CN103397009B - 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组人凝血因子FVII-Fc融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白从N端到C端依次包含人FVII、柔性肽接头和IgG2Fc变异体。这种Fc变异体无裂解性，且显示极小的Fc-介导的不良副作用。该融合蛋白具有与人FVII类似或更高的生物学活性和大大延长的血浆半衰期，从而改善药物动力学和药效。

Description

改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及一种改良型人凝血因子FVII的Fc融合蛋白及其制备方法和用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
背景技术
凝血是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块形成的过程，通常参与被称为凝血“级联反应”的血液组分是原酶或酶原，即不具有酶活性的蛋白，在激活剂的作用下使其转变为活性酶。凝血因子FVII就是这些凝血因子中的一种。
FVII是一种维生素K依赖性的血浆糖蛋白，在肝脏中合成，并以分子量约为53KDa的单链蛋白酶原形式分泌到血液中(Broze等，J Biol Chem，1980，255：1242-1247)。FVII酶原在单一位点Arg152-Ile153处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为其活性形式FVIIa。单链凝血因子FVII可以通过凝血因子FXa、凝血因子FXIIa、凝血因子FIXa、凝血因子FVIIa或凝血酶在体外水解转化为双链凝血因子FVIIa。活化的FVIIa包含NH2-末端衍生的轻链(～20KDa)和COOH-末端衍生的经由单一二硫键(Cys135至Cys262)连接的重链(～30KDa)。轻链含有细胞膜结合性Gla结构域和两个EGF结合结构域，而重链含有催化结构域。处于活化形式时，FVIIa作为丝氨酸蛋白酶，参与凝血级联反应的外源性途径(extrinsic pathway)。当血管的脉管内腔受损伤时，外源性凝血路径被启动，细胞膜糖蛋白组织因子(Tissue Factor，TF)被暴露，结合循环性的FVII和已存在的较小量活化FVIIa，这种结合促进FVII全部转化为FVIIa，随后在钙离子和磷脂的协同作用下，使FIX转化为FIXa，FX转化为FXa，继而进一步将凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶在血液凝固和伤口愈合方面起关键作用，在血管损伤的最初阶段，其诱导血小板聚集并诱导纤维蛋白形成，之后刺激细胞生长从而促进受损血管的修复(Osterud等，Proc Natl Acad Sci USA，1977，74：5260-5264)。
编码人FVII(hFVII)的基因位于13号染色体的q34-qter9，9个外显子组成，长度为12.8Kb(O’Hara等，Proc Natl Acad Sci USA，1987，84：5158-5162)。hFVII包含四个结构域：氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域，两个“类表皮生长因子(EGF)”结构域和羧基端丝氨酸蛋白酶域(催化结构域)。外显子Ia和Ib编码信号肽序列；外显子2编码Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码类表皮生长因子结构域；外显子6至8编码丝氨酸蛋白酶催化结构域(Yoshitake等，Biochemistry，1985，24：3736-3750)。成熟FVII蛋白经历多种翻译后修饰，包括维生素K依赖性的羧基化，导致该分子NH2-末端产生10个γ羧基化的谷氨酸残基。其他翻译后修饰包括羟基化(Asp63)、N-型糖基化(Asn145和Asn322)以及O-型糖基化(Ser52和Ser60)。
血友病A和B是遗传性疾病，分别是凝血因子FVIII和凝血因子FIX的缺陷而造成的。蛋白替代疗法是血友病A和B的传统治疗方法，包括静脉内给予从人血浆中制备的或基因工程方法获得的重组FVIII或FIX。然而，在血友病A和B的治疗中，存在最严重的医学问题是针对替代凝血因子的同种抗体(alloantibody)的产生，这导致治疗效力降低或者使治疗无效。所有血友病A患者中产生针对凝血因子FVIII抗体高达30％，而针对血友病B严生凝血因子FIX抗体发生几率较小，但具有更严重的后果，因为它们对免疫耐受性诱导疗法较不敏感。在血友病治疗中使用FVIIa是基于FVIIa对于凝血酶活化的血小板表面的低亲和性结合，通过给予药物学剂量的外源性FVIIa，使损伤位处血小板表面上的凝血酶产生被增强，这与FVIII/FIX的存在无关，即绕开对于凝血因子VIIIa和凝血因子IXa的需求来达到止血。因此，FVIIa可用于存在有抑制物的血友病患者的出血性状况的治疗。FVIIa还被用于治疗先天性FVII缺陷的患者。另外，FVIIa越来越多地被用做适应症外使用(off-lable use)，如治疗与非血友病患者中先天性或获得性出血性疾病，外伤或手术相关的出血。
鉴于血浆FVII的来源有限，且伴有病毒感染的风险。重组FVII已成为研发重点之一。有报道FVII在BHK细胞或其它哺乳动物细胞中的有效表达(WO9215686，WO9111514，WO8810295)，并在纯化过程中将其转变成活化的FVIIa。专利FR0604872还描述了利用转基因动物制备FVIIa的方法。市售的重组凝血因子FVIIa目前只有(Novo Nordisk，丹麦)。该药已在全世界范围内被批准用于治疗具有因产生FVIII或FIX抗体(抑制剂)的血友病A或B患者，先天性FVII缺陷的患者和终止与外伤和/或手术相关的出血事件或预防出血。
治疗性凝血蛋白药物包括FVIIa在内会被蛋白水解酶快速降解，并且易被抗体中和，这会降低它们的半衰期和体内循环时间，由此限制了它们的疗效。在“Summary Basis forApproval”(FDA参考号96-0597)中报道了重组FVIIa在人体内循环半衰期为2.3小时，而相对高的剂量和频繁给药对于达到并维持期望的疗效和预防效果是必须的，这导致极高的治疗成本以及患者治疗的不便。迄今，还没有商品化的具有延长血浆半衰期的重组FVIIa。由于凝血因子FVII/VIIa具有作为通用止血剂的潜能，因此仍然存在开发具有更长的体内功能半衰期(functional half-life)FVII的临床需求。目前有多种策略应用于改善FVII药动学特性，延长其体内半衰期。如与脂类或PEG结合。Novo Nordisk公司正在开发的糖聚乙醇二醇化FVIIa(参见专利US20050113565和US8053410)和PCT申请WO2008074032还提及一种具有延长体内半衰期的FVIIa-聚唾液酸结合物。此外，已公开的其它方法还有增加糖基化位点，比如Bayer公司正在开发的高糖基化FVIIa，T106N和V253N点突变(参见专利US20060252128、EP1549677B和US20100260741)或CSL Behring公司正在开发的FVIIa-白蛋白融合蛋白(参见专利WO2007090584)。美国Prolor Biotech公司正在开发的一种长效凝血因子FVII，将hCG的羧基肽(Carboxy-terminal，CTP)连接至凝血因子FVII的羧基端获得了具有延长半衰期的FVII(参见专利US20100317585)。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21天，而Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。大量研究已证实IgG的Fc片段与活性蛋白连接构成融合蛋白，可以提高活性蛋白的体内半衰期，这种方法已被用于一些临床上很重要的细胞因子(如EPO-Fc，GCSF-Fc，IL2-Fc，和IFNα2a-Fc)和可溶性受体(如TNFR-Fc，VEGFR-Fc，LFA3-Fc和CTLA4-Fc)，Fc融合蛋白在体内半衰期都有不同程度的延长(美国专利No.5349053和6224867)。天然原型或改造的双头同源二聚体Fc融合蛋白是通过IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基连接的形成类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似同亚型人IgG相当的体外药物动力学特性，目前已经上市的Fc融合蛋白都是这种类型的。另外，Biogen Idec公司最近几年开发的单头二聚体Fc融合蛋白是Fc二聚体一端含有融合的目标蛋白，另一端是不含任何目标蛋白的空白，这种方法主要针对以下两种情况：一是那些待表达的目标蛋白的重组表达难度很高，双头同源二聚体Fc融合的正确折叠和分泌效率低；二是目标分子很大，双头同源二聚体Fc融合可能产生三维结构的空间位阻而影响目标蛋白的功能发挥。目前单头二聚体Fc融合方法已经应用于凝血因子FVIII、FIX以及FVII，以期实现在CHO细胞内的高效重组表达，同时具有延长的体内半衰期，其中单头二聚体FVIII-Fc以及FIX-Fc融合蛋白均已进入临床研究阶段，并分别在WO2011069164A2和专利EP1624891B1中进行了公开，而同时欧洲专利EP1624891B1也公开了单头二聚体FVII与Fc的融合形式。
针对以上现有技术中所述有关同源二聚体Fc融合FVII的制备的困难及其在临床应用过程中存在的局限，如表达量不高、半衰期短以及稳定性差等，本领域迫切需要开发长效、稳定性好且可以以合理的成本生产的FVII衍生物。由于hFVII-L-vFc融合蛋白的构建有其本质上的困难，迄今为止尚没有获得具有半衰期显著延长且可稳定高效表达的FVII-Fc融合蛋白。
发明内容
本发明涉及一种具有大大延长体内半衰期的hFVII-L-vFc融合蛋白及其制备方法和用途。
本发明所述的hFVII-L-vFc融合蛋白从N端到C端依次含有人FVII、含多个氨基酸的柔性肽接头和含有Pro331Ser突变的人IgG2Fc突变体。柔性肽接头优选是柔韧的和非免疫原性的，并且在FVII和Fc之间产生足够的距离，使这两个融合蛋白的潜在干扰减小至最低限度。较佳地，使用约6-21个氨基酸长度含有以下2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。如本发明一实施例中所公开的优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。
本发明所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其成熟蛋白为切除了hFVII前导肽(1到38位氨基酸残基)之后SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其特征在于，人IgG2Fc突变体含有绞链区、CH2和CH3区域。其CH2区域在331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而消除了Fc的效应子功能。
本发明公开一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或辅形剂或稀释剂，以及有效量的本发明所述的hFVII-L-vFc融合蛋白。
本发明所述的融合蛋白一般的应用于FVII先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防和治疗以及血友病A或B患者的自发或手术性出血的预防和治疗或其他相关的出血性疾病。
在本发明的另一实施例中，公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法，导致重组融合蛋白在其生长培养基中每24小时生产超过(较佳地为3-4)μg/106细胞的稳定转染的细胞系。这些hFVII-L-vFc融合蛋白具有大大延长的血清半衰期而无不良副作用，改善了药物动力学和药效，从而降低了实现原来类似药效所需的剂量和注射次数。
此外，本发明所公开的融合蛋白的制备方法，表达产量高且IgG2Fc的融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。
综上，本发明所公开和/或所述的融合蛋白及其制备方法的优点概括如下：
1.FVII的体内循环半衰期大大延长，血清中药物浓度波动减少，安全性提高，耐受性改善，降低注射频率而提高患者的生活质量。
2.融合蛋白表达量高且纯化步骤高效便捷、可降低生产成本。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
以下具体介绍本发明内容：
非裂解性Fc变异体
Fc元件来源于免疫球蛋白IgG的恒定区Fc片段，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc介导的IgG的效应子功能发挥通过两种机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q结合，引发补体依赖性细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力较低，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。此外，人IgG1和IgG3还能有效结合C1q而激活补体级联反应。人IgG2与C1q结合相对弱，而IgG4不与C1q结合(Jefferis R等，Immunol Rev，1998，163：59-76)，所以人IgG2CDC效应也较弱。对于本发明的目标蛋白hFVII来说，Fc融合主要是为了增加它的体内循环半衰期和降低生产成本，Fc介导的效应子效果而裂解细胞功能是不必要的，甚至可能产生有害副作用。显然，没有一种天然IgG亚型非常适合产生hFVII-Fc融合蛋白。为了得到不具效应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是在天然Fc片段中的进行氨基酸突变，以减少或去除效应子功能。鉴于人IgG2的天然特性，用它的Fc片段进行点突变是最明智的选择。天然IgG2中Pro331被替代为Ser331(由EU编号体系确定的位置)，就使IgG2失去了与C1q的结合亲和力。
柔性连接肽
连接肽长度对融合蛋白活性非常重要。有报道称促红细胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，与EPO单体相比，含有2个完整的EPO区域(相隔3到7个氨基酸肽接头)的融合蛋白表现出减弱的活性(Qiu H等，J Biol Chem，1998，273：11173-11176)。然而，当这两个EPO区域间的肽接头的长度为17个氨基酸时，二聚体EPO分子的体外和体内生物活性明显提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem，1999，274：24773-24778；美国专利No.6187564)。这可能解释为融合蛋白两部分间增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能(Ashkenazi A等，Curr Opin in Immunol，1997，9：195-200)。WO2007090584专利中公开的一种FVII/FVIIa-白蛋白融合多肽，在FVII/FVIIa与白蛋白之间插入不同长度的连接肽，发现无连接肽的II/FVIIa的融合蛋白显示出显著减少的生物学活性，而含有连接肽的FVII/FVIIa-白蛋白融合蛋白，显示其生物学活性的增加依赖于连接肽的长度，这可能解释为融合蛋白两部分间增加的连接肽，使该分子的两部分能分别行使其功能，有利于形成更高摩尔比活性的构象。
本发明人首先设计了5种不同长度的含有甘氨酸和丝氨酸柔性连接肽接头制得hFVII的C端与Fc连接的融合蛋白，瞬时表达实验表明，2个氨基酸的短肽接头GlySer连接的融合蛋白也有活性，表明维持FVII生物活性的重要功能区域在三维结构上受C端序列影响较小。当连接肽接头增加到16个氨基酸GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer时，FVII生物活性已经充分展示出来了。此外，本发明人还发现，在hFVII和人IgG2Fc变异体间添加的肽接头以两种方式提高hFVII-L-Fc的体外生物活性：(1)使Fc区域远离hFVII上的结构域，和(2)使一个hFVII远离另一个hFVII的结构域，从而降低空间位阻效应。且人的IgG2Fc变体在CH2区域在331位点含有点突变，从而降低了Fc的效应子功能。
融合蛋白及其制备方法
本发明融合蛋白基因是密码子优化过的由人工合成方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便的用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法不限于人工合成或传统亚克隆等，具体方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，通过分段合成核苷酸序列再进行亚克隆的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞的表达载体，包含编码本发明的融合蛋白序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
哺乳动物细胞表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员还可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO细胞，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的融合蛋白，可获得活性良好，稳定性良好的融合蛋白。
本发明还提供一种用重组DNA技术制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：
1)提供编码融合蛋白的核酸序列；
2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转染宿主细胞；
5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，脂质体转染，电穿孔，微注射，病毒感染法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM等，Dev Biol Stand1996，86：338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集上清液。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。首先将表达上清浓缩，浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的介质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。还可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效剂量(如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种辅形剂和稀释剂。
药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者体重、患者免疫状况、给药途径等。
附图说明
图1显示了根据本发明实施例的在PCDNA3表达载体内SpeI-EcoRI片段的hFVII-L-vFc的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。人FVII由信号肽(1-38)和成熟FVII蛋白(39-444)构成。成熟的融合蛋白含有hFVII(39-444)、柔性肽接头(445-460)和Fc变异体(461-683)。
图2显示了所构建hFVII-L-vFc融合蛋白基因的真核表达质粒PFVII-D的基因图谱。该表达质粒全长9647bp，含有10个主要基因片断，包括1.hCMV启动子；2.目标基因hFVII-L-vFc；3.EMCV IRES；4.mDHFR筛选基因；5.bGH中止序列；6.SV40启动子；7.卡拉霉素抗性基因；8.SV40中止序列；9.ColE1复制子；10.氨苄青霉素抗性基因。
图3显示了旋转培养瓶内细胞株的生长及其分泌hFVII-L-vFc融合蛋白的浓度趋势曲线。
图4显示了hFVII-L-vFc纯化蛋白在SD大鼠中的血浆半衰期。
具体实施方式
实施例1.构建编码hFVII-L-vFc融合蛋白的表达质粒
编码hFVII前导肽和成熟蛋白的目标基因序列是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，经人工合成办法获得的。为了便于将目的基因片段插入表达载体的特定位点，在所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和BamHI。全长1351bp的DNA片段插入到转移载体如pUC57的EcoRV限制性酶切位点，获得了中间质粒，其所含hFVII基因序列由DNA测序验证。本发明首选的含2个氨基酸的柔性肽接头GlySer和人IgG2vFc变异体(Pro331Ser突变)的融合基因也是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为BamHI和EcoRI，并且在vFc中间设置了EcoRV位点。全长682bp的DNA片段应用BamHI和EcoRI酶切位点插入至上述含有hFVII基因的pUC57转移载体，获得第二个中间质粒，由DNA测序验证L-vFc序列。
采用人工合成方法获得的EMCV IRES片段和小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因插入到哺乳动物细胞表达载体PCDNA3(Invitrogen)的EcoRI(5’)和XhoI(3’)的位点中，获得载体PCDNA3-DHFR，其所含新目标片段由DNA测序验证。然后再将上述获得的含全长hFVII-L-vFc基因的2069bp DNA片段从中间载体转移至PCDNA-DHFR的SpeI(5’)和EcoRI(3’)位点，得到PCDNA3-hFVII-L-vFc表达质粒，又称之为PFVII-A。该质粒含有能够保证hFVII-L-vFc能够稳定高效表达的巨细胞病毒启动子CMV。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因缺陷型时，上述改造的PCDNA3表达载体含有小鼠DHFR基因，从而存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增hFVII-L-vFc融合基因和DHFR基因(美国专利No.4399216)。基于PFVII-A，通过基因合成方法产生更长的柔性肽接头序列来检验肽接头长短对FVII活性的影响。具体的，预先设置的BamHI(5′)和EcoRV(3′)单一位点用作插入不同长度的柔性肽接头和部分vFc基因(453bp)，从而获得其它4个表达质粒，又称作PFVII-B，PFVII-C，PFVII-D，PFVII-E，分别对应于柔性肽接头氨基酸数目为6个(序列为GlySerGlyGlyGlySer)，11个(序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)，16个(序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和21个(序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)。
实施例2.瞬时表达不同长度柔性肽接头的融合蛋白和活性测定
实施例1得到的5种表达质粒，在30ml的摇瓶里使用DNAFect LT试剂(ATGCeII)转染3X107CHO-K1细胞，经转染的细胞在含有100ng/ml维生素K1的无血清生长培养基中生长5天，用实施例8中详述的方法测定上清液中的融合蛋白浓度，并用实施例7中描述的方法测定其活性。ELISA结果显示5种质粒在该条件下的FVII瞬时表达量相似，但是它们凝血活性却显示出较大差别。含有2个氨基酸接头的PFVII-A质粒表达的FVII上清液活性最低，PFVII-B，PFVII-C，PFVII-D和PFVII-E质粒表达的FVII上清液活性分别是PFVII-A的113％，134％，147％和155％，表明肽接头的长度影响FVII活性。由PFVII-E表达质粒获得的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示。
实施例3.筛选高表达融合蛋白的稳定转染细胞系
将上述PFVII-D(含有序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer肽接头)表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达hFVII-L-vFc融合蛋白。为了维持稳定的高水平表达，优选的宿主细胞是DHFR缺陷型的CHO细胞(美国专利No.4,818,679)。一种优选转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂质体转染和微注射等。电穿孔方法应用设置为250V电压和1050μFd电容的Gene Pulser Electroporator(Bio-RadLaboratories)，放置在比色杯内的2～3×107个细胞中加入20μgPvuI线性化的表达质粒，电穿孔后的细胞转移至含30ml生长培养基的摇瓶中。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mLG418的生长培养基，细胞以一定浓度种植在96孔培养板里，培养10-12天直至大的离散细胞克隆出现。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子，也可用抗FVII的ELISA分析方法进行融合蛋白表达的定量测定，然后通过极限稀释法亚克隆产生高水平表达融合蛋白的孔。
为了实现融合蛋白更高水平表达，宜用MTX药物来抑制DHFR基因实现DHFR和融合蛋白基因的共扩增。在含有递增浓度的MTX生长培养基中，共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释法获得的亚克隆可以在高达6μg/mL MTX培养基中存活并缓慢生长，最终获得转染子。测定转染子分泌率，并进一步观察其细胞生长特性。分泌率超过1(较佳的为3-4)μg/106(即百万)细胞/24小时的细胞系用于下一步的无血清生长培养基悬浮培养驯化。
实施例4.生产融合蛋白
实施例3优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300ml摇瓶中进行补料流加培养或通过每天更换培养基的办法模拟灌流培养。上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中补料流加培养14天，其表达的重组融合蛋白累积产量为392mg/L(见图3)，活细胞密度最高可达到11×106个/mL。为了得到更多hFVII-L-vFc重组蛋白，也可以选用1000ml摇瓶培养。另一种培养方法，上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇瓶中每天更换培养基，其表达的重组融合蛋白每天累积产量约为40-60mg/L，在摇瓶中活细胞密度最高可达到25×106个/mL。以上两种方法生产的重组融合蛋白的测定的生物学活性相当。
实施例5.纯化与定性融合蛋白
用1N NaOH将含有实施例4获得的融合蛋白的条件培养基滴定到pH7.0并加入5mMEDTA，0.1％Triton X-100，然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的MabSelectTMProtein A柱(GE Healthcare)上。待融合蛋白结合于ProteinA柱后，弃去流出的组分，用PBS洗涤该柱，直到280nm处的OD值低于0.01。然后用20mM Tris，20mM CaCl2，300mM NaCl，900mM Arginine，45％Propylene Glycol(v/v)，0.05％Tween80(v/v)，pH6.8的缓冲液洗脱结合的融合蛋白。合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纤维素过滤器过滤，并立即存储在-70℃。在非还原条件下，由SDS-PAGE测得纯化的hFVII-L-vFc蛋白质的分子量范围在80-85kDa。在还原条件下，纯化的蛋白迁移至约160-170kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白质分析定量该融合蛋白。
实施例6.生色底物法间接测定融合蛋白的生物学活性
本发明采用HYPHEN BioMed公司生产的BIOPHEN FVII生色试剂盒(Ref：A221304)测定FVII的体外酶活性。该试剂盒测定原理为生色底物法，FVII是一种在外源性凝血途径起作用的丝氨酸蛋白酶，当FVII与组织因子结合后，在磷脂和Ca2+存在条件下，可激活凝血因子FX，使其转变为活性形式FXa。待测定的FVII蛋白首先与来源于兔促凝血酶原激酶的组织因子形成酶复合物，然后激活反应体系中一定浓度的(过量)凝血因子FX，使其转化为活性形式FXa，FXa作用于反应体系中特异性显色底物SXa-11，使底物裂解并产生pNA，所产生pNA量直接与FXa的活性成正相关性。在405nm处用比色计测定所释放的pNA浓度，即可知测试样本中FVII以及FXa活性之间的对应关系，以此计算出FVII的活性大小，用正常人的血浆作为标准品。用生色法间接测定的上述实施例5的hFVII-L-vFc纯化样品活性与实施例7用的凝血法直接测定的活性相当，推算约为1100-1300IU/mg。
实施例7.凝血法直接测定融合蛋白的生物学活性
凝血法测定FVII生物学活性是通过纠正FVII因子缺失血浆所导致凝固时间延长的能力而获得的。本发明采用法国STAGO公司生产的试剂盒-Deficient FVII(Cat.No.00743)。检测方法是将稀释的已知FVII活性的正常人冻干血浆(Unicalibrator，Cat.No.00625)做标准和待测样品一起测定凝血酶原时间(PT)，仪器为STAGO公司系列血凝仪，首先建立标准曲线，再将待测FVII样本适度稀释与缺乏FVII因子的基质血浆混合，测定其PT值，通过标准曲线所拟合的活性百分比C(％)与PT时间t(s)的对数方程，可测得待测样本FVII的活性多少，其结果用正常血浆的百分比进行表示(％)，试剂盒中所提供的标准品百分比活性(％)与国际酶活单位IU的对应关系为100％＝1IU，据此可求算出待测样品FVII的酶比活性大小，单位为IU/mg。用凝血法直接测定的上述实施例5的hFVII-L-vFc平均生物学活性为1300-1500IU/mg，考虑到hFVII-L-vFc的分子大小平均为160kD，相当于208-240IU/nM。CSL Behring公司报道的HEK细胞生产的重组hFVII生物学活性为2874IU/mg，相当于144IU/nM，而其用HEK或CHO细胞生产的重组hFVII融合白蛋白(hFVII-FP)生物学活性为620-770IU/mg，相当于69-75IU/nM(Weimer T等，Thromb Haemost，2008，99：659-667)。所以本发明中的hFVII-L-vFc融合蛋白生物学活性在相同摩尔情况下比hFVII和hFVII-FP更好。
实施例8.测定融合蛋白的药代动力学
SD大鼠三种剂量(20，80，180μg/Kg)尾静脉注射本发明实施例5的纯化的hFVII-L-vFc蛋白样品，选取不同时间点抽取SD大鼠的血液样品，静置1小时，离心后的上清液用ELISA方法测定血浆中的融合蛋白含量。在ELISA测定时，用羊抗人的Fc的多抗0.2μg/ml(JacksonLaboratories，Cat No：109-005-008)进行包埋、辣根过氧化物酶标记的兔抗人FVII多抗(Cedarlane，Cat No：CL20030HP)1∶2000来检测，实际测得结果见图4。实施例5中纯化hFVII-L-vFc样品在大鼠中血浆半衰期高中低剂量分别为18.8±1.5小时，17.2±0.8小时和16.0±0.5小时。报道的重组FVII相似剂量血浆半衰期约为40-45分钟，而重组hFVII-FP血浆半衰期是4.5小时(Weimer T等，Thromb Haemost，2008，99：659-667)。本发明中的重组hFVII-L-vFc融合蛋白血浆半衰期达到16-18小时，是重组FVII的20倍和hFVII-FP的4倍，所以hFVII-L-vFc融合蛋白具有大幅度延长的体内半衰期。
实施例9.测定融合蛋白的凝血两项指标
取体重约150g的SD大鼠8只，尾静脉注射180μg/Kg的本发明实施例5的hFVII-L-vFc融合蛋白或对照PBS溶液，大鼠给药后30分钟，腹腔麻醉注射10％水合氯醛，心脏取血1.8ml，迅速加入有1∶9柠檬酸钠溶液0.2ml的测定管中，3000rpm离心10分钟，吸取上清，在取血后2小时内用Start4血凝仪(法国)测定凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)。实验结果显示融合蛋白和对照组的PT时间分别是14.8秒和19.1秒，APTT时间分别是8.5秒和11.8秒，说明本发明中的hFVII-L-vFc是具有体内凝血活性的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种重组hFVII-L-vFc融合蛋白在制备以208-240IU/nM的生物活性体外纠正FVII因子缺乏血浆所导致凝固时间延长的药物中的应用，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的应用，其中编码所述的重组hFVII-L-vFc融合蛋白的DNA序列为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。
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