CN102639699A

CN102639699A - Dna构建体以及用其制备重组cho细胞的方法

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Publication number: CN102639699A
Application number: CN2010800545605A
Authority: CN
Inventors: 曾根崎修司; 大神有美; 山名良正; 成田纯也
Original assignee: Toto Ltd
Current assignee: Toto Ltd
Priority date: 2009-10-01
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2012-08-15
Also published as: MX2012003816A; IL218957A0; JPWO2011040285A1; EP2484761A4; EP2484761A1; WO2011040285A1; JP4998814B2; US20120270264A1

Abstract

本发明公开了一种适用于有效地生产可用于生产靶蛋白质的重组CHO细胞的DNA构建体。该DNA构建体从5'端到3'端包括第一同源DNA片段、靶蛋白基因以及第二同源DNA片段。第一和第二同源DNA片段具有能够与CHO细胞基因组中的一部分次黄嘌呤-磷酸核糖基转移酶(hprt)位点进行同源重组的同源性，并且具有不小于1kbp的链长度。

Description

DNA构建体以及用其制备重组CHO细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种用于高效制备重组CHO细胞的DNA构建体，以及用其来制备重组CHO细胞的方法。

背景技术

各种使用原核生物或真核生物作为宿主细胞的重组蛋白生产系统是公知的。在利用哺乳动物细胞作为宿主细胞的重组蛋白生产系统中，来自包括人类的高等动物的蛋白可以与其在体内合成类似的方式进行翻译后修饰，例如糖基化、折叠以及磷酸化。

翻译后修饰是利用重组蛋白质进行天然蛋白生理活性的复制所必须的，并且利用哺乳动物细胞作为宿主的蛋白质生产系统普遍用于在特别需要具有这种生理活性的药物中所使用的重组蛋白生产系统。

目前，两种蛋白生产系统即CHO-DHFR系统和GS-NS0系统可称作使用能用于大规模生产的哺乳动物细胞的主蛋白生产系统。在这些生产系统中，通过将质粒载体内所含的选择性标记与合适的药物选择方法相结合来筛选可以实现整合到染色体中的质粒载体拷贝数增加的克隆。尤其是，在CHO-DHFR系统中，其表达水平增大了几十倍的细胞克隆可以使用选择性药物甲氨蝶呤通过两段筛选法来进行筛选。

然而众所周知，上述蛋白生产系统存在着问题，例如，靶蛋白的表达水平并不仅仅总是随着扩增质粒载体的拷贝数量而按比例增加，而是需要花大量的时间来筛选表达水平提高的细胞克隆。此外，据报道，当在对表达水平提高的细胞克隆进行筛选之后在没有选择性药物存在的培养基中继续培养所选出的细胞克隆时，在大多数的克隆中可以观察到表达水平的降低或消失（PTL 1：JP 2002-541854T；NPL 1：Kim,N.S.(1998)Biotechnol.Bioeng.,60,679-688）。

此外，在采用哺乳动物细胞的靶蛋白生产系统中，在一般情况下，通过将含有靶蛋白基因的载体导入到宿主细胞中、筛选其中载体已整合到染色体中的细胞克隆，并且进一步在合适的培养条件下培养宿主细胞，从而来生产靶蛋白。

整合到染色体中通常发生在随机的位置处，并且靶蛋白质的表达水平随所获得的细胞克隆而变化。此外，一些细胞克隆存在着例如他们不表达靶蛋白的问题。为了克服这一缺点，采用了这样一种方法，其中根据重组蛋白的表达水平来选择大量的克隆，并且选择最有利的克隆。然而这一筛选方法非常麻烦，需要投入大量的工作。用于避免这种棘手的工作且可快速选择有利的克隆的各种方法已有报道。

例如，在一项公开的技术（PTL 2：JP 9(1997)-510865A）中，将载体整合到小鼠细胞的特异性染色体位置中。在重组细胞克隆池内通过载有与免疫球蛋白γ2A位同源的碱基序列的序列的载体来产生同源重组细胞克隆。目标染色体位置先标识为一个当外源基因整合后可提供比随机整合更高的表达水平的位置。因此，当具有较高表达水平的同源重组细胞克隆在重组细胞克隆池中作为筛选目标而以给定的频率出现时，根据表达水平来进行筛选的工作就会减少。

还公开了一种利用标记质粒的技术（PTL 3：JP 2001-516221A）。具有存在于标记质粒内的高表达水平的标记基因的克隆从通过标记质粒的随机重组得到的细胞克隆种群中预先获得。接下来，继承了标记基因表达水平的靶蛋白生产克隆通过选择细胞克隆来获得，在所述细胞克隆中，在载有靶蛋白基因的质粒载体和随机整合的标记质粒序列之间已经进行了位点特异性重组。

上述技术对于减少选择具有高表达水平的克隆所需的工作是有利的。然而，例如当在不添加选择性药物的条件下对重组细胞进行连续培养时，由此获得的克隆是否可以长时间稳定地保持表达水平就无法预知了。

在药用蛋白的大规模生产中，蛋白的表达稳定地保持高水平是很重要的。尤其是从成本的角度以及从药用蛋白的认证和安全的角度考虑，稳定地维持表达水平是很重要的。为了将重组蛋白生产细胞用于大规模生产，有必要扩大生产细胞克隆的培养规模。据估计，在一般情况下，在开始培养后需要从克隆中立即进行至少约60次细胞分裂（NPL 2：Brown,M.E.et al.(1992)Cytotechnology,9,231-236），并且表达水平会维持在恒定的水平。

此外，选择性药物会造成更高的培养成本，同时还包括与为避免杂质混入药剂的可能性而进行的分离纯化过程有关的成本增长。因此，急需开发一种无需添加选择性药物就可以稳定地维持表达水平的细胞克隆制备技术。

就算不考虑上述经济问题，也不能说对靶蛋白表达水平的稳定性已经进行了令人满意的技术研究。到目前为止，在很多用于制备蛋白生产系统的方法中，克隆的选择一直是基于长时间培养的生长率和产率的累积数据凭经验进行的。然而，这种经验性的克隆选择方法很难实现具有稳定表达水平的细胞克隆的获得（NPL 3：Barnes,L.M.et al.(2003)Biotechnology and Bioengineering,81,631-639）。

在最近研究的一项技术中，靶蛋白基因特异性地整合到细胞基因组中的靶基因位点，以便有效地获得能够以稳定的方式长时间表达蛋白的重组细胞。

hprt基因可以被看作是靶基因的一个示例。hprt基因被认为是位于例如人类的X染色体的长臂上的持家基因。细胞在剔除hprt基因后对药物6-硫鸟嘌呤(6TG)和G418具有抗性，因此很容易进行负选择。

本发明的一些发明人曾报道，已经利用重组载体通过将靶蛋白基因导入到雄性人源HT1080细胞系的hprt位点而获得了在无选择性药物条件下可以长时间地稳定表达蛋白的重组细胞（PTL 5：JP2007-325571A；NPL 4：Koyama Y Et Al.,(2006)Biotechnology AndBioengineering,95,1052-1060）。据报道，在该文献的实验中，通过将大约1-kbp的第一同源DNA片段和大约1-kbp的第二同源DNA片段用作同源臂，每10⁷细胞可以获得大约10克隆的重组细胞。

此外据报道，作为靶向hprt位点的另一个示例是靶向小鼠胚胎干细胞。

不过，即使标靶是同一位点，基因打靶频率有时也会随培养细胞的类型而显著变化。例如，在Porter C.G.ItzhakiJ.E,Eur.J.Biochem218,273-281（NPL 5）和Annual Report of the Hiroshima UniversityResearch Institute for Radiation Biology and Medicine,vol.44(2003)（NPL 6）中报道了，胚胎干细胞和HT1080细胞的基因打靶频率和体细胞源培养细胞彼此不同，基因打靶频率很低。

另一方面，在抗体药用蛋白生产系统中将CHO细胞用作宿主细胞，并且需要采用CHO细胞来构建高水平的和稳定的蛋白生产系统。

然而，还没有关于在CHO细胞的hprt位点进行基因打靶的报道。只有关于使用CHO细胞的一个染色体上的aprt基因中有缺陷的特殊细胞系的研究（NPL 11：PNAS,88,9488-9502(1991)；NPL 12:SomaticCell.Mol.Genet.,19,363-375；NPL 13：PNAS,86,4574-4578(1989)）。在这些实验中，其aprt基因只存在于一个染色体上的细胞系被用作宿主，而2.6-4kbp的同源DNA片段用作同源臂。结果，每10⁷细胞获得大约几个到15个克隆的同源重组体。

除了外显子外，还没有关于CHO细胞的hprt位点的基因组序列的报道。因此，针对CHO细胞的hprt位点的特异性基因打靶存在一个问题，即一开始就应该对所有碱基序列而不是外显子进行分析和识别。

另外，CHO细胞是雌性源细胞时就会有两个具有两个hprt位点的X染色体。因此，当一个外源基因被整合到染色体的这两个hprt位点中时，CHO细胞会对诸如6TG之类的选择性药物产生抗性。这样两个染色体中的重组概率一般低于雄性源细胞。例如，当在一个染色体内重组的概率被假设为10^-6时，同时将重组到Koyama Y等人,(2006)Biotechnology And Bioengineering,95,1052-1060（NPL 4）中所述雄性源HT1080细胞系的hprt位点中的效率作为参考时，在两个染色体内同时重组的理论概率是10^-12。

另外，在雌性源细胞中，两个X染色体中有一个是父系遗传，而另一个则是母系遗传。因此存在多态性。与同源臂的基因组同源对于基因打靶的频率很重要，并且碱基序列中的差异有时会导致基因打靶频率的显著降低（NPL 7：Datt,A.et al.,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94,9757-9762；NPL 8：Selva E.M.et al.,(1995)Genetics.139,1175-1188；NPL 9：Riele H.et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,5128-5132；NPL 10：Deng C,D,Capecchi M,R(1992)Mol.Cell.Biol.12,3365-3371）。因此，在雌性源培养细胞如CHO细胞中，X染色体的多态性的影响还会导致重组细胞的采集频率低于雄性源培养细胞。

因此，仍然需要开发一种用于表达靶蛋白基因的重组CHO细胞的高效制备技术。

专利文献

[PTL 1]JP 2002-541854A

[PTL 2]JP 9(1997)-510865A

[PTL 3]JP 2001-516221A

[PTL 4]WO 2004/022741A

[PTL 5]JP 2007-325571A

[PTL 6]JP 5(1993)-507853A

非专利文献

[NPL 1]Kim,N.S.(1998)Biotechnol.Bioeng.,60,679-688

[NPL 2]Brown,M.E.et al.(1992)Cytotechnology,9,231-236

[NPL.3]Barnes,L.M.et al.(2003)Biotechnology and Bioengineering,81,631-639

[NPL.4]Koyama Y Et Al.,(2006)Biotechnology And Bioengineering,95,1052-1060

[NPL 5]Porter C.G.Itzhaki J.E,Eur.J.Biochem 218,273-281

[NPL.6]Annual Report of the Hiroshima University Research Institutefor Radiation Biology and Medicine,vol.44(2003)

[NPL 7]Datt,A.et al.,(1997)PNAS,U.S.A.94,9757-9762

[NPL 8]Selva E.M.et al.,(1995)Genetics.139,1175-1188

[NPL 9]Riele H.et al.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,5128-5132

[NPL 10]Deng C,D,Capecchi M,R(1992)Mol.Cell.Biol.12,3365-3371

[NPL 11]PNAS,88,9488-9502(1991)

[NPL 12]Somatic Cell.Mol.Genet.,19,363-375

[NPL 13]PNAS,86,4574-4578(1989)

[NPL 14]Mol Gen.Genet.,212,301-309(1988)

[NPL 15]Molecular Biology Reports,31,85-90(2004)

[NPL 16]Biotechnology and Bioengineering,91,1-11(2005)

发明内容

本发明人发现，通过确定包含CHO细胞的hprt基因中的内含子的完整DNA序列，并进一步通过含有该hprt基因的同源DNA片段的特异性DNA构建体来将靶蛋白基因导入到CHO细胞中，能够以相当高的频率来制备重组CHO细胞。本发明是基于上述发现产生的。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于高效制备重组CHO细胞的DNA构建体，以及使用该DNA构建体来制备重组CHO细胞的方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种DNA构建体，其从5'端到3'端包括第一同源DNA片段、靶蛋白基因和第二同源DNA片段，其中，所述第一和第二同源DNA片段具有允许与CHO细胞基因组中的一部分次黄嘌呤-磷酸核糖基转移酶(hprt)位点进行同源重组的同源性，并且具有不小于1kbp的链长度。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备重组CHO细胞的方法，该方法包括将含有DNA构建体的载体导入到CHO细胞中。

根据本发明，可以极高的频率来获得表达靶蛋白基因的重组CHO细胞。

附图说明

图1是实施例1中的CHO-K1细胞系的hprt位点的典型示意图。序号1-9分别代表hprt基因的外显子1-9，而外显子之间的序列代表代表内含子1-8。

图2是实施例2中所使用的用于同源重组的载体的典型示意图。图2(A)显示了一种含有来自CHO细胞的hprt基因的同源DNA片段的载体。图2(B)显示了一种含有源自人类HT1080细胞的同源DNA片断的载体。

图3(A)是显示了实施例4中的CHO细胞的hprt基因区域、用于同源重组的载体以及作为重组CHO细胞的基因组PCR的指标的DNA之间的关系的典型示意图。图3(B)和3(C)是显示了实施例4中的PCR结果的示意图。

图4(A)是显示了实施例5中的CHO细胞的hprt基因区域、用于同源重组的载体以及作为南方杂交的指标的DNA之间的关系的典型示意图。图4(B)显示了实施例5中的南方杂交的结果。

图5是显示了通过在实施例6中获取的重组CHO细胞所生产的抗体的量的条形图。

图6是实施例7中所使用的用于具有2.5-kbp同源DNA片段的同源重组的载体的典型示意图。

图7(A)是显示了实施例7中的CHO细胞的hprt基因区域、用于同源重组的载体以及作为重组CHO细胞的基因组PCR指标的DNA之间的关系的典型示意图。图7(B)和(C)显示了实施例7中的PCR的结果。

图8(A)是显示了实施例7中的CHO细胞的hprt基因区域、用于同源重组的载体以及作为南方杂交的指标的DNA之间的关系的典型示意图。图8(B)是显示了实施例7中的南方杂交的结果的示意图。

图9(A)是详细解释了用于确认野生型hprt基因在CHO细胞中的残留的基因组PCR的典型示意图。图9(A)的左侧部分显示了野生型CHO细胞中的PCR，图9(A)的中心部分显示了异质结型重组CHO细胞中的PCR，而图9(A)的右侧部分显示了单质结型重组CHO细胞中的PCR。图9(B)显示了实施例8中的PCR的结果。

图10是实施例9中所使用的用于具有2.5-kbp的同源DNA片段和CHO内源性启动子的同源重组的载体的典型示意图。

图11是显示了实施例9中的抗体产率的示意图，其中对所获得的重组CHO细胞进行长时间的传代培养。

图12是实施例10中所使用的用于具有2.5-kbp的同源DNA片段的同源重组的载体的典型示意图。

图13是显示了实施例11中所使用的具有源自人类hprt基因内含子的MAR以及包含整合到CHO hprt位点中的载体的染色体的CHO重组载体的典型示意图。图13(A)显示了在整合后具有MAR非转录结构和染色体结构的载体。图13(B)显示了在整合后具有其中MAR通过hprt位点的转录进行转录的结构和染色体结构的载体。图13(C)显示了在整合后具有其中MAR通过CMV启动子来转录的结构和染色体结构的载体。

图14是显示了实施例11中所使用的通过具有MAR的CHO重组载体获取的CHO细胞在抗体生产中的稳定性的曲线图。

图15是显示了实施例12中所使用的具有200b×2的同源臂长的CHO重组载体(A)和具有500b×2的同源臂长度的CHO重组载体(B)的典型示意图。

图16是实施例13中所使用的具有5kb×2的同源臂长的CHO重组载体的典型示意图。

具体实施方式

DNA构建体

根据本发明的DNA构建体的一个特征是包括两个同源DNA片段，它们具有能够与CHO细胞基因组中的一部分hprt位点进行同源重组的同源性，并且每个具有不小于1kbp的链长度。出人意料的是，根据该DNA构建体，尽管CHO细胞具有两个X染色体，但重组CHO细胞仍然可以相当高的频率获取。根据本发明的DNA构建体，正如在下文所述的实施例10中所描述的那样，每1×10^-7个细胞可获得130个重组细胞。如上所述，由于在两个染色体的hprt位点中同时重组的估算概率理论上是10^-12，因此该结果是一个出人意料的事实。

在根据本发明的DNA构建体中，一部分hprt位点是同源重组的靶区。作为靶区的一部分Hprt位点的获取有利于以高水平稳定地表达靶蛋白基因。此外，从采用6-TG等通过负选择来抑制hprt基因的转录和表达以灭活hprt基因的功能以及有效地获取重组细胞的角度考虑，将DNA构建体整合到靶区域也是优选的。

本发明的靶区域可以在hprt位点中合理地确定，只要靶蛋白基因的表达不被抑制。在考虑到同源重组所必须的同源DNA片段的链长等时，靶区域优选是含有hprt基因的至少一部分内含子的区域。对于内含子而言，本发明人现在已确定了碱基序列。具体来说，下文所述的图1中所示的内含子1-8可以被理解为具有由SEQ ID No.15-22中的任意一个所代表的碱基序列。

根据本发明的靶区域可以包含全部或一部分与内含子相邻的外显子。具体来说，图1所示的外显子1-9可以被理解为这种外显子。其碱基序列可以通过例如美国国家生物技术信息中心中的已知数据库获得。

在本发明中，与hprt位点中的所需区域同源的同源DNA片段可以由本领域的普通技术人员基于与图1所示的hprt位点中的内含子和外显子的分布及其碱基序列相关的信息来合理构建。

根据本发明的具有同源DNA片段的DNA构建体可以整合到hprt位点中的所需目标靶区域中。所述整合的具体实施方式包括：(1)外显子通过DNA构建体的整合来进行分隔的方式，(2)一个或多个外显子通过DNA构建体的整合来进行删除的方式，(3)一个外显子通过DNA构建体的整合被扩增到2个且所述DNA构建体插入到这两个外显子之间的方式，(4)内含子通过DNA构建体的整合来进行分隔的方式，(5)一个或多个内含子通过DNA构建体的整合来进行删除的方式，(6)一个内含子通过DNA构建体的整合被扩增到2个且所述DNA构建体被插入到这两个内含子之间的方式。

如上文所述，当考虑到同源重组所需要的链长度时，根据本发明的DNA片段优选与含有hprt基因的至少一部分内含子的区域同源。因此，在本发明的一个实施方式中，根据本发明的第一同源DNA片段和第二同源DNA片段包括在SEQ ID No.15-22中的任一个中所述的碱基序列或其部分序列。

该部分序列的链长的下限是1bp，而上限可以在SEQ ID No.15-22中的任一个中所述的碱基序列的链长范围中进行合理的调整。

同源DNA片段与hprt位点之间的同源性可以通过考虑同源重组的效率而合理地确定，但是优选不低于99.0%，更为优选的是不低于99.9%，还更优选的是100%。同源性例如可用DNA测序仪或类似仪器通过分析来确定。

此外，同源DNA片段的链长度不小于1kbp，此链长度优选为可实现DNA构建体的相当高频率的同源重组。同源DNA片段的链长度的下限优选不小于2.5kbp。同源DNA片段的链长度的上限不大于7.5kbp，优选不大于5kbp。同源DNA片段的链长度的上限和下限可以合理地结合，以确定同源DNA片段的链长度范围。具体说来，链长度优选为1-7.5kbp，更优选是1-5kbp，最优选是2.5-5kbp。当链长度处在上述确定的范围内时，可以保持良好的重组细胞的获取频率，同时实现DNA构建体的极高频率的同源重组。

在根据本发明的DNA构建体中，靶蛋白基因优选编码药用蛋白。cDNA衍生序列或含有源自基因组DNA的天然内含子的结构基因可适合用作靶蛋白基因。靶蛋白的具体示例包括抗体、酶、细胞活素、激素、凝血因子、调节蛋白以及受体。优选的是单克隆抗体、多克隆抗体、促红细胞生成素，以及组织特异性纤溶酶原激活因子或粒细胞集落活化剂。

优选的是，靶蛋白基因作为含有表达诸如启动子序列和转录终止信号序列所必须的要素的表达单元被整合到hprt位点中。在本发明的一个实施方式中，靶蛋白基因作为至少含有启动子序列和转录终止信号序列的表达单元而设置在DNA构建体内。

还可以采用其中表达所必须的要素在CHO细胞中是内源性的构造体。该实施方式纳入本发明的范围内。

所述启动子或转录终止信号例如可以依据靶蛋白基因的类型和特性来合理地确定。合适的启动子序列的示例包括CMV启动子和SV40启动子（SV40P）。合适的转录终止信号序列的示例包括BGH多聚腺苷酸信号序列和SV40多聚腺苷酸（SV40pA）信号序列。

例如，用于高效表达靶基因（例如增强子、IRES（内部核糖体进入位点）序列、LoxP序列、FRT序列或其他重组酶识别序列）的调节要素可以合理地选择，并用作除启动子序列和转录终止信号序列之外的表达所必须的要素。调节要素可以根据特性设置于表达单元中的适当位置处。表达所必须的要素可以通过考虑例如靶蛋白的产率来进行合理的选择。

优选的是，除上述要素外，DNA构建体还包含正选择标记基因。只要同源重组不被抑制，正选择标记基因就可以合理地设置于DNA构建体中。合适的正选择标记基因的示例包括新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶基因和谷氨酰胺合酶基因。使用正选择标记基因的优点在于，在选择重组CHO细胞的过程中，通过hprt基因的灭活可以施加正选择和负选择，因此可以大大减少假阳性克隆。

载体

根据本发明的DNA构建体可整合到载体中，接着导入到CHO细胞基因组内。载体系统没有特别的限制，只要DNA构建体可以通过同源重组反应整合到CHO细胞基因组内。优选的是质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体或人工染色体载体。

根据本发明的DNA构建体以及含有所述DNA构建体的载体可以通过限制性内切酶裂解反应和接合反应的组合进行合理的构建。DNA构建体以及含有所述DNA构建体的载体例如可以通过将每个组成单元两端的限制性内切酶识别序列合并、与用于识别序列的限制性内切酶进行裂解反应、通过剔除凝胶来去除不必要的DNA序列（例如大肠杆菌内的操作序列）以及对所得单元进行接合反应来构建。

通过接合反应所构建的载体DNA例如通过苯酚-氯仿萃取来进行纯化，并且可以在宿主细胞内生长，例如在考虑载体类型时所选择的大肠杆菌或酵母菌细胞。

优选的是，根据本发明的载体装载了可操作性地接合到靶蛋白基因的CHF1α启动子。整合到CHO hprt位点的外源基因的表达通过启动子的灭活来进行。当载体具有由CHO中的内源性CHEF1α启动子导致靶蛋白基因的表达的结构时，就可能在CHO hprt位点中进行稳定的表达。

优选的是，在根据本发明的载体内，在载体整合到染色体中之后，源自人类hprt基因的第一内含子的核/基质粘附区(MAR)保持在这种结构中，以使MAR本身通过原来发生于整合位点处的转录来进行转录。当人类hprt基因内含子的MAR装载于上述结构的载体上时，可以有效地制备具有表达稳定性的重组CHO。

本申请人以前曾报道，整合到hprt位点的外源基因可在HT1080细胞系（一种人源细胞系）中稳定表达（PTL 4：WO 2004/022741和NPL 5：Porter C.G.Itzhaki J.E,Eur.J.Biochem 218,273-281）。此外，众所周知，称为核/基质粘附区(MAR)的稳定因子存在于人类hprt基因的第一内含子中（NPL 14）。基于这些事实，可以估计人类hprt基因中的表达稳定性是通过存在于整合位点周围的MAR的作用来实现的。

附带提及，hprt基因是很多包括CHO的哺乳动物中所共有的一种基因。在CHO的hprt位点中，据估计在选择整合细胞时都遇到了困难。因此，尚未见有hprt位点曾被用作载体整合位点的例子。本领域的普通技术人员通常认为，当外源基因整合到CHO的hprt位点中时，稳定表达就会如在人类细胞中一样发生。不过，CHO的hprt位点的内含子序列与人类hprt基因中的完全不同，本发明人首次阐明了一个出人意料的事实，即在内含子中不存在MAR。事实上，如实施例11所证实的那样，整合到CHO的hprt位点中的外源基因不能被稳定地表达。

基于上述结果，当外源基因整合到CHO的hprt位点中时，本领域的普通技术人员会想到，在CHO内，通过获取人类hprt基因内含子的MAR、将MAR装载于CHO重组载体上，以及将载体整合到CHO的hprt位点中，就可能象在人类细胞中那样实现稳定的表达。沿着这种思路，在相关的现有技术中已经知道，通过将MAR装载于载体上，并且随机地将该载体整合到CHO的染色体中，或者将该载体固定为染色体外的质粒，已经可以实现部分的稳定（NPL 14：MolGen.Genet.,212,301-309(1988)和NPL 15：Molecular Biology Reports,31,85-90(2004)）。在这些相关的现有技术中，采用一种其中MAR装载于载体上的MAR本身不被转录的位置处的结构（NPL 14），或者一种其中MAR本身也利用设有靶蛋白基因转录预期的启动子来进行转录的结构（NPL 15）。

然而，正如下文所述的实施例11中所证实的，出人意料的是，在CHO的hprt位点中，这些结构没有显著的效果，因此无法令人满意地实现长时间的稳定表达。据发现，为了实现在CHO的hprt位点中的稳定表达，如实施例11中所证实的，必要的结构是装载于载体上的MAR只能由原来发生于载体整合位点处的转录来进行转录。

重组CHO细胞/制备方法

根据本发明的重组CHO细胞可以通过将载体导入到CHO细胞中来进行适当的制备。

因此，根据本发明的重组CHO细胞包括整合到hprt位点中的外源靶蛋白基因。在本发明的一个优选的实施方式中，在重组CHO细胞中，hprt基因的功能被灭活。重组CHO细胞对于高水平地稳定生产诸如抗体之类的靶蛋白是有利的。

载体导入

常用的方法均适用于载体的导入。这些方法的示例包括磷酸钙法、电穿孔法、微量注射法、DEAE-葡聚糖法、使用脂质体试剂的方法，以及使用阳离子脂质的脂质转染法。在载体是循环式的时，还可采用通过常规方法将载体线性化、然后再将线性化的载体导入细胞中的方法。

根据载体或靶蛋白的特性，并且考虑到重组细胞的获取效率等因素，还可以适当地运用利用如Cre/LoxP系统或Flp/FRT系统的重组酶的位点特异性导入系统。该实施方式也纳入本发明的范围内。

细胞系的筛选

在根据本发明的制备方法中，在导入完成后，优选进行重组CHO细胞的筛选。筛选步骤可以基于hprt基因的灭活通过负选择来进行。当负标记基因已被导入到重组CHO细胞中时，可以通过负选择与正选择的组合来进行高精度的细胞筛选。

除上述筛选方法外，例如还可以组合式使用启动子陷阱法以及多聚腺苷酸陷阱法。

此外，在根据本发明的制备方法中，可以通过获取重组CHO细胞，然后再将重组CHO细胞移植到化学成分确定的培养基等中，以进行无血清条件下的培养。移植的条件可根据重组细胞的情况合理地确定。

生产靶蛋白的方法

根据本发明的另一个方面，提供了一种生产靶蛋白的方法，该方法包括提供重组CHO细胞，以及培养该细胞来生产靶蛋白。根据该方法，靶蛋白可以有效及稳定的方式获得。

用于培养步骤的培养基可以根据重组CHO细胞的情况从常规培养基中进行合理的选择，但优选是无血清培养基。在考虑到培养成本和分离纯化成本时，培养基优选不补加选择性药物。合适的培养基的示例包括化学成分确定的培养基。

常规的培养方法，例如分批培养法、分批补料培养法以及逆流式培养法都是适用的培养方法。

用于制备重组CHO细胞的各种方法例如可详见F.M.Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,(1989)，其所公开的内容作为参考引用于此。

实施例

下面将结合下列实施例来进一步说明本发明，这些实施例并不限制本发明。

在以下的实验中，诸如通过限制性内切酶进行的反应、PCR反应以及接合反应的反应条件是通过由制造商或《分子克隆》（Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，第二版）中所述的方法推荐的反应条件来设置的。为了获得各种质粒载体DNA，采用DNA测序仪（310Genetic Analyser Applied Bio Systems公司）来确定DNA序列。同源臂1和2分别对应于根据本发明的第一和第二同源DNA片段。

实施例1：CHO细胞的hprt位点DNA序列的信息的获取

CHO-K1细胞系，一种中国仓鼠卵母细胞的细胞系，来自JCRB细胞库（细胞编号：JCRB9018），在CO₂培养箱(37°C,5%CO₂)中采用AMEM培养基（组成：高级MEM(GIBCO)，5%[v/v]FBS，1×GlutaMAX(GIBCO)）进行培养。由此获得的培养液经离心处理，获得CHO-K1细胞颗粒。这些颗粒采用适用于细胞和组织的DNA分离试剂盒（Roche Diagnostics K.K.公司）处理，获得基因组DNA。以基因组DNA为模板，通过聚合酶链反应（PCR；KOD-Plus，Ver.2，TOYOBO公司）来获得CHO-K1细胞的hprt位点的7个DNA片段。这些片段如图1所示。用于扩增这7个片段的PCR引物参照Zu Z等人（Mutat Res.1993.288(2):237-48）所介绍的引物序列进行制备。引物序列如下所示。

片段1正义链引物：

5’-tctgcaggct tcctcctcac accg-3’(SEQ ID No.1)

片段1反义链引物：

5’-acatgtcaag gcaacgccat ttcca-3’(SEQ ID No.2)

片段2正义链引物：

5’-tggaaatggc gttgccttga catgt-3’(SEQ ID No.3)

片段2反义链引物：

5’-caccttttcc aaatcctcga-3’(SEQ ID No.4)

片段3正义链引物：

5’-agcttatgct ctgatttgaa atcagctg-3’(SEQ ID No.5)

片段3反义链引物：

5’-cttcagtctg ataaaatcta cagtca-3’(SEQ ID No.6)

片段4正义链引物：

5’-aagacttgcc cgagatgtca tgaa-3’(SEQ ID No.7)

片段4反义链引物：

5’-ccaagtgagtgattgaaagc acag-3’(SEQ ID No.8)

片段5正义链引物：

5’-tgtgtgtatt caagaatatg catg-3’(SEQ ID No.9)

片段5反义链引物：

5’-gctgagaaaa tttaacagta ttttag-3’(SEQ ID No.10)

片段6正义链引物：

5’-caaatacaag caagaatttc ccagag-3’(SEQ ID No.11)

片段6反义链引物：

5’-ggacttgaac atctagggag-3’(SEQ ID No.12)

片段7正义链引物：

5’-acttaccact taccattaaa tacc-3’(SEQ ID No.13)

片段7反义链引物：

5’-gacaatctat cgaaggctca tagtgc-3’(SEQ ID No.14)

对这7个片段进行DNA测序（BigDye Terminator v3.1,AppliedBiosystems公司）。

如图1所示，确定了CHO-K1细胞系中的hprt位点的DNA序列：

位于外显子1和外显子2之间的内含子1(SEQ ID No.15)，

位于外显子2和外显子3之间的内含子2(SEQ ID No.16)，

位于外显子3和外显子4之间的内含子3(SEQ ID No.17)，

位于外显子4和外显子5之间的内含子4(SEQ ID No.18)，

位于外显子5和外显子6之间的内含子5(SEQ ID No.19)，

位于外显子6和外显子7之间的内含子6(SEQ ID No.20)，

位于外显子7和外显子8之间的内含子7(SEQ ID No.21)，和

位于外显子8和外显子9之间的内含子8(SEQ ID No.22)。

实施例2：靶向载体的构建

为了将抗体基因整合到hprt位点，通过以下方法来构建包括抗体基因且如图2(A)所示的载体（CHO 1k×2抗体载体）。

此外，作为对照，构建了一种载体（HT1080同源臂载体），除了以来自CHO细胞的hprt基因序列的同源DNA片段替换来自于人类hprt基因序列的同源DNA片段以外，其具有与CHO1k×2抗体载体相同的结构，如图2(B)所示。

与人类hprt基因同源的DNA片段的获取

HT1080细胞系，一种人源细胞系，来自JCRB细胞库（目录号：IF050354），采用GFX基因组血液DNA纯化试剂盒（AmershamBiosciences公司）进行处理，获得基因组DNA。接下来，采用基因组DNA为模板，通过PCR反应（KOD-Plus-，TOYOBO公司）来克隆作为标靶的hprt基因同源的DNA片段（HA1和HA2）。如下文中的图3所示，HA1和HA2设置为与包括hprt基因内的外显子3的区域同源的序列。在该PCR反应中使用了以下的引物序列。

HA1正义链引物：

5’-CCTGCAGGTCGCGATTGGTACTTGTTCAGCTTTATTCAAG-3’(SEQ ID No.23)

HA1反义链引物：

5’-GTCGACAAGGACGCGTTCTGATAAAATCTACAGTCATAGGA-3’(SEQ ID No.24)

HA2正义链引物：

5’-GTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCTCCGGAGACTGAAGAGCTATTGTGTGAGTAT-3’(SEQ ID No.25)

HA2反义链引物：

5’-ACATGTTCTCTTAAGTCGCGAAGTAGTGTTATGATGTATGGGCATA-3’(SEQ ID No.26)

在PCR反应中，限制性内切酶Sse 8387I和Nru I的识别位点被添加到HA1正义链引物的5'端。同样地，Sal I和Mlu I的识别位点被添加到HA1反义链引物的5'端，Sal I和Acc III的识别位点被添加到HA2正义链引物的5'端，Pci I和Nru I的识别位点被添加到HA2反义链引物的5'端。

通过PCR反应，从pQBI25质粒载体的DNA（Wako Pure ChemicalIndustries公司）中克隆含有作为大肠杆菌内的复制起源的ori序列和氨苄青霉素抗性基因的DNA序列。该PCR反应使用了以下的引物序列。在该PCR反应中，限制性内切酶Pci I和Sse 8387I的识别位点被添加到正义链引物的5'端和3'端。

Ecoli正义链引物：

5’-ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAAC-3’(SEQ ID No.27)

Ecoli反义链引物：

5’-CCTGCAGGGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGC-3’(SEQ ID No.28)

HA1、HA2以及含有ori序列和氨苄青霉素抗性基因的DNA序列分别通过PCR反应来进行克隆。这三个DNA序列被限制性内切酶PciI、Sse 8387I和Sal I切割，并进行接合反应以获得pHA12质粒载体。然后，PHA12质粒载体再被限制性内切酶Mlu I和Acc III切割，获得其中HA2、包含ori序列和氨苄青霉素抗性基因的DNA序列以及HA1按该顺序从5'端进行连接的DNA序列1。

此外，从pcDNA3,1-hygro(+)（体外）中获得含有限制性内切酶Bam HI识别位点的DNA片段。限制性内切酶Mlu I和Acc III位点被添加到端部，接着再通过PCR扩增来获得DNA序列2。该片段连接到DNA序列1上，以获得p23HA12质粒载体。

碱基载体的构建

p23HA12质粒载体采用Mlu I和Bam]HI进行切割。将通过对链接体2-s oligo和链接体2-a oligo进行退火处理所得的DNA片段插入到其中，以获得碱基载体II。

链接体2-s oligo：

5’-CGCGTatcTCTAGAataATCGATagaAAGCTTacaG-3’(SEQ ID No.29)

链接体2-a oligo：

5’-GATCCtgtAAGCTTtctATCGATtatTCTAGAgatA-3’(SEQ ID No.30)

通过PCR反应，从pQBI15质粒载体的DNA（Wako Pure ChemicalIndustries公司）中扩增含有SV40启动子、多聚腺苷酸信号序列和新霉素抗性基因（包含SV40、neo R以及合成多聚腺苷酸(合成pA)的表达盒）的DNA序列3。在该PCR反应中使用了以下的引物序列。在PCR反应中，限制性内切酶Xba I的识别位点被添加到正义链引物的5'端，合成多聚腺苷酸和Cla I的识别位点添加到正义链引物的3'端。

neo R正义链引物：

5’-ccttTCTAGActtctgaggcggaaagaacc-3’(SEQ ID No.31)

neo R反义链引物：

5’-ttATCGATtCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTT

ATTgtgggcgaagaactccagca-3’(SEQ ID No.32)

碱基载体II采用限制性内切酶Xba I和Cla I切割，并且将DNA序列3接合到其中来获得碱基载体+Neo R质粒。

抗体重链表达盒的构建

以持有重链可变区的质粒为模版（"Cloning of cDNA andCharacterization of Anti-RNase A Monoclonal Antibody 3A21″:Journalof Fermentation and Bioengineering.Vol.82,No.3,pp.312-314,1999），采用IGH-3A21s和IGH-3A21a1的引物集通过PCR来扩增可变区，以获得DNA序列4。

IGH-3A21s引物：

5’-TAAAAGGTGTCCAGGATGTGCAGTTTCAGG-3’(SEQ ID No.33)

IGH-3A21a1引物：

5’-GAGGCCGATGAAACAGTGACCAGAGTCCCT-3’(SEQ ID No.34)

采用通过ISOGEN（NIPPON GENE公司）从RPMI8226培养细胞中提取出的RNA用作模板，采用One-Step RT-PCR试剂盒（QIAGEN公司）进行逆转录-聚合酶链(RT-PCR)反应。以所得mRNA为模板，采用IGH-Cs和IGH-Ca的引物集通过PCR来扩增恒定区，以获得DNA序列5。

IGH-Cs引物：

5’-CATCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT-3’(SEQ ID No.35)

IGH-Ca引物：

5’-TTAAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAG-3’(SEQ ID No.36)

然后，以DNA序列4为模板，采用IGH-LS和IGH-Va的引物集进行PCR扩增，以获得其中添加有分泌信号的DNA序列6。

IGH-LS引物：

5’-GGTCGCCACCATGGAGTTTGGACTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGGATGTG-3’(SEQ ID No.37)

IGH-Va引物：

5’-GCCCTTGGTGGAGGCCGATGAAACAGTGAC-3’(SEQ ID No.38)

以DNA序列5和DNA序列6为模板，采用IGH-Vs和IGH-Ca引物集进行PCR拼接，以获得含有两个彼此连接的序列的DNA序列7。

IGH-Vs引物：

5’-TTCCGGTACCGGTCGCCACCATGGAGTTTG-3’(SEQ ID No.39)

使用Prime STAR MAX（Takara Shuzo公司），采用NotI-site-s/NotI-site-a引物集来对pmaxGFP质粒(amaxa)进行PCR反应以导入突变体，从而获得含有被导入到正好在CMV启动子之前的NotI位点的pmaxGFP+NotI质粒。

NotI-site-s引物：

5’-ATGCggccgcATGTCAATATTGGCCATT-3’(SEQ ID No.40)

NotI-site-a引物：

5’-GACATgcggccGCATGGGAGGAGACCGGG-3’(SEQ ID No.41)

然后以pcDNA3.1-hygro(+)（体外）为模板，采用NotI-spacerA-s/NotI-spacerA-a引物集对0.5kbp的片段进行扩增，并插入到pmaxGFP+NotI的NorI位点中，以获取pmaxGFP+spacerA质粒。

NotI-spacerA-s引物：

5’-ttGCGGCCGCgaaaaagcctgaactcaccg-3’(SEQ ID No.42)

NotI-spacer A-a引物：

5’-ttGCGGCCGCgacggtgtcgtccatcacag-3’(SEQ ID No.43)

以DNA序列7为模板，采用KpnI-IGH-s/BglII-IGH-a引物集对重链进行扩增，接着再进行pmaxGFP+spacerA中的GFP替换，从而获得pmax+spacerA+IgH引物。

KpnI-IGH-s引物：

5’-ccttGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCaTGGAGTTTGGACTGAGCTGGG-3’(SEQ ID No.44)

BglII-IGH-a引物：

5’-ccttAGATCTtcatttacccggagacaggg-3’(SEQ ID No.45)

以pmax+spacerA+IgH为模板，采用MluI-spA(IgH)-s2/MluI-CMV-IgHL-SVpA-a引物集进行PCR扩增。扩增产物克隆到pCR-BluntII-TOPO载体（体外），接着再用限制性内切酶Mlu I切割，从而获得DNA序列8（重链盒）。

MluI-spA(IgH)-s2引物：

5’-ccttACGCGTgacggtgtcgtccatcacag-3’(SEQ ID No.46)

MluI-CMV-IgHL-SVpA-a引物：

5’-cttACGCGTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3’(SEQ ID No.47)

抗体轻链表达盒的构建

同样地，将持有轻链可变区的质粒用作模板，采用IGL-3A21s1和IGL-3A21a1引物集通过PCR对可变区进行扩增，从而获得DNA序列9。

IGL-3A21s1引物：

5’-CCCAGGTGCCAGATGTGACATCAAGATGAC-3’(SEQ ID No.48)

IGL-3A21a1引物：

5’-GCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC-3’(SEQ ID No.49)

采用通过ISOGEN从RPMI8226培养细胞中提取的RNA作为模板，利用One-Step RT-PCR试剂盒进行RT-PCR扩增。以所得mRNA为模板，采用IGL-Cs和IGL-Ca引物集通过PCR对恒定区进行扩增，以便获取DNA序列10。

IGL-Cs引物：

5’-TGGAAATAAAACGAACTGTGGCTGCACCAT-3’(SEQ ID No.50)

IGL-Ca引物：

5’-TTAAGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGT-3’(SEQ ID No.51)

以DNA序列9为模板，采用IGL-LS和IGL-3A21a引物集进行PCR扩增，以获得其中添加有分泌信号的DNA序列11。

IGL-LS引物：

5’-GGTCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGACA-3’(SEQ ID No.52)

IGL-3A21a引物：

5’-GCCACAGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTC-3’(SEQ ID No.53)

以DNA序列10和DNA序列11为模板，采用IGL-Vs和IGL-Ca引物集进行PCR拼接，获得包含两个互相连接的产物的DNA序列12。

IGL-Vs引物：

5’-CCTTGGTACCGGTCGCCACCATGGACATGA-3’(SEQ ID No.54)

然后，以pcDNA 3.1-hygro(+)（体外）为模板，采用NotI-spacerB-s/NotI-spacerB-a引物集对0.5kbp片段进行扩增，获得pmaxGFP+spacerB质粒。

NotI-spacerB-s引物：

5’-ttGCGGCCGCctgtgatggacgacaccgtc-3’(SEQ ID No.55)

NotI-spacerB-a引物：

5’-ttGCGGCCGCctattcctttgccctcggac-3’(SEQ ID No.56)

然后，以DNA序列12为模板、采用KpnI-IGH-s/BglII-IGH-a引物集对轻链进行扩增，接着再进行pmaxGFP+spacerB中的GFP替换，以便获得pmax+spacerB+IgL质粒。

KpnI-IGL-s引物：

5’-ccttGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCatggacatgagggtccccgc-3’(SEQ ID No.57)

BglII-IGL-a引物：

5’-ccttAGATCTctaacactctcccctgttga-3’(SEQ ID No.58)

以pmax+spacerB+IgL为模板，用HindIII-spB(IgL)-s2/Hin3-CMV-IgHL-SVpA-a引物集进行PCR扩增。扩增产物克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中，接着再用限制性内切酶Hind III进行切割，以获得DNA序列13（轻链盒）。

HindIII-spB(IgL)-s2引物：

5’-ccttAAGCTTctattcctttgccctcggac-3’(SEQ ID No.59)

Hin3-CMV-IgHL-SVpA-a引物：

5’-cttAAGCTTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3’(SEQ ID No.60)

碱基载体+neo R质粒用限制性内切酶Hind III切割，并插入DNA序列13（轻链盒）中，以获得碱基载体+neoR+IgL质粒。

与CHO细胞中的hprt基因同源的DNA片段的获取

将CHO-K1细胞的基因组DNA用作模板，与作为标靶的hprt基因同源的DNA片段（CHA1和CHA2）通过PCR反应（KOD-Plus-Ver2,TOYOBO公司）进行克隆。如下文中所述的图3所示，CHA1和CHA2设置为与包含hprt基因中的外显子3的区域同源的序列。在PCR反应中使用了以下的引物序列。

SseNru-CHA1-1k-s引物：

5’-ttCCTGCAGGTCGCGAaggagtttattagaggaaatat-3’(SEQ ID No.61)

MluI-CHA1-r引物：

5’-ttACGCGTtgataaaatctacagtcatggg-3’(SEQ ID No.62)

Bam-CHA2-s引物：

5’-ttGGATCCgactgaagagctactgtgta-3’(SEQ ID No.63)

PciNru-CHA2-1k-r引物：

5’-ttACATGTTCGCGAatcagatccctgggactgga-3’(SEQ ID No.64)

CHO 1kx×2抗体载体的获取

采用Bam-CHA2-s/PciNru-CHA2-1k-r引物集扩增的CHA2序列用限制性酶Bam HI和Pci I切割，接着再进行碱基载体+neoR+IgL质粒中的HA2序列的替换。然后，用SseNru-CHA1-1k-s/MluI-CHA1-r引物集扩增的CHA1序列用限制性酶Sse8387I和Mlu I切割，接着再进行HA1序列的替换。接下来，将DNA序列8（重链盒）插入到限制性内切酶Mlu I位点中，以获得如图2(A)所示的CHO 1k×2抗体载体。

HT1080同源臂载体的获取

将DNA序列8（重链盒）插入到碱基载体+neoR+IgL+质粒中的限制性内切酶Mlu I位点，以获取如图2(B)所示的HT1080同源臂载体。

实施例3：载体到细胞中的导入

载体线性化

将CHO 1k×2抗体载体和HT1080同源臂载体用Endofree PlasmidMaxi试剂盒（QIAGEN公司）进行纯化，并用Nru I进行切割，然后溶于无菌水中，获得2g/L的浓度，所得溶液用于下述转染实验中。

转染和筛选

采用核转染T溶液（amaxa公司）将CHO-K1细胞调整至1×10⁶个细胞，并与2μg线性化质粒载体混合。接下来，将由此获得的混合溶液和Nuceofector II（amaxa公司）用于按照程序U-023施加电压。对每个载体进行三次转染。转染的细胞以350个细胞/孔的方式接种到96孔板中，并放置在37℃及5%CO₂的培养箱中培养（培养基：加有5%FBS和1×Glutamax(GIBCO)的高级培养基(GIBCO)），转染2天后添加G418（体外）（终浓度：500μg/mL）。

转染4天后添加G418（终浓度：500g/mL）和6TG（终浓度：50μM）（Wako Pure Chemical Industries公司），接着再培养6天。培养后对所有孔进行确认，并分离G418/6TG抗性克隆。结果如表1所示。

结果如表1所示。通过CHO 1k×2抗体载体所得的G418/6TG抗性克隆的数量为6克隆/3×10⁶细胞。另一方面，在HT1080同源臂载体内，没有获得G418/6TG抗性克隆。

表1

实施例4：通过基因组PCR进行分析

采用DNA分离试剂盒（Roche公司），从由CHO 1k×2抗体载体的转染中获得并具有G418和6TG抗性的克隆中提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，通过以下PCR反应来确认目标hprt位点的特异性重组区。

图3(A)是详细解释通过基因组PCR进行同源重组反应分析的典型示意图。

hprt基因(1)的同源重组中的靶区域(2)设置为包含外显子3(3)。载体DNA(6)中的CHA1(4)、CHA2(5)以及保持于CHA1(4)与CHA2(5)之间的抗体重链序列(7)、新霉素抗性基因(8)和抗体轻链序列(9)通过同源重组整合到该区域中。

含有CHA1(4)和一部分抗体重链序列(7)的DNA(1688bp DNA)以及含有CHA2(5)和一部分抗体轻链序列(9)的DNA(1752bp DNA)只能通过同源重组从基因组中获取，并因此可以成为同源重组的指标。

因此，如图3(A)所示的1688bp DNA被设置为CHA1和靶区域之间的同源重组的指标，并且DNA采用如下所示的引物CHPRTs/NotI-spacerA-s通过PCR反应进行检测。另一方面，如图3(A)所示的1752bp DNA设置为CHA2和目标hprt位点之间的同源重组的指标，并且该DNA采用如下所示的引物IGL Cs/CHA2-seq-a1通过PCR反应进行检测。

CHPRTs引物：

5’-TGTTCCTGTGCATACTAGGC-3’(SEQ ID No.65)

CHA2-seq-a1引物：

5’-CCAGAGAAATTATTTGCCACCAGC-3’(SEQ ID No.66)

接下来，由此获得的PCR扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳法进行分析。结果如图3(B)和3(C)所示。

在图3(B)和3(C)中，数字1-6代表采用CHO 1k×2抗体载体所获得的克隆。1688bp和1752bp这两个PCR扩增产物都在所得的6个克隆中的5个克隆中得以确认，表明发生了同源重组反应。

实施例5：南方杂交分析

通过以下南方杂交来确认通过在实施例4中所获得的5个克隆中的位置特异性重组来将CHO 1k×2抗体载体整合到目标hprt位点中。

图4(A)是详细解释实施例5中的南方杂交的典型示意图。

如图4(A)所示，hprt基因(1)的同源重组中的靶区域(2)设置为包含外显子3(3)，而同源臂1(CHA1)(4)和同源臂2(CHA2)(5)则设置为与靶区域中的两个相邻区域同源。Pci I限制性内切酶位点定位于成可保持其间的靶区域(2)，且不在靶区域(2)内。另一方面，在CHO 1k×2抗体载体中不存在Pci I限制性内切酶位点。CHO 1k×2抗体载体中的新霉素抗性基因序列(6)被设计为使得NR探针可以杂交。

如图4(A)所示，在检测到10488bp DNA时，从Pci I限制性内切酶位点的位置及DNA序列的链长度中可以确定CHO 1k×2抗体载体已经整合到克隆的hprt位点中。

NR探针的制备

按照以下过程来合成具有针对CHO 1k×2抗体载体中的新霉素抗性基因的互补序列的NR探针。首先，通过PCR对CHO 1k×2抗体载体中的新霉素抗性基因编码序列的全部长度进行扩增，接着TA克隆到pGEM T质粒载体（Promega公司）中。接下来，采用PCR DIG探针合成试剂盒（Roche公司，引物：M13正/反向引物）来制备DIG（地高辛配基）标记的探针。

制膜

每个细胞克隆的基因组DNA都从6TG抗性集落中提取，并采用Pci I限制性内切酶切割。所切开的基因组DNA(5μg)在0.6%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并转覆到尼龙膜（Hybond N+膜，AmaershamBiosciences公司）上。由此获得的膜在80℃条件下处理2小时，以将DNA固定于膜上。

杂交

用NR探针对该膜进行杂交。在这种情况下，依照DIG实用手册（Roche公司）来进行预杂交、杂交和探针检测。

如图4(B)所示，在所有进行分析的5个克隆中，采用NR探针来检测10488bp DNA片段。

实施例6：通过重组细胞制备蛋白

重组克隆的培养以及培养基取样

首先，重组克隆以每板2×10⁵个细胞的方式接种，并在37℃和5%的CO₂存在的条件下在含有G418（终浓度：500μg/mL）、6-TG（终浓度：50μM）以及FBS（5％，Japan Bio Serum公司）的10mL高级培养基中培养（体外）。从培养开始第五天，收集培养基。所收集的培养基用于以下的酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。

通过ELISA进行定量分析

采用Human IgG EIA试剂盒（预涂覆）（Takara Shuzo公司)，通过测量450nm处的吸光率来测定所收集的培养基中的IgG的量。

结果如图5所示。在所测量的3个克隆中，每板IgG的量平均为1.29±0.18μg/培养皿，且CV值为14.2％。

实施例7：采用具有2.5kbp链长的同源DNA片段的载体的同源重组与CHO细胞中的hprt基因同源的2.5kbp的DNA片段的获取

为了制造具有链长为2.5kbp的同源DNA片段且如图6所示的CHO 2.5k×2抗体载体，采用CHO-K1细胞的基因组DNA为模板并通过PCR反应（KOD-Plus-Ver2，TOYOBO公司）对与目标hprt基因同源的DNA片段（CHA1-2.5和CHA2-2.5）进行克隆。如下文所述的图7(A)所示，CHA1-2.5和CHA2-2.5设置为与含有hprt基因的外显子3的区域同源的序列。在所述PCR反应中，使用了如实施例2所述的MluI-CHA1-r引物和Bam-CHA2-s引物，以及以下引物。

SseNru-CHA1-2.5k-s引物：

5’-ttCCTGCAGGTCGCGAgtctgtgtgtatgtttgtgataggc-3’(SEQ ID No.67)

NcoNru-CHA2-2.5k-r引物：

5’-ttCCATGGTCGCGAtgaaggttatagagcataggggacc-3’(SEQ ID No.68)

CHO 2.5k×2抗体载体的获取

由Bam-CHA2-s/NcoNru-CHA2-2.5k-r引物集扩增的CHA2-2.5序列采用限制性酶Bam HI和Nco I切割，接着再进行碱基载体+neo R+IgL质粒中的HA2序列的替换。然后，由SseNru-CHA1-2.5k-s/MluI-CHA1-r引物集扩增的CHA1-2.5序列采用限制性内切酶Sse8387I和Mlu I切割，接着再进行HA1序列的替换。接下来，将DNA序列8（重链盒）插入到限制性内切酶Mlu I位点中，以获得如图6所示的CHO 2.5k×2抗体载体。

CHO 2.5k×2抗体载体整合的克隆的获取

采用与实施例3相同的方式来纯化和线性化CHO 2.5k×2抗体载体。线性化的载体溶于无菌水中，获得2g/L的浓度，接着再导入到1×10⁶个细胞中。

接下来，采用与实施例3相同的方式用选择性药物进行筛选。结果，分离出5个克隆的G418/6TG抗性克隆。

用基因组PCR进行分析

从通过CHO 2.5k×2抗体载体的转染获得的G418和6TG抗性克隆中提取基因组DNA，并且以基因组DNA为模板通过以下PCR反应来确定目标hprt位点的位置特异性重组。

图7(A)是用于详细解释通过基因组PCR进行同源重组反应的分析的典型示意图。

hprt基因(1)中的同源重组的靶区域(2)设置为含有外显子3(3)。载体DNA(6)中的CHA1-2.5(4)、CHA2-2.5(5)以及保持于CHA1-2.5(4)与CHA2-2.5(5)之间的抗体重链序列(7)、新霉素抗性基因(8)和抗体轻链序列(9)通过同源重组整合到该区域。

含有CHA1-2.5(4)和一部分抗体重链序列(7)的DNA(3075-bpDNA)以及含有CHA22.5(5)和一部分抗体轻链序列(9)的DNA(3228-bp DNA)只能通过同源重组从基因组中获得，因此可以成为同源重组的指标。

因此，图7(A)所示的3075-bp DNA设置为CHA1-2.5和靶区域之间的同源重组的指标，而DNA则是采用引物CHA1-seq-s11/NotI-spacerA-s通过PCR反应进行检测。另一方面，图7(A)所示的3228-bpDNA设置为CHA2-2.5和目标hprt位点之间的同源重组的指标，而DNA则是采用引物IGL Cs/CHA2-seq-a4通过PCR反应进行检测。

CHA1-seq-s11引物：

5’-GACACATGCAGACAGAACAG-3’(SEQ ID No.69)

CHA2-seq-a4引物：

5’-GTTTGCTAACACCCCTTCTC-3’(SEQ ID No.70)

接下来，由此获得的PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳法进行分析。结果如图7(B)和(C)所示。

在图7(B)和(C)中，数字1-5代表由CHO 2.5k×2抗体载体获得的克隆。3075-bp和3228-bp这两个PCR扩增产物在所获得的5个克隆之中的4个克隆中均得以确认，说明发生了同源重组反应。

通过南方杂交进行分析

通过以下南方杂交来确认CHO 2.5k×2抗体载体到在实施例7中所得的4个克隆中的目标hprt位点中的位置特异性整合。

图8(A)是详细解释实施例7中的南方杂交的典型示意图。

如图8(A)所示，hprt基因(1)中的同源重组的靶区域(2)设置为包含外显子3(3)，而同源臂1(CHA1-2.5)(4)和同源臂2(CHA2-2.5)(5)则设置为与靶区域中的两个相邻区域同源。只有一个Eco RV限制性内切酶位点存在于靶区域(2)的周围，且只有一个Eco RV限制性内切酶位点存在于靶区域内。另一方面，在CHO 2.5k×2抗体载体中，只有一个Eco RV限制性内切酶位点存在于CHA2-2.5中。CHO 2.5k×2抗体载体中的新霉素抗性基因序列(6)设计成使得NR探头可以进行杂交。

如图8(A)所示，在检测到12302-bp DNA时，从Eco RV限制性内切酶位点的位置以及DNA序列的链长中可以确定CHO 2.5k×2抗体载体已经整合到克隆的hprt位点中。

探针的制作

以与实施例5相同的方式提供具有针对CHO 2.5k×2抗体载体中的新霉素抗性基因的互补序列的NR探针。

制膜

每个细胞克隆的基因组DNA从6TG抗性集落中提取，并用EcoRV限制性内切酶切割。所切出的基因组DNA采用与实施例5中相同的方式进行南方杂交分析。

如图8(B)所示，在所分析的所有4个克隆中，通过NR探针检测12302-bp DNA片段。

实施例8：CHO细胞的两个染色体中的同源重组的确认

通过基因组PCR进行残留野生型hprt基因的确认

采用从CHO 1k×2抗体载体和CHO 2.5k×2抗体载体的同源重组克隆中提取的基因组DNA为模板，通过以下PCR反应来确认是否存在野生型hprt基因的残留。

图9(A)是用于详细解释用于确认残留野生型hprt基因的基因组PCR的典型示意图。

首先，图9(A)的左侧部分显示了具有两个X染色体的野生型CHO细胞中的PCR。hprt基因(1)的同源重组中的靶区域(2)设置为包含外显子3(3)。在未导入载体的野生型细胞中，靶区域的DNA(2322bp)可以通过PCR反应进行扩增，这样便可以此为指标来确认野生型hprt基因的残留。

图9(A)的中心部分的图显示出包含整合到一个X染色体的hprt位点中的载体的异质结型同源重组细胞中的PCR。在一个染色体中，载体DNA(7)（含有CHA1(4)、CHA2(5)以及保持于CHA1(4)与CHA2(5)之间的抗体重链、新霉素抗性基因和抗体轻链序列）通过同源重组整合到靶区域(2)中。另一方面，另一个染色体保持有靶区域，该靶区域中的DNA(2322bp)可以通过PCR反应进行扩增，从而能够确认野生型hprt基因的残留。

另一方面，如图9(A)中的右侧部分所示，在包括整合到两个X染色体中的载体的同质结型同源重组细胞中，只有重组DNA被表达，并且靶区域中的DNA(2322bp)未通过PCR反应扩增。

基于之前的理解，如图9(A)所示的2322-bp DNA被设置为指标，并且为了DNA检测，采用引物CHPRTs/CHA2-seq-a1进行PCR反应。

接下来，由此获得的PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳法进行分析。结果如图9(B)所示。

在图9(B)中，WT代表野生型细胞，1k×2载体整合的克隆（1、2、3、5和6）代表在实施例4中所得的CHO 1k×2抗体载体整合的克隆，而2.5k×2载体整合的克隆(1-4)代表在实施例7中所得的CHO 2.5k×2抗体载体整合的克隆。2322-bp PCR扩增产物被确认为来自野生型细胞，并由此证实了野生型hprt基因的存在。另一方面，在所有进行分析的重组克隆中，任何2322-bp PCR扩增产物都没得到确认，表明重组细胞为一种其中载体整合到两个X染色体中的同质结型。

基于该结果可以确认，使用根据本发明的载体，能够高频率地获取包含有整合到两个X染色体的两个hprt位点中的靶蛋白基因的重组克隆。

实施例9：采用CHO内源性启动子通过重组载体克隆进行的抗体的长时间稳定表达

CHO CHEF1P载体的制备

以CHO-K1基因组DNA为模板，采用EF1aP-MluI-F/EF1aP-XbaI-R引物集来扩增CHEF1α启动子。

EF1aP-MluI-F引物：

5’-AGAACGCGTCCACACAATCAGAACCACA-3’(SEQ ID No.71)

EF1aP-XbaI-R引物：

5’-GACGATCTAGAGGTGGTTTTCACAACA-3’(SEQ ID No.72)

此外，以CHO 2.5k×2H-neo-L质粒为模板，采用CMV-seq-s/MluI-CMV-IgHL-SVpA-a引物集来扩增IgH基因。

CMV-seq-s引物：

5’-AGGGACTTTCCATTGACGTC-3’(SEQ ID No.73)

MluI-CMV-IgHL-SVpA-a引物：

5’-cttACGCGTAACGTCTCGCCCTTTGGTCTC-3’(SEQ ID No.74)

接下来，由此获得的CHEF1αP和IgH基因分别用XbaI和NheI切割，接着再接合。之后，对CHEF1αP+IgH基因的条带进行凝胶提取，然后将CHEF1αP+IgH基因克隆到TOPO载体（体外），接着采用MluI切割来获得CHEF1αP+IgH基因盒。

另一方面，以CHO-K1基因组DNA为模板，采用EF1aP-HindIII-F/EF1aP-HindIII-R引物集来扩增CHEF1α启动子。

EF1aP-HindIII-F引物：

5’-AGAAAGCTTCCACACAATCAGAACCACA-3’(SEQ ID No.75)

EF1aP-HindIII-R引物：

5’-GACGAATTCGCGGTGGTTTTCACAACA-3’(SEQ ID No.76)

以CHO 2.5k×2_H-neo-L质粒为模板，采用IgLser-EcoRI-F/IgLser-HindIII-R引物集来扩增IgL基因。

IgLser-EcoRI-F引物：

5’-TATGAATTCGTCGCCACCATGGACAT-3’(SEQ ID No.77)

IgLser-HindIII-R引物：

5’-TGTAAGCTTTACCACATTTGTAGAGGTTTT-3’(SEQ ID No.78)

由此获得的CHEF1αP和IgL基因用EcoRI切割，接着再接合。此后，对CHEF1αP+IgL基因的条带进行凝胶提取，并将CHEF1αP+IgL基因克隆到TOPO载体中，接着再用HindIII切割，以获得CHEF1αP+IgL基因盒。

CHO 2.5k×2_H-neo载体用HindIII切割，再脱磷，并将CHEF1αP+IgL基因盒插入其中，以获得H-neo-EF1L载体。接下来，在MluI切割和脱磷后，将CHEF1αP+IgH基因盒插入到其中，以获得如图10所示的CHO CHEF1P载体。

CHO CHEF1P载体重组CHO细胞的获取

以与实施例3相同的方式对所构建的CHO CHEF1P载体进行线性化、导入到CHO细胞中和筛选，以获得CHO CHEF1P载体重组CHO细胞。

CHO CHEF1P载体克隆的抗体生产中的长时间稳定性的确认

在7°C和5%CO₂条件下对所获得的CHO CHEF1P载体重组CHO细胞进行传代培养（无选择性药物的培养基：加有5%FBS和1xGlutamax(GIBCO)的高级培养基），并将其及时地用于抗体产量的测量。

细胞在传代培养过程中被剥离，以2×10⁶细胞的量接种到100mm的培养皿中，在37°C和5%CO₂条件下培养一整夜。所培养的细胞被剥离，调整为3×10⁵细胞/毫升。按照每孔1.5毫升的量将细胞接种到12孔板中并进行培养。从培养开始经过24小时后，将培养基完全除去。加入新鲜培养基（1.5毫升），接着再培养24小时。收集全部的培养基，并用ELISA分析来测量IgG的量。粘附在孔底部的细胞被剥离，计算细胞个数。

结果如图11所示。即使在无选择性药物条件下传代培养16周后，包含有整合到hprt位点中的CHO CHEF1P载体的CHO细胞的抗体生产率仍保持不变，生产率不会降低。

实施例10：通过具有链长为2.5kbp的同源DNA片段且表达抗体重链的载体来获得同源重组

表达抗体重链的重组载体的制备

实施例7中所制备的CHO 2.5k×2抗体载体用限制性内切酶HindIII切割，再进行自身环化，以制备如图13所示的CHO 2.5kb×2重链载体。

CHO 2.5kb×2重链载体重组CHO细胞的获取

以与实施例3相同的方式对所构建的CHO 2.5kb×2重链载体进行线性化、导入到CHO细胞中和筛选，以获得CHO 2.5kb×2重链载体重组CHO细胞。结果，每10⁷个细胞获得130个重组CHO细胞。

实施例11：通过具有来自人类的hprt位点内含子的MAR且表达抗体重链的载体来获得CHO细胞的稳定表达

MAR非转录载体的制备

以实施例2所提供的HT1080细胞系（一种人源细胞系）的基因组DNA为模版，采用XbaI-hprtMAR-s/XbaI-hprtMAR-a引物集来扩增人类hprt基因内含子的MAR(hprtMAR1)。

XbaI-hprtMAR-s引物：

5’-ttTCTAGAtagttatgagcccatgtccc-3’(SEQ ID No.79)

XbaI-hprtMAR-a引物：

5’-ttTCTAGAcggtgaaatcctgtctctac-3’(SEQ ID No.80)

在实施例7中制得的CHO 2.5k×2抗体载体用限制性内切酶XbaI切割，并且将hpMAR1插入到其中，以获得如图13(A)所示的MAR非转录载体。

MAR转录载体的制备

以HT1080（一种人源细胞系）的基因组DNA为模版，采用AscI-hprtMAR-s/MluI-hprtMAR-a引物集来扩增人类hprt基因内含子的MAR(hprtMAR2)。

AscI-hprtMAR-s引物：

5’-ttGGCGCGCCtagttatgagcccatgtccc-3’(SEQ ID No.81)

MluI-hprtMAR-a引物：

5’-ttACGCGTcggtgaaatcctgtctctac-3’(SEQ ID No.82)

在实施例7中制得的CHO 2.5k×2抗体载体用限制性内切酶MluI切割，且将hprtMAR2插入到其中。然后，产物用限制性内切酶MluI切割，将实施例2的抗体重链表达盒插入到其中，以获得如图13(B)所示的MAR转录载体。

MAR CMV转录载体的制备

以HT1080（一种人源细胞系）的基因组DNA为模版，采用BglII-hprtMAR-s/BglII-hprtMAR-a引物集来扩增人类hprt基因内含子的MAR(hprtMAR3)。

BglII-hprtMAR-s引物：

5’-ttAGATCTtagttatgagcccatgtccc-3’(SEQ ID No.83)

BglII-hprtMAR-a引物：

5’-ttAGATCTcggtgaaatcctgtctctac-3’(SEQ ID No.84)

在实施例2中制得的pCR-BluntII-TOPO+抗体重链表达盒用限制性内切酶BglII切割，且将hprtMAR3插入到其中。该产物采用限制性内切酶MluI切取出，以获得抗体重链+MAR表达盒。

在实施例2中制得的pCR-BluntII-TOPO+抗体轻链表达盒用限制性内切酶BglII切割，并将hprtMAR3插入到其中。该产物采用限制性内切酶HindIII切取出，以获得抗体轻链+MAR表达盒。

在实施例7中制得的CHO 2.5k×2抗体载体用限制性内切酶MluI切割，且将抗体重链+MAR表达盒插入到其中。接下来，该产物用限制性内切酶HindIII切割，且将抗体轻链+MAR表达盒插入到其中，以获得如图13(C)所示的MAR CMV转录载体。

MAR载体重组CHO细胞的获取

以与实施例3中相同的方式将所构造的MAR非转录载体、MAR转录载体以及MAR CMV转录载体进行线性化、导入到CHO细胞中和筛选，以获得重组CHO细胞。

具有来自人类hprt位点内含子的MAR且表达抗体重链的载体克隆的抗体生产稳定性的确认

采用与实施例9中相同的方式，对由如图13(A)、(B)和(C)所示的MAR载体所得的重组CHO克隆的抗体产率进行分析。

结果如图14所示。从该结果中可以看出，可以维持抗体产率的克隆是唯一具有下述载体的克隆，在该载体中，只通过位于被整合到其中的载体整合位点处的hprt基因的转录来转录人类hprt的MAR。对于通过具有人类hprt的MAR非转录结构的载体以及具有靶蛋白基因和MAR同时被CMV启动子转录的结构的载体所获得的克隆，在7天的培养过程中其抗体产率降低。

实施例12：通过具有链长度为200b和500b的同源DNA片段且表达抗体重链的载体获得同源重组

CHO 200b×2载体和CHO 500b×2载体的制备

以CHO-K1细胞的基因组DNA为模板，采用SseNru-CHA1-200-s/MluI-CHA1-r引物集和Bam-CHA2-s/PciNru-CHA2-200-r引物集，分别通过PCR反应来克隆靶hprt基因的同源DNA片段（CHA1-200和CHA2-200）。CHA1-200和CHA2-200设置为与含有hprt基因的外显子3的区域同源的序列。在PCR反应中使用了以下的引物序列。

SseNru-CHA1-200-s引物：

5’-ttCCTGCAGGTCGCGAtggaatcttctattcctgattt-3’(SEQ ID No.85)

PciNru-CHA2-200-r引物：

5’-ttACATGTTCGCGAtcagcactcaggagtcagag-3’(SEQ ID No.86)

实施例2中的碱基载体+neo R+IgL质粒采用限制性酶Bam HI和PciI切割，接着再进行CHA2-200片段的替换。然后，该产物用限制性酶Sse8387I和Mlu I切割，接着再进行CHA1-200片段的替换。最后，将DNA序列8（重链盒）插入到限制性内切酶Mlu I位点，以获得如图15(A)所示的具有200b的同源臂长的CHO 200b×2载体。

另一方面，采用SseNru-CHA1-500-s/MluI-CHA1-r引物集和Bam-CHA2-s/PciNru-CHA2-500-r引物集，分别通过PC反应对目标hprt基因的同源DNA片段（CHA1500和CHA2500）进行克隆。

SseNru-CHA1-500-s引物：

5’-ttCCTGCAGGTCGCGAgatgcctagcatgtacctgg-3’(SEQ ID No.87)

PciNru-CHA2-500-r引物：

5’-ttACATGTTCGCGAtaagtacaaatccatcttgggtgac-3’(SEQ ID No.88)

接下来，实施例2中的碱基载体+neo R+IgL质粒采用限制性酶Bam HI和Pci I切割，接着再用CHA2-500片段替换。然后，该产物用限制性酶Sse8387I和Mlu I切割，接着再用CHA1-500片段替换。最后，将DNA序列8（重链盒）插入到限制性内切酶Mlu I位点，以获得如图15(B)所示的具有500b同源臂长的CHO 500b×2载体。

CHO 200b×2载体和CHO 500b×2载体重组CHO细胞的获取

采用与实施例3中相同的方式，对所构建的CHO 200b×2载体和CHO 500b×2载体进行线性化、导入到CHO细胞中以及筛选。

尽管进行了两次导入操作，然而在任意一个CHO 200b×2载体和CHO 500b×2载体中仍然根本无法获得重组CHO细胞。

实施例13:通过具有5kb链长的同源DNA片段且表达抗体重链的载体获得同源重组

CHO 5kb×2载体的制备

以CHO-K1细胞的基因组DNA为模板，采用NsiNru-CHA1-5k-s/MluI-CHA1-r引物集和BclI-CHA2-s/BspNru-CHA2-5k-r引物集，分别通过PCR反应对目标hprt基因的同源DNA片段（CHA1-5k和CHA2-5k）进行克隆。CHA1-5k和CHA2-5k设置为与含有hprt基因的外显子3的区域同源的序列。在PCR反应中使用了以下的引物序列。

NsiNru-CHA1-5k-s引物：

5’-ttATGCATTCGCGAAtctcaggtgataggagacataagac-3’(SEQ ID No.89)

BclI-CHA2-s引物：

5’-ttTGATCAgactgaagagctactgtgta-3’(SEQ ID No.90)

BspNru-CHA2-5k-r引物：

5’-ttTCATGAaTCGCGAAtcagcactcaggagtcagag-3’(SEQ ID No.91)

接下来，实施例2中的碱基载体+neo R+IgL质粒采用限制性酶Bam HI和Pci I切割，接着再进行CHA2-5k片段的替换。然后，该产物用限制性酶Sse8387I和Mlu I切割，接着再进行CHA1-5k片段的替换。最后，将DNA序列8（重链盒）插入到限制性内切酶Mlu I位点中，以获得如图16所示的具有5kb同源臂长的CHO 5kb×2载体。

CHO 5kb×2载体重组CHO细胞的获取

采用与实施例3中相同的方式，对所构建的CHO 5kb×2载体进行线性化、导入到CHO细胞中以及筛选.

结果，每1×10⁶个细胞获得7个克隆的重组CHO细胞。具有实施例7中的2.5kb同源臂长的载体的获取频率为每1×10⁶细胞4个克隆，说明5kb的同源臂长会产生更好的结果。