TWI316958B - - Google Patents

Description

1316958 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種對標的核酸導入突變之方法，其將突 變導入基因，以致可用於修復基因上之突變。 【先前技術】 目前進行之基因治療，係對於因細胞中之基因缺損及突 變造成機能異常之細胞，使用病毒類載體等將該基因導入 細胞中之方法。藉此，細胞可以回復正常，履行本來之任 務。此可謂基因之補充療法。 但是藉由病毒類載體導入基因具有問題點。在染色體上 犬：變基因以逕自殘存，若來自該突變基因之突變蛋白質與 來自正常基因之正常蛋白質具有類似之構造，突變蛋白質 可能會妨礙正常蛋白質之機能。 近年，與藉由病毒類載體導入DNA不同，而是使細胞中 目的基因之鹼基變換之基因插靶法（gene targeting)正受到 注目。舉例言之，力洛m丄-λα μ _ .

之環狀構造複雜， 導入目的部位。但是，嵌合募核苷酸脂 為維持該構造使用多餘的8個胸腺嘧啶， 86645-980522.doc 1316958 因此對於標的DNA之結合力有相當負面的影響。 〇· Igoucheva等人開發單股寡核苷酸（以下稱為ss οι。。) 形成法[Gene Therapy，Vol· 8, p 391〜399 (2001)]。其中在中 央配置與標的核酸中待突變之鹼基對應之鹼基，在兩側使 用帶有數個曱基化尿嘧啶之由數十個鹼基組成之寡核苷 酸’其中該甲基化尿嘧啶難以被核酸酶分解。 但是，上述二種突變導入方法之修復效率皆低。在二者 中修復效率較佳之單股寡核苷酸（ss 〇Hg〇)形成法亦有明確 之優點。該法在鍵結於標的核酸後之錯配修復過程中，雙 股DNA之意義及反義兩股之突變鹼基無法一次修復，而只 能修復任一方之突變鹼基，剩下之互補股中之突變鹼基需 要藉由細胞之錯配修復機構再一次修復。 上述Kmiec等人之嵌合寡核苷酸（chimera 〇iig〇)為了維持 環狀構造，導入與標的DNA沒有關係之序列。其之數目占 全部募核苷酸之十分之一以i。因&，嵌纟寡核苷酸插入 標的DNA之活性低。 另一重點為chimera olig〇及ss 〇lig〇之修復機制，從所使 用之募核苷酸之構造觀之，不可能同時修復二個以上分離 之犬變鹼基。進行二個以上之分離鹼基之修復或突變之導 入時，必須進行數次之寡核苷酸導入及選殖。不用說費工 夫，目前將DNA導入細胞之技術對於細胞之傷害大，要得 到生存且保持期望機能之細胞有困難。 又，在修復細胞之染色體之突變鹼基之情況，只能將修 復用DNA導入細胞質。該修復用DNA視濃度梯度以自由擴 86645-980522.doc Ϊ316958 散之方式向核移動。在該情況必須將高莫耳數修復用dna 導入細胞中，結果，進入核之量少，突變之修復效率不佳。 /、基因治療之發展之同時，期望改變上述機制複雜且效 果不佳之修復方法，而可以同時修復複數個鹼基，主動地 將修復用核酸輸送至核且效果高的方法。 【發明内容】 本發明者為達成上述目的深入檢討之結果，發現藉由使 用具有逆方向反覆之DNA，可以有效率地將突變導入標的 核酸之鹼基中，於是完成本發明。 本發明之第1發明係關於將突變導入標的核酸之鹼基序 列之方法，其特徵為包含： U)調製具有逆方向反覆序列之DN A之步驟，其中該具有逆 方向反覆序列之DN A之驗基序列與標的核酸相同，且具 有含待導入標的核酸中之突變之鹼基序列；以及 (2)將上述具有逆方向反覆序列之DNA導入細胞内之步驟。 在第1發明中，該具有逆方向反覆序列之DNA可具有針對 有核定位信號（nuclear localization signal)之蛋白質之碎合 基元序列（binding motif sequence) ’例如針對轉錄因子之結 合基元序列。又，上述DN A可含有適當修飾之驗基。 在第1發明中，標的核酸可為存在於細胞質或核之核酸。 又，具有逆方向反覆序列之DNA可為雙股及單股之任一者 之 DNA。 依照第1發明之方法，可以同時將複數個突變導入標的核 酸。被導入標的核酸中之突變例如為鹼基之置換、缺失及/ [ 86645-980522.doc 1316958 或插入。 本發明之第2發明為藉由第1發明之方法將突變導入標的 核酸用之套組，其特徵為含有具逆方向反覆序列之DNA， 該DNA與標的核酸相同且具有包含待導入標的核酸之突變 之鹼基序列。 第2發明之套組所含有之具逆方向反覆序列之DNA可含 有針對轉錄因子之結合基元序列（binding motif sequence) 或經適當修飾之鹼基。再者，具逆方向反覆序列之DNA可 為雙股及單股DNA之任一者。 【實施方式】 發明之詳細說明 對於本說明書中記載之「標的核酸」無特殊限定，其包 含期望導入突變之任一種核酸。舉例言之，本發明可被用 於將突變導入存在於細胞内之DN A，而以存在於細胞質内 之DNA(游離基因DNA、質體及粒線體DNA等）或存在於核 内之DNA(染色體DNA)做為標的核酸。 又’在本發明中，對於被導入標的核酸中之突變無特殊 限定’可以導入鹼基取代、缺失及插入等突變，在該情況， 所使用之具有逆方向反覆序列之DNA包含具有上述突變之 驗基序列。 再者’在本發明中突變之導入，不僅將突變導入正常的 驗基序列’當然亦包含將天然或生成之鹼基序列之突變修 復成正常序列之態樣。 在本發明中所使用之具有逆方向反覆序列之DNA(以下 86645.980522.doc 1316958 稱為逆方向反覆DNA)為與標的核酸相同且具有含待導入 標的核酸中之突變之鹼基序列之DNA。其中所謂「相同」 .¾指具有與標的核酸或其之互補股可形成雙股之驗基序列 者’並非意味具有完全一致之鹼基序列者。亦即，意指具 有藉由形成鹼基對可與標的核酸充分形成雙股之鹼基序列。 對於具有逆方向反覆序列之DNA之製作方法無特殊限 定’可以使用化學合成、酵素合成（核酸增幅反應等）及生 物學合成（利用具有質體等之自行複製能力之核酸之方法） 之任一種。具有逆方向反覆序列之DNA中，標的核酸之意 義股及反義股之序列雖為縱列式並列，但在兩者之間，於 可將突變導入標的核酸之範圍内，可以插入任意之序列（間 隔基）。 在本發明中，雖然可以使用具有逆方向反覆之雙股 DNA，但亦可使用將此等雙股DNA變性得到之單股DNA。 該單股DNA ’由於意義股部份及反義股部份具有互補的鹼 基序列，有時亦得到該二部分形成鹼基對鍵結之堆疊構 造’此等形態之單股DNA在本發明中亦可被使用。 上述形成堆疊構造之具有逆方向反覆序列之DNA，例如 可藉由與美國專利第5,643,762號、第5,714,323號及第 6,043,028號中被記載為S1DNA之單股DNA相同之方法調製。 在本發明之方法中，可以將同時突變導入標的核酸上之 兩個以上處所。被使用於該目的之具有逆方向反覆序列之 DNA只要長度夠即可。在細胞之增殖週期中之dna合成期 (S phase)中’進行DN A相同重組修復。從父dn A複製成母 86645-980522.doc -10· 1316958 DNA之時，父DNA螺旋解開形成複製交又（〖〇1<]〇。在該時期 可以同時鍵結於交又部分之DNA之意義股與反義股二者之 DNA，插靶（targeting)活性應該高。基於上述，本發明者製 作在單股DNA中’同時具有標的職之意義股及反義股之 序列且可結合於標的DNA之意義及反義兩股之單股逆方向 反覆DNA。 關於該方法，首先構築質體，在該質體中置入二相同基 因或其片段以逆向方式排列之逆方向反覆DNA插子。例如 為實施例2所述之質體之構築方法。培養用該質體轉形之大 腸菌’可以得到大量之質體。在質體中逆方向反覆dna插 子之兩端，使用限制酵素將該插子從載體中切斷，可以得 到逆方向反覆DNA。又，亦有用以上述質體做為模板之pcR 法來增幅逆方向反覆DNA之方法。 但是，在上述質體之構築中，對於插在逆方向反覆dna 中之基因或其之片段雖無特殊限定，但一般以5〇〇叶至 1500 bP為較佳，在5〇0bp以下之情況’要將完全相同之二 個DNA片段彼此以逆方向插入載體質體有困難。在該情 況，可用其他方法（例如化學方法或酵素方法）合成目的之 DNA。 在本發明中’可以使用在待導入突變之標的核酸上之部 位之上、下游’具有包含10個鹼基以上或百個鹼基以上之 驗基序列之逆方向反覆DNA ’以易於弓丨起相同重組。 依照本發明’使用具有逆方向反覆序列之屬將突變導 入標的核酸中之情;兄，壯要校正存在於I因上之突變驗 86645-980522.doc 1316958 基之情況’若製作具有在對應於突變驗基之部位上包含正 *驗基之野生型基因之序列之逆方向反覆dna，並使用公 知之DNA導人法（例如碟酸㉙法、電泳法或將脂質做為媒體 之轉染法等）將其導入細胞，將可以修復突變之驗基‘、、。、 相反地’將突變導人野生型基因之情況，調製包含欲導 入該基因之鹼基（鹼基序列）之逆方向反覆dna，然後使用 上述之DNA導入法導入細胞，可以將突變導入標的基因。 >為了防止具有本發明中之逆方向反覆序列之Dna被核酸 酶分解’可保護上述DNA之5,末端及3,末端以防核酸酶作 用。對於末端之保護，雖無特殊限定，但例如可將DNA以 物理及化學方法實施環化。又，在上述DNa中可含有修飾 之鹼基，例如修飾之去氧核糖核苷酸、修飾之核糖核苷酸 及LNA (W0 99/14226號國際公開公報）等；以導入甲基化之 核糖核苷酸及去氧核糖核苷酸等進行末端之保護為較佳。 上述各種鹼基對具有逆方向反覆序列之DNA之末端部分之 導入’可藉由化學的手段或如下述實施例所示之酵素手段 實施。 在本發明所使用之具有逆方向反覆序列之DNA中，可以 含有針對具有核定位信號之蛋白質之結合基元（binding motif)序列（亦即能結合於該蛋白質之dna序列）。 對於在本發明中可以使用之具有核定位信號之蛋白質， 無特殊限定，可以使用天然或人工之蛋白質，例如轉錄因 子、SV40大型T抗原、組蛋白、核質（nucie〇piasmin)、以及 為雙股RNA結合蛋白質之NF90等。又，多種具有核定位信 86645-980522.doc -12- 1316958 號之蛋白質被記載在 Biochim. Biophys. Acta” Vol. 1071，p 83〜101 (1991)中’此等在本發明中可被使用。 在上述有核定位信號之蛋白質具有能結合於特定DNA序 列之此力之情況’本發明之具有逆方向反覆序列之Dn a可 含有針對上述蛋白質之結合基元序列。 對於在本發明中使用之結合基元序列無特殊限定，例如 在本發明中可以使用能與待導入突變之細胞中所表現之具 有核疋位信號之蛋白質結合之序列。對於沒有DNA之結合 部位或者不知結合部位是否存在之具有核定位信號之蛋白 貝亦可以藉由製作具有此等核定位信號及適當的DNA結 合序列之嵌合蛋白質而用於本發明。 於上述具有核疋位信號之蛋白質在待導入突變之細胞中 表現之情況，藉由將具有針對上述蛋白質之基元序列之具 逆方向反覆序列之DNA導入細胞中，被導入之DNA將與上 述蛋白質結合以及被輸送至核中，而可以將目的突變導入 染色體DNA。具有核定位信號之蛋白質在待導入突變之細 胞中不被表現之情況，或為人卫製作之情況，則在待導入 突變之細胞中導人上述蛋白質或編碼其之基因，可以實施 本發明之方法。將上述蛋白質或編碼其之基因導入細胞之 方法’又有特殊限疋，可以利用公知之方法，例如使用核糖 體專方法及使用質體類媒體或病毒類媒體等之方法。再 者，上述蛋白質或編碼該蛋白質之基因與具有針對該蛋白 質之基it序列之具逆方向反覆序列之驗同時導人細胞中。 在本發明中適合使用之可與具有核定位信號之蛋白質結 86645-980522.doc 1316958 合之序列，例如為可與轉錄因子結合之DNA序列。在本發 明中記载之所謂轉錄因子意指會影響藉由RNA聚合酶從 DNA轉錄為RNA之效率之因子。在本發明中可以使用之針 對轉錄因子之結合基元（binding motif)序列，雖非用來特別 限定本發明，但是可列舉NF-κΒ、Spl、API、NF-IL6 (C/ΕΒΡβ)、AP2、Oct-1、SRF及Ets-1等可與轉錄因子結合 之序列為例。上述轉錄因子之結合基元序列，例如為以下 文獻記載者：Eur. J. Biochem，Vol· 268，p 1828〜1836 (2001) ； J. Biol. Chem., Vol. 263, p 3372-3379 (1998) ； Cell

Vol. 49’ p 741 〜752 (1987) ; EMBO J. Vol· 9, p 1897〜1906 (1990) ; proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, p 7948〜7952 (1991) ; Genes Dev.，Vol. 2, p 1582〜1599 (1988) ; Nucleic

Acids Res., V〇l. 20, p 3297-3303 (1992) ； Genes Dev., V〇l. 4} p 1451〜1453 (1990)〇 本發明之具有逆方向反覆序列之DNA所含有之結合基元 序列之套數沒有限定，可為丨套，亦可為複數套。又，對於 其之位置亦無特殊限定，可為上述〇^^八之5,或3,端部分。舉 例σ之可在5末端部分及3'末端部分二者含有2套以上之 結合基元序列。較佳在逆方向反覆序列部分之中央亦即 反覆序列之間導入結合基元序列。 上述含有針對具有蚊位信號之蛋白質之結合基元序列 之具逆方向反覆序列之DNa，由於可以主動地輸送至核 内因此顯不將突變導入染色體dna或修復突變之效率高。 藉由本發明之方法可以進行基因之失活，在該情況例 86645-980522.doc 1316958 如將為起始密碼子之ATG中之一個或二個驗基置換，可以 妨礙蛋白質之轉譯。又，在標的基因中之適當位置導入终 碼子’可以阻礙全長轉譯產物之生成。再者，調製在 ^的基因之驗基序列中插人（或刪除）—個或二個驗基之逆 方向反覆DNA，利用其可以在標的基因中編喝蛋白質之區 =之驗基序列巾使譯碼區位移，而達減因之*活。舉例 口之’期望使下列鹼基突變··基因之起始密碼子鹼基、從 起始密碼子起之2〜30個鹼基内之鹼基，於酵素蛋白質之情 況編碼相當於酵素活性部位之胺基酸殘基之鹼基，以及於 發出螢光之情況編碼決定螢光之胺基酸殘基之鹼基。 雖然可以同時修復二個或二個以上分離之突變鹼基為本 發明最重要之特徵。若使在數百個至數千個鹼基之間含有 能修復標的核酸中之複數個突變鹼基之鹼基，並使用數百 至數千個鹼基之逆方向反覆DNA，將可與修復單一突變鹼 基同樣，修復複數個突變。例如，如實施例5所述，基因中 相隔200個驗基之二個突變驗基可以一次修復。 依照上述態樣，將突變導入2個以上部位之情況，對於上 述部位間之距離無特殊限定，可以相隔數百個鹼基。從突 變導入效率之觀點言之，以相隔2〇〇個鹼基以内為較佳，以 相隔1 00個鹼基以内為更佳，以相隔3 〇個鹼基以内為特佳。 本發明提供一種供上述本發明之突變導入用之套組。在 一實施態樣中，該套組含有將突變導入標的核酸用之具有 逆方向反覆序列之DNA。再者，可含有將上述£^八導入細 胞用之試藥。 86645-980522.doc •15. 1316958 再者’藉由本發明之方法將突變導入基因中之細胞可被 移植於身體。如此可以在身體内進行使突變基因表現或使 突變被修復之基因表現之基因治療。 對於上述細胞無特殊限定，例如血液細胞（造血細胞、造 血幹細胞、骨髓細胞、臍帶血液細胞、末梢血幹細胞、單 核球、淋巴球、B細胞及T細胞等）、纖維母細胞、神經母細 胞、神經細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、肌肉 母細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、癌細胞及白血病細胞 等。 以造血幹細胞為標的細胞之基 舉例言之 ，” π〜恩⑵所潔精田Κ 下操作實施。首先，從提供者採取含有造血幹細胞之材料 例如骨髓組織、末梢Α液及臍帶血液等。此等材料雖可心 逕自用於基因導人操作’但通常藉由密度梯度離心等方沒 調製包含造血幹細胞之單核細胞部分，然後利用適當的知 胞表面標記進行造血幹細胞之純化。對於此等含有造血男 細胞之材料’使用本發明之方法實施突變之導人或突變之 如此得到之細胞，例如可以藉由靜脈内投與或其付 =移植至接受者4受者較料供給者本身，亦可 =異系移植，例如在以臍帶血液做為材料之情 以進仃同種異系移植。 或==之基因治療，例如以在患者中之表現宄進， 致機能降低或失去之基因為對象。舉例言 適於藉由本：月驗基置換之基因病如鐮形紅血球貧▲症為 错由本發明之方法治療之疾病。 86645.980522.doc -16- 1316958 上述基因治療可適用於人類， 及非脊椎動物。 及人類以外之脊椎動物 再者，本發明之適用之一例，例如 性势h_ 〜叩王沒糸細胞（胚 幹、，·胞、原生殖細胞、卵母細胞、印原細胞 母細胞及精子等）做為標的細胞之非 ' 偭制从卜八類轉基因動物之簡 更製作。依照本發明之方法，可以製 J Λ取作僅特異性抑制目的 暴因之表現之基因失活動物。上述失 ι天，古動物在基因機能之 解析以及與該基因之機能相關之藥劑之篩選上非常有用。 實施例 以下雖以實施例詳細地說明本發明，但本發明非限於實 施例之範圍内。 實施例1 將突變基因導入紅轉綠螢光蛋白質基因 對於被插入質體pQBI25(量子生物科技公司製）中之編碼 紅轉綠螢光蛋白質（以下簡稱為GFP)之基因（序列表之序列 編號1) ’將鹼基序列中之一個鹼基置換，以不使該基因表 現。使用PCR試管内突變誘導套組（Takara Bi〇公司製），將 對於GFP之螢光頗為重要之第66〜68號胺基酸殘基中，編碼 第67號之絡胺酸之密碼子TAT變換成為終止密碼子之 TAG。將如此製作之突變GFP (mGFp)基因及編碼未導入突 變之GFP之基因分別插入質體pDON-AI (Takara Bio公司 製），以構築pDON-mGFP及pDON-GFP。將包含此等質體1 之 ΤΕ 緩衝液 50 μΐ 與包含 1 pg 之 Lipofectamine 2000 (LF2000 ’ Gibco BRL公司製）之 50 μΐ Optimen 培養基（Gibco 86645-980522.doc -17- 1316958 BRL公司製）混合，並轉染293細胞，4日後用螢光顯微鏡觀 察。在加入pDON-GFP之細胞中，雖然觀察到強的綠色螢 光，但在加入pDON-mGFP之細胞中未觀察到螢光。結果， 構築出在細胞内未發出螢光之突變基因。將該mGFP基因用 在以下之實驗中。 實施例2 爲了製作具有GFP基因之鹼基序列之逆方向反覆DNA(以 下稱為irDNA)。首先將做為irDNA增幅模板之二個逆向GFP 基因片段插入質體中。將插在質體PQBI25中之GFP基因之 全序列用引子Us-EcoRI及DEND(序列表之序列編號2及3) 增幅之片段以EcoRI及BamHI(皆為Takara Bio公司製）消化 所得之760 bp DNA片段，插在質體pUC19 (Takara Bio公司 製）之EcoRI及BamHI部位間。繼而，將在該質體之Hindlll 及BamHI部位間之GFP基因之全序列用引子Us-hindIII(序 列表之序列編號4)及DEND增幅所得之DNA片段，插在用 Hindlll (Takara Bio 公司製）及 BamHI 消化所得之 760 bp DNA片段中，將如此構築之質體命名為pucGFPO-O。 又，將GFP基因之全序列用引子Us-EcoRI及DEND增幅所 得之片段用EcoRI及PvuII (Takara Bio公司製）消化所得之 714 bp之DNA片段，插在質體pUC19之EcoRI與Smal部位之 間。繼而，在該質體Hindlll與BamHI部位之間，插入將GFP 基因之全序列用引子Us-hindIII及DEND增幅所得之DNA片 段以Hindlll及BamHI消化所得之760 bp DNA片段。將如此 構築得之質體命名為pucGFPO-2。 86645-980522.doc -18- 1316958 再者’將GFP基因用引子uiOOhindlll及UlOObamhI(序列 表之序列編號5及6)增幅所得之DNA片段用Hindlll及 BamHl消化，以調製110 bpi 〇ΝΑ片段。將上述質體 PucGFPO-O 中之 760 bp Hindlll-BamHI 片段與 110 bp 之 DNA 片段交換’以構築質體pucGFP0-6。 pucGFPO-O ’具有編碼GFP之基因之全長之逆方向反覆序 列且插子DNA之長度為1518 bp。pucGFPO-2，反覆序列中 之一者缺失從終止密碼子起之3 8個鹼基序列且插子DNA之 長度為1479 bp。質體pucGFPO-6，具有編碼GFP之基因之全 長及從GFP基因中之第150〜250號鹼基形成之逆方向反覆 序列，且插子DNA之長度為868 bp。圖lA圖示pucGFP0-0, 圖1B圖示pucGFPO-2，以及圖1C圖示pucGFPO-6。 分別以pucGFPO-O，pucGFPO-2 以及 pucGFPO-6 為模板， 藉由PCR製作為逆方向反覆DNA之0-0 irDNA、0_2 irDNA 及0·6 irDNA。在0-0 irDNA及0-2 irDNA之製作上，使用引 子Us-ecoRI-1及Us-hindIII-Ι(序列表之序列編號7及8)，又 在0-6 irDNA之製作上，使用引子Us-ecoRI-1及U100 hindlll-Ι (序列表之序列編號9)。將導入mGFP基因之突變鹼 基G及C恢復為野生型GFP基因之鹼基用之T及A，分別相當 於0-0 irDNA、0-2 irDNA及0-6 irDNA中從意義鏈之5,側或 反義鏈之3'側（EcoRI site)算起之第237及1282號鹼基、第 237及1243號鹼基、以及第237及813號鹼基。在圖1中，將 mGFP基因之意義鏈或反義鏈中與突變鹼基之修復相關之 鹼基之位置以*及#表示。 86645-980522.doc -19- 1316958 實施例3 在游離基因（episome)實驗模型中mGFP基因之單一突變驗 基之修復 藉由逆方向反覆DNA進行基因修復實驗，並調查與標的 核酸之結合以及標的核酸之突變鹼基之修復。為了避免數 次導入DNA造成對細胞之毒性，將插入為標的核酸之mGFP 基因之質體（pcep-mGFP)，與修復用之三種逆方向反覆 DNA(irDNA)或對照組所用之單股寡核苷酸（ss Oligo)之任 一者同時導入細胞質中。ss Oligo之驗基序列被示於序列表 之序列編號1 0中。 (1)藉由以熱變性之irDNA修復游離基因mGFP基因 為了製作實驗模型，從在實施例1中構築之pDON-mGFP 單離包含mGFP基因之760 bp Hindlll-BamHI片段，將其次 選殖在為游離基因之哺乳動物表現載體之pCEP4 (Invitrogen公司製）之Hindlll與BamHI部位之間，以製作質 體pcep-mGFP。在48穴平皿中播種293個細胞（8萬個），並在 含10% FBS之DEME培養基中培養一夜。將0-0 irDNA、0-2 irDNA及0-6 irDNA各2 pg分別於94°C熱變性5分鐘，然後用 冰水急冷。將 2 pg之 ss Oligo、0-0 irDNA、0-2 irDNA及 0-6 irDNA以及1.5 pg之pcep-mGFP或pUC 19(陰性對照組1)用 3 7.5 μΐ Optimen培養基稀釋，並與同量之包含2pg LF2000 之Optimen培養基混合。另外將只含3.5 pg之pcep-mGFP之 37.5 μΐ Optimen培養基與同量之包含2 pg LF2000之 Optimen培養基混合，將如此所得之混合物做為陰性對照組 86645-980522.doc -20- 1316958 2。 培育20分鐘後，將此等DNA-LF2000試劑複合物添加至細 胞中，並置於室溫30分鐘，然後添加1 50 μΐ之Optimen培養 基。轉染6小時後，添加1 ml包含10% FBS之DEME培養基。 48小時後，在陰性對照組1及陰性對照組2中未見到發出綠 色螢光之細胞（GFP陽性細胞），相對於此，在用包含突變修 復用ss Oligo或三種irDNA以及標的DNA之pcep-mGFP轉染 之穴中已可見到GFP陽性細胞，在第4日GFP陽性細胞成為 最多者。將該細胞用胰蛋白酶處理並從平板取出細胞，然 後用FACS測定GFP陽性細胞。從該測定值減去相當於背景 之陰性對照組1之值，並將結果示於表1中。 每1萬個239細胞（為mGFP基因上之突變鹼基之修復指標） 之GFP陽性細胞之數目，在0-0 irDNA之情況最多，該修復 效果為ss Oligo之修復效果之約3倍。就4次獨立實驗之 Mann-Whitney之U檢定結果言之，0-0 irDNA之修復效率與 ss Oligo之修復效率相較，顯示有意義差（p< 0.05)。 表1 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 18.21 ±4.22 個 0-2 irDNA 11.79 ±2.84個 0-6 irDNA 5.26 ±0.74個 ss Oligo 5.40 ± 2.64個 (2)未經熱變性之irDNA所造成之游離基因mGFP基因之修 86645-980522.doc -21 - 1316958 復 除了未將藉PCR增幅而調製之irDNA熱變性之外，以與上 述實施例3-(1)相同之操作調查mGFP基因之修復。將1萬個 293細胞中出現之GFP陽性細胞之數目示於表2中。使用未 熱變性之irDNA之情況之修復效率皆比ss Oligo高。就4次獨 立實驗之Mann-Whitney之U檢定結果言之，0-0 irDNA及0-2 irDNA之修復效率與ss Oligo之修復效率相較，顯示有意義 差（p< 0.05)。 表2 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 39.27 土 9.21 個 0-2 irDNA 20.78 ± 2.80個 0-6 irDNA 13.12±2.15 個 ss Oligo 6.54 ± 2.6Φί固 另一方面，在將為標的核酸之pcep-mGFP及突變修復用 0-0 irDNA以6小時之間隔依次轉染之情況，亦得到比使用 ss Oligo之情況高之修復效率。 由於已明白在上述（2)之實驗中，為標的核酸之質體未被 導入全部使用之細胞，因此將peep-GFP及0-0 irDNA在與上 述相同之條件下導入293細胞，然後調查GFP陽性細胞數。 結果，質體僅被導入21.22±4.67°/。之細胞中。因此，表2所 示之結果，若除掉未導入質體之細胞來換算，每1萬個導入 peep-mGFP之細胞，突變驗基被修復之GFP陽性細胞之數目 如表3所示。就4次獨立實驗之Mann-Whitney之U檢定結果 86645-980522.doc -22- 1316958 言之，0-0 irDNA之修復效率與ss 〇ngo之修復效率相較 顯示有意義差（P < 0.05)。 表3 DNA 每104個導入pcep-mGFP之 細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 201.42 ±58.42個 0-2 irDNA 109.12 ±27.48個 0-6 irDNA 72.24 ± 23.97個 ss Oligo 39.76 ±20.94個 在上述實驗中’於轉染時使用三種類之irDNA及ss 〇1 ig0 各2 pg ’若將其各個換算為莫耳數，ss ohg〇之莫耳數為529 nmol ; 〇-〇 irDNA、0-2 irDNA及 Ο-ό irDNA之莫耳數分別為 9.5、10.1及 16.6 nmol。因此，三種irDNA之任一者與ss 〇Ug〇 相比，突變鹼基之修復率較高。縱使在未變性下轉染之情 況，與用熱變性irDNA後轉染之情況一樣，包含全部GFp 基因領域之0-0 irDNA修復效率高，為ss 〇1^〇之5倍以上。 0-0 irDNA之數目儘管比ss 01ig〇少數1〇倍，但修復效率比 ss Oligo尚數倍之實驗結果，暗示irDNA插靶於標的核酸之 活性比ssOligo高，導致修復效率提高。 實施例4 將mGFP基因導入細胞之染色體 使用逆病毒套組（Retrovir^ packaging kh amph〇)(Takara

Bio公司製）製作將mGFP基因導入細胞染色體之逆病毒粒 子。將在實施例1中記載之重組逆病毒載體pD〇N_mGFp& 86645-980522.doc •23- 1316958 上述套組之套裝載體’藉由磷酸鈣法同時導入293細胞。培 養48小時後’採取培養上清液及經由濾器過濾。再者，將 該培養上清液（逆病毒溶液）稀釋並添加於293細胞之培養 基中。在從其選殖之細胞（293-10細胞）中mGFP基因之導 入’藉由解析用PCR增幅之DNA片段之序列而確認。又， 萃取出該293-10細胞之染色體組DNA，解析逆病毒載體之 整合部位及與該部位鄰接之細胞側之染色體DNA序列，以 及確認有一套GFP基因導入細胞中。在以下之實驗中使用 該純系化之細胞。 實施例5 用甲基化核糖核苷酸修飾之修復用〇_〇 irDNA之製作及 mGFP突變基因之修復 使用2·-0-甲基RNA磷醯胺化物及CE-磷醯胺化物並以碟

醯胺化物法合成之5'引子RNA-ecoRI及3'引子RNA-hindIII 之驗基序列被分別示於序列表之序列編號丨丨及丨2中。此二 引子之最初ό個鹼基為甲基化之核糖核苷酸。使用該二個弓丨 子以及用pucGFPO-O做為模板進行PCR，在得到之〇 〇 irDNA之意義股及反義股之5ι末端帶有6個甲基化之核糖核 苦酸。將該在細胞内難以被核酸酶分解之〇_〇 irDNA命名為 RO-O irDNA。 將40萬個293-10細胞或293細胞（陰性對照組用）播種在24 穴平板之各穴中，在含10% FBS之DEME培養基中培養— 夜。將4 之ss 〇ng0以及〇_〇 irD]SfA或RO_〇卜^^八用 Optimen培養基稀釋成75 μ卜並與包含4叫LF2〇〇〇之同量 86645-980522.doc -24· 1316958

Optimen培養基混合。培育20分鐘後，將該DNA-LF2000試 劑複合物直接加入細胞中，然後添加90 μΐ包含1 0°/。FBS之 DEME培養基並進行轉染。在培養基中ss Oligo之莫耳數為 992.00 nmol，0-0 irDNA 為 1 7.83 nmol 以及 RO-O irDNA 為 17.82 nmol。6小時後，添加1·5 ml包含10% FBS之DEME培 養基。16〜18小時後，將培養基交換成包含3% FBS之 DEME，並於3 2°C培養2日半。 爲了正確計算GFP陽性細胞，將用PBS洗淨之細胞用胰蛋 白酶剝下，移至新平板之加有培養基之穴中，然後用螢光 顯微鏡計算各穴（160〜190萬個細胞）中各個GFP陽性細胞。 從加有修復用DNA之293-10細胞中GFP陽性細胞之數目減 去在對照293細胞中之背景值而算出。結果，在使用ss Oligo、0-0 irDNA及RO-O irDNA之情況，平均每穴中存在 54，2300及3800個GFP陽性細胞。將每1萬個293-10細胞中 之GFP陽性細胞之數目示於表4中。 就4次獨立實驗之Mann-Whitney之U檢定結果言之，二種 類 irDNA之修復效率與ss Oligo之修復效率相較，顯示有 意義差（p< 0.05)。 表4 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 0-0 irDNA 12.32 ±4.08 値I RO-O irDNA 24.20 ±3.84値] ss Oligo 0.31 ±0.08 個 以上293-10細胞染色體中之突變鹼基藉由RO-O irDNA之 86645-980522.doc -25- 1316958 修復率比藉由ss 〇14〇及0_〇 irDNA之修復率高，該實驗結 果暗示甲基化核糖核苷酸由於對於核酸酶等之分解作用具 有耐性，因此R〇_〇 irDNA在細胞質或核中之時間比〇-〇 irDNA保持得長，以致突變修復效率高。 實施例6 包含能與轉錄因子結合之序列之irDNA所造成之突變鹼基 之修復 轉錄因子為與信號轉導於核有關之重要因子，其扮演控 制基因表現之角色。多個轉錄因子在細胞質中被合成，通 常在細胞質中等待機會出任務。當接收到活化信號時，轉 錄因子移行至核内發揮機能。 抑制為轉錄因子之NF-κΒ及其之活性之Ι-κΒ多以結合形 式存在於細胞質中，當被TNFa等細胞激素刺激時，Ι-κΒ被 磷酸化以及NF-κΒ被活性化並移行至核中[proc. Natl. Acad Sci，USA，Vol. 91，p 1 1884〜1 1888 (1994)]。NF-κΒ與在基因 上游所謂NF-κΒ基元序列（NF_kB motif)之短DNA序列結 合，並促進基因之轉錄。 在293細胞中存在NF-κΒ，能與其結合之DNA序列 (5'-gattgctttagcttggaaattccggagctg-3'，序列編號 13)曾被報 告[Eur. JL Biochem，Vol. 268, p 1828~1836 (2001)]。爲了將 該序列導入在irDNA中央之逆方向反覆序列中，合成三種 引子GFP-kBl、GFP-kB2及GFP-kB3(各引子之鹼基序列被分 別示於序列表之序列編號14, 15及16中）。首先使用GFP-kBl 及上述之引子Us-EcoRI，以及用從pucGFPO-O切出之包含 86645-980522.doc -26- 1316958 GFP基因之EcoRI-BamHI片段做為模板DNA，進行PCR反 應，得到增幅之DN A片段。繼而以該增幅片段做為模板， 以及使用GFP-KB2及Us-EcoRI進行PCR，得到增幅片段。然 後，以該增幅片段做為模板，使用GFP-KB3及Us-EcoRI進 行PCR，得到增幅片段。將得到之增幅片段用EcoRI及BamHI 消化，將該片段入替pucGFPO-O中之EcoRI-BamHI片段。將 如此構築之質體命名為pucGFP0nf-0。 在pucGFPOnf-O中包含具有GFP基因之逆方向反覆序列 及NF-κΒ結合基元序列之插子，且插子之長度為1548 bp。 以該質體做為模板DNA，使用RNA-ecoRI引子及 RNA-hindIII引子，或者S-ecoRI引子及S-hindIII引子（就序 列言之，RNA-ecoRI引子與RNA-hindIII引子雖然大體相 同，但前者為從5'側起之6個鹼基變更為去氧核糖核苷酸， 同時其中之磷酸基被硫分子修飾之引子）進行PCR。被增幅 之片段被分別命名為R0nf-0 irDNA及S0nf-0 irDNA。 293-10細胞及為陰性對照組之293細胞之前培養條件以 及轉染修復用DNA之方法雖然與實施例5相同，但導入ss Oligo、RO-O irDNA、R0nf-0 irDNA及 S0nf-0 irDNA後 6 小 時，在添加之培養基中加入8 ng/ml之TNF α。 如實施例5般處理細胞，在螢光顯微鏡下計算各穴之GFP 陽性細胞之數目。從導入修復用DNA細胞中之GFP陽性細 胞之數目減去為對照組之293細胞中之背景值而算出。在ss Oligo之情況，平均GFP陽性細胞數為88個，相對於此，在 RO-O irDNA之情況為約 6000個，在 R0nf-0 irDNA及S0nf-0 86645-980522.doc -27- 1316958 irDNA之情況分別超過1萬個。使用ss Oligo、RO-O irDNA、 R0nf-0 irDNA及S0nf-0 irDNA之情況，每 1萬個 293-10細胞 之GFP陽性細胞之數目被示於表5中。使用修復效率最高之 S0nf-0 irDNA之情況，顯示修復效率為ss Oligo者之138倍。 就4次獨立實驗之Mann-Whitney之U檢定結果言之，三種 類irDNA之修復效率與ss Oligo之修復效率相較，顯示有意 義差（p< 0.05)。又，導入轉錄因子之結合基元序列之R0nf-0 irDNA及S0nf-0 irDNA之修復效率，與RO-O irDNA之修復效 率相較，顯示有意義之差（p< 0.05)。 表5 DNA 每104個細胞之GFP陽性細胞數 RO-O irDNA 28.19 ±6.54個 R0nf-0 irDNA 61.02 ±13.72個 S0nf-0 irDNA 67.58 ±20.31 個 ss Oligo 0·49±0.14 個 用lipofectamine導入細胞質中之ss Oligo及0-0 irDNA為 被動擴散之形態，沿著濃度梯度自由擴散入核中。0-0 irDNA之濃度由於為ss Oligo之數目之十分之一，進入核中 之數目少，所以起初認為0-0 irDNA對於突變鹼基之修復率 比s s 01 i g 〇低，但實際結果顯示比s s 01 i g 〇之修復效率高。 該結果暗示縱使0·0 irDNA進入細胞核之套數少，但由於具 有高插靶活性，所以突變鹼基之修復率高。又，藉由將可 與轉錄因子結合以致能促進irDNA輸送至核内之短DNA序 86645-980522.doc -28- 1316958 列導入irDNA中，可以提高修復之效果。該irDNA之5'側用 難以被核酸酶分解之甲基化核糖核苷酸或硫化去氧核糖核 苷酸修飾，效果將更為提高。 但是，在不具逆方向反覆構造且具有與標的DNA相同之 序列之單一 DNA中，縱使加入NF-κΒ之結合基元序列，修 復效果只有逆方向反覆DNA (0-nf-0 irDNA)之數分之一。 又，若將二分子彼此為逆向之NF-κΒ之結合基元序列導入 0-0 irDNA中央之DNA中，則修復效果為導入一分子Onf-O irDNA之效果之約一半。 實施例7 具有雙重突變之GFP基因之修復。 使用在試管内突變誘發法中使用之PCR，將為GFP基因之 起始密碼子之ATG中之G變換為T。將該突變GFP (mlGFP) 基因次選殖入pCEP4中，然後轉染293細胞，確認未見到螢 光。然後使用該mlGFP基因之Hindlll-Nhel片段（-36-174) 入替在實施例1中製作之mGFP基因之上游側之Hindlll-Nhel片段（-36-174)，以構築雙重突變GFP(dmGFP)基因。 在該dmGFP基因中，有第三位之T及第201位之G之二個 突變鹼基，兩者相隔198個鹼基。將導入該dmGFP基因中之 760 bp Hindlll-BamHI 片段次選殖入 pCEP4 之 Hindlll 與 BamHI之間，以製作做為標的核酸之質體pcep-dmGFP。 在實驗條件為與實施例3相同之條件下，調查0-0 irDNA 對於雙重突變之同時修復之效率。結果，顯示可於一次修 復二個突變鹼基之GFP陽性細胞，每1萬個細胞可以得到 86645-980522.doc -29- 1316958 15·85±2.00 個。 產業上利用之可能性 藉由本發曰月，提供一種^ 序列之方法。依照本發明，可以將入基因之驗基 之DNA，或者修復發生突# 、犬變導入細胞内 州多復發生突變而無機能之基因。本發明之方 法可用於基因治療、失活生物 ^之万 王物之製作以及基因機能之解析 等。 序列一覽表

質之基因。 螢光蛋白質之基因之PCR 序列編號1 :編碼紅轉綠鸯光蛋白 序列編號2 :用於增幅編碼紅轉綠 引子 Us-EcoRI。 序列編號3 :用於增幅編碼紅鏟

轉綠螢光蛋白質之基因之PCR 引子DEND。 序列編號4 :用於增幅編碼红娃

、，工轉綠螢光蛋白質之基因之PCR 引子 Us_HindIII。 光蛋白質之基因之一部 光蛋白質之基因之一部 序列編號5 :用於增幅編碼紅轉綠營 份之 PCR 引子 UlOOHindlll 〇 序列編號6 .用於增幅編竭k轉纟予肇 份之 PCR 引子 DIOOBamHI。

光蛋白質之基因之PCR 序列編號7 :用於增幅編碼紅轉綠發 引子 Us-EcoRI-1。 序列編號8 :用於增幅編石馬以蛙組& ^ ^

汁力 轉綠螢光蛋白質之基因之PCR 引子 Us-HindIII-1。 序列編號9 :用於增幅編碼紅輟汰& # ^ m 汁力 锝綠螢光蛋白質之基因之一部 86645-980522.doc '30. 1316958 份之 PCR 引子 U100HindIII-l。 序列編號10 :嵌合寡核苷酸ss Oligo。"核苷酸1至4及5〇至 53為2’-0·甲基尿苷 序列編號11 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之— 部份之PCR引子RNA-ecoRI。"核苷酸1至6為2·-〇-甲基核糖 核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核苷酸"》 序列編號1 2 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子RNA-hindIII。”核苷酸1至6為甲基核糖 核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核苷酸"。 序列編號14 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之一 部份之PCR引子GFP-kBl。 序列編號15:用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之— 部份之PCR引子GFP-kB2。 序列編號1 6 :用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因之— 部份之PCR引子GFP-kB3。 【圖式簡單說明】 圖1A-1C:在本發明中製作之具有逆方向反覆序列之質體 之模式圖。 86645-980522.doc •31· 1316958 序列表 <110〉日商寶生物股份有限公司 <120〉對標的核酸導入突變之方法 <130〉 <140> 092118857 <141> 2003-07-10 <150〉2002-204887 <151〉 2002-07-12 <150> JP 2003-113534 <151〉 2003-04-18 <160> 16 <170> Paten tin Ver. 2. 1 <210〉 1 <211〉 720 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因。 <400〉 1 atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60 86645-980522.doc 1316958 ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120 ggaaaactta ccctgaagtl catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180 ctagtcacta ctctgtgcta Lggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240 cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300 ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420 aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660 cltcttgagt Ltgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720 <210> 2 <21 Π0 <2\2> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之PCR 引子 Us-EcoRI。 〈柳> 2 cttgaattcg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa <210> 3 <211> 20 86645-980522.doc 1316958 <.212> ϋΝΛ <213〉人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之PCR引子DEND。 <400> 3 cactggcggc cgttactagt 20 <210〉 4 <211> 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之PCR 引子 Us-HindIII。 <400> 4 cttaagcttg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa 40 <210> 5 <211〉 40 <212> DNA <213〉人造序列 86645-980522.doc <220〉 <220〉1316958 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子UlOOHindlll。 〈棚> 5 ctaagcttct ggcaaactgc ctgttccatg gccaacacta 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA 〈213>人造序列 <220 <223〉人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子DlOOBamHI。 <400〉 6 tcggatccaa gtcatgccgt ttcatatgat ccgggtatct 40 <210> 7 <211> 37 <2L2> DNA <213>人造序列 86645-980522.doc <220〉 <220〉1316958 <223〉人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之 PCR 引子 Us-EcoRM。 <400〉 7 gaattcggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa <21()> 8 <211> 37 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明··用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之PCR 引子Us-HindIII_l。 <400〉 8 aagcttggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa <210〉 9 <211> 38 <212> DNA <213〉人造序列 <220> 86645-980522.doc 1316958 <223>人^序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子UlOOHindlll-卜 <400> 9 aagcttctgg caaactgcct gttccatggc caacacta 38 <210〉 10 <211> 5Ί <212> DNA <213>人造序列 <220> <221〉修飾之鹼基 <222〉（1)..(4) <223> um <220〉<221〉修飾之鹼基 <222〉（50). (53) <223> um <220〉 <223〉人造序列之說明：嵌合募核苷酸ssOligo。 <400> 10 uuuuatcttg aaaagcattg aacaccatag cacagagtag tgactagtgu uuut 54 86645-980522.doc 1316958 <210〉 11 <211> 35 <212> DNA <213〉人造序列 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部份之PCR引子RNA-ecoRI » "核苷酸1至6為2，_〇_ 甲基核糖核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核脊酸"。 <400> 11 gaauucggta ccgagctcgg atcgggcgcg caaga <210〉 12 <21l> 35 <212> DNA <213>人造序列 <220〉 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部份之PCR引子RNA-hindIII。"核苷酸1至6為2'-0-甲基核糖核苷酸一其他核苷酸為去氧核糖核苷酸％ <400> 12 aagcuuggta ccgagctcgg atcgggagag caaga 86645-980522.doc 1316958 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213〉人類 <4()0> 13 30 gattgcttta gcttggaaat tccggagctg <210> 14 <211〉 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子GFP-kBl。 <400> 14 agctaaagca atctcagttg tacagttcat ccatgccatg <210> 15 <21l> 40 <212> DNA <213〉人造序列 86645-980522.doc 1316958 <223〉人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白質之基因 之一部分之PCR引子GFP-kB2。 <400〉 15 tccggaattt ccaagctaaa gcaatctcag ttgtacagtt 40

<210〉 16 <21I> 40 <212> DNA <213〉人造序列 因 <223>人造序列之說明：用於增幅編碼紅轉綠螢光蛋白 之一部分之PCR引子GFP-kB3 - 丞 <400> 16 ttttggatcc cagctccgga stttccaagc taaagcsatc 86645-980522.doc

Claims (1)

1316958 拾、申請專利範圍： 1. 一種於活體外將突變導入標的核酸之方法’其特徵為其 係將突變導入標的核酸之驗基序列之方法’該方法係包 含： (1) 調製具有逆方向反覆序列之DNA之步驟，其中該具 有逆方向反覆序列之DNA之鹼基序列具有與標的核 酸同源、且含欲導入標的核酸中之突變之鹼基序 列；以及 (2) 將上述具有逆方向反覆序列之DNA導入細胞内之步 驟； 其中，該細胞非屬生瘦系細胞。 2. 如申請專利範圍第1項之將突變導入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DNA具有針對含核定位 信號（nclear localization signal)之蛋白質之結合基元序 歹1J (binding motif sequence) 〇 3. 如申請專利範圍第2項之將突變導入標的核酸之方法， 其中該針對含核定位信號之蛋白質之結合基元序列為 針對轉錄因子之結合基元序列。 4. 如申請專利範圍第1項之將突變導入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DN A具有經修飾之核酸 驗基。 5 ·如申請專利範圍第1項之將突變導入標的核酸之方法， 其中該具有逆方向反覆序列之DNA為雙股DNA。 6_如申請專利範圍第1項之將突變導入標的核酸之方法， 86645-980522.doc 1316958 其中該具有逆大a &万向反覆序列之DNA為單股DNA。 7_如申請專利餘 祀圍第1項之將突變導入標的核酸之方法， 其中該枯的核酸為存在於細胞質中之核酸。 8·如申明專利範圍第1項之將突變導入標的核酸之方法， 其中該標的核酸為存在於核中之核酸。 9. 如申清專利範圍第丨項之將突變導入標的核酸之方法， 其係將複數個突變同時導入標的核酸中者。 10. 如申凊專利範圍第丨項之將突變導入標的核酸之方法， 其中導入標的核酸中之突變為鹼基之取代、缺失及/或 插入者。 11. 一種套組，其特徵為藉由申請專利範圍第i項之方法將 大變導入“的核酸用者’該套組含有具逆方向反覆序列 之DNA，該DNA具有與標的核酸同源、且含欲導入標的 核酸之突變的鹼基序列。 12. 如申請專利範圍第η項之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA具有針對含核定位信號之蛋白質之結合基 元序列。 1 3 ·如申請專利範圍第12項之套組，其中該針對含核定位信 號之蛋白質之結合基元序列為針對轉錄因子之結合基 元序列。 14. 如申請專利範圍第11項之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA具有經修飾之核酸驗基。 15, 如申請專利範圍第11項之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA為雙股DNA。 86645-980522.doc 1316958 16. 如申請專利範圍第11項之套組，其中該具有逆方向反覆 序列之DNA為單股DNA。 86645-980522.doc 1316958 柒、 指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1 )圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無元件代表符號 捌、 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 86645-980522.doc