CN107893073A - 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型hek293细胞株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明利用CRISPR/Cas9系统构建了基于HEK293细胞、可稳定传代、适应悬浮培养、并可应用于重组蛋白表达的谷氨酰胺合成酶缺陷型细胞株HEK293‑GS‑/‑。本发明所述细胞株可以通过GS/MSX筛选系统筛选表达各种重组蛋白的工程细胞株。基于HEK293‑GS‑/‑构建的细胞株经多次传代后能稳定表达目的蛋白；所构建的细胞能够适应大部分的商业无血清培养基；筛选后的细胞自身高表达谷氨酰胺合成酶，从而大大简化了上游培养工艺。HEK293‑GS‑/‑既可以应用于分子生物学、细胞生物学等研究领域，也适合构建应用于生物制药领域的工程细胞。

Description

一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种筛选谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型HEK293细胞株的方法和基于所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株筛选表达重组蛋白细胞株的方法。
背景技术
蛋白修饰(post-translational modifications,PTMs)在蛋白活性、稳定性和免疫原性方面起着至关重要的作用，直接影响重组蛋白类药品的药效、半衰期和抗药性。未来药品升级、新药开发必然关注在PTMs和人自身蛋白的相似性上。使用人源细胞生产重组蛋白是解决PTMs差异性的捷径。
HEK293细胞来源于人胚胎肾脏细胞，通过转染腺病毒5基因得以永生化。转染后的HEK293细胞株基因组携带腺病毒5E1区域，表达可以使细胞永生化的E1A和能抑制病毒介导的细胞杀伤的E1B两个基因。HEK293细胞生长迅速、操作简单、转染效率高、高表达外源蛋白，因此广泛应用于细胞信号通路研究、重组蛋白表达、病毒载体制备、药品研发等领域，是用途最广、最成熟的人源细胞系之一。近些年，HEK293的细胞培养工艺发展迅速，知名试剂公司如Invitrogen、Hyclone、Lonza、Millipore、Xell、PAN-BIOTECH等都开发出针对HEK293细胞优化的无血清培养基，多个实验组成功实现高效转染无血清培养基悬浮培养的HEK293，从而进一步推动了HEK293细胞在科研及产业内的应用。另外，基于(1)HEK293在免疫缺陷型老鼠的低致瘤性，符合药品安全需求；(2)现有用于药品研发生产的工程细胞系在蛋白修饰方面的功能局限性，如CHO细胞无法满足Drotrecoginalfa(重组人活化蛋白C)的前导肽断裂以及谷氨酸残基的γ-羧化两种PTM修饰；(3)HEK293在病毒载体制备方面的不可取代性等三个主要原因，美国FDA于2001年发布公告，允许基于人腺病毒5E1区域永生化的HEK293用于疫苗和生物制药生产，并于2004年在Vaccine Cell Substrate Conference会议上讨论通过了HEK293作为药品开发细胞株的使用规范。截至2016年，美国FDA已经通过两个基于HEK293细胞生产的蛋白药物，分别是由Biogen idec公司研制的重组人凝血因子VIII(ELOCTATE)和重组人凝血因子IX(ALPROLIX)。得益于人源HEK293细胞在PTM上与人自身蛋白相似的优点，这两种药物在药效，半衰期及耐药性上都有了极大的提升，如ELOCTATE的半衰期长达19.7小时而且临床三期结果显示受试者体内没有检测到中和抗体(34.5％使用CHO生产的凝血因子VIII产生中和抗体和耐药性)。此外，其它制药公司也积极开发基于HEK293平台生产的重组蛋白类药物，如Octapharma公司基于HEK293细胞开发长效重组人凝血因子VIII和重组粒细胞集落刺激因子(rG-CSF)。HEK293在生物制药领域的重要性日趋显现。近年来，基于人源HEK293生产的蛋白类药物陆续通过FDA认证，并在药效学、稳定性等方面优于过往已上市同类药品。可以预知未来重组蛋白药物的研发生产上，HEK293细胞必然成为重要的技术平台之一。
在细胞培养中，谷氨酰胺一方面用于细胞的能量代谢，另一方面参与蛋白质的合成和核酸代谢。在没有或低谷氨酰胺的培养条件下，Glutaminesynthetase(GS)催化谷氨酸和铵离子合成生成谷氨酰胺，供给细胞代谢和蛋白质合成。Methionine sulfoximine(MSX)是GS的竞争型抑制剂，MSX结合到GS的谷氨酸盐位点之后，会被ATP磷酸化，从而不可逆的抑制GS活性。GS/MSX筛选系统广泛应用于筛选基于CHO细胞的蛋白类药品工程细胞株。通常目的蛋白基因和GS基因被共同转染到细胞内，GS基因作为筛选标记基因表达谷氨酰胺合成酶，使阳性细胞能在低或无谷氨酰胺条件下生长。随后，通过逐渐提高MSX的浓度筛选细胞种群中有高拷贝、能高表达GS基因的细胞。这些细胞一般也携带更高拷贝数的目的基因，并能高表达目的基因蛋白。另外利用GS/MSX方法构建的工程细胞株在培养时无需加入谷氨酰胺，极大减少了代谢废物-氨在培养基中的积累，具有培养工艺易于优化，质控容易，蛋白表达量高等优点。
虽然HEK293细胞在科学研究及制药领域被广泛认可，但不同于CHO细胞，目前还没有商业化的、可用于高效外源基因扩增和适合快速筛选高蛋白表达的细胞株。比如在CHO平台广泛使用的谷氨酰胺合成酶/蛋氨酸砜亚胺(Glutamine synthetase/Methioninesulfoximine，GS/MSX)筛选系统由于HKE293高表达GS基因，对谷氨酰胺不敏感而无法使用。已有研究发现HEK293的GS活性大约是CHO细胞的4.8倍，低于500μM的MSX浓度对于HEK293细胞基本没有筛选能力，即使在1000μM的高MSX浓度下，细胞筛选阳性率也只有26％，而且无法通过进一步提高MSX浓度来筛选高基因拷贝数、高蛋白表达的细胞克隆。通过敲除或下调GS基因，构建对谷氨酰胺高度敏感的HEK293细胞株是在HEK293上使用GS/MSX的可行方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供谷氨酰胺合成酶(GS)基因的sgRNA序列，具有如SEQID NO.2-82所示序列中的一种。
进一步的，所述的sgRNA序列，选自SEQ ID NO.2-82所示序列5′端延或3′端伸或缩短1-5个碱基的序列中的一种。
本发明的第二个目的是提供包含上述sgRNA序列的载体。
本发明的第三个目的是提供一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法，包括以下步骤：
(A)筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列；
(B)HEK293瞬时转染含有步骤(A)筛选获得的可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列的质粒，通过比较细胞在高低谷氨酰胺浓度下增殖差异的MTS细胞增殖实验筛选谷氨酰胺依赖型细胞株。
优选的，所述筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法还包括步骤(C)通过细胞形态、倍增时间、GS蛋白表达免疫印迹、基因测序或对谷氨酰胺浓度依赖检测中至少一种方法鉴定筛选细胞株；
优选的，所述筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法还包括步骤(D)无血清悬浮培养驯化获得的谷氨酰胺依赖型细胞株。
进一步的，步骤(A)所述筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列具体包括以下步骤：
(1)构建含有GS-sgRNA的质粒；
(2)构建含有序列重叠区域需要重组修复的标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒；
(3)将含有GS-sgRNA的质粒与含有序列重叠区域需要重组修复的标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒共转染HEK293细胞，通过标记蛋白的重组修复效率计算剪切效率筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列。
本发明的第四个目的是提供谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株，其为HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6，其中所述HEK293GSKO-#2B4其GS基因序列如SEQ IDNO.85所示，所述HEK293GSKO-#3D6其GS基因基因序列如SEQ ID NO.86所示。
本发明的第五个目的是提供所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株在表达重组蛋白中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种筛选高表达重组蛋白细胞株的方法，包括以下步骤：
①构建含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒；所述目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列可以位于同一质粒上，亦可以分别位于不同质粒上；
②采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时转染步骤①所述含有目的重组蛋白质粒的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒；若所述目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列分别位于不同质粒上，则需要共转染HEK293细胞；
③筛选稳定转染的细胞种群；
④通过逐步递增MSX浓度筛选目的重组蛋白高表达细胞株。
进一步的，步骤③所述筛选稳定转染的细胞种群的方法为抗生素筛选或降低/去除谷氨酰胺的培养基培养。
进一步的，步骤④所述筛选细胞使用的MSX浓度从0μM到3000μM递增。
本发明利用CRISPR/Cas9系统构建了基于HEK293细胞、可稳定传代、适应悬浮培养、并可应用于重组蛋白表达的谷氨酰胺合成酶缺陷型细胞株HEK293-GS-/-。本发明所述细胞株可以通过GS/MSX筛选系统筛选表达各种重组蛋白的工程细胞株；通过MSX逐步加压增加目的基因在HEK293-GS-/-基因组中的拷贝数，从而进一步提高重组蛋白表达量。基于HEK293-GS-/-构建的细胞株经多次传代后能稳定表达目的蛋白；所构建的细胞能够适应大部分的商业无血清培养基；筛选后的细胞自身高表达谷氨酰胺合成酶，从而大大简化了上游培养工艺。HEK293-GS-/-既可以应用于分子生物学、细胞生物学等研究领域，也适合构建应用于生物制药领域的工程细胞，具有很好的临床应用前景和商业价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示构建HEK293谷氨酰胺合成酶缺陷型细胞的方法流程图；
图2示pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP质粒图谱；
图3示sgRNA剪切效率分析结果；
图4示细胞单克隆对谷氨酰胺依赖程度；
图5示实施例5GS缺陷HEK293单细胞克隆GS蛋白表达检测结果；
图6示实施例5#2B4和#3D6单细胞克隆基因测序结果；
图7示实施例5#2B4和#3D6对谷氨酰胺浓度依赖检测结果；
图8示实施例6无血清悬浮培养驯化后细胞谷氨酰胺依赖性检测结果；
图9示实施例7pShCMV-EGFP-IRES-GS质粒图谱；
图10示实施例7基于GS缺陷型HEK293筛选EGFP稳定表达细胞株显微镜结果；
图11示实施例7MSX加压筛选EGFP阳性细胞流式细胞仪分析结果；
图12示pCMV(PacI)-MCS-IRES-EGFP质粒图谱；
图13示pShCMV-MCS质粒图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种筛选谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型HEK293细胞株的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
CRISPR/Cas9系统是近年来发现的强大的基因编辑工具，它利用crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的基因序列靶位点剪切双链DNA。张锋实验室通过设计包含tracrRNA和crRNA序列功能的sgRNA序列，简化了靶位点序列设计；通过构建同时表达sgRNA和Cas9基因的pX330质粒，简化了基因敲除的步骤，提高了敲除效率。目前pX330质粒已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。利用CRISPR/Cas9系统敲除内在GS基因是获得谷氨酰胺高敏HEK293细胞株的有效手段。
基于此，本申请利用CRISPR/Cas9系统敲除HEK293细胞中的GS基因，从而获得对谷氨酰胺高度敏感的细胞株，并构建了基于此细胞株的GS/MSX筛选技术。
一方面本发明提供了GS基因的sgRNA序列。本申请针对GS基因编码区第三至八部分外显子，利用CRISP/Cas9系统敲除HEK293中GS基因并设计筛选部分sgRNA序列。
其中，所述GS基因的sgRNA序列具有如SEQ ID NO.2-82所示序列中的一种。
进一步的，所述的sgRNA序列，选自SEQ ID NO.2-82所示序列5′端或3′端延伸或缩短1-5个碱基的序列中的一种。
本发明进一步提供了包含上述sgRNA序列的载体。所述载体优选为CRISP/Cas9系统载体，如pX330。本申请共构建了基于pX330的81个pX330-GS-sgRNA(E3#01-E8#13)载体。
本发明提供了一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法，通过CRISP/Cas9系统敲除HEK293内源GS基因并筛选单克隆稳定细胞株，包括以下步骤：
(A)筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列；
(B)HEK293瞬时转染含有步骤(A)筛选获得的可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列的质粒，通过比较细胞在高低谷氨酰胺浓度下增殖差异的MTS细胞增殖实验筛选谷氨酰胺依赖型细胞株。
本发明所述筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法中步骤(A)通过pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP系列质粒大规模筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列，其具体包括以下步骤：
(1)构建含有GS-sgRNA的质粒；
(2)构建含有序列重叠区域需要重组修复的标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒；
(3)将含有GS-sgRNA的质粒与含有序列重叠区域需要重组修复的标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒共转染HEK293细胞，通过标记蛋白的重组修复效率计算剪切效率筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列。其中，步骤(1)所述含有GS-sgRNA的质粒如前所述，为基于pX330的81个含有pX330-GS-sgRNA(E3#01-E8#13)载体的质粒
步骤(2)所述标记蛋白可以为荧光标记蛋白、生物素标记蛋白等。
在一些实施方案中，步骤(2)所述标记蛋白为强化绿荧光蛋白，所述含有标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒为pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP质粒。
步骤(3)通过pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP五个质粒分别共转染的方法快速鉴定涵盖整个GS基因的高效sgRNA序列。
pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP质粒包含两段有同源区的不完整EGFP基因片段，在其中间分别插入了GS基因的第三、四、五、六七、和八部分外显子及其附近的内显子序列共构建了五个质粒。pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP质粒在单独转染时无法表达出正确的EGFP蛋白不发绿色荧光，但当结合了高效sgRNA的Cas9复合体能剪切两个EGFP片段中间的GS基因外显子序列时，细胞将通过同源重组的方式修复pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP质粒上的EGFP基因，并表达能发绿色荧光的EGFP蛋白。本发明通过分别共转染pX330-GS-sgRNA(E3#01-E8#13)和pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP并观察绿色荧光细胞的比例可以快速筛选出高效的sgRNA。
由于越靠近起始密码子的移码突变越容易导致基因丧失功能，所以本发明优选使用GS基因第三外显子剪切效率最高的pX330-GS-sgRNAE3#13作为后续敲除HEK293内源性GS基因的质粒。需要指出，本申请所涉及的81个sgRNA即使效率低至3％以下依然可以通过增加筛选细胞数目获取GS基因缺陷的HEK293单克隆细胞。
表达Cas9和sgRNA的质粒在HEK293瞬时转染后，会根据sgRNA的序列剪切相对应的基因组序列，被切开的基因组会通过同源重组homologous recombination或非同源末端结合non homologous endjoining(NHEJ)修复基因组DNA。当细胞使用NHEJ修复基因组时会随机丢失修复位置碱基，形成移码突变最终导致蛋白无法表达。CRISP/Cas9系统在细胞系内的剪切效率介于20％至50％之间。所以需要快速检验方法鉴定单细胞克隆是否为GS缺陷型。GS野生型和缺陷型对谷氨酰胺的依赖程度不同，在高浓度谷氨酰胺培养条件下GS野生型和缺陷型因为有外源谷氨酰胺生长速度类似；但在低谷氨酰胺培养条件下，GS缺陷型因不能合成谷氨酰胺所以生长缓慢。因此通过比较同一株细胞在高低谷氨酰胺浓度下的生长速度差异可以快速鉴定出谷氨酰胺合成酶依赖型HEK293细胞。本发明所述筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法中步骤(B)利用MTS细胞增殖实验，通过细胞在高低谷氨酰胺浓度下增殖差异快速筛选谷氨酰胺依赖型细胞株，鉴定出14条GS缺陷型HEK293细胞。
MTS细胞增殖实验筛选出的谷氨酰胺敏感细胞株需要进一步用分子生物学方法确认其内源GS酶是否表达。本发明所述筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法步骤(C)通过细胞形态、倍增时间、GS蛋白表达免疫印迹实验、基因测序或对谷氨酰胺浓度依赖检测中至少一种方法鉴定筛选的细胞株其内源GS酶是否表达，确定GS基因敲除HEK293细胞系。
免疫印迹法可以证明GS酶是否表达，而细胞株目标基因片段测序可以最终确定细胞株基因型，并检测细胞是否来源于单克隆。本发明从14条GS缺陷型HEK293细胞中通过细胞形态、倍增时间等标准选取9条细胞用免疫印迹法测试，其中5条检测不到GS酶表达，有另外4条微量表达GS酶。基因测序检测其中HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6两条细胞显示sgRNA设计区域均有移码突变，证实两条细胞株均为GS基因敲除细胞。
进一步的，本发明所述筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法步骤(D)采用无血清悬浮培养驯化获得的谷氨酰胺依赖型细胞株，以使筛选得到的GS缺陷型HEK293细胞适应无血清悬浮培养。
所述无血清培养基可以选择目前生物试剂公司提供的任意HEK293悬浮培养无血清培养基，如Invitrogen公司、Hyclone公司、Lonza公司、Millipore公司、Xell公司、PAN-BIOTECH公司。在一个具体实施例中本发明使用CDM(Hyclone公司)培养基驯化HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6悬浮培养。驯化后的HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6对谷氨酰胺浓度敏感，在低谷氨酰胺浓度下无法快速生长。
因此，本发明提供了谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株，HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6，其中所述HEK293GSKO-#2B4其GS基因序列如SEQ ID NO.85所示，所述HEK293GSKO-#3D6其GS基因基因序列如SEQ ID NO.86所示。
进一步，本发明还提供所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株在表达重组蛋白中的应用。
本发明所述对谷氨酰胺高度敏感的细胞株可用于构建GS/MSX筛选技术，所述GS/MSX筛选技术可以广泛应用于重组蛋白表达、蛋白类药品开发、基因治疗、细胞治疗及其它生命科学领域。
因此本发明建立了基于此类GS缺陷型HEK293细胞快速筛选高表达重组蛋白细胞株的方法。该方法包括以下步骤：
①构建含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒，所述目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列可以位于同一质粒上，亦可以分别位于不同质粒上；即构建含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒，或分别构建含有目的重组蛋白的基因序列的质粒和含有谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒；
②采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时转染步骤①所述含有目的重组蛋白质粒的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒，若所述目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列分别位于不同质粒上，则需要共转染HEK293细胞；即采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时转染步骤①所述含有目的重组蛋白质粒的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒，或采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时共转染步骤①所述含有目的重组蛋白的基因序列的质粒和含有谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒；
③筛选稳定转染的细胞种群；
④通过逐步递增MSX浓度筛选目的重组蛋白高表达细胞株。
在一些实施方案中，本发明所述含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒含有以下功能元件：
a)目的重组蛋白的基因序列：此基因序列可以来源于哺乳动物、病毒、细菌、植物或人工设计序列，通常编码一段蛋白或有功能的碱基序列。在本发明所述实施例中所述目的重组蛋白为绿色荧光蛋白EGFP，利用GS基因作为筛选标记基于GS酶缺陷HEK293细胞HEK293GSKO-#2B4细胞快速筛选高表达绿色荧光蛋白EGFP细胞株的方法。
b)GS基因序列：GS基因表达谷氨酰胺合成酶，此酶可以催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺。此基因序列可以来源于哺乳动物，如人、猴子、小鼠等；也可以来源于植物或细菌；或通过基因合成或突变获得。在本发明所述实施例中使用人GS基因为例。
c)启动子或其它诱导蛋白表达方法的基因序列：所述启动子包括但不限于CMV，RSV，PGK，SV40等。其它蛋白表达方法包含但不限于融合蛋白表达方法；通过IRES序列在同一条mRNA上表达2个或多个蛋白；通过furin-P2A等方法先表达一个融合蛋白再通过自剪切及细胞内酶修饰形成两个独立蛋白；或通过外显子选择性剪切等方法共用同一个启动子等。在本发明所述实施例中使用CMV和IRES序列为例。
d)其它常见抗性筛选标记基因：此类抗性基因可以用于稳转细胞系的初步筛选，如新霉素(neomycin)抗性基因、潮霉素(hygromycin)抗性基因、嘌呤霉素(puromycin)抗性基因等。
在本发明一个实施例中，所述含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒的载体为pShCMV-EGFP-IRES-GS(如图9)。其质粒特点包含CMV启动子、目标基因EGFP、内部核糖体进入位点序列IRES和人GS基因。目标蛋白EGFP和筛选标记基因GS通过同一个启动子CMV转录在同一条mRNA上，使得目标蛋白表达量能和GS筛选标记基因相关联。当细胞在MSX梯度筛选时，高表达GS基因的细胞将有更高的概率同时高表达目标基因。
本发明所述筛选高表达重组蛋白细胞株的方法步骤②采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时转染步骤①所述含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒。所述细胞转染可以为化学转染如磷酸钙沉淀法，脂质体转染如PEI法、lipofactamine等，电转或使用病毒载体如慢病毒或AAV病毒等转染。在本发明所述实施例中，所述细胞转染为磷酸钙沉淀法。
在另一些实施方案中，本发明所述目的重组蛋白的基因序列与谷氨酰胺合成酶的基因序列可以分别存在于两个质粒中，即分别构建含有目的重组蛋白的基因序列的质粒和含有谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒。然后采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时共转染所述含有目的重组蛋白的基因序列的质粒和含有谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒。本领域技术人员可以理解所述含有目的重组蛋白的基因序列的质粒含有上述目的重组蛋白的基因序列、启动子或其它诱导蛋白表达方法的基因序列以及常见抗性筛选标记基因等功能元件，而所述含有谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒含有上述GS基因序列、启动子或其它诱导蛋白表达方法的基因序列以及常见抗性筛选标记基因等功能元件。
瞬时转染后的细胞一般需要通过筛选才能获得含有目的重组蛋白基因的稳定转染细胞种群。所述筛选方法包括但不限于使用各类抗生素筛选携带抗性基因的细胞种群，如使用neomycine(G418)筛选携带新霉素抗性基因的阳性细胞；或通过降低/去除谷氨酰胺培养基利用GS基因培养筛选稳定转染细胞群。在本发明所述实施例中，所述筛选方法为降低/去除谷氨酰胺的DMEM培养基培养。
进一步的，本发明所述筛选高表达重组蛋白细胞株的方法步骤④通过逐步递增MSX浓度筛选目的重组蛋白高表达细胞株。MSX是GS酶的抑制剂。通过逐步提高MSX的浓度可以筛选细胞种群中高表达GS基因的亚种群。优选的，所述筛选细胞使用的MSX浓度从0μM到3000μM递增。如0μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1000μM，如有必要，可以使用更高的MSX浓度，如2000μM、3000μM。
以本发明以上部分步骤或应用其它分子生物学常见类似方法在原理上可以基于本发明构建的GS缺陷型HEK293细胞构建表达任意蛋白的细胞系，受过分子生物学或细胞生物学培训的专业人员可以较容易理解并应用本发明技术，所以基于本发明方法构建的GS缺陷型HEK293表达其它蛋白属于相似技术，也在本专利保护范围。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中所有限制性内切酶均购自NEB公司；DMEM培养基均购自Thermo公司；非必需氨基酸混合液购自Thermo：11140076；0.1mM谷氨酰胺CDM(Hyclone:SH30858.02)购自Hyclone公司；MSX购自Sigma：M5379-500。
实施例1：设计GS基因sgRNA并构建CRISP/Cas9质粒
(1)设计GS基因sgRNA序列
通过综合比对多种在线工具预测结果，分析错配数、GC含量、移码变异评分(out-of-frame score)等条件，在GS基因编码区第三至第八个外显子区间(SEQ ID NO.1)共设计了81个sgRNA序列(具体序列见表1)。
表1 GS基因编码区sgRNA序列
(2)构建pX330-GS-sgRNA(E3#01-E8#13)载体
将表1的sgRNA序列5’端添加BbsI粘性末端，设计反向互补序列，并合成相应引物(表2)。合成的sgRNA正向和反向互补引物以各0.5μM的终浓度溶于T4多聚核苷酸激酶冲液中，经T4多聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase，NEB：M0201S)催化，使其磷酸化(37℃水浴30分钟)；然后在PCR仪中使互补引物序列退火为双链核苷酸(反应程序为95℃反应5min后，每分钟降低1℃，直至降到25℃)。以此方法共制备了81条sgRNA插入片段。
表2 sgRNA正向和反向互补引物
pX330(addgene：Plasmid#42230)质粒经BbsI限制性内切酶(NEB：R0539S)37℃酶切15h，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen)切胶回收。回收的线性化pX330与各sgRNA插入片段分别用T4DNA连接酶进行连接，连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，37℃倒置过夜培养，所得单克隆用PCR法鉴定(正向引物：每个sgRNA正向引物序列；反向引物：5’CGTAGATGTACTGCCAAGTAG；PCR条件：94℃1分钟，然后94℃30秒-58℃30秒-72℃30秒循环30次)，阳性克隆用天根DNA小提试剂盒纯化。以此方法共构建了pX330-GS-sgRNA(E3#01)至pX330-GS-sgRNA(E8#13)共81种质粒。
实施例2：构建pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP质粒
(1)构建pShCMV-EGx-MCS-xFP质粒。
以质粒pCMV(PacI)-MCS-IRES-EGFP(质粒图谱如图12所示)为模板P CR扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)基因片段。EGFPfrag1引物为5'acagATCGATgccaccATGGTGAGCAAGGGCGA G和5'CTGggatccgaattcAGTGGTTGTCGGGCAGCAG；EGFPfrag2引物为5'TCACctcgagGCAAGCTGACCCTGAAGTTC和5'CTACTGagatctTTACTTGTACAGCTCGTCCATG。PCR反应采用KAPAHiFiDNA Polymerase，退火温度58℃，延伸15s。回收的EGFP1片段和pShCMV-MCS(MCS序列如SEQ I D NO.83所示，质粒图谱如图13所示)质粒经ClaI、BamHI酶切处理、凝胶回收纯化、T4DNA连接酶连接、DH5α感受态细胞转化和质粒DNA小量制备及鉴定构建了pShCMV-EGx-MCS质粒。将上面获得的EGFP2PCR片段依照类似分子克隆手段插入到pShCMV-EGx-MCS质粒XhoI、BglII酶切位点得到质粒pShCMV-EGx-MCS-xFP质粒(EGx-MCS-xFP序列如SEQ ID NO.84所示)。质粒经测序鉴定与设计无误。
(2)构建pShCMV-EGx-GSE(3-8)-xFP五个检测质粒。
以苯酚氯仿方法抽提HEK293基因组DNA并以此为PCR模板，以表3所示引物序列，touch down PCR法扩增人谷氨酰胺合成酶基因第三(GS#E3F-GS#E3R)、四(GS#E4F-GS#E4R)、五(GS#E5F-GS#E5R)、六至七(G S#E6&7F-GS#E6&7R)、部分八(GS#E8F-GS#E8R)外显子片段。PCR条件为退火温度从62℃下降到52℃，1℃/循环，10个循环，然后从52℃下降到48℃，35个循环。所获得的五个PCR片段分别连入质粒pShCMV-EGx-MCS-xFP的BamHI和HindIII酶切位点，构建了pShCMV-EGx-GSE3-xFP、pShCMV-EG x-GSE4-xFP、pShCMV-EGx-GSE5-xFP、pShCMV-EGx-GSE(6&7)-xFP、pSh CMV-EGx-GSE8-xFP五个质粒，图谱如图2所示，并通过测序验证。
表3引物序列
实施例3：快速sgRNA效率检测
将pX330-GS-sgRNA(E3#01)至(E3#16)与pShCMV-EGx-GSE3-xFP质粒共16个样品；pX330-GS-sgRNA(E4#01)至(E4#10)与pShCMV-EG x-GSE4-xFP质粒共10个样品(其中E4#2-1和E4#2-2等质量比例共转染)；pX330-GS-sgRNA(E5#01)至(E3#15)与pShCMV-EGx-GSE5-xFP质粒共15个样品；pX330-GS-sgRNA(E6#01)至(E6#10)和pX330-GS-sgRNA(E7#01)至(E7#16)与pShCMV-EGx-GSE(6&7)-xFP质粒共26个样品；pX330-GS-sgRNA(E8#01)至(E8#13)与pShCMV-EGx-GSE8-xFP质粒共13个样品通过磷酸钙共沉淀法共转染HEK293细胞。将不含有sgRNA序列的pX330质粒分别和pShCMV-EGx-GSE3-xFP、pShCMV-EGx-GSE4-xFP、pShCMV-EGx-GSE5-xFP、pShCMV-EGx-GSE(6&7)-xFP、pShCMV-EGx-GSE8-xFP五个质粒共转染作为阴性对照。实验步骤如下：
(1)将HEK293细胞在12孔板用高糖DMEM完全培养基(含10％小牛血清和4mM谷氨酰胺)，37℃、5％CO2的环境培养至60％单层；
(2)将4μgpX330质粒和0.5μg pShCMV-EGx-GS(3-8)-xFP质粒稀释到220μl去离子水中，分别在管底和液面上加入30μl2M氯化钙和250μl2×HE PES缓冲液，并用气泡法混合；
(3)室温静置15分钟后，加速混合并在每孔细胞缓慢加入100μlDNA混合液；
(4)转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，用荧光显微镜拍照并用软件分析绿色荧光比例。
实验结果如果图3所示，绝大多数设计的sgRNA都能介导Cas9剪切相对应的含有GS基因第三至八外显子的pShCMV-EGx-GS(3-8)-xFP质粒，并通过细胞内的同源重组修复方式形成能发光的EGFP基因，其剪切效率在2％至38％之间，平均值为13.8％。
为了简化后续构建GS缺陷型HEK293细胞的工作量，本发明采用靠近G S基因起始密码子并且测试剪切效率达35％的pX330-GS-sgRNAE3#13质粒用于后续实验。依照实验原理推断，本发明检测过的sgRNA在原理上都可以依照下文方法构建相应GS缺陷型HEK293细胞系。
实施例4：构建及筛选GS缺陷型HEK293细胞株
(1)质粒扩增及纯化。
将pX330-GS-sgRNAE3#13质粒转入DH5α感受态细胞涂平板过夜培养，挑选单克隆并接种在800mlLB(含100μg/ml氨苄青霉素)震荡培养24小时。获得菌液通过碱裂解法初提和氯化铯密度梯度离心法纯化制备高纯度DNA。
(2)HEK293瞬时转染pX330-GS-sgRNAE3#13质粒
将HEK293细胞在60mm培养皿用高糖DMEM完全培养基(含10％小牛血清和4mM谷氨酰胺)，37℃、5％CO2的环境培养至60％单层；将5μgpX330-GS-sgRNAE3#13质粒稀释到220μl去离子水中，分别在管底和液面上加入30μl 2M氯化钙和250μl 2×HEPES缓冲液，并用气泡法混合；室温静置15分钟后，加速混合并将DNA混合液全部加入细胞中；在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养8小时后，更换新鲜培养基。
(3)极限稀释法获得HEK293单克隆细胞。
将转染过pX330-GS-sgRNAE3#13质粒的HEK293细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养48小时后，用胰酶消化细胞，并将消化后的细胞按每孔0.8个细胞种植于16块96孔板中。静置2小时后，通过显微观察排除无细胞或多于两个细胞的孔。继续培养8天后，排除生长缓慢、细胞形态不均一培养孔后，将合格细胞传代培养至4块24孔板中。
(4)通过MTS细胞增殖实验筛选谷氨酰胺依赖型细胞株
当4块24孔板中的细胞长到大于50％满盘时，用胰酶消化，取一半细胞接种在新的25孔板中，并将剩余细胞平均接种在4个96孔板板孔中，其中两孔培养在低谷氨酰胺浓度下GlnLow(DMEM加入10％小牛血清、非必需氨基酸混合液Thermo：11140076和0.1mM谷氨酰胺)；另外两孔培养在高谷氨酰胺浓度下GlnHigh(DMEM加入10％小牛血清、非必需氨基酸混合液Thermo：11140076和4mM谷氨酰胺)，共培养72小时。培养72小时后，每孔加入20μl MTS反应试剂(Promega：G3581)反应2小时后，读取490nm和630nmOD值并用以下公式计算每个细胞克隆对谷氨酰胺依赖程度。结果见图4。
如图4所示所测细胞单克隆对谷氨酰胺依赖程度从0.00％到86.21％，平均值为23.61％，标准差为20.26％。以平均值加一个标准差43.87％为基准，共筛选出14条高谷氨酰胺依赖细胞，筛出比率为15.6％。通过观察14条单细胞克隆的细胞形态和生长状态，选取#1A5、#1C4、#2A1、#2B2、#2B4、#2D5、#3B4、#3C2和#3D6共9条细胞克隆用于后续实验。
实施例5：检测GS缺陷型HEK293单克隆细胞GS蛋白表达、基因测序、以及对谷氨酰胺浓度依赖情况。
(1)GS缺陷HEK293单细胞克隆GS蛋白表达检测。
将筛选到的9条谷氨酰胺依赖型HEK293单细胞克隆和HEK293原始细胞分别用高糖DMEM完全培养基(含10％小牛血清和4mM谷氨酰胺)，37℃、5％CO2的环境培养至接近100％长满。将培养基抽走并加入500μl1×PAGE上样缓冲液并用细胞刮刀刮取细胞至1.5mlEP管。在沸水中处理样品10分钟，然后在PAGE凝胶中每孔上样20μl。电泳结束后，将蛋白转入NC(PALL货号P/N66485)膜，封闭后分别孵育一抗mouse-anti-hGS(BD:610517)和mouse-anti-hactinβ(abcam：ab8224)1小时。之后经洗涤、二抗goat-anti-mouseIgG(Thermo：A16072)孵育及ECL(Tanon:180-501)显色，显示结果如图5所示。
结果显示，#1A5、#1C4、#2A1、#2B2、#2B4完全检测不到GS蛋白表达；#2D5、#3B4、#3C2和#3D6有少量GS蛋白表达；HEK293原始细胞有高含量GS蛋白；actinβ的结果显示样品上样量均一。为减少后续实验工作量，随机抽取#2B4和#3D6完成后续实验。
(2)#2B4和#3D6单细胞克隆基因测序检测
将#2B4和#3D6如上文培养至60mm培养皿至接近100％长满。用细胞刮刀将细胞刮取，离心去上清。将细胞重悬至500μl裂解缓冲液(100mM NaCl、10mMTris-Cl(pH8.0)、25mMEDTA(pH8.0)、0.5％SDS、0.2mg/ml proteinaseK和100μg/ml RNaseA)在55℃恒温箱中孵育2小时。反应后通过苯酚氯仿DNA抽提方法纯化基因组DNA。以基因组DNA为模板，GS#E3F和GS#E3R为引物，通过touch down PCR法(条件为退火温度从62℃下降到52℃，1℃/循环，10个循环，然后从52℃下降到48℃，35个循环)扩增#2B4和#3D6GS基因第三外显子片段。并将获得的E3片段连入质粒pShCMV-MCS的BamHI和HindIII酶切位点。将连接产物转入大肠杆菌DH5α，划平板并过夜培养后，每种细胞随机选取5个细菌菌落测序，测序结果如图6所示。
结果显示所测的5个#2B4菌落在GS第三外显子上都缺少CCCTGGA这7个碱基，并形成移码变异无法表达正确的GS蛋白。在5个#3D6样品中，有4个样品同样显示GS第三外显子缺少CCCTGGA序列形成移码突变，同时有一个样品显示在CCCTGGA序列前缺少一个A碱基突变，此突变也为移码突变。在#3D6两种突变中都使得GS蛋白无法表达。
(3)#2B4和#3D6对谷氨酰胺浓度依赖检测。
将#2B4、#3D6和HEK293每种细胞按0.5×106细胞/盘接种在5盘35mm培养皿中并用高糖DMEM完全培养基(含10％小牛血清和1X非必需氨基酸混合液)加入0μM、50μM、100μM、200μM和2mM五种不同浓度谷氨酰胺，在37℃、5％CO2的环境培养6天。移除培养基并加入结晶紫(生工E607309-0100)染色所得结果如图7所示。
结果显示#2B4和#3D6细胞无法在0至200μM低谷氨酰胺浓度下生长，但在培养基中加入足量的谷氨酰胺(2mM)后和原始HEK293生长状态基本一样。原始HEK293细胞在GS基因完整条件下即使在无谷氨酰胺时依然可以生长。
实施例6：驯化#2B4和#3D6细胞适应无血清悬浮培养
(1)无血清悬浮培养驯化
将贴壁培养的HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6用胰酶消化，以0.5×106cells/mL的终浓度稀释于20ml加入4mM谷氨酰胺的CDM(Hyclone:SH30858.02)培养基中，然后置于37℃，5％CO2，转速为160rpm的恒温摇床中进行培养。当细胞密度上到3×106cells/ml后，离心去上清，并重新以0.5×106cells/ml的浓度接种在相同的培养基中继续培养并且以相同方法连续培养5代。
(2)无血清悬浮培养驯化后细胞谷氨酰胺依赖性检测
将适应无血清悬浮培养的HEK293GSKO-#2B4、HEK293GSKO-#3D6和HEK293分别以0.5×106cells/ml的浓度接种在含有0.4mM或4mM谷氨酰胺的CDM培养基中，然后置于37℃，5％CO2，转速为160rpm的恒温摇床中进行培养。每24小时取样检测活细胞数，结果如图8所示。
结果显示在低谷氨酰胺条件下(0.4mM)，HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6活细胞浓度最多可达到1.46×106cells/ml而表达GS的HEK293细胞可以生长到3.09×106cells/ml；在高谷氨酰胺浓度下(4mM)，HEK293GSKO-#2B4活细胞浓度可达5.08×106cells/ml、HEK293GSKO-#3D6活细胞浓度可达3.46×106cells/ml和HEK293活细胞浓度(4.25×106cells/ml)相当。此结果证明无血清悬浮培养驯化后的GS缺陷型HEK293细胞依然具有谷氨酰胺依赖的特性。
实施例7：以HEK293GSKO-#2B4细胞构建重组蛋白表达细胞系
(1)构建表达载体。
将pShCMV-EGFP-IRES-GS质粒(图9)和阴性对照质粒pShCMV-EGFP分别转入DH5α感受态细胞涂平板过夜培养，挑选单克隆并接种在800mlLB(含100μg/ml氨苄青霉素)震荡培养24小时。获得菌液通过碱裂解法初提和氯化铯密度梯度离心法纯化制备高纯度DNA。
(2)细胞转染。
将HEK293GSKO-#2B4细胞在60mm培养皿用高糖DMEM完全培养基(含10％小牛血清和4mM谷氨酰胺)，37℃、5％CO2的环境培养至60％单层；将5μg pShCMV-EGFP-IRES-GS质粒和阴性对照质粒pShCMV-EGFP质粒稀释到220μl去离子水中，分别在管底和液面上加入30μl2M氯化钙和250μl2×HEPES缓冲液，并用气泡法混合；室温静置15分钟后，加速混合并将DNA混合液全部加入细胞中；在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养8小时后，更换新鲜培养基。
(3)细胞筛选。
转染48小时后，用PBS润洗细胞两次，并将培养基换为DMEM(加入10％小牛血清和1×非必须氨基酸混合液)无谷氨酰胺培养基继续培养。当细胞长到80％满盘，用胰酶消化，并以2×106cells/每100mm培养皿浓度分盘。连续培养3代，通过荧光显微镜可以观察到转染pShCMV-EGFP-IRES-GS质粒的HEK293GSKO-#2B4细胞荧光比例先下降随后又逐渐上升，细胞转染后在无谷氨酰胺培养基上生长缓慢并伴随大量漂浮死细胞，第二代后细胞生长速度逐渐恢复，EGFP阳性比例逐渐增加，荧光强度略有增加。阴性对照细胞转染pShCMV-EGFP荧光比例逐渐下降，细胞生长速度逐渐减慢伴随大量死细胞而且没有改善迹象(见图10)。
(4)逐步提高MSX浓度筛选。
将转染了pShCMV-EGFP-IRES-GS质粒并完全适应无谷氨酰胺培养条件的HEK293GSKO-#2B4细胞依次在5μM MSX、10μM MSX、25μM MSX、50μM MSX条件下筛选。每个MSX筛选浓度下培养细胞3至5代，每次筛选加压以细胞生长速度、细胞形态、EGFP荧光比例和EGFP荧光强度等指标综合判断。细胞在100mm培养皿中培养，每次长到80％满盘，用胰酶消化并以2×106细胞/盘重新接种。不同筛选阶段细胞留样并通过流式细胞分析，结果如图11所示。
结果可见，逐步增加MSX筛选压力后，EGFP阳性比例和单细胞荧光强度快速增加，而且在50μM MSX筛选后，种群中出现EGFP高表达种群，此种群比例在MSX筛选压力递增后快速增加。
序列表
<110> 深圳市港科深研生物科技有限公司
<120> 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法
<130> MP1720158
<160> 86
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4333)
<223> n(1474)=t或c;n(2827)=t或c;n(3023)=t或c;n(3697)=a或-(缺失);n(3698) =t或-(缺失)
<400> 1
atgaccacct cagcaagttc ccacttaaat aaaggcatca agcaggtgta catgtccctg 60
cctcagggtg agaaagtcca ggccatgtat atctggatcg atggtactgg agaaggactg 120
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aaggcaccct cagaaaacca ctgctctaac ctgagaatgc catctagttt acaaactctt 540
agaaaactgt gtttaatact catatcactg gcttctagat gtgaagcaaa tgctctacaa 600
tggtttttaa ataggactaa tttttagttg atgccacttt tggaaattct taaactaatt 660
gcgtatccct ctaggagcta cagttagatt atagttgtga ccttcatttt tcagtctaga 720
acaagccata gtcttccctc ttctggaaag gggccagagg aaagtatcat atcctaccta 780
gtttagggta gtttactttt cctttttgag taagtgaatg atcataatac aaagcctata 840
ttgtgtactt gctatgtggc agatgatagt gcacagacac tgaagataca aagtgagagt 900
ctcgtctctg ccttcagaga actcagtcag ctagagagac caagcagcct tcaaaacagt 960
gggaaaggtg gataggtgat aagggagcat cctagagtaa gtcatcctgc tagtcgtctg 1020
ttccctcatc tataaaataa ggacataact tgccagaata cactgggggc ataagaagga 1080
tgcaacacat tacctaatgg aagaatcaga atccttcact atctcaatat tttaagtgat 1140
tgataggatg gtagtgataa cagaatgctt cagcttgtct cctggaagac atttgggaag 1200
ggagtatctg atatatttct tttaaggaat tggtacaatg gtcttacttg gaactcaaat 1260
aggaagggct ataagatcag gtacaggtgc cagggtatac atattaatga tggcatttat 1320
accttaatga attcctggaa aagagatatt tagagatggg aaggtgagtg aagggctggc 1380
tgtatttgca ttgcttggaa agctcctgta tgttttaaat gtaattttcc ctctttttgc 1440
cccagagttg cctgagtgga atttcgatgg ctcnagtact ttacagtctg agggttccaa 1500
cagtgacatg tatctcgtgc ctgctgccat gtttcgggac cccttccgta aggaccctaa 1560
caagctggtg ttatgtgaag ttttcaagta caatcgaagg cctgcaggtg tgttatagca 1620
cagctatgga tacccctcct caatctgtga atgctgtgaa ggggagggag aagacattct 1680
gaaatcagca ttgggaagac taggcaattt cagcactatt ttaagaatct gagtgattct 1740
tttccctgaa cttctgcttt gaggaagaga taatatggcc catctttcta tggtcttctc 1800
tgttggttgc ataaaatagc attggatttg tccagatctg tttgccggtc ttggagtccc 1860
cagtaacagc cttcctgcct ggaatgtagg ccaggacaaa tgtaaaccaa tggacaaatg 1920
tttctcaaaa attatagaat ggctccaagt gcctgagaaa tgaagaataa atctgacaac 1980
cagaagcagc tgtcttgtga atagagggtt aagtgcctgg catttggtgc ttgggaggtg 2040
gccagaatgc agataaggtg aaagttgccc tgttctaaat ccactcccat gtgacttggt 2100
tgtaactgag tttagttaaa actgaagtct ttcagagtct tcctacagat gtacaattaa 2160
cagcttctct catttttctg actcggtgat cccaagaagg cctatactgg gtcagttcat 2220
accatagtgc acacctcagt tgtatagaat ccaaggacta ttctcccatc agcatcggta 2280
ttcagcatct atgtctttag atccctgatg gcgtattatt gactcttttt tctagagacc 2340
aatttgaggc acacctgtaa acggataatg gacatggtga gcaaccagca cccctggttt 2400
ggcatggagc aggagtatac cctcatgggg acagatgggc acccctttgg ttggccttcc 2460
aacggcttcc cagggcccca gggtaagtct ccttgggtta gaggtgaaat tcccagaagt 2520
gtctaactgt gcaggaatgc cccttcccag ggatgggaat gactttcaga atcaagaagc 2580
aaaataatac agtaaaggcg aaacagccct cacatcacca aagtccaaaa atggatatga 2640
atatataaag taaggtttta gggggaacgt ttggccccac tgaagctgtg gtgaagagga 2700
actcccctat tgcccctccc ctgccccgca cctgcagatg aaggcaagga tagtgattca 2760
agagggcaag gcttaagggc cttctgatct ctgactttgg gattctctgg atttcttgac 2820
tcttagngtt ttgtcctgat gcttctgtag gtccatatta ctgtggtgtg ggagcagaca 2880
gagcctatgg cagggacatc gtggaggccc attaccgggc ctgcttgtat gctggagtca 2940
agattgcggg gactaatgcc gaggtcatgc ctgcccaggt aagtatagct ccaatccatc 3000
aatgaagaag ggtaggtagg tgnacatagg acttttgcta gtaagggctg ctgatacacc 3060
actcactaac ccaaaaccta agaacgggtt ggagtacagg tgagaagaga acaggtttag 3120
gagattctga gttggagtga gcagttagct ttgttttaat ggccaagctt ctcgtttcta 3180
gtgggaattt cagattggac cttgtgaagg aatcagcatg ggagatcatc tctgggtggc 3240
ccgtttcatc ttgcatcgtg tgtgtgaaga ctttggagtg atagcaacct ttgatcctaa 3300
gcccattcct gggaactgga atggtgcagg ctgccatacc aacttcagca ccaaggccat 3360
gcgggaggag aatggtctga agtgagtacc ttctgctggg gccatcttta atctcctgtg 3420
gcagaaaact tgggaggaga cttagcaatc tctcagcaaa gtctcctttg caggatgact 3480
tgcaaatatt tgccaaagat gagtaaactt gacttctcag tctggacgta ctttaggtgt 3540
tgacacttgc cttcacattc tctcattttg ttcctatttg aaaaatacca aataatactt 3600
ctgattcaca gtgataaata tttgttataa tttatataat atatattagt catatatcat 3660
tatataaata tatatcgata tatatatttg tgacatnngt catggtgaca gggaaaagtt 3720
gacaaattca tgcatttgaa aatcttttag aactaaatta gtaacaatac aggcatgtgg 3780
ataagcttaa tgcttatgag ggggagaaag tttcaaatga ttagtctttt caacaaacag 3840
taactttgta ctgcttgtcg ggcactgttc tcaccactga gacacacagg taagaagatg 3900
cagccactgc cctcatgaag tatttgttct actggtatca tattttggtg cacttcattc 3960
ttggctccat acctggagac aaggttggac tgccatcttt tctgtttact ctaggtacat 4020
cgaggaggcc attgagaaac taagcaagcg gcaccagtac cacatccgtg cctatgatcc 4080
caagggaggc ctggacaatg cccgacgtct aactggattc catgaaacct ccaacatcaa 4140
cgacttttct gctggtgtag ccaatcgtag cgccagcata cgcattcccc ggactgttgg 4200
ccaggagaag aagggttact ttgaagatcg tcgcccctct gccaactgcg accccttttc 4260
ggtgacagaa gccctcatcc gcacgtgtct tctcaatgaa accggcgatg agcccttcca 4320
gtacaaaaat taa 4333
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ttaagtggga acttgctgag g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aagttcccac ttaaataaag g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tgatgccttt atttaagtgg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
taaataaagg catcaagcag g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tgtacatgtc cctgcctcag g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ctttctcacc ctgaggcagg g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ctggactttc tcaccctgag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gtccaggcca tgtatatctg g 21
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
catcgatcca gatatacatg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
tatctggatc gatggtactg g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gatcgatggt actggagaag g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ggactgcgct gcaagacccg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
gctgcaagac ccggaccctg g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
gctcactgtc cagggtccgg g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
acttgggctc actgtccagg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
acagtgagcc caagtgtgtg g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
gccatcgaaa ttccactcag g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ctagtacttt acagtctgag g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
ccagtacttt acagtctgag g 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
cgagatacat gtcactgttg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
tgcctgctgc catgtttcgg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
ggaaggggtc ccgaaacatg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
ttcgggaccc cttccgtaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
gttagggtcc ttacggaagg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
agcttgttag ggtccttacg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cataacacca gcttgttagg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gttttcaagt acaatcgaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
tacaggtgtg cctcaaattg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
ttgaggcaca cctgtaaacg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
acacctgtaa acggataatg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
gtaaacggat aatggacatg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
gtgagcaacc agcacccctg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
caaccagcac ccctggtttg g 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
agcacccctg gtttggcatg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
tgctccatgc caaaccaggg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
gcaggagtat accctcatgg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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accctcatgg ggacagatgg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
gacagatggg cacccctttg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gatgggcacc cctttggttg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cgttggaagg ccaaccaaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gccttccaac ggcttcccag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggggccctgg gaagccgttg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tcccacacca cagtaatatg g 21
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
gggagcagac agagcctatg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
gcagacagag cctatggcag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cctatggcag ggacatcgtg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
atcgtggagg cccattaccg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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acaagcaggc ccggtaatgg g 21
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 50
ccgggcctgc ttgtatgctg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgactccagc atacaagcag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
atgctggagt caagattgcg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 53
ttgcggggac taatgccgag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 54
tcagattgga ccttgtgaag g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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catgctgatt ccttcacaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
agcatgggag atcatctctg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
tgggagatca tctctgggtg g 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
cacgatgcaa gatgaaacgg g 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
tcgtgtgtgt gaagactttg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gaatgggctt aggatcaaag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgatcctaag cccattcctg g 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
gttcccagga atgggcttag g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
attccagttc ccaggaatgg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
tgcaccattc cagttcccag g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
ttggtgctga agttggtatg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
tggccttggt gctgaagttg g 21
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ttcagcacca aggccatgcg g 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
gcaccaaggc catgcgggag g 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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ggccatgcgg gaggagaatg g 21
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<400> 70
gcttgcttag tttctcaatg g 21
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<211> 21
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taggcacgga tgtggtactg g 21
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attgtccagg cctcccttgg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
ggaatccagt tagacgtcgg g 21
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ttgatgttgg aggtttcatg g 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 75
catcaacgac ttttctgctg g 21
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<400> 76
gtatgctggc gctacgattg g 21
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ttccccggac tgttggccag g 21
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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aagtaaccct tcttctcctg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 79
gggtcgcagt tggcagaggg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 80
gcttctgtca ccgaaaaggg g 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 81
gtgtcttctc aatgaaaccg g 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 82
ttaatttttg tactggaagg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 83
gatcagatct atcgatggta ccgtttaaac actagttcaa agcttcagct cgagtcagaa 60
ttcgatatct ctagacaggg atccgatc 88
<210> 84
<211> 1274
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 84
atcgatgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 60
gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 120
gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 180
ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 240
gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 300
cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 360
ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 420
atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 480
aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 540
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 600
cccgacaacc actgaattcg gatccgctag ctctagagtc gacggtacca gtactaagct 660
tgcctcgagg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 720
ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 780
acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 840
ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 900
acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 960
tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 1020
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 1080
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 1140
acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 1200
acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 1260
acaagtaaag atct 1274
<210> 85
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 85
atgaccacct cagcaagttc ccacttaaat aaaggcatca agcaggtgta catgtccctg 60
cctcagggtg agaaagtcca ggccatgtat atctggatcg atggtactgg agaaggactg 120
cgctgcaaga cccggacagt gagcccaagt gtgtggaagg tgagacagca atgtggagtg 180
gagcacatgc tgggtgggat ctgcagaggg gtgggcagca gcctttgact cagcctctgg 240
attaggccta agctt 255
<210> 86
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 86
atgaccacct cagcaagttc ccacttaaat aaaggcatca agcaggtgta catgtccctg 60
cctcagggtg agaaagtcca ggccatgtat atctggatcg atggtactgg agaaggactg 120
cgctgcaaga cccggccctg gacagtgagc ccaagtgtgt ggaaggtgag acagcaatgt 180
ggagtggagc acatgctggg tgggatctgc agaggggtgg gcagcagcct ttgactcagc 240
ctctggatta ggcctaagct t 261

Claims (11)

1.GS基因的sgRNA序列，其特征在于，具有如SEQ ID NO.2-82所示序列中的一种。
2.根据权利要求1所述的sgRNA序列，其特征在于，选自SEQ ID NO.2-82所示序列5′端或3′端延伸或缩短1-5个碱基的序列中的一种。
3.包含权利要求1所述sgRNA序列的载体。
4.一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列；
(B)HEK293瞬时转染含有步骤(A)筛选获得的可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列的质粒，通过比较细胞在高低谷氨酰胺浓度下增殖差异的MTS细胞增殖实验筛选谷氨酰胺依赖型细胞株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括步骤(C)通过细胞形态、倍增时间、GS蛋白表达免疫印迹、基因测序或对谷氨酰胺浓度依赖检测中至少一种方法鉴定筛选细胞株。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，还包括步骤(D)无血清悬浮培养驯化获得的谷氨酰胺依赖型细胞株。
7.根据权利要求4-6任意一项所述方法，其特征在于，其中步骤(A)所述筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列具体包括以下步骤：
(1)构建含有GS-sgRNA的质粒；
(2)构建含有序列重叠区域需要重组修复的标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒；
(3)将含有GS-sgRNA的质粒与含有序列重叠区域需要重组修复的标记蛋白和谷氨酰胺合成酶基因的外显子片段的质粒共转染HEK293细胞，通过标记蛋白的重组修复效率计算剪切效率筛选可用于HEK293内源性GS基因的sgRNA序列。
8.谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株，其特征在于，其为HEK293GSKO-#2B4和HEK293GSKO-#3D6，其中所述HEK293GSKO-#2B4其GS基因序列如SEQ ID NO.85所示，所述HEK293GSKO-#3D6其GS基因基因序列如SEQ ID NO.86所示。
9.权利要求8所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株在表达重组蛋白中的应用。
10.一种筛选高表达重组蛋白细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①构建含有目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒，所述目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列可以位于同一质粒上，亦可以分别位于不同质粒上；
②采用所述谷氨酰胺合成酶缺陷型HEK293细胞株瞬时转染步骤①所述含有目的重组蛋白质粒的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列的质粒，若所述目的重组蛋白的基因序列和谷氨酰胺合成酶的基因序列分别位于不同质粒上，则需要共转染HEK293细胞；
③筛选稳定转染的细胞种群；
④通过逐步递增MSX浓度筛选目的重组蛋白高表达细胞株。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤③所述筛选稳定转染的细胞种群的方法为抗生素筛选或降低/去除谷氨酰胺的培养基培养；步骤④所述筛选细胞使用的MSX浓度从0μM到3000μM递增。
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