CN105567733B - CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 - Google Patents
CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105567733B CN105567733B CN201610019499.XA CN201610019499A CN105567733B CN 105567733 B CN105567733 B CN 105567733B CN 201610019499 A CN201610019499 A CN 201610019499A CN 105567733 B CN105567733 B CN 105567733B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fibrin ferment
- plasmid
- subunit
- dna
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 title claims abstract description 70
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 title claims abstract description 70
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 64
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims abstract description 17
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims description 7
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 claims description 7
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 241001505404 Deinagkistrodon acutus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 231100000645 Reed–Muench method Toxicity 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种CHO细胞表达凝血酶‑Fc融合蛋白的方法，其包括如下步骤：(1)构建表达质粒：分别构建表达凝血酶a‑亚基和b‑亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒；(2)细胞转染：使用上述重组表达载体质粒转染CHO细胞；(3)对上述CHO细胞进行驯化培养，收集上清液。本发明的方法高效稳定地成功表达了有酶活性的双亚基融合蛋白，即CHO细胞表达凝血酶‑Fc融合蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法。
背景技术
凝血酶为医用止血的重要制剂，目前来源于天然蛇毒提取。已知存在多种凝血酶，可以切割纤维蛋白原α-链，使其转化为纤维蛋白，造成血凝。
其中，有的凝血酶为单链蛋白，有的为双链糖蛋白。如Xin Chen等人、肖昌华等人、孙狄等人从五步蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒中分离出含有两条肽链的凝血酶。这些凝血酶分子量均在30KDa左右，结构高度相似，均有止血功效。
但是，由蛇毒中提取凝血酶不但工艺复杂、收率低，而且大大受限于原料。原料价格也推高了产品价格，影响产品经济效益和病人收益。
中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，CHO细胞)是一种实验室常见的贴壁细胞系，广泛用于生物制品的表达，诞生于70年代末，因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其能够有效表达凝血酶。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其包括如下步骤：
(1)构建表达质粒：分别构建表达凝血酶a-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒、以及表达凝血酶b-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒；
(2)细胞转染：使用上述重组表达载体质粒转染CHO细胞；
(3)对上述CHO细胞进行驯化培养，收集上清液。
优选地，所述步骤(1)的具体操作如下：
将凝血酶a亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过限制性内切酶BamH I和Xba I将凝血酶a亚基连His-tag片段酶切得到；同时用BamH I和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和新霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc1质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶a-Fc载体质粒，再将得到的质粒用Bgl II线性化后用于转染；
将凝血酶b亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过Bgl II和Nhe I将此凝血酶b亚基连His-tag的DNA片段酶切得到；同时用BamH I和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和万古霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc2质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶b-Fc载体质粒，再将得到的质粒用Bgl II线性化后用于转染。
优选地，所述步骤(2)的具体操作如下：
S1.取对数期生长的CHO细胞，离心后重悬在DMEM-F12培养基中，该培养基中加入谷氨酰胺、1％胎牛血清、1％大豆蛋白胨Soy Peptone UF、1mM丁酸钠，密度为2×106细胞/毫升；
S2.准备转染试剂，将PEI制成1mg/ml的水溶液，按比例将下列试剂混合：16μgDNA、60μl PEI、加入150mM氯化钠溶液至500μl，漩涡搅拌10秒，在室温孵育10分钟；上述DNA中，凝血酶a-亚基DNA与凝血酶b-亚基DNA的比例为1:1；
S3.将上述混合物加入CHO细胞，摇动培养4小时；
S4.将培养基换成CD-CHO培养基，继续培养3天；
S5.将细胞计数后稀释，接种入96孔板，加入含有新霉素或万古霉素的选择培养基；
S6.持续培养直到抗性克隆形成，每7天换液一次。
本发明采用DNA重组技术，将双亚基凝血酶与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段融合，并在CHO细胞进行表达。采用该方法，本发明高效稳定地成功表达了有酶活性的双亚基融合蛋白，即CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白。
附图说明
图1是表达a-亚基的质粒结构。
图2是表达b-亚基的质粒结构。
图3是融合蛋白的检测结果，其中，1-2道为凝血酶a亚基-Fc，3-4道为凝血酶b亚基-Fc，M为蛋白Marker)。
图4是不同培养条件下凝血酶表达水平的对比。
图5是不同PEI/DNA比例下凝血酶表达水平的对比。
图6是不同DNA用量下凝血酶表达水平的对比。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案进行描述，但本发明并不限于以下实施例。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件。为了使技术方案更为清楚，除非特别指出，以下实施例中对本领域的一些常规技术操作进行了省略说明，但可理解的是，本领域技术人员熟知这些技术手段，并且是可实现的。
实施例1表达质粒的构建
分别构建表达凝血酶a-亚基和b-亚基的表达质粒。
表达a-亚基的质粒结构如图1所示，其中，凝血酶a亚基(连信号肽共152个氨基酸)序列采用Genbank序列Q9IAM1；His-Tag序列为“CATCATCATCATCATCAT”，置于凝血酶信号肽序列之后；其中，表达新霉素的表达盒可筛选转染阳性的细胞。
凝血酶a亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过限制性内切酶BamH I和Xba I将凝血酶a亚基连His-tag片段酶切得到；同时用BamH I和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和新霉素表达盒的质粒(pAPZ-Fc1质粒)。通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶a-Fc载体质粒，得到的质粒用Bgl II线性化后用于转染。
表达b-亚基的质粒结构如图2所示，其中，凝血酶b-亚基(连信号肽共146个氨基酸)的序列采用Genbank序列Q8JIW1；His-Tag序列为“CATCATCATCATCATCAT”，置于凝血酶信号肽序列之后；其中，表达万古霉素的表达盒可筛选转染阳性的细胞。
凝血酶b亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过Bgl II和Nhe I将此凝血酶b亚基连His-tag的DNA片段酶切得到；同时用BamH I和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和万古霉素表达盒的质粒(pAPZ-Fc2质粒)。通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶b-Fc载体质粒，得到的质粒用BglII线性化后用于转染。
实施例2细胞转染
为了表达融合蛋白，进行细胞转染，具体步骤如下：
1.取对数期生长的CHO细胞，离心后重悬在DMEM-F12培养基中(加2mM谷氨酰胺，加入1％(v/v)胎牛血清(FBS)、1％(w/v)大豆蛋白胨Soy Peptone UF、1mM丁酸钠)，密度为2×106(2e6)细胞/毫升。
2.准备转染试剂，将PEI(聚乙烯亚胺)制成1mg/ml的水溶液。按比例将下列试剂混合：
16μg质粒DNA
60μl PEI(1mg/ml)
加入150mM氯化钠溶液至500μl，漩涡搅拌10秒，在室温孵育10分钟。
上述DNA中，凝血酶a-亚基DNA与凝血酶b-亚基DNA的比例为1:1。
3.将上述混合物加入CHO细胞，摇动培养4小时。
4.将培养基换成CD-CHO培养基，继续培养3天。
5.将细胞计数后稀释，接种入96孔板，加入含有新霉素或万古霉素的选择培养基。
6.持续培养直到抗性克隆形成，每7天换液一次。
实施例3融合蛋白的检测
将上述表达质粒(即，凝血酶a-亚基的表达质粒和b-亚基的表达质粒)分别转染入CHO细胞，经驯化培养后收集上清液。上清液中蛋白经SDS-PAGE胶分离，转膜后使用抗His-Tag抗体WESTERN BLOTTING检测，可看到蛋白条带(如图3所示)，其中，1-2道为凝血酶a亚基-Fc，3-4道为凝血酶b亚基-Fc，M为蛋白Marker)。Fc段单体蛋白分子量为30KDa左右，凝血酶亚基连His-Tag后分子量13-15kDa。WESTERN BLOTTING可以检测到分子量在50KDa以上的条带，这说明表达质粒可以在CHO细胞中表达出凝血酶-Fc融合蛋白。
实施例4蛋白酶活性检测
采用凝血酶降解纤维蛋白原检测凝血酶-Fc融合蛋白的活性。
向20mM Tris、pH 7.4、0.5mg/mL的人纤维蛋白酶原溶液中，加入不同稀释倍数的样品，一小时后观察溶液浑浊情况，作为检测凝血酶功能的依据。凝血酶表达量用样品稀释前的相对水平表示。具体方法如下：
在96孔板第一行加入未稀释样品，每行10个孔。向下一行进行连续3倍稀释。第8行即稀释约3000倍。每孔加入人纤维蛋白酶原溶液，孵育1小时后观察溶液浑浊情况。计数每行出现浑浊的孔数，用Reed-Muench法计算出的数值代表凝血酶表达量。
检测结果显示，凝血酶亚基与Fc融合后，可以形成有功能的凝血酶，凝血酶a-亚基的表达质粒和b-亚基均成功表达，并正确组合，生成有酶活性的凝血酶。
Claims (3)
1.一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其包括如下步骤：
（1）构建表达质粒：分别构建表达凝血酶a-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒、以及表达凝血酶b-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒；
（2）细胞转染：使用上述重组表达载体质粒转染CHO细胞；
（3）对上述CHO细胞进行驯化培养，收集上清液；
其中，His-Tag序列置于凝血酶a-亚基信号肽序列之后；His-Tag序列置于凝血酶b-亚基信号肽序列之后。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体操作如下：
将凝血酶a亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过限制性内切酶BamH I和Xba I将凝血酶a亚基连His-tag片段酶切得到；同时用BamH I 和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和新霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc1质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶a-Fc载体质粒，再将得到的质粒用Bgl II线性化后用于转染；
将凝血酶b亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过Bgl II和Nhe I将此凝血酶b亚基连His-tag的DNA片段酶切得到；同时用BamH I 和 NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和万古霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc2质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶b-Fc载体质粒，再将得到的质粒用Bgl II线性化后用于转染。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作如下：
S1. 取对数期生长的CHO细胞，离心后重悬在DMEM-F12培养基中，该培养基中加入2mM谷氨酰胺、1%胎牛血清、1% 大豆蛋白胨Soy Peptone UF、1mM 丁酸钠，密度为2×106细胞/毫升；
S2. 准备转染试剂，将PEI制成 1mg/ml 的水溶液，按比例将下列试剂混合：16μg DNA、60μl PEI 、加入150mM氯化钠溶液至500μl，漩涡搅拌10秒，在室温孵育10分钟；上述DNA中，凝血酶a-亚基DNA与凝血酶b-亚基DNA的比例为1:1；
S3. 将上述混合物加入CHO细胞，摇动培养4小时；
S4. 将培养基换成 CD-CHO 培养基，继续培养3天；
S5. 将细胞计数后稀释，接种入96孔板，加入含有新霉素或万古霉素的选择培养基；
S6. 持续培养直到抗性克隆形成，每7天换液一次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610019499.XA CN105567733B (zh) | 2016-01-11 | 2016-01-11 | CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610019499.XA CN105567733B (zh) | 2016-01-11 | 2016-01-11 | CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105567733A CN105567733A (zh) | 2016-05-11 |
| CN105567733B true CN105567733B (zh) | 2019-04-23 |
Family
ID=55878356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610019499.XA Active CN105567733B (zh) | 2016-01-11 | 2016-01-11 | CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105567733B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1332242A (zh) * | 2001-04-29 | 2002-01-23 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 |
| CN1926237A (zh) * | 2004-01-28 | 2007-03-07 | 森托尼克斯制药有限公司 | 用于治疗不育症的异二聚体促卵泡激素－Fc(FSH－Fc)融合蛋白 |
| CN102690354A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-09-26 | 安源生物科技(上海)有限公司 | 重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统 |
| CN103509121A (zh) * | 2012-11-22 | 2014-01-15 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774269B (zh) * | 2013-08-16 | 2016-02-24 | 安源生物科技(上海)有限公司 | 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途 |
| SG11201605242YA (en) * | 2014-01-10 | 2016-07-28 | Biogen Ma Inc | Factor viii chimeric proteins and uses thereof |
-
2016
- 2016-01-11 CN CN201610019499.XA patent/CN105567733B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1332242A (zh) * | 2001-04-29 | 2002-01-23 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 |
| CN1926237A (zh) * | 2004-01-28 | 2007-03-07 | 森托尼克斯制药有限公司 | 用于治疗不育症的异二聚体促卵泡激素－Fc(FSH－Fc)融合蛋白 |
| CN102690354A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-09-26 | 安源生物科技(上海)有限公司 | 重组二聚化抗凝血酶III-Fc融合蛋白及其哺乳动物细胞高效表达系统 |
| CN103509121A (zh) * | 2012-11-22 | 2014-01-15 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Biochemical and functional characterization of a recombinant monomeric factor VIII–Fc fusion protein";R.T. Peters et al.;《Journal of Thrombosis and Haemostasis》;20131231;第11卷;第132-141页 |
| "Purification, Characterization, and cDNA Cloning of a New Fibrinogenlytic Venom Protein, Agkisacutacin,from Agkistrodon acutus Venom";Xin Cheng et al.;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;19991231;第265卷(第2期);第530-535页 |
| Cheng,X et al.."RecName:Full=Snaclec agkisacutacin subunit A Short=Agk-A;Flags:Precursor，Accession No：Q9IAM1.2".《NCBI》.2015,第1-3页. |
| Cheng.X.et al.."RecName:Full=Snaclec agkisacutacin subunit B Short=Agk-B;Flags;Flags:Precursor，Accession No:Q8JIW1.2".《NCBI》.2015,第1-2页. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105567733A (zh) | 2016-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meissner et al. | Transient gene expression: recombinant protein production with suspension‐adapted HEK293‐EBNA cells | |
| CN101501216B (zh) | 制备重组人凝血酶的方法 | |
| WO2020088301A1 (zh) | 一种cho细胞基因组内nw_006884764-1稳定表达蛋白质的应用 | |
| WO2020088300A1 (zh) | 一种cho细胞基因组内nw_003613638-1稳定表达蛋白质的应用 | |
| CN116987179A (zh) | 一种长效耐热胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN110066782A (zh) | 基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶及其生产方法 | |
| CN114085841A (zh) | 一种cho细胞基因nw_003614092.1内稳定表达蛋白质的位点及其应用 | |
| CN106755089A (zh) | 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN104130977B (zh) | 一种抗肿瘤药物筛选细胞模型及其应用 | |
| WO2020088299A1 (zh) | Cho细胞基因组内nw_006883358.1稳定表达蛋白质的应用 | |
| WO2020088302A1 (zh) | 一种cho细胞基因组内nw_006882456-1稳定表达蛋白质的应用 | |
| CN105567733B (zh) | CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 | |
| RU2009124471A (ru) | Вирусный вектор и его применение | |
| US20210222202A1 (en) | Use of genomic nw_006880285.1 in cho cell for stably expressing a protein | |
| CN102639699A (zh) | Dna构建体以及用其制备重组cho细胞的方法 | |
| CN101818138A (zh) | 生产含有gla残基的丝氨酸蛋白酶的方法 | |
| CN114107253B (zh) | 一种利用工程细胞进行基因编辑的系统及方法 | |
| CN104531762B (zh) | 一种rab7a和egfp基因过表达融合绿色荧光蛋白的慢病毒载体及其构建方法和应用 | |
| CN110029130A (zh) | 基于CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因方法 | |
| CN105177032A (zh) | 新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白 | |
| CN109206494A (zh) | ZmRPH1基因在调控植物株高及抗倒伏能力中的应用 | |
| CN109321570A (zh) | 用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒 | |
| CN108164601A (zh) | 一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法 | |
| CN113025578A (zh) | 一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法 | |
| CN104975018B (zh) | 一种新型增强子及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Room 303, No.23 Jinzhong Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: Guangdong anpuze biomedical Co.,Ltd. Address before: 528231 6th floor, building B, phase I, Guangdong biomedical industry base, Xianxi section, 321 National Road, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province Patentee before: AMPO BIOTECHNOLOGY Inc. |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Expression of thrombin Fc fusion protein in CHO cells Effective date of registration: 20220704 Granted publication date: 20190423 Pledgee: Guangdong richangsheng Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: Guangdong anpuze biomedical Co.,Ltd. Registration number: Y2022440000145 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20190423 Pledgee: Guangdong richangsheng Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: Guangdong anpuze biomedical Co.,Ltd. Registration number: Y2022440000145 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |