CN110950964A - 突变型单链人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突变型重组单链人凝血因子VIII(FVIII)融合蛋白、其制备方法及用途。该融合蛋白从N端到C端依次包含缺失部分B‑结构域的突变型单链人FVIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(优选人IgG Fc变体)。该融合蛋白具有与重组FVIII类似的生物学活性及延长的体内活性半衰期，以及更好的体外和体内稳定性，从而改善融合蛋白的药代动力学和药效。

Description

突变型单链人凝血因子VIII融合蛋白及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及融合蛋白领域，更具体地，涉及一种突变型人凝血因子VIII(FVIII)的融合蛋白及其制备方法和用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。

背景技术

凝血因子VIII(FVIII)，又称抗血友病因子，在内源性凝血体系中具有十分重要的作用。FVIII分子遗传学的大量研究结果表明性染色体X-连锁基因中缺乏FVIII会导致A型血友病。据统计，血友病A在男性人群中患病率为1/5000，占血友病总数的80％以上。血友病A目前常用的治疗方法为替代治疗，即补充血友病患者所缺乏的FVIII。

成熟的FVIII由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成，具有A1-A2-B-A3-C1-C2的结构域。在细胞内，对B结构域中Arg-1648残基进行的蛋白酶解产生90-200kDa的大小不均一的重链(A1-A2-B)和80kDa的轻链(结构域A3-C1-C2)。重链和轻链通过二价金属离子依赖性的链接结合为异源二聚体。在血浆中，重链和轻链的二聚体再以高亲和力结合冯.维勒布兰德因子(von Willebrand，vWF)，保护其免于成熟前降解。血浆中非活化FVIII结合vWF的半衰期约为12小时。FVIII在重链内的Arg372和Arg740位置，和在轻链内的Arg1689位置被活化的凝血因子FX(FXa)及凝血酶FII(FIIa)水解切割而活化，导致vWF因子释放并产生活化的FVIII二聚体(FVIIIa)，在Ca²⁺存在下，它与磷脂表面上活化的凝血因子FIX(FIXa)和FX形成紧密复合物，FX接着被FIXa激活，活化的FX从复合物中解离出来，转而将凝血酶原转化为凝血酶，后者能将纤维蛋白原直接转化成纤维蛋白。作为一种凝血系统的辅助因子，FVIII能使FIXa对FX的活化催化效率增强几个数量级。

由于FVIII蛋白质结构复杂，分子量大，致使FVIII很不稳定，在原料血浆收集及重组纯化制备等过程中容易失活。FVIII的有效期相对短暂，特别在水溶液中，保存温度、无机盐离子、微量蛋白酶以及参与凝血的其他蛋白质(特别是vWF和白蛋白)等因素都会对FVIII分子的稳定性产生影响。FVIII冻干品复溶后注射给药的过程中，必须确保安全、无菌，且要在规定时间内输液完毕，一般不超过4h。另一方面，冻干复溶过程中的剧烈振荡也会导致蛋白结构受损从而使FVIII失活。因此，研发具有更好稳定性的FVIII分子，能够提高FVIII制品在临床应用中的灵活性，对大幅提高患者的用药安全和生活质量而言至关重要。

FVIII的B结构域含有18个N糖基化位点，在凝血中没有已知功能且与其他蛋白质没有同源性，B-结构域缺失的FVIII分子仍具有良好的促凝血活性。Eaton等公开了一种从中心B结构域区域缺失766个氨基酸(797到1562)的FVIII分子保持了其生物活性，此外，缺失B结构域区域的FVIII在哺乳动物细胞中的表达量是高于全长分子的，并且表现出比全长分子更快和更高的激活率(Eaton等，Biochemistry,1986,25:8343-8347)。其它研究也表明，大部分B结构域缺失(Ser743到Gln1638)对FVIII的功能活性没有影响，且显著降低了分子量(减少38％)，增加了真核细胞中的表达水平(Peters R T等,J Thromb Haemost,2013,11(1):132-141；Sandberg H等,Semin Hematol,2001,38:4-12)。

Afstyla是一种新型重组单链人FVIII产品，是目前唯一获批治疗A型血友病的轻重链融合在一起的单链凝血因子产品。由于其对血管假性血友病因子(VWF)具有极强的亲和性，因而具有更高的分子稳定性和更长的疗效持续时间。在临床研究中，Afstyla在预防性治疗(prophylaxis)和按需治疗(on-demand treatment)均表现出优秀的止血和预防出血功效，在2种给药方案中，Afstyla的用药剂量均较低，同时也具有非常好的安全性。相较于标准护理药物Octocog alfa，Afstyla的蛋白构型更为稳定，疗效也相对持久，但仍需每周注射2-3次。

为了延长FVIII的体内功能半衰期，现有技术将FVIII与PEG、人血清白蛋白(HSA)、转铁蛋白或IgG Fc等延长半衰期部分连接。目前Novo Nordisk(N8-GP)，Bayer(BAY94-9027)和Baxter(BAX 855)公司均开发了PEG化的长效FVIII产品，并已进入临床研究，然而，在该蛋白制备工艺中增加了PEG与FVIII化学缀合的额外步骤，降低了最终产率、加大了制备成本。另一方面，药代动力学研究数据显示，PEG化的FVIII并未获得显著延长的半衰期(Tiede A等,J Thromb Haemost,2013,11:670-678；Turecek PL等,Hamostaseologie,2012,32 Suppl 1:S29-38)。WO2013106789公开了一种包含FVIII部分和Fc部分的嵌合多肽(FVIIIFc)，所述嵌合FVIII多肽的终末半衰期相较于rFVIII延长了两倍，预防性治疗的给药频次为每周两次，以维持FVIII活性的水平在1-3％。

CTP是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽，含有多个O-糖基化位点。这种带负电、高度唾液酸化的的肽段与其它蛋白的C末端共价连接，能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长与之连接的目标蛋白在体内的半衰期。一些专利文献公开CTP可以作为融合蛋白中包含的延长半衰期部分。本发明创造性地将具有多个O-糖基位点的CTP多肽作为连接肽的一部分，用于连接单链FVIII和Fc片段，而不是放在C末端作为融合配体发挥作用，因它具有的天然糖基化位点，不仅能使融合蛋白的半衰期进一步延长，生物利用度提高，同时与常规的柔性GS柔性连接肽相互配合，形成稳定的立体构象，促使单链FVIII和Fc段独立折叠形成正确三维构象，大大降低了融合配体Fc对单链FVIII的位阻效应，使其保持了较高的生物学活性。另外，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性。

综上，虽然目前有许多研究提供了有效的重组FVIII蛋白制备方案，然而相比全长FVIII而言，FVIII衍生物的异源数目、结构和凝血酶活化的不稳定仍然是一个严峻的问题。此外，由于许多B-结构域缺失的FVIII作为融合蛋白表达，非天然的氨基酸序列给药后可能出现新的免疫原性。FVIII分子的稳定性对于储存和临床应用而言也至关重要。在这种情况下，希望开发活化、稳定、安全的FVIII衍生物，能够具有同样的凝血酶活性、提高的产量和更长的半衰期，可以通过降低注射频率来维持预防性治疗，有助于改善治疗效果。

发明内容

本发明提供一种重组突变型单链凝血因子VIII的Fc融合蛋白，具有延长的体内活性半衰期且与重组FVIII相似的生物学活性。此外，本发明提供了一种高效、稳定表达所述融合蛋白的方法，该方法表达的融合蛋白具有产量高、在制备和存储过程中稳定性好，并且其生物活性和已上市的重组FVIII因子相似的优点。本申请的发明人令人惊讶的发现构建的重组突变型单链FVIII融合蛋白的稳定性实质地增强，融合蛋白在细胞内可以阻止蛋白酶剪切，得到的融合蛋白在纯化后显示出更好的稳定性，皮下施用时显示出良好的生物利用率。

本发明的第一方面，本发明涉及一种重组突变型单链凝血因子VIII融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次含有缺失部分B-结构域的单链人FVIII(scFVIII)、柔性肽接头(Linker，L)、至少一个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元(以下简称CTP刚性单元，表示为(CTP)_n，较优地，n为1,2,3,4,或5)和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgG Fc变体(表示为vFc))。本发明的一些优选实施例中，所述融合蛋白表示为scFVIII-L-CTP-vFc。

其中，所述scFVIII其和SEQ ID NO：1所示全长人野生型FVIII氨基酸序列相比缺失了765至1651位氨基酸；具体地，所述scFVIII具有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。

其中，所述柔性肽接头优选非免疫原性的，并且在scFVIII和Fc之间产生足够的空间距离，使相互之间的位阻效应降至最低。较佳地，使用含有2个或更多个氨基酸残基组成的柔性肽接头，且选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。

更优选地，所述柔性肽接头包含G和S残基。连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。对本发明而言，所述肽接头可优选地包含以(GS)_a(GGS)_b(GGGS)_c(GGGGS)_d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。

具体地，本发明的实施例中，所述肽接头可优选地包含如下序列：

(i)L1：GSGGGSGGGGSGGGGS；

(ii)L2：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iii)L3：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iv)L4：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。

其中，所述CTP刚性单元选自人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第113至145位氨基酸所组成的全长序列或其片段，具体地，所述CTP刚性单元包含如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或其截短的序列。首先，这种人体内天然存在的含有多个糖基化位点的CTP多肽是非免疫原性的。其次，含有多个糖基化位点的CTP刚性连接肽相对于柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，促使scFVIII和Fc段独立折叠形成正确三维构象而互不影响各自生物活性。另外，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性。

优选地，所述CTP刚性单元包含至少2个糖基化位点；例如，本发明的一优选实施例中，所述CTP刚性单元包含2个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3N端的10个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*；或所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3C端的14个氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含3个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3N端的16个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另一些实施例中，所述CTP刚性单元包含4个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含28、29、30、31、32或33个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第113、114、115、116、117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3N端的28个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都代表本发明的独立实施方式。

在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少95％同源。

本发明具体实施例中所述CTP刚性单元可优选地包含如下序列：

(i)CTP¹：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(ii)CTP²：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(iii)CTP³：SSSSKAPPPS；

(iv)CTP⁴：SRLPGPSDTPILPQ。

本发明一些实施例中，所述融合蛋白包含1个上述CTP刚性单元。本发明另一些实施例中，所述融合蛋白包含2个或2个以上的上述CTP刚性单元，优选地，包含2，3，4或5个上述CTP刚性单元。

其中，延长半衰期部分优选自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA Fc片段；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体的Fc片段；进一步地，所述人IgG Fc变体包含位于野生型人IgGFc中的至少一种氨基酸修饰，且变体具有降低的效应子功能(ADCC和/或CDC效应)和/或与新生儿受体FcRn的结合亲和力增强。进一步地，人IgG Fc变体可选自下组：

(i)vFcγ₁：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列)；

(ii)vFcγ_2-1：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列)；

(iii)vFcγ_2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列)；

(iv)vFcγ_2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列)；

(v)vFcγ₄：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列)。

本发明所提供的IgG Fc变体包含但不限于(i)～(v)中所述5种变体，还可以是IgG同种亚型间两类功能变体突变位点的组合或叠加，如上述(iv)中所述变体即是由(ii)和(iii)中的突变位点相叠加所获得的新的IgG2Fc的组合变体。

本发明所述融合蛋白中的Fc变体(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数系统确定)含有氨基酸突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低，而且依旧是FcγR非结合子。IgG4 Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比IgG1低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1降低的效应子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备FVIII融合蛋白。而250和428位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc区与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能变体的相互组合或叠加，获得新的组合变体，使其效应子功能降低的同时且延长了其半衰期。本发明所述Fc变体包含却不局限于上述几个位点的突变，也可引入其它位点的替换使得Fc具有降低的效应子功能和/或与FcRn受体的结合力增强，同时还不会致使Fc变体功能/活性降低或引起不良的构象变化，常见的突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604。

本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述融合蛋白的DNA。

本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：10所示。

根据本发明的再一个方面，提供一种载体，该载体包含上述DNA。

根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体，或者转染了上述的载体。

在本发明的具体实施方式中，宿主细胞是CHO的衍生细胞株DXB-11。

根据本发明的第五方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白。

根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)将编码所述融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；

(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过1IU/10⁶个细胞的高产量细胞株；

(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；

(d)收获步骤(c)得到的发酵液，并分离纯化融合蛋白。

进一步地，所述步骤(a)中CHO衍生细胞系为DXB-11。

进一步地，所述步骤(c)中，细胞培养可选用分批、灌流或流加培养方法。

进一步地，所述步骤(d)中采用四步层析法对融合蛋白进行纯化，分别为亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析。本发明结合实施例5进一步给出其优选条件。

本发明优选实施例中，采用上述方法制备得到的融合蛋白的活性>6000IU/mg。

根据本发明的第六方面，提供所述融合蛋白在制备用于预防或治疗因FVIII缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病或事件的药物中的应用。

进一步地，所述疾病包括甲型(或称A型)血友病。在甲型血友病患者的自发出血事件、手术预防、围手术期处理或手术治疗中，本发明所述融合蛋白起到控制或预防出血发生的作用。

本发明所公开和/或所记载的融合蛋白及其制备方法的优点可以概括如下：

1、本发明构建的突变型单链FVIII融合蛋白，其Fc段是非裂解性的，即通过对Fc片段的补体、受体结合域进行突变，调节Fc与相应受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，而只保留Fc段延长活性蛋白体内半衰期的作用，却不产生细胞毒性。

2、本发明提供的突变型单链FVIII融合蛋白包含具有多个糖基侧链的刚性CTP多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻隔”作用促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。CTP含有多个O型修饰的寡糖基，带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其清除作用，进一步延长融合蛋白的半衰期；再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解。

3、本发明所述融合蛋白无论在发酵、纯化过程以及储存过程中均具有良好的体外稳定性。25度室温储存7日，突变型单链FVIII融合蛋白的活性显著高于Arg1648和Glu1649间(根据人野生型FVIII全长序列SEQ ID NO：1编码)蛋白酶切位点未被失活的重组双链FVIII Fc融合蛋白药物，且活性丧失小于20％。

4、本发明提供的所述融合蛋白的制备方法，产量较高，在300ml摇瓶中培养14天，累积产量至少可达到200mg/L，可进行工艺放大，实现大规模工业化生产。

发明详述：

hCG-β羧基末端肽(CTP)

CTP是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA等,Proc NatlAcad Sci USA,1992,89(10):4304-4308)。天然CTP含有37个氨基酸残基，具有4个O-糖基化位点，终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长体内循环半衰期(Fares F A等,Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(10):4304-4308)。然而，本发明创造性地将至少一个CTP多肽与适当长度的柔性连接肽连接，共同作为连接肽，用于连接FVIII与延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)。

本发明发现，通过在FVIII与Fc变体间增加CTP肽，相当于增加了一段刚性连接肽。这一方面保证了N-端融合的FVIII不会影响Fc变体与FcRn的结合位点，从而影响半衰期；另外Fc的Protein A结合位点对于制备工艺中纯化步骤很重要，连接CTP保证N-端融合的FVIII也不会“罩住”它与protein A的结合位点，因而可选择更便宜和更适用的填料纯化融合蛋白，降低纯化成本。另一方面，CTP的添加也使得约25kDa大小的Fc片段不会干扰N-端融合的FVIII的正确折叠，造成其生物学活性/功能的下降或丧失。具有多个糖基侧链的刚性CTP多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻隔”作用促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解。

IgG Fc变体

非裂解性Fc变体

Fc元件来源于免疫球蛋白IgG的恒定区Fc片段，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc介导的IgG的效应子功能发挥通过两种机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q结合，引发补体依赖性细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力较低，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。此外，人IgG1和IgG3还能有效结合C1q而激活补体级联反应。人IgG2与C1q结合相对弱，而IgG4不与C1q结合(Jefferis R等,Immunol Rev,1998,163:59-76)，所以人IgG2CDC效应也较弱。显然，没有一种天然IgG亚型是非常适合构建FVIII-Fc融合蛋白的。为了得到不具效应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是对Fc片段上补体、受体结合域突变改造，调节Fc与相关受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，只保留功能蛋白的生物学活性和Fc段长效体内半衰期，而不产生细胞毒性。更多的非裂解性Fc变体所包含突变位点可以参见Shields RL等,J BiolChem,2001,276(9):6591-604或中国发明专利CN 201280031137.2。

与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体

IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH 6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian等,Nat.Rview Immunology7:715-725,2007)。韩国专利号KR 10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L 2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Paul R.Hinton等,J Immunol,2006,176:346-356)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加、清除率降低、皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等.MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267-273.)。

融合蛋白及其制备方法

本发明融合蛋白基因是密码子优化过的由人工合成方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便的用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法不限于人工合成或传统亚克隆等，具体方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，通过分段合成核苷酸序列再进行亚克隆的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明还提供了一种哺乳动物细胞的表达载体，包含编码本发明的融合蛋白序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

哺乳动物细胞表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员还可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。

根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。

本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO细胞，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的融合蛋白，可获得活性和稳定性良好的融合蛋白。

本发明还提供一种用重组DNA技术制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：

1)提供编码融合蛋白的核酸序列；

2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；

3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；

4)在适合表达的条件下培养转染宿主细胞；

5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。

将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，脂质体转染，电穿孔，微注射，病毒感染法，碱金属离子法。

有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM等，Dev Biol Stand 1996，86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集上清液。

可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一或特定条带。首先将表达上清浓缩,浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的介质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。还可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效剂量的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种辅形剂和稀释剂。

药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者体重、患者免疫状况、给药途径等。

附图说明

图1、纯化后融合蛋白SS-F8的SEC-HPLC峰谱图。

图2、纯化后融合蛋白SS-F8的SDS-PAGE电泳图。

图3、融合蛋白SS-F8对SD大鼠隐动脉出血时间的影响。

图4、融合蛋白SS-F8对SD大鼠血浆APTT的影响。

具体实施方式

实施例1、构建编码突变型单链FVIII融合蛋白的表达质粒

编码FVIII前导肽、B-结构域部分缺失的FVIII蛋白、柔性肽接头、CTP刚性单元和人IgG vFc变体的基因序列都是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，经人工合成获得。所合成融合蛋白全长DNA片段的5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和EcoRI，全长DNA片段插入至pUC57转移载体相应酶切位点间，并由DNA测序验证其序列。

将上述获得的融合蛋白全长基因片段从中间载体转移到自制表达质粒PXY1A1M的相应酶切位点间，得到融合蛋白高表达质粒。PXY1A1M质粒包含但不限于以下重要表达元器件：1)人巨细胞病毒早期启动子和哺乳动物细胞外源高表达所需增强子；2)双重筛选标记物，在细菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳动物细胞中具有G418抗性；3)鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达框，当宿主细胞为DHFR基因缺陷型时，氨甲蝶呤(MTX)能共扩增融合基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。再将融合蛋白表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，为了获得稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的筛选培养基，细胞以一定浓度(5000-10000个活细胞/孔)种植在96孔培养板里，培养10-14天直至大的离散细胞克隆出现。用ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平融合蛋白的孔。

本发明构建了一系列突变型单链FVIII融合蛋白，它含有不同长度的肽接头(Linker)、不同组成的CTP刚性单元以及几种不同亚型的IgG Fc变体(vFc)元件组成，以验证连接肽、Fc变体对突变型单链FVIII融合蛋白活性的影响。详见表1。各组成元件的氨基酸序列见序列表。

表1、各种单链FVIII融合蛋白组成

实施例2、筛选高表达融合蛋白的稳定转染细胞系

将上述融合蛋白的表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达突变型单链FVIII融合蛋白。为了维持稳定的高水平表达，优选的宿主细胞是DHFR缺陷型的CHO细胞(参见美国专利US 4,818,679)。一种优选转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂质体转染和微注射等。电穿孔方法应用设置为300V电压和1050μFd电容的GenePulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories公司)，往放置在比色杯内的2～3×10⁷个细胞中加入50μg PvuI线性化的表达质粒，电穿孔后的细胞转移至含30ml生长培养基的摇瓶中。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的生长培养基，细胞以一定浓度种植在96孔培养板里，培养10-12天直至大的离散细胞克隆出现。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子，然后通过极限稀释法亚克隆产生高水平表达融合蛋白的孔。

为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约1(较佳地约3)IU/10⁶(即百万)个细胞/24小时的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养，然后再用条件培养基纯化融合蛋白。

实施例3、生产融合蛋白

将实施例2优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300ml摇瓶中进行补料流加培养或通过每天更换培养基的办法模拟灌流培养。由实施例2筛选得到的生产融合蛋白SS-F8的CHO衍生的细胞株在300ml体积的摇瓶中补料流加培养14天，其表达的重组融合蛋白累积产量达到200mg/L，活细胞密度最高可达到15×10⁶个/mL。为了得到更多融合蛋白，也可以选用1000ml摇瓶培养。另一种培养方法，上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中每天更换培养基，其表达的重组融合蛋白每天累积产量约为20mg/L，在摇瓶中活细胞密度最高可达到30×10⁶个/mL。以上两种方法生产的重组融合蛋白的测定的生物学活性相当。

实施例4、纯化与定性融合蛋白

本发明主要采用四步层析法对融合蛋白SS-F8进行纯化。分别为亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析和分子筛层析(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA pure25M。本实施例中采用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析级)。

第一步，亲和层析：采用GE公司的VIII Select亲和层析介质进行样品捕获、浓缩以及部分污染物的去除。首先使用平衡buffer：10mM HEPES，150mM NaCl，25mM CaCl₂，0.05％Tween-80，pH 6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；将经过澄清后的发酵液以50-100cm/h的线性流速上样，载量不高于50000IU/ml；上样完毕后，使用平衡buffer：10mM HEPES，150mM NaCl，5mM CaCl₂，0.05％Tween-80，pH 6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer1：10mM HEPES，1M NaCl，25mM CaCl₂，0.05％Tween-80，pH 6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用平衡buffer：10mM HEPES，150mMNaCl，25mM CaCl₂，0.05％Tween-80，pH 6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用洗脱buffer：20mM His-HCl，25mM CaCl₂，0.02％Tween 80，45％丙二醇，pH 6.8-7.2，以不高于50cm/h的线性流速洗脱目标产物，收集目标峰。

第二步，阴离子交换层析：使用博格隆公司的Q-HP或其它市售的阴离子交换层析介质(例如GE的Q HP、TOSOH的Toyopearl GigaCap Q-650、天地人和的DEAE Beads 6FF，赛分科技的Generik MC-Q、Merck的Fractogel EMD TMAE、Pall的Q Ceramic HyperD F)进行中间纯化，分离结构变异体、进一步去除HCP、DNA等污染物。首先使用平衡buffer：20mMHis-HCl，100mM NaCl，10mM CaCl₂，0.02％Tween 80，pH 7.0-7.5，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；经第一步亲和层析分离得到的目标蛋白稀释5-10倍，降低有机物浓度后上样，载量控制在5000-10000IU/ml；上样完毕，使用平衡buffer：20mM His-HCl，100mM NaCl，10mM CaCl₂，0.02％Tween 80，pH 7.0-7.5，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用wash buffer：20mM His-HCl，500mM NaCl，10mMCaCl₂，0.02％Tween 80，pH 7.0-7.5，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)，去除部分杂蛋白，之后采用层级梯度的盐浓度进行洗脱，洗脱buffer：20mM His-HCl，1M NaCl，10mM CaCl₂，0.02％Tween80，pH 7.0-7.5，条件为洗脱buffer从50％和60％，洗脱3-5个柱体积(CV)，线性流速控制在不高于50cm/h，对洗脱组分进行分段收集，分别送样进行蛋白含量、SEC-HPLC、活性和HCP含量检测。经蛋白浓度测定，及蛋白活性测定。

第三步，疏水层析：使用博格隆公司的Butyl HP或其它市售的疏水层析介质(例如GE的Butyl HP、TOSOH的Toyopearl Butyl-650、天地人和的Butyl Beads 4FF，赛分科技的Generik MC30-HIC Butyl、Merck的Fractogel EMD Propyl)进行中间纯化，用于降低聚合体含量，第二步阴离子交换层析洗脱液中仍含有一定比例的聚合体，因为聚合体的形成原因多样，包括结构未改变的聚合和结构发生变化的聚合，它们的生物学活性差别较大，因此对于生物学活性的分析带来较大的干扰。目标蛋白聚合以后，聚合体和单体之间存在性质上的差异，包括电荷特性以及疏水性，我们使用疏水性的差异对二者进行分离。因为纯化最后步骤是分子筛层析，所以使用Butyl HP进行纯化，目标是部分去除聚合体，使其含量低于10％。首先，使用平衡buffer：20mM His-HCl，1.5M NaCl，5mM CaCl₂，0.02％Tween 80，pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；第二步阴离子交换层析分离得到的目标蛋白用buffer：2M(NH₄)₂SO₄调电导，然后上样，载量控制在<20000IU/ml；上样完毕后，使用平衡buffer：20mM His-HCl，1.5M NaCl，5mM CaCl₂，0.02％Tween 80，pH6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用wash buffer：20mM His-HCl，1.5M NaCl，5mM CaCl₂，0.02％Tween 80，pH 6.8-7.2，以50-100cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)，去除部分聚合体；最后进行目标蛋白洗脱，使用洗脱buffer：20mM His-HCl，5mM CaCl₂，0.02％Tween 80，50％乙二醇，pH 6.8-7.2，分别以20％、40％、100％洗脱buffer，以不高于60cm/h的线性流速洗脱3-5个柱体积(CV)，对洗脱组分进行分段收集，分别送检SEC-HPLC。将单体百分比大于90％的目标组分合并进行下一步层析。

第四步，分子筛层析：使用GE的superdex 200或其它市售的分子筛介质(例如博格隆公司的Chromdex 200prep grade)进行分离，目标是降低聚合体含量至<5％，并进一步降低关键污染物的含量。使用平衡buffer：10mM His-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl₂，10mM蔗糖，0.02％Tween80，pH 6.8-7.2，以20-40cm/h的线性流速冲洗层析柱2个柱体积(CV)；上样量不高于柱体积的3％，以20cm/h的线性流速冲洗，依次收集洗脱组份，SEC检测合并。

样品的SEC-HPLC纯度结果及SDS-PAGE电泳结果分见图1和图2，其中SEC-HPLC结果显示，纯化后融合蛋白的主峰纯度达98％以上；SDS-PAGE电泳带型符合预期，非还原电泳包含未加工融合蛋白条带(约390kDa)，在另一常见酶切位点E720处被切割而脱落两条重链片段后所形成的(LC-L-CTP-Fc)₂二聚片段(约210kDa)，以及LC-L-CTP-Fc单链片段(约100kDa)和HC片段(约90kDa)；还原后可得清晰的HC-LC-L-CTP-Fc(约190kDa)、LC-L-CTP-Fc(约105kDa)和HC(约90kDa)单链条带。得到的蛋白质组份的比活在6000-8000IU/mg。

实施例5.发色底物法间接测定融合蛋白体外活性

突变型单链FVIII融合蛋白的活性可采用发色底物法测定。本实施例采用BiophenFVIII:C试剂盒(HYPHEN BioMed，Ref.221402)测定，其检测原理如下：当被凝血酶激活后，FVIII:C在磷脂和钙离子存在下，与FIXa结合形成酶复合物，继而可激活因子X转变成其活性形式Xa。激活形成的因子Xa继而可使其特异性发色底物(SXa-11)发生裂解，释放发色基团pNA。在405nm下测定所产生pNA的量，即可知与其量直接成正比关系的FXa的活性大小，其中在体系中因子IXa和因子X的含量是一定且过量的，FXa的活性仅与FVIIIa的含量多少直接相关。以本法测定突变型单链FVIII融合蛋白的比活性约为6000-8000IU/mg。

实施例6、纯化的融合蛋白的稳定性研究

为进一步验证突变型单链FVIII融合蛋白在25度室温条件下稳定性，将突变型单链FVIII融合蛋白在25度室温条件下存放数天，考察该条件对融合蛋白活性的影响。

药品稳定性试验箱(购自上海—恒科学仪器)设置试验温度为25℃，湿度为75％。将稀释至相同浓度的SS-F8和双链八因子对照药物DS-F8(该融合蛋白保留了人野生型FVIII Arg1648和Glu1649间的蛋白酶剪切位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)各分装8支，每支200μl，放入药品稳定性试验箱保存。各取一支SS-F8和DS-F8分装蛋白，根据上述实施例5所述的方法，检测融合蛋白的活性，记为第一天(d1)的活性值。之后分别在室温条件(温度：25℃，湿度75％)下放置d3、d5、d7和d14后，分别检测突变型单链FVIII融合蛋白的活性。结果显示，25度室温条件下放置5天后，SS-F8仅下降约10％的蛋白活性，而DS-F8的蛋白活性下降了25％以上；室温放置7天中，DS-F8的活性降低速率较SS-F8而言更显著，且放置7天后SS-F8仍保有80％以上的蛋白活性，由此可见SS-F8融合蛋白的稳定性明显优于DS-F8。

实施例7、融合蛋白的药效学研究

血液凝固实际是一系列凝血因子的酶促反应，整个凝血过程分为三个阶段：第一阶段为血液凝血活酶形成；第二阶段凝血酶形成；第三阶段纤维蛋白形成，其中FVIII、FIX属于内源性凝血因子，而FVII是外源性凝血因子。出血时间是表示皮肤毛细血管被刺破后自然出血到自然止血所需的时间，通过观察突变型单链FVIII融合蛋白对SD大鼠隐动脉出血时间的影响来检测融合蛋白的促凝血作用。

选取7周龄的SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，随机分为2组。给药组以200IU/只单次静脉给予SS-F8，对照组给以相同体积的生理盐水。给药3h后，对大鼠进行诱导麻醉。对手术位置消毒处理后，由内脚踝往上约1cm位置处，经膝关节至腿根部动脉处剪开皮肤，分离皮下组织和血管上保护膜，依次暴露静脉血管、动脉血管和神经。在膝关节位置找到隐动脉及其分支，用显微直镊锐性分离静脉血管旁5mm*1mm处肌肉位置，从内侧挑起静脉、动脉及神经；用显微剪剪断隐静脉和隐动脉，不得触碰和损伤神经，看到血液涌出即为起始出血时间，记为t1。每隔30s观察一次出血部位，直到看到不出血位置，计为止血时间t2。计算t2-t1，记录出血时间。对数据进行统计分析，实验数据以均数±标差(Means±SD)表示，若数据符合正态分布，则采用SPSS 18.0软件，单因素方差分析或者student’s-test；若非正态分布，采用非参数检验Kruskal-wallis检验或者Mann-whitney检验，P≤0.05具有显著性差异，P≤0.01有非常显著性差异。

实验结果如图3所示，在预防给药后，SD大鼠手术导致隐动脉出血后，SS-F8与生理盐水组的出血时间有明显的统计学差异。在200IU/只剂量下，预防性给予受试药SS-F8对该出血模型有明显地止血作用。

实施例8、凝血法直接测定融合蛋白的生物学活性

通过测定活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)，观察SS-F8对SD大鼠血浆的体外抗凝血作用。

选取7周龄的SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，随机分为12组。将大鼠诱导麻醉后，在持续麻醉状态下，以手术刀沿腹部正中线划开，自腹部主动脉取血10-12ml。取上述血样，20℃下以1500rpm离心30min，分离上清血浆，分别加入到标记好的1.5ml离心管中。将全血浆与受试药物SS-F8和DS-F8按体积比6:1，分别配制成25-1000IU/ml浓度的待测样品，对照组按体积比6:1加入稀释液。以全自动血凝仪(CS-2000i，Sysmex公司)检测上述样品的APTT值。根据公式计算APTT变化率＝(给药组APTT值-对照组APTT值)/对照组APTT值，实验数据以均数±标差(Means±SD)表示，若数据符合正态分布，则采用SPSS18.0软件，单因素方差分析或者student’s-test；若非正态分布，采用非参数检验Kruskal-wallis检验或者Mann-whitney检验，P≤0.05具有显著性差异，P≤0.01有非常显著性差异。

从图4中可以看出，受试药SS-F8和DS-F8对正常大鼠的血浆有抗凝血作用，在高浓度1000IU/ml下，受试药DS-F8和SS-F8的APTT时间与溶剂对照组比较，分别下降了33.65％和31.86％；DS-F8和SS-F8的EC₅₀值分别是139.4IU/ml和115.6IU/ml，受试药SS-F8的EC₅₀值低于DS-F8，可以预见更低的给药剂量。随着各受试药浓度的增加，APTT的时间明显缩短，且有一定的量效关系。

虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导做出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可对本发明做各种修改或改动，这些等价形式同样落后于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 安源医药科技（上海）有限公司

旭华（上海）生物研发中心有限公司

<120> 突变型单链人凝血因子VIII融合蛋白及其制备方法与用途

<130> 2018

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2351

<212> PRT

<213> 全长FVIII氨基酸序列()

<400> 1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro

755 760 765

Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp

770 775 780

Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys

785 790 795 800

Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser

805 810 815

Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr

820 825 830

Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn

835 840 845

Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly

850 855 860

Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu

865 870 875 880

Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys

885 890 895

Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn

900 905 910

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900 905 910

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915 920 925

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930 935 940

Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val

945 950 955 960

His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu

965 970 975

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<211> 223

<212> PRT

<213> vFcγ2-3氨基酸序列()

<400> 7

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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 8

<211> 229

<212> PRT

<213> vFcγ4氨基酸序列()

<400> 8

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 9

<211> 1723

<212> PRT

<213> scFVIII融合蛋白氨基酸序列()

<400> 9

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

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Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

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740 745 750

Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Arg Thr Thr Leu

755 760 765

Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu

770 775 780

Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser

785 790 795 800

Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val

805 810 815

Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg

820 825 830

Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe

835 840 845

Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu

850 855 860

Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val

865 870 875 880

Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr

885 890 895

Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly

900 905 910

Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr

915 920 925

Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp

930 935 940

Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val

945 950 955 960

His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu

965 970 975

Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe

980 985 990

Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met

995 1000 1005

Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr

1010 1015 1020

Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp

1025 1030 1035 1040

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Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu

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Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His

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Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr

1125 1130 1135

Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala

1140 1145 1150

Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr

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Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile

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Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile

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Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser

1220 1225 1230

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1235 1240 1245

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1250 1255 1260

His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met

1265 1270 1275 1280

Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys

1285 1290 1295

Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met

1300 1305 1310

Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg

1315 1320 1325

Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln

1330 1335 1340

Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly

1345 1350 1355 1360

Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser

1365 1370 1375

Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys

1380 1385 1390

Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn

1395 1400 1405

Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln

1410 1415 1420

Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu

1425 1430 1435 1440

Ala Gln Asp Leu Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1445 1450 1455

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1460 1465 1470

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1475 1480 1485

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Val Glu Cys Pro

1490 1495 1500

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

1505 1510 1515 1520

Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

1525 1530 1535

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

1540 1545 1550

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

1555 1560 1565

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

1570 1575 1580

Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

1585 1590 1595 1600

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

1605 1610 1615

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1620 1625 1630

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

1635 1640 1645

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

1650 1655 1660

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

1665 1670 1675 1680

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

1685 1690 1695

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

1700 1705 1710

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

1715 1720

<210> 10

<211> 5169

<212> DNA

<213> scFVIII融合蛋白核苷酸序列()

<400> 10

gccaccagga ggtactacct cggagccgtc gagctcagct gggattatat gcagagcgac 60

ctcggagaac tccctgtcga tgccaggttt cccccccggg tgcccaagtc cttccccttt 120

aacacctccg tcgtctacaa gaagaccctg ttcgtcgagt tcacagacca tctgttcaat 180

attgctaaac ccaggccccc ctggatggga ctgctgggcc ccacaatcca agccgaggtg 240

tatgataccg tggtgatcac cctcaagaat atggcttccc atcccgtctc cctgcacgcc 300

gtcggcgtgt cctactggaa ggcctccgaa ggcgccgagt acgatgatca gacaagccag 360

cgggagaagg aggatgataa ggtctttccc ggaggttctc acacctatgt ctggcaggtg 420

ctgaaagaga acggccccat ggctagcgac cccctgtgcc tcacctattc ctacctcagc 480

catgtggacc tggtgaagga tctgaactcc ggcctgattg gcgccctcct ggtctgcagg 540

gagggaagcc tggccaaaga aaagacccag accctgcata aattcatcct cctgtttgcc 600

gtcttcgatg agggcaagtc ctggcactcc gaaacaaaga actccctgat gcaggacagg 660

gacgctgcct ccgccagggc ctggcccaag atgcacaccg tcaacggata cgtgaatagg 720

tccctccccg gcctgattgg atgccatcgg aagtccgtgt attggcacgt gatcggcatg 780

ggaaccacac ccgaagtgca ctccatcttc ctggaaggac atacatttct cgtccggaac 840

caccggcagg cttccctgga aatctcccct atcaccttcc tgaccgctca gacactgctg 900

atggatctgg gccagttcct gctgttctgc cacatttcct cccaccagca cgacggcatg 960

gaggcttatg tcaaggtgga tagctgcccc gaggaacccc agctgcggat gaaaaacaat 1020

gaggaagccg aggactacga cgatgacctc accgatagcg agatggacgt ggtcaggttc 1080

gacgacgata actccccttc cttcatccag atccggagcg tggccaagaa gcaccccaaa 1140

acctgggtgc actacatcgc cgctgaggag gaagactggg actatgctcc tctcgtgctg 1200

gcccccgatg acaggtccta caaaagccag tatctgaaca atggacccca gcggattgga 1260

aggaagtata agaaagtccg gtttatggct tacaccgacg agacctttaa aacccgggaa 1320

gccatccagc acgagagcgg catcctcggc cctctcctgt acggagaggt cggagacaca 1380

ctcctcatca tttttaagaa ccaggcctcc cggccctaca acatctatcc tcatggcatc 1440

accgatgtga ggcctctgta cagcaggagg ctgcccaaag gagtcaagca cctgaaagat 1500

ttccctatcc tccccggaga gatcttcaag tacaaatgga ccgtcaccgt ggaggacggc 1560

cccacaaagt ccgatccccg gtgcctgacc cggtactatt ccagctttgt caacatggag 1620

cgggacctcg ccagcggcct gatcggccct ctgctcatct gctataagga gtccgtcgat 1680

cagaggggaa accagatcat gtccgataag cggaatgtga tcctgttttc cgtgtttgac 1740

gaaaaccggt cctggtatct gaccgagaac atccagcggt ttctgcctaa ccccgctggc 1800

gtgcaactgg aagatcctga gttccaggct tccaatatca tgcacagcat caacggctac 1860

gtcttcgaca gcctgcagct gtccgtctgc ctgcacgaag tcgcctactg gtacattctc 1920

agcattggcg cccagacaga cttcctgtcc gtctttttct ccggctatac cttcaaacat 1980

aagatggtct acgaggatac cctcacactg ttccctttca gcggcgaaac cgtgtttatg 2040

agcatggaaa atcccggcct gtggatttta ggatgccaca actccgattt caggaatagg 2100

ggcatgacag ctctcctcaa agtgtcctcc tgcgacaaga acacaggcga ctactacgag 2160

gacagctatg aggatatttc cgcctacctg ctcagcaaga ataatgccat cgagcctagg 2220

tccttctccc aaaactcccg gcatcccagc acccggcaga agcagttcaa tgccaccaca 2280

attcctgaaa atagaacaac cctgcagtcc gaccaggagg aaatcgacta cgatgacacc 2340

atctccgtcg agatgaagaa ggaagacttc gacatctatg acgaggacga aaaccagagc 2400

cctcggtcct ttcagaaaaa aacacggcat tactttatcg ctgccgtcga acggctgtgg 2460

gactacggca tgagctcctc cccccatgtg ctccggaatc gggctcaatc cggctccgtg 2520

cctcagttta agaaggtggt gtttcaagag ttcaccgacg gcagctttac acagcccctg 2580

tacaggggag agctgaacga gcacctggga ctgctcggac cttacattcg ggccgaagtc 2640

gaggataaca tcatggtgac ctttaggaat caggcttccc ggccttactc cttctactcc 2700

agcctcatct cctacgaaga agaccaacgg cagggcgccg agcctcggaa gaatttcgtg 2760

aagcccaatg aaaccaaaac atacttttgg aaagtccagc accacatggc ccctaccaag 2820

gatgagttcg actgcaaagc ctgggcctat ttctccgatg tggatctgga gaaggacgtc 2880

cattccggac tgatcggccc cctcctcgtc tgccacacca acaccctcaa tcctgcccac 2940

ggcaggcagg tgacagtcca ggagttcgcc ctgtttttca ccatctttga cgagaccaag 3000

tcctggtact ttaccgagaa tatggaaagg aattgcaggg ccccctgcaa cattcagatg 3060

gaggacccca ccttcaaaga gaactaccgg tttcatgcca ttaatggata catcatggac 3120

acactgcccg gcctggtgat ggctcaggac caacggattc ggtggtacct gctgagcatg 3180

ggctccaacg aaaatatcca cagcatccac tttagcggcc acgtgtttac cgtgcggaag 3240

aaggaggagt ataaaatggc cctctacaac ctctatcccg gcgtgttcga aacagtcgag 3300

atgctcccta gcaaggccgg aatctggagg gtggaatgcc tgattggcga acatctgcac 3360

gccggaatga gcaccctctt cctggtctac agcaacaaat gtcagacccc tctgggcatg 3420

gcttccggcc acatcaggga ctttcagatt accgctagcg gacaatatgg ccagtgggcc 3480

cctaaactcg ctaggctgca ctacagcgga agcatcaacg cctggtccac aaaggaacct 3540

ttctcctgga tcaaggtgga tctcctcgcc cctatgatca tccatggcat caagacccaa 3600

ggcgctaggc agaagtttag ctccctgtac atcagccagt ttatcatcat gtactccctc 3660

gacggcaaga agtggcagac ataccgggga aactccacag gcaccctgat ggtgttcttt 3720

ggcaacgtgg acagcagcgg aattaagcat aatattttca accctcctat catcgccagg 3780

tacatccggc tgcaccctac acactacagc atcaggagca ccctgaggat ggagctgatg 3840

ggctgcgatc tgaatagctg ctccatgccc ctcggcatgg agagcaaggc tatttccgac 3900

gcccaaatta ccgccagctc ctatttcacc aacatgttcg ccacatggag ccctagcaaa 3960

gctcggctcc atctccaggg caggtccaac gcctggcggc ctcaggtgaa taatcccaaa 4020

gaatggctgc aggtcgactt ccagaagaca atgaaagtga ccggcgtgac cacccaggga 4080

gtcaaaagcc tcctcaccag catgtacgtc aaagagttcc tgatcagctc ctcccaggac 4140

ggacatcaat ggacactctt ttttcagaac ggcaaggtga aggtgttcca gggcaaccag 4200

gattccttta cccctgtggt caactcctta gatcctcccc tcctgacacg gtacctgcgg 4260

attcaccctc agtcctgggt gcatcagatc gctctgagga tggaagtgct cggctgcgaa 4320

gcccaagacc tgtacggatc cggtggcggt ggctccggtg gaggcggaag cggcggtgga 4380

ggatcaggcg gtggaggtag cggcggaggc ggtagctcca gctctagtaa agctccccct 4440

ccttccctgc cctcaccctc aagactgcct ggaccttccg acactcccat cctgccacag 4500

gtggagtgcc ctccatgtcc agcaccccct gtcgcaggtc catctgtgtt cctgtttcca 4560

cccaagccta aagaccagct gatgatctcc cgcaccccag aagtcacctg tgtggtcgtg 4620

gatgtgagcc atgaagaccc cgaggtccag ttcaattggt acgtggatgg cgtcgaggtg 4680

cacaacgcta agacaaaacc tagagaagag cagttcaact ctacctttcg cgtcgtgagt 4740

gtgctgacag tcgtgcacca ggactggctg aatggcaagg agtataagtg caaagtgagc 4800

aacaaaggac tgcctgcctc aatcgaaaag actatttcca agaccaaagg acagccaaga 4860

gagccccagg tgtacaccct gcctccaagc cgcgaagaga tgactaaaaa tcaggtctct 4920

ctgacctgtc tggtgaaggg gttttatcct agtgatatcg ccgtggaatg ggagtcaaac 4980

ggtcagccag agaacaatta caagaccaca ccccctatgc tggacagcga tgggtctttc 5040

tttctgtata gcaaactgac agtggacaag tctcggtggc agcagggtaa cgtcttctct 5100

tgcagtgtgc tgcacgaagc actgcacaat cattacaccc agaagtcact gtcactgagc 5160

ccaggaaaa 5169

<210> 11

<211> 1716

<212> PRT

<213> DS-F8融合蛋白氨基酸序列()

<400> 11

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His

740 745 750

Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile

755 760 765

Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp

770 775 780

Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

785 790 795 800

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly

805 810 815

Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser

820 825 830

Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser

835 840 845

Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu

850 855 860

Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr

865 870 875 880

Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile

885 890 895

Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe

900 905 910

Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His

915 920 925

Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe

930 935 940

Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro

945 950 955 960

Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln

965 970 975

Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr

980 985 990

Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro

995 1000 1005

Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe

1010 1015 1020

His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met

1025 1030 1035 1040

Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn

1045 1050 1055

Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg

1060 1065 1070

Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val

1075 1080 1085

Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val

1090 1095 1100

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe

1105 1110 1115 1120

Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly

1125 1130 1135

His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp

1140 1145 1150

Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp

1155 1160 1165

Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1170 1175 1180

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys

1205 1210 1215

Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe

1220 1225 1230

Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro

1235 1240 1245

Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile

1250 1255 1260

Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys

1265 1270 1275 1280

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile

1285 1290 1295

Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser

1300 1305 1310

Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln

1315 1320 1325

Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met

1330 1335 1340

Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser

1345 1350 1355 1360

Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln

1365 1370 1375

Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn

1380 1385 1390

Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu

1395 1400 1405

Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1410 1415 1420

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Gly Ser

1425 1430 1435 1440

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1445 1450 1455

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro

1460 1465 1470

Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr

1475 1480 1485

Pro Ile Leu Pro Gln Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1490 1495 1500

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu

1505 1510 1515 1520

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

1525 1530 1535

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

1540 1545 1550

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

1555 1560 1565

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn

1570 1575 1580

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser

1585 1590 1595 1600

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

1605 1610 1615

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

1620 1625 1630

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

1635 1640 1645

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

1650 1655 1660

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

1665 1670 1675 1680

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

1685 1690 1695

Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

1700 1705 1710

Ser Pro Gly Lys

1715

Claims (17)

1.一种人凝血因子VIII的融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次包含B-结构域部分缺失的突变型单链人凝血因子VIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分；其中，所述单链人凝血因子VIII氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；其中，延长半衰期部分选自免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgGFc变体)。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的，优选是通过在哺乳动物细胞(如，中国仓鼠卵巢细胞)中表达而糖基化的。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述B-结构域部分缺失的突变型单链人凝血因子VIII包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者所述单链人凝血因子VIII的氨基酸序列与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有至少90％的同一性。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头含有2个或多个选自G、S、A和T残基的氨基酸，

优选地，所述柔性肽接头具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1，

更优选地，所述柔性肽接头优选自下组：

(i)GSGGGSGGGGSGGGGS；

(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或其截短的序列，其中，所述截短的序列包含至少2个糖基化位点，优选地，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含以下氨基酸序列：

(i)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(ii)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(iii)SSSSKAPPPS；

(iv)SRLPGPSDTPILPQ。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元与权利要求5所述融合蛋白中的羧基末端肽刚性单元氨基酸序列至少具有70％，80％，90％或95％的同一性。

7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元。

8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgG Fc变体具有降低的ADCC效应和/或CDC效应和/或与FcRn受体的结合亲和力增强，优选地，所述Fc变体选自：

(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域；

(ii)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；

(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；

(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；

(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。

9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示。

10.如权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的活性>6000IU/mg。

11.编码如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的DNA，优选所述DNA的序列如SEQID NO：10所示。

12.一种载体，其特征在于，包含如权利要求11所述的DNA。

13.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求12所述的载体，或者转染了权利要求12所述的载体。

14.一种药物组合物，其特征在于，包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白。

15.一种如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的制备方法，所述方法包括：

(a)将权利要求11所述编码融合蛋白的DNA序列引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；

(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过1IU/10⁶(百万)个细胞的高产细胞株；

(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；

(d)收获步骤(c)得到的发酵液，并分离纯化融合蛋白。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中融合蛋白纯化过程包含亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析。

17.一种如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白在制备用于预防或治疗出血性疾病(例如，用于FVIII先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防或治疗、血友病A患者的自发或手术性出血的预防或治疗)的药物中应用。

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