-07-31 | Биовератив Терапьютикс Инк. | Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения |
| KR20180031775A (ko) | 2015-08-12 | 2018-03-28 | 셀 머신스, 인크. | 긴 반감기 응집 복합체와 관련된 방법 및 조성물 |
| GB201520021D0 (en) * | 2015-11-13 | 2015-12-30 | Asterion Ltd | Fusion polypeptide |
| BR112018013407A2 (pt) | 2015-12-30 | 2018-12-18 | Kodiak Sciences Inc | anticorpos e conjugados dos mesmos |
| WO2017201428A1 (en) | 2016-05-19 | 2017-11-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of making gels and film using curli nanofibers |
| CA3059938A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Kodiak Sciences Inc. | Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof |
| GB201706781D0 (en) | 2017-04-28 | 2017-06-14 | Univ Sheffield | Parathyroid hormone fusion polypeptide |
| CN114072420A (zh) | 2019-07-04 | 2022-02-18 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | 用于增加凝血因子viii的体外稳定性的截短的血管性血友病因子(vwf) |
| JP2022546525A (ja) | 2019-09-02 | 2022-11-04 | ビオテスト・アクチエンゲゼルシャフト | 延長された半減期を有する第ｖｉｉｉ因子タンパク質 |
| EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
| CA3157509A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
| JP2023500953A (ja) | 2019-11-11 | 2023-01-11 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト | 第ｖｉｉｉ因子に対する寛容を誘導するためのポリペプチド |
| KR20220130692A (ko) * | 2020-01-20 | 2022-09-27 | 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 | 친화성 크로마토그래피를 위한 신규한 세척 완충제 용액 |
| WO2023227015A1 (zh) * | 2022-05-25 | 2023-11-30 | 江苏晟斯生物制药有限公司 | 具有延长的半衰期的fviii融合蛋白缀合物及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008077616A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
| CN101379077A (zh) * | 2005-12-07 | 2009-03-04 | 夏洛特·豪泽 | 因子ⅷ和因子ⅷ-类似蛋白的小肽或者拟肽亲合性配体 |
| WO2009156137A1 (en) * | 2008-06-24 | 2009-12-30 | Csl Behring Gmbh | Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3879395T2 (de) | 1987-05-29 | 1993-06-24 | Sagami Chem Res | Fusionsprotein, enthaltend lymphotoxin. |
| AU2645588A (en) | 1987-12-04 | 1989-06-15 | Scripps Clinic And Research Foundation | The von willebrand factor binding domain of factor viii |
| US5843440A (en) | 1990-10-03 | 1998-12-01 | Redcell Canada, Inc. | Cellular and serum protein anchors for modulating pharmacokinetics |
| US6939677B1 (en) | 1990-11-01 | 2005-09-06 | Cancer Research Fund Of Contra Costa | Antibody with 46 kdalton HMFG antigen binding specificity, immunoassay kit and diagnostic method |
| US5859204A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5629384A (en) | 1994-05-17 | 1997-05-13 | Consiglio Nazionale Delle Ricerche | Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| US6172213B1 (en) | 1997-07-02 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides |
| US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| US6524572B1 (en) | 2000-06-26 | 2003-02-25 | Rainbow Therapeutic Company | Targeting recombinant virus with a bispecific fusion protein ligand in coupling with an antibody to cells for gene therapy |
| ES2411007T3 (es) | 2001-10-10 | 2013-07-04 | Novo Nordisk A/S | Remodelación y glicoconjugación de péptidos |
| WO2004062619A2 (en) | 2003-01-13 | 2004-07-29 | Macrogenics, Inc. | SOLUBLE FcϜR FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF |
| US7348004B2 (en) * | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| WO2005040382A2 (de) | 2003-10-28 | 2005-05-06 | Alexander Cherkasky | Cherkasky - fusionsproteine enthaltend antikorperbinde-, antigenbinde - mikrotubulibinde und immunantwortauslosende |
| WO2005113584A1 (en) | 2004-04-29 | 2005-12-01 | Board Of Regents, University Of Texas System | Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting |
| WO2006102652A2 (en) | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Neose Technologies, Inc. | Expression of soluble, active eukaryotic glycosyltransferases in prokaryotic organisms |
| US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
| JP5102635B2 (ja) | 2006-01-31 | 2012-12-19 | 石原産業株式会社 | エンベロープウイルスの構成成分に親和性を有するポリペプチドと細胞内物質導入への使用 |
| US20100056428A1 (en) * | 2006-09-01 | 2010-03-04 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modified proteins |
| JP2010511397A (ja) | 2006-12-05 | 2010-04-15 | アブリンクス エン．ヴェー． | 血清タンパク質と結合可能なペプチド |
| WO2008091682A2 (en) * | 2007-01-23 | 2008-07-31 | Zymogenetics, Inc. | Soluble fc gamma r1a for reducing inflammation |
| US8043621B2 (en) | 2007-05-10 | 2011-10-25 | Ramot At Tel Aviv University Ltd. | Recombinant fusion protein and polynucleotide construct for immunotoxin production |
| ES2400107T3 (es) | 2007-10-22 | 2013-04-05 | Merck Serono S.A. | IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de lgG mutado |
| EP2626080A3 (en) * | 2008-02-27 | 2014-03-05 | Novo Nordisk A/S | Conjugated factor VIII molecules |
-
2011
- 2011-02-10 CN CN201180009864.4A patent/CN102770450B/zh not_active Expired - Fee Related
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2016
- 2016-02-08 JP JP2016021624A patent/JP6185097B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2016-10-04 US US15/285,138 patent/US20170015729A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-07-26 JP JP2017144266A patent/JP2017190342A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101379077A (zh) * | 2005-12-07 | 2009-03-04 | 夏洛特·豪泽 | 因子ⅷ和因子ⅷ-类似蛋白的小肽或者拟肽亲合性配体 |
| WO2008077616A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
| WO2009156137A1 (en) * | 2008-06-24 | 2009-12-30 | Csl Behring Gmbh | Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A LEYTE等: "Sulfation of Tyr1680 of human blood coagulation factor VIII is essential for the interaction of factor VIII with von Willebrand factor", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11123438B2 (en) | 2016-08-19 | 2021-09-21 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Linker peptide for constructing fusion protein |
| CN106279437B (zh) * | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN106279437A (zh) * | 2016-08-19 | 2017-01-04 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| US11833212B2 (en) | 2016-08-19 | 2023-12-05 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Linker peptide for constructing fusion protein |
| US11472863B2 (en) | 2016-08-19 | 2022-10-18 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Human coagulation factor IX (FIX) fusion protein, preparation method therefor, and use thereof |
| US11471513B2 (en) | 2016-08-19 | 2022-10-18 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Highly glycosylated human blood-clotting factor VIII fusion protein, and manufacturing method and application of same |
| CN108623695A (zh) * | 2017-03-24 | 2018-10-09 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用 |
| WO2019219049A1 (zh) * | 2018-05-18 | 2019-11-21 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | 改进的fviii融合蛋白及其应用 |
| US20210361775A1 (en) * | 2018-05-18 | 2021-11-25 | Zhengzhou Gensciences Inc | Improved fviii fusion protein and use thereof |
| CN113166271A (zh) * | 2018-05-18 | 2021-07-23 | 郑州晟斯生物科技有限公司 | 具有延长半衰期的融合多肽缀合物 |
| CN113039200A (zh) * | 2018-05-18 | 2021-06-25 | 郑州晟斯生物科技有限公司 | 改进的fviii融合蛋白及其应用 |
| CN113039200B (zh) * | 2018-05-18 | 2023-07-25 | 郑州晟斯生物科技有限公司 | 改进的fviii融合蛋白及其应用 |
| CN110950964A (zh) * | 2018-09-26 | 2020-04-03 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 突变型单链人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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