CN106279436B - 活化的人凝血因子vii融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

活化的人凝血因子vii融合蛋白及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高糖基化的活化的人凝血因子VII(FVIIa)融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白从N端到C端依次包含人FVIIa、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(优选人IgG Fc变体)。该融合蛋白具有与天然人FVIIa类似的生物学活性，且具有更长的体内活性半衰期，从而改善药代动力学和药效。

Description

活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，更具体地，涉及一种活化的人凝血因子VII(FVIIa)融合蛋白及其制备方法和用途，特别是在用于制备治疗多种凝血相关疾病药物中的用途。
背景技术
FVII是一种维生素K依赖性的血浆糖蛋白，在肝脏中合成，并以分子量约为53KDa的单链蛋白酶原形式分泌到血液中(Broze等,J Biol Chem,1980,255:1242-1247)。FVII酶原在单一位点Arg152-Ile153处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为其活性形式FVIIa。活化的FVIIa包含NH2-末端衍生的轻链(约20KDa)和COOH-末端衍生的经由单一二硫键(Cys135至Cys262)连接的重链(约30KDa)。轻链含有细胞膜结合Gla结构域和两个“类表皮生长因子(EGF)结构域”，而重链含有丝氨酸蛋白酶催化结构域。处于活化形式时，FVIIa作为丝氨酸蛋白酶，参与凝血级联反应的外源性途径(extrinsic pathway)。在血友病治疗中使用FVIIa是基于FVIIa对于凝血酶活化的血小板表面低亲和性结合，通过给予药物学剂量的外源性FVIIa，使损伤位处血小板表面凝血酶产生被增强，这与FVIII/FIX存在无关，即绕开对于FVIIIa和FIXa的需求来起到止血作用。因此，FVIIa可用于产生抑制物的血友病患者出血性状况的预防和治疗。市售的重组凝血因子VIIa目前只有(Novo Nordisk，丹麦)。该药已在全世界范围内被批准用于治疗产生FVIII或FIX抗体(抑制物)的血友病A或B患者、先天性FVII缺陷的患者以及终止与外伤和/或手术相关的出血事件或预防出血。
然而，治疗性凝血蛋白药物包括FVIIa在内会被蛋白水解酶快速降解，并且易被抗体中和，这导致其体内循环半衰期大幅降低，由此限制了它们的疗效。重组FVIIa在人体内循环半衰期约为2.3小时，需要每隔2-3小时注射一次。
为了提高FVIIa的体内半衰期，由CSL Behring公司开发的rFVIIa-FP(白蛋白与FVIIa的C端融合)已完成临床I期研究，它在正常受试者中的血清半衰期与市售FVIIa相比提高了3-4倍(Golor G等,J Thromb Haemost,2013,11(11):1977-85)，生物学活性为620-770IU/mg，相当于69-75IU/nM(Weimer T等，Thromb Haemost,2008,99:659-667)。
FVIIa的聚乙二醇化脂质体制剂PEGLip-FVIIa(Omri公司开发)也处于临床早期，并且其血清半衰期仅为天然FVIIa的2倍。此外，由诺和诺德公司开发的N-糖基定点PEG化修饰FVIIa(N7-GP)相对rFVIIa延长了约5倍，但由于临床II期数据缺乏量-效线性关系且有受试者发生了过敏反应，该项目已终止研究(Ljung R等,J Thromb Haemost,2013,11(7):1260-8)。
由Biogen公司开发的rFVIIaFc单体-二聚体杂合型(monomer/dimer hybrid)融合蛋白仍处于早期研究阶段，研究显示Monomeric rFVIIaFc在A型血友病小鼠体内的终末半衰期为6.6小时，为对照组rFVIIa的5.5倍。在静脉注射rFVIIaFc 5分钟时，小鼠凝血活性即恢复至正常值的40％，然而在起始阶段其活性会急剧衰减，在给药后30分钟即下降到20％左右，给药后1小时已下降至约10％，这与在0～1小时的下降趋势相似。虽然给药1h后与rFVIIa相比，rFVIIaFc组活性下降趋势有所变缓，但在静注rFVIIaFc 8小时后，活性已降至1％左右，已低于凝血活性基线水平，无法有效止血。这暗示rFVIIaFc仅在短时间内可有效控制急性出血症状，并不能长期、平稳、有效地维持机体的正常凝血功能。体外凝血活性试验显示rFVIIaFc摩尔比活性为1115IU/nM，与(2511IU/nM)相比下降约60％，研究者认为这种活性降低是由于融合配体Fc的空间位阻效应引起的，这使得它与可溶性组织因子(sTF)的结合常数(Kd)下降(J.Salsa等,ThrombosisResearch,2015,135:970–976)。此外，本发明人之前构建的一种同源二聚体型rFVIIa-Fc，虽然其半衰期大幅延长，但也存在活性降低的问题，体外活性也仅为208-240IU/nM(中国发明专利号：CN104774269B)。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)β链的羧基末端肽(以下称其为CTP)也具有延长某些蛋白质体内半衰期的作用，因此有些专利文献公开的融合蛋白中包含的延长半衰期部分可以选择使用Fc、HSA、CTP或其他能延长半衰期的融合配体。例如，OPKO/Prolor公司开发的rFVIIa-CTP融合蛋白，rFVIIa分别串联1～5个CTP分子会以与CTP成比例的方式显著增加FVII的半衰期，当添加3、4或5个CTP分别使FVII半衰期延长了0.67、2和3倍；但CTP的添加降低了rFVIIa比活性，如rFVIIa-CTP3相对于的比活性(U/mg FVIIa)降低了约4倍(中国发明专利申请号：CN201380019660.8)。另外，CTP也可以作为接头序列，主要用于连接同一个蛋白质的不同亚基。例如，中国专利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公开的融合蛋白中，CTP作为接头，位于促卵泡激素的beta亚基和alpha亚基之间；专利WO2005058953A2公开的融合蛋白中，CTP作为接头，用于连接糖蛋白激素的beta亚基和alpha亚基。
本发明人发现，现有技术公开的长效rFVIIa都存在半衰期延长有限、生物活性显著降低或免疫原性强的问题，其原因主要是因为FVIIa的C端含有丝氨酸蛋白酶结构域(153-406残基)，因而C末端融合其他分子会影响FVIIa的催化活性及功能。另外，本发明人发现，在FVIIa和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)之间，仅通过一段较长的常规的柔性肽接头(例如(GGGGS)n)连接，反而使得融合蛋白对蛋白酶更为敏感，更糟糕的是这样长的肽接头还使得大部分融合蛋白以聚合体形式表达，几乎没有生物学活性。本发明人经过长期的研究，令人意外地发现了，采用柔性肽和CTP共同组成的接头分子连接FVIIa和延长半衰期部分(如，人IgG Fc)，能够最大程度地保留FVIIa的生物活性，并更显著地延长其体内活性半衰期。
发明内容
本发明目的是提供一种高糖基化的活化的人凝血因子VII融合蛋白，所述融合蛋白具有显著延长的半衰期且保持与重组人凝血因子VIIa(FVIIa)类似的生物学活性；另一方面，本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法与用途。
一方面，本发明提供了一种活化的人凝血因子VII融合蛋白(以下简称融合蛋白)，所述融合蛋白从N端至C端依次含有活化的人凝血因子VII(FVIIa)、柔性肽接头(表示为L)、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元(以下简称CTP刚性单元，表示为(CTP)n，较优地，n为1,2,3,4,或5)和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgG Fc变体(表示为vFc))。本发明的一些优选实施例中，所述融合蛋白表示为FVIIa-L-CTPn-vFc。
其中，所述人凝血因子VII的氨基酸序列与天然人凝血因子VII至少80％同源；更优选地，所述人凝血因子VII的氨基酸序列与天然人凝血因子VII至少90％同源；最优选地，所述人凝血因子VII包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
其中，FVIIa还包括于施药者体内被激活或于施药前被激活为FVIIa的以酶原形式存在的人凝血因子VII(简写为FVII)。
其中，所述柔性肽接头优选是非免疫原性的，并且在FVII和Fc之间产生足够的距离，使相互之间的位阻效应降至最低。较佳地，使用含有2个或更多个氨基酸残基组成的柔性肽接头，且选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。
更优选地，所述柔性肽接头包含G和S残基。连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。对本发明而言，所述肽接头可优选地包含以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。
具体地，本发明的实施例中，所述肽接头可优选地包含如下序列：
(i)L1：GSGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：2所示)；
(ii)L2：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：3所示)；
(iii)L3：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：4所示)；
(iv)L4：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(如SEQ ID NO：5所示)；
(v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(如SEQ ID NO：6所示)；
其中，所述CTP刚性单元选自由人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第113至145位氨基酸所组成的全长序列或其片段，具体地，所述刚性单元包含如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列或其截短的序列。
优选地，所述CTP刚性单元包含至少2个糖基化位点；例如，本发明的一优选实施例中，所述CTP刚性单元包含2个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的10个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*，或所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7C端的14个氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含3个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的16个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另一些实施例中，所述CTP刚性单元包含4个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含28、29、30、31、32或33个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第113、114、115、116、117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的28个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都代表本发明的独立实施方式。
在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少95％同源。
本发明的具体实施例中，所述CTP刚性单元可优选地包含如下序列：
(i)CTP1：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(如SEQ ID NO：7所示)；
(ii)CTP2：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(如SEQ ID NO：8所示)；
(iii)CTP3：SSSSKAPPPS(如SEQ ID NO：9所示)；
(iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ(如SEQ ID NO：10所示)。
本发明一些实施例中，所述融合蛋白包含1个上述CTP刚性单元。
本发明另一些实施例中，所述融合蛋白包含1个以上的上述CTP刚性单元，优选地，包含2，3，4或5个上述CTP刚性单元，如本发明的一实施例中，所述融合蛋白包含2个CTP3刚性单元：SSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3，或表示为(CTP3)2)。
其中，延长半衰期部分优选自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA Fc片段；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体的Fc片段；进一步地，所述人IgG Fc变体包含位于野生型人IgGFc中的至少一种氨基酸修饰，且变体具有降低的效应子功能(ADCC和/或CDC效应)和/或与新生儿受体FcRn的结合亲和力增强。进一步地，人IgG Fc变体可选自下组：
(i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列)；
(ii)vFcγ2-1：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列)；
(iii)vFcγ2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：13所示氨基酸序列)；
(iv)vFcγ2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：14所示氨基酸序列)。
(v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列)。
本发明所提供的IgG Fc变体包含但不限于(i)～(v)中所述5种变体，还可以是IgG同种亚型间两类功能变体突变位点的组合或叠加，如上述(iv)中所述变体即是由(ii)和(iii)中的突变位点相叠加所获得的新的IgG2Fc的组合变体。
本发明所述融合蛋白中的Fc变体(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数系统确定)含有氨基酸突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低，而且依旧是FcγR非结合子。IgG4Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比IgG1低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1降低的效应子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备FVIIa融合蛋白。而250和428位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc区与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能变体的相互组合或叠加，获得新的组合变体，使其效应子功能降低的同时且延长了其体内循环半衰期。本发明所述Fc变体包含却不局限于上述几个位点的突变，也可引入其它位点的替换使得Fc具有降低的效应子功能和/或与FcRn受体的结合力增强，同时还不会致使Fc变体功能/活性降低或引起不良的构象变化，常见的突变位点参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604。
本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示；
根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述融合蛋白的DNA。
本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：17所示。
根据本发明的再一个方面，提供一种载体，该载体包含上述DNA。
根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体，或者转染了上述的载体。
在本发明的实施例中，所述宿主细胞是CHO的衍生细胞株DXB-11。
根据本发明的再一个方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白。
根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产所述融合蛋白的方法，包含以下步骤：
(a)将编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生细胞系；
(b)筛选步骤(a)中每24小时期间内，表达超过3μg/106个细胞的高产量细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；
(d)收获步骤(c)得到的发酵液，纯化融合蛋白；
(e)激活步骤(d)中纯化的融合蛋白。
进一步地，所述步骤(a)中CHO衍生细胞系为DXB-11。
进一步地，所述步骤(d)中采用四步层析法对融合蛋白进行纯化，分别为ProteinA亲和层析、多维模式层析、阴离子交换层析和分子筛层析。
第一步Protein A亲和层析步骤，优选地使用市售的例如但不限于GE的MabselectTM、Mabselect SuReTM，或TOSOH的Toyopearl AF-rProteinA-650FTM，或博格隆的rProtein A BestaroseTM，或天地人和的rProtein A BeadTM，或赛分科技的MabPurixTM层析介质。它是利用融合蛋白的Fc片段(人IgG)与单克隆抗体特异性的结合进行捕获，因为亲和介质上的protein A配基对Fc段具有很高的亲和力，可以与其可逆的特异性结合。X射线晶体衍射分析显示，protein A和Fc片段结合位点中心一个高度保守的组氨酸残基六元环，在中性及碱性pH下这个组氨酸残基不带电，因为疏水作用紧紧的结合在一起。而当pH降低或者疏水性减弱以后，组氨酸残基带电后相互排斥或者Fc融合蛋白在溶剂中的溶解性增强时，与亲和介质结合的蛋白能够被洗脱下来。因此本发明第一步采用亲和层析可以快速高效的从发酵液中捕获并纯化融合蛋白。
第二步的多维模式层析步骤，优选地使用市售的例如但不限于Bio-Rad公司的CHTTM(陶瓷羟磷灰石I型或II型)层析介质(40μm或80μm)。融合蛋白N端存在10个可被羧基化的Glu残基，经羧基化后具有成对的负电荷。CHT介质为五个钙双联体和一对含羟基的磷三联体组按一个重复的几何图形排列，其中PO43－离子能与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，而Ca2+离子与融合蛋白的自由羧基上的成对的负电荷以金属螯合方式结合，且该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸钠浓度梯度竞争性洗脱。根据文献报道，FVIIa的羧基化程度与其生物学活性具有相关性(Hagen FS等，Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(8):2412-2416；美国专利US8304224；美国专利US2009/0042784)。所以本发明中经亲和层析捕获的融合蛋白使用CHT进行第二步纯化，以分离较高生物学活性的目标组分。
第三步的阴离子交换层析步骤，优选地使用市售的例如但不限于GE的QSepharose HPTM、Q Sepharose FFTM层析介质，或博格隆的Q Bestarose HPTM、Q BestaroseFFTM层析介质，或天地人和的Q Beads 6HPTM、Q Beads 6FFTM层析介质进行分离纯化，用于去除污染物。离子交换对分子的分离是基于它们表面净电荷的差异。分子的电荷性质差异较大，它们所带的总电荷、电荷密度以及表面电荷分布的差异会导致它们与加载电荷后的离子交换层析填料的结合能力不同。通过逐渐提高缓冲液中的NaCl浓度进行竞争性洗脱，可以将融合蛋白与污染物进行分离。
第四步的分子筛层析步骤，优选地使用市售的例如但不限于GE的Superdex200TM，或博格隆的Chromdex 200 prep gradeTM层析介质进行分离。分子筛层析主要是根据蛋白分子大小来进行分离的一种层析方法。分子筛介质是多孔的球状颗粒，当不同大小的蛋白(如同一种蛋白的单体和聚合体)通过装好的分子筛柱时，不同大小的蛋白在柱中所走的路径不同，大分子不能进入介质的小孔中，在柱中保留时间相对短，先洗脱出来；而小分子可以进入介质的小孔中，在层析柱中经过的路径要长，因此后洗脱出来。本发明中经上述三步层析分离得到的融合蛋白仍具有一定的聚合体组分，可能会影响其激活过程及激活后的生物学活性，因此采用分子筛层除去其中的聚合体组分。
进一步地，所述步骤(e)中的激活步骤可以通过凝血因子XII(FXII)激活、柱上自激活或溶液孵育自激活法对融合蛋白进行激活。FVII转变成活性的FVIIa需要在FXII的作用下完成(Hedner等,J Clin Invest,1983,71:1836-1841)，或者其他具有胰蛋白酶样活性的蛋白酶也可以激活FVII(Kisiel等,Behring Inst Mitt,1983,73:29-42)；FVII也可以不利用其他蛋白酶，仅靠FVII自身激活为FVIIa，即通过它的丝氨酸蛋白酶区域自激活。FVII还可以通过与带正电荷表面或者填料结合完成自激活，如阴离子交换填料(Pedersen AH等,Biochemistry,1989,28:9331-9336)。增加离子强度、降低PH，或者增加溶液中Ca2+的浓度可以使活化的FVIIa从正电荷表面或者填料上解离(Bjoern等,Research Disclosures,1986,269:564-56)。溶液条件下自激活参照美国专利US2007/0129298。
本发明一实施例中，采用溶液孵育自激活法对融合蛋白进行激活，活化的融合蛋白的活性>15000IU/mg。
根据本发明的再一个方面，提供了所述融合蛋白在制备用于治疗或预防出血性疾病的药物中应用。优选地，所述融合蛋白用于治疗FVII先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防或治疗，血友病A或B患者的自发或手术性出血的预防或治疗，或其它相关的出血性疾病药物中应用。
应理解，在本发明范围内，上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
本发明人发现，本发明所公开和/或所记载的融合蛋白及其制备方法的优点可以概括如下：
1、本发明构建的FVIIa融合蛋白，其Fc段是非裂解性的，即通过对Fc片段的补体、受体结合域进行突变，调节Fc与相应受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，而只保留Fc段延长活性蛋白体内半衰期的作用，却不产生细胞毒性。Biogen公司开发的FVIIa融合蛋白，其Fc段是天然来源的，可以预测由Fc介导的不良效应子功能必将会增加患者的治疗风险。
2、FVIIa融合蛋白在体内活性半衰期延长了约3倍，单次注射FP-A 3h后血浆凝血活性约40％，而等活性给药的诺其组3h后活性已降至3％；FP-A给药12h后血浆凝血活性仍保持在7％以上，与Biogen公司开发的单体-二聚体杂合型(Monomeric)rFVIIaFc(参见J.Salsa等,Thrombosis Research,2015,135:970–976)相比，具有更长的体内活性半衰期。而血清中药物浓度波动减少，安全性提高，可降低注射频率而提高患者的生活质量；
3、本发明构建的融合蛋白相对于Biogen公司构建的单体-二聚体杂合型(Monomeric)FVII融合蛋白，其表达、纯化步骤更加高效便捷、可大大降低生产成本。Biogen公司构建了rFVIIIFc与Fc的双表达载体，其中Fc分子以Flag标记(欧洲专利，公开号：EP1624891B1)。其所表达的融合蛋白发酵液中预期应含有三种形式的产物，分别是FVII-Fc:FVII-Fc同源二聚体型(Dimeric)融合蛋白、FVII-Fc:FLAG-Fc单体-二聚体杂合体(Monomeric)融合蛋白以及FLAG-Fc:FLAG-Fc二聚体三种产物。一方面，在融合蛋白表达过程中，因宿主细胞需同时表达FVII-Fc和Fc两种单链分子，再分别两两聚合形成上述三种产物，因而使最终目的产物的表达效率大大减弱；再者，在纯化过程中还必须去除另外两种形式的杂质，这使其纯化过程也更为复杂、生产效率低下，其生产成本也大大增加。因此，本发明的制备方法相对于Biogen公司开发的Monomeric rFVIIFc融合蛋白具有一定的技术优势和价格优势，其表达、纯化工艺都更简单、高效，生产成本也更低；
4、各批次纯化的融合蛋白的比活性至少可以达到15000IU/mg，约2949IU/nM(每个融合蛋白含有2个FVIIa，相当于1474.4IU/nM FVIIa)，还有一些批次的融合蛋白活性最高甚至超过22470IU/mg，换算为摩尔比活性约为4325IU/nM(每个融合蛋白含有2个FVIIa，相当于2162IU/nM FVIIa)，与已上市的重组FVIIa——诺其(2511IU/nM FVIIa)的活性相当，说明本发明提供的融合蛋白，其C端融合的Fc对FVIIa的活性影响极小；
5、组成所述融合蛋白的CTP刚性单元，它含有多个O-糖基侧链，能形成相对稳定的立体构象，可以有效地将FVIIa与Fc隔离开。另一方面，CTP刚性单元含有糖基，带负电、高度唾液酸化的CTP刚性单元能够抵抗肾脏的清除作用，进一步延长融合蛋白的半衰期；再一方面，CTP刚性单元糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解；
6、本发明提供的所述融合蛋白的制备方法，具有产量高的优点。本发明的一优选实施例中，在300ml摇瓶中连续培养14天，累积产量达到310mg/L，可进行工艺放大，实现大规模工业化生产。
发明详述：
柔性连接肽
连接肽长度对融合蛋白活性非常重要。WO2007090584A1专利中公开的一种FVII/FVIIa-白蛋白融合多肽，在FVII/FVIIa与白蛋白之间插入不同长度的连接肽，发现无连接肽的FVII/FVIIa融合蛋白的生物学活性显著下降，而含有连接肽的FVII/FVIIa-FP融合蛋白，显示其生物学活性的增加依赖于连接肽的长度，这可能解释为融合蛋白两部分间增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能，有利于形成更高比活性的构象。
本发明人此前设计了3种不同长度的由甘氨酸和丝氨酸组成的柔性连接肽，FVII通过该连接肽与其C端融合的Fc连接组成融合蛋白(不含CTP刚性单元)，瞬时表达实验表明，由2个氨基酸的短肽接头GlySer连接的融合蛋白几乎检测不到活性，表明维持FVIIa生物活性的重要功能区域在三维结构上受C端融合配体的影响较大。当连接肽增加到16个氨基酸时，FVIIa融合蛋白的生物活性明显提高，但仍远低于重组FVIIa。再当连接肽进一步延长至37个氨基酸时，CHO细胞所分泌的融合蛋白部分发生聚合，活性较低。这表明单纯通过延长连接肽的长度并不能完全解决Fc片段对FVIIa活性影响的问题。
hCG-β羧基末端肽(CTP)
CTP是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA等,Proc NatlAcad Sci USA,1992,89:4304-4308)。天然的CTP含有37个氨基酸残基，它具有4个O-糖基化位点，终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期。然而，本发明人创造性地将至少一个CTP多肽与适当长度的柔性连接肽连接，共同作为连接肽，用于连接FVII与延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)。
本发明人发现，FVIIa的C端催化功能域对其功能发挥极为关键，且FVIIa空间构象复杂、脆弱，融合配体的位阻效应极易对其正确折叠造成干扰。通过在FVIIa与Fc变体间增加CTP刚性单元，相当于增加了一段刚性连接肽。这一方面保证了N-端融合的FVIIa不会影响Fc变体与FcRn的结合位点，从而影响半衰期；另外Fc的Protein A结合位点对于制备工艺中纯化步骤很重要，连接CTP刚性单元保证N-端融合的FVIIa也不会“罩住”它与protein A的结合位点。另一方面，CTP刚性单元的添加也使得约25KD大小的Fc片段不会干扰N-端融合的FVIIa的正确折叠，造成其生物学活性/功能的下降或丧失。同时还证实单纯延长柔性连接肽的长度并不能改善Fc段对FVIIa活性的影响，过长的连接肽还会造成多聚体的形成以及对蛋白酶敏感性增加而易被降解，而CTP刚性单元的加入使得融合蛋白的生物学活性显著提高。这可能解释为具有多个糖基侧链的CTP刚性多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻隔”作用促使FVIIa和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解。
IgG Fc变体
非裂解性Fc变体
Fc元件来源于免疫球蛋白IgG的恒定区Fc片段，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc介导的IgG的效应子功能发挥通过两种机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q结合，引发补体依赖性细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力较低，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。此外，人IgG1和IgG3还能有效结合C1q而激活补体级联反应。人IgG2与C1q结合相对弱，而IgG4不与C1q结合(Jefferis R等,Immunol Rev,1998,163:59-76)，所以人IgG2CDC效应也较弱。显然，没有一种天然IgG亚型是非常适合构建FVIIa/Fc融合蛋白的。为了得到不具效应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是对Fc片段上补体、受体结合域突变改造，调节Fc与相关受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，只保留Fc的长循环半衰期特性，而不产生细胞毒性。更多的非裂解性Fc变体所包含突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604或中国发明专利CN 201280031137.2。
与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体
IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH6.0时结合，在pH7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian等,Nat.Rview Immunology7:715-725,2007)。韩国专利号KR 10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L 2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Paul R.Hinton等,J Immunol,2006,176:346-356)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射方式给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加，清除率降低，皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等.MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267-273.)。
融合蛋白及其制备方法
本发明融合蛋白基因是密码子优化过的由人工合成方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便的用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法不限于人工合成或传统亚克隆等，具体方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，通过分段合成核苷酸序列再进行亚克隆的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞的表达载体，包含编码本发明的融合蛋白序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
哺乳动物细胞表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员还可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO细胞，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的融合蛋白，可获得活性良好，稳定性良好的融合蛋白。
本发明还提供一种用重组DNA技术制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包含：
1)提供编码融合蛋白的核酸序列；
2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转染宿主细胞；
5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物；
6)激活融合蛋白。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，脂质体转染，电穿孔，微注射，病毒感染法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM等，Dev Biol Stand 1996，86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集上清液。
有关融合蛋白的激活方法，可以通过凝血因子XII(FXII)激活、柱上自激活或溶液孵育自激活法对融合蛋白进行激活。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。首先将表达上清浓缩，浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的介质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。还可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效剂量的(160～360μg/kg)本发明所述融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包含各种辅形剂和稀释剂。
药学上可接受的载体包含(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包含但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者体重、患者免疫状况、给药途径等。
附图说明
图1、根据本发明实施例在PCDNA3表达载体内SpeI-EcoRI(酶切位点以下划线标注)片段的FP-A的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。人FVII由信号肽(1-38，以下划线标注)和成熟FVII蛋白(39-444)构成。成熟的融合蛋白含有hFVII(39-444)、柔性肽接头(445-471，以下划线标注)、CTP刚性单元(472-499，以下划线标注)和Fc变异体(500-722)。
图2、FP-A经MabSelect层析SEC检测结果。
图3、FP-A经CHT层析分离目的组分P3SEC检测结果。
图4、FP-A经MabSelect分离组分和经CHT层析分离组分P1、P2和P3的SDS-PAGE电泳图。
图5、FP-A经Q-HP层析洗脱组分P3的SEC检测结果。
图6、FP-A经Superdex 200层析洗脱组分P3-3SEC检测结果。
图7、P3-3组分激活40h的SEC检测结果。
图8、P3-3组分激活16～40h后还原SDS-PAGE电泳检测结果。
图9、小鼠出血时间结果统计图。注：*p<0.01，***p<0.001。
图10、小鼠出血量结果统计图。注：**p<0.01，***p<0.001。
图11、HemA小鼠等活性给予FP-A和诺其1h和2h后出血时长比较。注：与HA-N-1h组相比，*P＜0.05，***P＜0.01；与C57-NS组相比，#P＜0.05，###P＜0.01。
图12、FP-A及诺其在华法林大鼠上的活性半衰期。
具体实施方式
实施例1.构建编码FVII融合蛋白的表达质粒
编码FVII前导肽、成熟蛋白、柔性肽接头、CTP刚性单元和人IgG vFc变体的基因序列是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，经人工合成获得。所合成融合蛋白全长DNA片段的5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和EcoRI，全长DNA片段插入至pUC57转移载体相应酶切位点间，并由DNA测序验证序列。然后再将上述获得的融合蛋白全长基因片段从中间载体转移到以PCDNA3.1为模板并改造后的表达质粒PTY1A1的SpeI(5’)和EcoRI(3’)位点间，得到融合蛋白高表达质粒。PTY1A1质粒包含但不限于以下重要表达元器件：1)人巨细胞病毒早期启动子和哺乳动物细胞外源高表达所需增强子；2)双重筛选标记物，在细菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳动物细胞中具有G418抗性；3)鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因表达框，当宿主细胞为DHFR基因缺陷型时，氨甲蝶呤(MTX)能共扩增融合基因和DHFR基因(参见美国专利US4,399,216)。再将融合蛋白表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，为了获得稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的筛选培养基，细胞以一定浓度(5000-10000个活细胞/孔)种植在96孔培养板里，培养10-14天直至大的离散细胞克隆出现。用ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平融合蛋白的孔。
如下表所示，本发明构建了一系列rhFVII融合蛋白，它含有不同长度的肽接头(Linker)、不同组成的CTP刚性单元以及几种不同亚型的IgG Fc变体(vFc)元件组成。为了验证含有至少1个，并且不同长度的CTP刚性单元均能显著提高融合蛋白的活性，我们构建了融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D和FP-E；其中，FP-A的氨基酸及编码核苷酸如图1所示。为了验证CTP刚性单元对融合蛋白活性的重要性，我们还同时构建了不含CTP刚性单元的两种Fc融合蛋白FP-G和FP-H，表达质粒构建方法同上。此外，我们还构建了CTP位于Fc C端的FP-F，以验证CTP刚性单元位置的重要性。详见表1。各组成元件的氨基酸序列见序列表。
表1、各种FVII融合蛋白组成
实施例2.瞬时表达各融合蛋白和活性测定
将实施例1得到的8种表达质粒，在30ml的摇瓶里使用DNAFect LT试剂TM(ATGCell公司)转染3×107CHO-K1细胞，经转染的细胞在含有1000ng/ml维生素K1的无血清生长培养基中生长5天，测定上清液中融合蛋白的浓度，并用实施例7或8中描述的方法测定其活性。ELISA结果显示8种质粒在该条件下的瞬时表达量(物质的量)相似，但是它们凝血活性却显示出较大差别。其中，我们将FP-A的摩尔比活性定义为100％。FP-F、FP-G和FP-H质粒表达的融合蛋白上清液活性较低，仅为FP-A的29.4％、26.3％和41.2％，纯化蛋白用SDS电泳分析，显示这三种融合蛋白部分呈不同程度的聚合现象；而FP-B、FP-C、FP-D和FP-E的活性分别为FP-A的98.0％、89.2％、86.1％和92.9％。表明仅靠延长肽接头并不能有效改善融合蛋白的活性，即彼此的空间位阻效应并不能随着柔性肽接头的延伸而显著削弱。甚至，过长的肽接头不仅不能提高融合蛋白的活性，反而会使蛋白错误折叠，以无活性的多聚体形式分泌(FP-H发酵液中产物多为聚合体)。我们推测原因，过长的柔性肽接头，给了FVIIa更高的灵活度，使其能相对Fc自由转动，这可能使FVIIa的立体结构更加靠近Fc区，而在二者之间加入CTP刚性单元，一方面相当增加了一段刚性肽接头，使彼此远离，更重要的是CTP刚性单元含多个糖基侧链，相对于柔性肽接头的无规则卷曲形态，CTP刚性单元可以形成固定的空间构象，能够有效地分开融合蛋白的不同功能区，这更有利于两部分独立折叠成正确的三维构象，保持了较高的活性。我们通过FP-A和FP-F的活性比较验证了这种推测的正确性，即CTP刚性单元置于Fc C端的FP-F的活性仅为CTP刚性单元置于Fc N端的FP-A的29.4％，FP-F的活性与不含CTP刚性单元的FP-G相似。以上结果，证实CTP刚性单元对融合蛋白的活性极为关键，并且CTP刚性单元置于Fc的N端能有效提高融合蛋白的活性。
实施例3.筛选高表达融合蛋白的稳定转染细胞系
将上述FP-A、FP-B、FP-C、FP-D和FP-E的表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达FVII融合蛋白。为了维持稳定的高水平表达，优选的宿主细胞是DHFR缺陷型的CHO细胞(美国专利No.4818679)。一种优选转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂质体转染和微注射等。电穿孔方法应用设置为300V电压和1050μFd电容的GenePulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories公司)，放置在比色杯内的2～3×107个细胞中加入50μg PvuI线性化的表达质粒，电穿孔后的细胞转移至含30ml生长培养基的摇瓶中。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的生长培养基，细胞以一定浓度种植在96孔培养板里，培养10-12天直至大的离散细胞克隆出现。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子，也可用抗FVII的ELISA分析方法进行融合蛋白表达的定量测定，然后通过极限稀释法亚克隆产生高水平表达融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约3(较佳地约5)IU/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系使用无血清培养基进行适应性悬浮培养，然后再用条件培养基纯化融合蛋白。
实施例4.生产融合蛋白
将实施例3优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300ml摇瓶中进行补料流加培养或通过每天更换培养基的办法模拟灌流培养。由实施例3筛选得到的生产融合蛋白FP-A的CHO衍生的细胞株在300ml体积的摇瓶中补料流加培养14天，其表达的重组融合蛋白累积产量为310mg/L，活细胞密度最高可达到15×106个/mL。为了得到更多融合蛋白，也可以选用1000ml摇瓶培养。另一种培养方法，上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中每天更换培养基，其表达的重组融合蛋白每天累积产量约为50mg/L，在摇瓶中活细胞密度最高可达到25×106个/mL。以上两种方法生产的重组融合蛋白的生物学活性相当。
实施例5.纯化与定性融合蛋白
本实施例中以FP-A为例，具体描述上述实施例获得的几种融合蛋白纯化步骤及方法，FP-B、FP-C、FP-D和FP-E方法相同，实施例中不再赘述。
本发明主要采用四步层析法对融合蛋白进行纯化。分别为亲和层析、多维模式层析、阴离子交换层析和分子筛层析。
第一步，亲和层析使用发明内容部分所述的层析介质进行样品捕获。首先使用平衡buffer：20-50mM Tris-HCl,150-500mM NaCl,pH6.8-7.2，平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；经过澄清后的发酵液上样，载量不高于30g/L；使用平衡buffer：20-50mM Tris-HCl,150-500mM NaCl,pH6.8-7.2，平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer：20mM Tris，1.5-2M NaCl，0.5-2M尿素，5-10mM(EDTA)2Na，pH6.5-7.0冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用平衡buffer：20-50mM Tris-HCl,150-500mM NaCl,pH6.8-7.2，平衡层析柱3-5个柱体积(CV)后；使用洗脱buffer：100mM Gly-HCl，150-300mMNaCl，pH3.0-3.5洗脱目标产物，直接加入到1M Tris，pH8.0中，中和pH值至中性。
融合蛋白经第一步Mabselect亲和层析纯化后的SEC分析结果如图2所示。
第二步，多维模式层析使用发明内容部分所述的Bio-Rad公司的CHT陶瓷羟磷灰石骨架的层析介质进行样品捕获。首先使用平衡buffer：20-50mM PB，pH6.8-7.2，平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；经过亲和层析捕获的样品上样，载量不高于10g/L；使用平衡buffer：20-50mM PB，pH6.8-7.2，平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份，命名为P1；使用洗脱buffer 1：120mM PB，pH6.8-7.2冲洗层析柱3-5个柱体积，收集洗脱组分，命名为P2；使用洗脱buffer2：200mM PB，pH6.8-7.2冲洗层析柱3-5个柱体积，收集洗脱组分，命名为P3。分离得到的P1、P2和P3组分分别激活后，体外测定其比活性分别为103.2、3026.7和5705.7IU/mg，说明不同洗脱组分之间存在差异，体现了羧基化程度的差异。
融合蛋白FP-A经第二步CHT层析分离目的组分P3的SEC检测结果如图3所示。MabSelect分离组分和CHT层析分离组分P1、P2和P3的SDS-PAGE电泳结果见图4。
第三步，阴离子交换层析使用发明内容部分所述的层析介质进一步分离纯化。使用平衡Buffer：20-50mM Tris-HCl，pH7.5-8.0平衡层析柱3-5个柱体积；CHT层析的P3洗脱组份上样，载量不高于30g/L；使用平衡Buffer：20-50mM Tris-HCl，pH7.5-8.0平衡层析柱3-5个柱体积；使用线性梯度洗脱方式洗脱目标组份，洗脱buffer：20mM Tris-HCl，500mMNaCl,pH7.5-8.0，洗脱的流速为60cm/h，梯度为25-30个柱体积。结果显示，色谱峰为单峰，我们收集的部分为最高紫外吸收的1/3以上的部分，这部分的SEC检测结果见图5。
第四步，分子筛层析使用发明内容部分所述的层析介质进行分离，首先用平衡buffer：100mM Hepes,100mM NaCl,pH8.0平衡层析柱1.5-2个柱体积；上样量不高于柱体积的2％；使用平衡buffer：100mM Hepes,100mM NaCl,pH8.0，以30cm/h的流速洗脱，放弃前段的聚合体峰，收集单体峰的上升段、中段和下降段(以色谱峰的最高紫外吸收的1/2为限)，分别命名为P3-2、P3-3、P3-4。其中P3-3组分的SEC检测结果见图6。
实施例6.融合蛋白体外激活
本发明通过溶液孵育自激活法对融合蛋白进行激活。将分子筛层析分离得到的融合蛋白单一组分P3-3加载于30kDa超滤浓缩管(Corning，货号431489)，然后以台式高速低温离心机(Eppendorf，型号5810R)离心，更换缓冲液为20mM PB，0.3M NaCl，5mM CaCl2，pH7.0-7.2，并浓缩至蛋白浓度为3-5mg/ml(采用消光系数法定量)，置于4℃进行激活，激活时间16～40小时。激活结束利用G-25脱盐柱，将其置换到buffer：20mM PB，pH7.0中，-80℃冻存备用。
采用本发明实施例7或8所述生物学活性测定法和还原性SDS-PAGE检测层析分离组分体外激活不同时间的激活程度。不同激活时间的生物学活性结果见表2；P3-3组分在激活过程中取样，16～40h激活产物的还原型SDS-PAGE检测结果见图8，及其激活40小时的SEC检测结果见图7。可知，P3-3经40小时激活的活化程度最高。SDS-PAGE还原胶电泳显示FP-A经实施例5中四步层析分离获得的P3-3组分被激活后主要呈现两条主带，分别是约74.3KDa的HC-L-CTP-Fc(与FVIIa重链相连的柔性肽接头、CTP刚性单元和IgG Fc段部分)和约24.0KDa的LC(FVIIa的轻链部分)。
表2、P3-3组分激活16-40h的生物学活性检测结果
实施例7.生色底物法间接测定融合蛋白的生物学活性
本发明采用HYPHEN BioMed公司生产的BIOPHEN FVII生色试剂盒(Ref:A221304)测定由实施例6所示方法激活的各融合蛋白的体外酶活性。该试剂盒测定原理为生色底物法，FVIIa是一种在外源性凝血途径起作用的丝氨酸蛋白酶，当FVIIa与组织因子结合后，在磷脂和Ca2+存在条件下，可激活凝血因子FX，使其转变为活性形式FXa。待测定的融合蛋白首先与来源于兔的促凝血酶原激酶的组织因子形成酶复合物，然后激活反应体系中一定浓度的(过量)凝血因子FX，使其转化为活性形式FXa，FXa作用于反应体系中特异性显色底物SXa-11，使底物裂解并产生pNA，所产生pNA量直接与FXa的活性成正相关性。在405nm处用比色计测定所释放的pNA浓度，即可知测试样本中FVIIa以及FXa活性之间的对应关系，以此计算出FVIIa的活性大小，用正常人的血浆作为标准品。
实施例8.凝血法直接测定融合蛋白的生物学活性
凝血法测定FVIIa生物学活性是通过纠正FVIIa因子缺乏血浆所导致凝固时间延长的能力而获得的。采用法国STAGO公司生产的试剂盒FVII(Cat.No.00743)。检测方法首先是将稀释的已知FVII活性的正常人冻干血浆(Unicalibrator,Cat.No.00625)与乏VII基质血浆混合，测定凝血酶原时间(PT)，建立标准曲线，再将待测血浆适度稀释后与乏FVII基质血浆混合，进行PT测定。通过标准曲线所拟合的活性百分比C(％)与PT时间t(s)的对数方程，可测得待测样本FVIIa的活性多少，其结果用正常血浆的百分比来表示(％)，试剂盒中所提供的标准品百分比活性(％)与国际酶活单位IU的对应关系为100％＝1IU，据此可求算出待测样品FVII的酶比活性大小，单位为IU/mg。
各层析步骤分离组分体外激活24h的生物活性测定结果见表3。其中，四步层析最终获得的目的组分P3-3激活16-40h的活性数据见表2。经纯化获得的FP-A有效单一组分P3-3激活40h的生物学活性为22470IU/mg，换算为摩尔比活性约为4417IU/nM(每个融合蛋白含有2个FVIIa，相当于2208.7IU/nM FVIIa)，与已上市的重组FVIIa——诺其(2511IU/nMFVIIa)的活性相当，说明本发明提供的融合蛋白，其C端融合的Fc对FVIIa的活性影响极小。其活性同时也显著高于其他已报道的重组FVIIa的活性，例如，CSL Behring公司报道的HEK细胞生产的重组hFVII生物学活性为2874IU/mg，相当于144IU/nM。而其用HEK或CHO细胞生产的融合蛋白hFVII-FP的生物学活性为620-770IU/mg，相当于69-75IU/nM(Weimer T等，Thromb Haemost,2008,99:659-667)。
表3、各层析步骤分离组分体外激活24h的生物活性测定结果
实施例9.FP-A对血友病A小鼠急性出血的止血作用
我们以FVIII因子基因剔除纯合子甲型血友病小鼠(hemophilia A，HA,购自上海南方模式生物研究中心)断尾出血模型(tail vein transection(TVT)bleeding model)评估实施例5中所制备的活化的融合蛋白FP-A(单一组分P3-3)在HA小鼠体内的止血活性。选取10-12周龄雄性HA小鼠(购自上海南方模式生物研究中心)，适应性饲养一周后将小鼠随机分为5组，每组8只。以0.8％戊巴比妥钠(Sigma公司)按照0.1ml/10g剂量腹腔注射麻醉小鼠，然后分别尾静脉注射7,000(HA-F-0.7W组)、21,000(HA-F-2.1W组)、70,000(HA-F-7W组)和210,000IU/kg(HA-F-21W组)的FP-A和100,000IU/kg的诺其(Novo Nordisk公司)(HA-N组)。给药5分钟后，在小鼠尾末梢处剪断，切断处直径为3mm，迅速将尾端浸入装有14mL、37℃，含0.1％BSA(Amresco公司)生理盐水(0.9％NaCl，NS)的离心管中，并开始计时。如果出血在30分钟内停止，记录出血时间。如果出血时间超过30分钟，结扎鼠尾并用滚烫的金属棒灼烧止血，出血时间记作1800秒。同时，计算失血量。失血量(ml)＝(采血后离心管重量(g)-采血前离心管重量(g))/1.05。另以10-12周龄，野生型雄性C57BL/6J(购自上海南方模式生物研究中心)小鼠(n＝8)静注给予生理盐水(购自湖南科伦制药有限公司)作为正常对照组(C57-NS组)，操作方法同给药组。所有数据以均数±标准误差表示，各实验组间比较采用t-test检验分析，分析软件采用Graphpad Prism 5.0，p<0.05认为有统计学意义。
从图9和图10中各组动物的出血时间和出血量的统计结果分析，HA小鼠给予70,000IU/kg FP-A 5分钟后，其出血时间和出血量与C57-NS组接近，促凝效果明显，说明FP-A可以作为血友病等凝血因子缺乏症发生急性出血情况的有效凝血剂；小鼠给药FP-A 210,000IU/kg后，在出血时间和出血量上同样与C57-NS组接近。与FP-A 7,000IU/kg给药组比较，FP-A 70,000IU/kg组或FP-A210,000IU/kg组的出血时间显著缩短(p<0.001；p<0.001)，出血量也显著减少(p<0.001；p<0.01)，具有一定的剂量-效应关系(详细结果见表4和表5)。
表4、出血时间数据统计表(单位：秒)
注：组1(C57-NS)：C57BL/6J小鼠给予生理盐水组；组2(HA-N)：HA小鼠给于10,000IU/kg诺其组；组3(HA-F-0.7W)：HA小鼠给于FP-A 7,000IU/kg组；组4(HA-F-2.1W)：HA小鼠给于FP-A 21,000IU/kg组；组5(HA-F-7W)：HA小鼠给于FP-A 70,000IU/kg组；组6(HA-F-21W)：HA小鼠给于FP-A 210,000IU/kg组。
表5、出血量数据统计表(单位：mL)
注：分组同表4。
实施例10.FP-A在血友病A小鼠体内凝血作用的长效性研究
本实验是为了考察FP-A(单一组分P3-3激活后样品)对HA小鼠体内凝血作用的长效性。16-20周龄雄性HA小鼠(购自上海南方模式生物研究中心)适应性饲养一周后，随机分为3组，每组6只。其中两组给予300,000IU/kg的FP-A，另一组给予300,000IU/kg的诺其(Novo Nordisk公司)。同时以16-20周龄，野生型雄性C57BL/6J小鼠(购自上海南方模式生物研究中心)尾静脉注射给予生理盐水，作为正常对照组(n＝6)。给予FP-A的两组HA小鼠分别于给药后1h和2h进行断尾试验；给予诺其的HA小鼠于给药后1h进行断尾试验；C57BL/6J正常对照组(C57-NS组)小鼠于注射后2h进行断尾试验。具体操作方法参照实施例9。所有数据以均数±标准误差表示，各实验组间比较采用t-test检验分析，分析软件采用Graphpad Prism 5.0，p<0.05认为有统计学意义。
如图11所示，诺其组给药1h后，小鼠出血时间为30分钟，说明它已无促凝止血效果(HA-N-1h组)，而给予FP-A 1h(HA-F-1h组)和2h后(HA-F-2h组)仍然能有效止血，出血时间均比诺其组显著缩短(P<0.01；P<0.05)。这说明FP-A相对于诺其具有显著延长的活性半衰期。具体数值参见表6。
表6、出血时间数据统计表(单位：s)
实施例11.FP-A的体内活性半衰期研究
本实验为考察FP-A(单一组分P3-3)在华法林致大鼠凝血障碍模型上的活性半衰期。依文献报道的方法(Joe Salas等,Thrombosis Research,2015,135(5):970-976或Gerhard Dickneite等,Thrombosis Research,2007,119:643-651)进行实验，选取8-12周龄200-220g SD大鼠16只(购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001)，将大鼠随机分为2组，每组8只。以2.5mg/kg华法林(Orion Corporation，Finland，批号：1569755)灌胃，24h后分别静脉给予10,000IU/kg的FP-A或诺其(Novo Nordisk公司)。FP-A组于给药后0.05、0.5、1、2、3、5、8、12h采血；诺其组于给药后0.05、0.5、1、2、3、5h采血。血样以终浓度0.013M的柠檬酸钠为抗凝剂，3000rpm离心10min取上清，按实施例8进行样品活性测定并计算活性半衰期。
如图12所示，测得FP-A的活性半衰期为3.03±0.35h；诺其的活性半衰期为1.01±0.16h。相比等活性的诺其，FP-A在大鼠体内活性半衰期延长了约3倍，单次注射FP-A 3h后血浆凝血活性约40％，而等活性给药的诺其组3h后活性已降至3％；FP-A给药12h后血浆凝血活性仍保持在7％以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (22)

1.一种活化的人凝血因子VII的融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次包含活化的人凝血因子VII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分；其中，延长半衰期部分选自人免疫球蛋白Fc片段或其变体、白蛋白、转铁蛋白或PEG，
其中，所述柔性肽接头具有以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1；且所述人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元包含以下氨基酸序列：
(i)SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(ii)PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(iii)SSSSKAPPPS；
(iv)SRLPGPSDTPILPQ。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是糖基化的。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通过在哺乳动物细胞中表达而糖基化的。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达而糖基化的。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人凝血因子VII的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性肽接头优选自下组：
(i)GSGGGSGGGGSGGGGS；
(ii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iii)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iv)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1、2、3、4或5个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc变体具有降低的ADCC效应和/或CDC效应，和/或与FcRn受体的结合亲和力增强。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc变体选自：
(i)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域；
(ii)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(iii)含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(iv)含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(v)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域。
10.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：16所示。
11.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的活性>15000IU/mg，和/或，所述融合蛋白在动物体内循环半衰期至少延长1倍。
12.编码如权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白的DNA分子。
13.如权利要求12所述DNA分子，所述DNA分子的序列如SEQ ID NO：17所示。
14.一种载体，其特征在于，包含如权利要求12或13所述的DNA分子。
15.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求14所述的载体，或者转染了权利要求14所述的载体。
16.一种药物组合物，其特征在于，包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的如权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白。
17.一种制备如权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将根据权利要求12或13所述编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过3μg/106个细胞的高产细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；
(d)收获步骤(c)中得到的发酵液，纯化融合蛋白；
(e)激活步骤(d)中纯化的融合蛋白。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中融合蛋白纯化过程包含Protein A亲和层析、多维模式层析、阴离子交换层析和分子筛层析。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中Protein A亲和层析使用Mabselect层析介质；和所述多维模式层析使用CHT陶瓷羟磷灰石II型层析介质；和所述阴离子交换层析使用Q Sepharose High Performance层析介质；和所述分子筛层析使用Superdex 200层析介质。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(e)中激活步骤采用凝血因子XII激活、柱上自激活或溶液自激活。
21.一种如权利要求1-11中任一项所述融合蛋白在制备预防或治疗出血性疾病的药物中应用。
22.如权利要求21所述的应用，包括用于制备产生FVIII抗体的A型血友病患者或产生FIX抗体的B型血友病患者的自发性出血、手术中或手术后出血的治疗或预防、先天性或后天获得性FVII缺乏症患者的出血性疾病的预防或治疗、和/或血小板机能不全患者的治疗的药物中应用。
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