CN112899238A - 基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于N6‑甲基腺嘌呤(N6‑methyladenosin，m6A)水平的化合物筛选细胞模型，以及该模型的构建及应用。利用RNA‑m6A甲基化修饰调控RNA稳定性的原理，首先使用基因工程技术构建携带m6A修饰基序的表达载体，进一步利用该载体构建能够反映m6A修饰水平的细胞模型，最终通过细胞荧光强度差异计算化合物对m6A修饰水平的影响。此细胞筛选模型相较于荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等检测方法，具有操作简单、通量高、灵敏度强的优势。

Description

基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用
技术领域
本发明涉及一种基于N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosin，m6A)修饰水平的化合物筛选细胞模型，以及该模型的构建及应用。
背景技术
m6A是RNA上含量最丰富的化学修饰，在病毒、细菌、酵母、植物和哺乳动物中普遍存在。其受甲基转移酶、去甲基化酶及识别蛋白共同调控，主要分布在mRNA的3’非翻译区(untanslated region，UTR)，核心基序为RRACH(R，嘌呤；H，非鸟嘌呤碱基)。研究结果显示，m6A通过调节mRNA的降解、翻译、可变剪切以及mRNA的细胞定位等角度影响mRNA的功能与命运，在生理及病理过程中发挥了重要作用。
近年的多个研究结果显示m6A修饰水平能够调控肿瘤干细胞的自我更新以及致瘤能力；m6A相关蛋白的异常表达与肿瘤的发展、转移、耐药性、不良预后及复发显著相关。例如，肥胖相关基因(Fat mass and obesity associated，FTO)作为m6A去甲基化酶，在急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)中起着至关重要的致癌作用。FTO通过降低mRNA转录物中的m6A水平来调节靶基因的表达，从而增强白血病致癌基因所介导的细胞转化和白血病发生。另一方面，也有研究证明类甲基转移酶3(Methyltransferase like3，METTL3)及类甲基转移酶14(Methyltransferase like 14，METTL14)在正常骨髓生成和AML发病机制中起着关键作用。除此之外，有研究证明m6A修饰在阿尔兹海默症、肥胖、2-型糖尿病、肝细胞癌等疾病具有重要作用。由此可见，m6A修饰及其调控蛋白是重要的疾病治疗的新靶点，针对该修饰的药物筛选模型的开发具有重要的实践意义和社会价值。
目前已发现并鉴定的m6A抑制剂或激活剂较少，灵敏且高效的的m6A相关化合物筛选模型的建立将有助于化合物的开发。因此，急需开发一种基于m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型。
发明内容
本发明针对该问题，利用m6A调控转录本稳定性的原理，开发了基于m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型，模型示意图如图1所示。本发明基因工程技术构建了可表达富含m6A修饰转录本的荧光蛋白表达载体。我们首先选取转录本3’UTR区域富含m6A位点且易受YTHm6A结合蛋白2(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 2，YTHDF2)识别的基因序列；进一步将其构建在增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)的3’UTR区域；利用YTHDF2蛋白识别m6A修饰调控转录本稳定性的原理，调节EGFP表达水平，最终在细胞水平通过荧光强度的变化来反映EGFP基因的3’UTR区域上的m6A水平的变化。通过该模型，可以快速高效地对化合物进行筛选，获得调控m6A水平的化合物。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)构建携带m6A修饰基序的表达载体：将ADGRE5基因的3’UTR区域插入EGFP-C1报告载体的BamH I和EcoR I位点中，获得携带m6A修饰基序的表达载体；
(2)构建基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型：将(1)构建的携带m6A修饰基序的表达载体转染HEK-293细胞，用G418硫酸盐筛选具有新霉素抗性的细胞株，再通过稀释法获取单克隆细胞株，所述单克隆细胞株即基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型。
本发明采用ADGRE5基因的作用在于：
(1)该基因3’UTR区域具有多个m6A位点；
(2)该基因上的m6A容易被YTHDF2蛋白识别并结合，进而调控ADGRE5基因降解。利用这一特性，可将ADGRE5基因的3’UTR区域构建在EGFP基因上，使得EGFP基因能被YTHDF2蛋白调控。
进一步的，步骤(1)中所述ADGRE5基因的3’UTR区域序列是以HEK-293细胞的cDNA为模板，通过PCR技术，使用特异性引物扩增得到的；所述特异性引物为：
hADGRE5-F：5’-GGAATTCGGCATCAGAGTCCGGCAT-3’(SEQ ID NO.3)，
hADGRE5-R：5’-CGCGGATCCACAACGTCTACAACCTTCAC-3’(SEQ ID NO.4)。
进一步的，所述步骤(1)具体操作为：
(1-1)采用EGFP-C1载体序列上的BamH I和EcoR I位点，并用BamH I和EcoR I限制性内切酶对扩增后的ADGRE5基因片段两端进行双酶切，获得具有BamH I和EcoR I粘性末端的ADGRE5基因的3’UTR片段；
(1-2)用BamH I和EcoR I限制性内切酶对EGFP-C1载体进行双酶切，回收EGFP-C1载体酶切产物；
(1-3)连接扩增产物和EGFP-C1载体酶切产物，获得携带m6A修饰基序的表达载体。
进一步的，步骤(1)中所述ADGRE5基因的3’UTR区域核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述携带m6A修饰基序的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，步骤(2)的具体操作为：
(2-1)转染HEK-293细胞：取两份等量的与Opti-MEM培养基，一份与(1)构建的携带m6A修饰基序的表达载体以5μg/ml的浓度混合，另一份与Lipofectamine 2000以10μl/μl的浓度混合，将两份混合产物充分混匀，加入贴壁培养HEK-293细胞的细胞培养皿中转染4小时，换成体积百分比为10％的胎牛血清的完全DMEM培养基继续培养，36-48小时后利用荧光显微镜观察细胞荧光，若能观察到细胞荧光，证明EGFP基因成功表达；
(2-2)用G418硫酸盐进行细胞筛选：在转染HEK-293细胞48小时后加入含800ng/μlG418硫酸盐溶液的完全培养基，连续筛选至镜下观察存活的细胞80％以上具有绿色荧光；
(2-3)获取单克隆细胞株：将(2-2)中的含800ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基换成含400ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基进行培养，待细胞株的荧光稳定后再通过将细胞株稀释并种到96孔细胞培养盘，确保每孔仅含有1个细胞，培养两周后，单个细胞长至一团细胞，将具有荧光的单克隆扩大培养并保存，即为筛选模型的单克隆细胞株。
本发明的第二个目的是提供一种基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型，所述基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型是通过前述的构建方法构建得到的。
本发明的第三个目的是提供前述的基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型在筛选影响m6A修饰水平的化合物中的应用。
进一步的，将待筛选化合物与所述细胞模型混合后，检测细胞荧光强度，如细胞荧光强度有显著变化，则所述待筛选化合物为对m6A修饰水平有影响的化合物。
进一步的，如细胞荧光强度增强，则所述待筛选化合物为m6A激活剂，如细胞荧光强度减弱，则所述待筛选化合物为m6A抑制剂。
进一步的，所述应用包括以下步骤：
(1)向细胞培养皿中加入DMEM培养基，所述DMEM培养基的加入量为1.5ml DMEM培养基/3.5cm细胞培养皿，将所述基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型以4×105个细胞/3.5cm细胞培养皿的比例接种，培养至细胞汇合度达到60％；
(2)向培养基中加入待筛选化合物，所述待筛选化合物的加入量为0.1-1.5μl/3.5cm细胞培养皿，继续培养40小时；
(3)培养结束后，收集细胞并使用PBS缓冲液清洗，再加入200μl RIPA细胞裂解液，裂解15分钟后，加入RIPA裂解液两倍体积的50mM Tris-Hcl，充分混匀，所述50mM Tris-Hcl的pH＝10.0；
(4)按照每孔80μl体积将步骤(3)的混合产物加入到白色无盖的96孔酶标板中(此处必须为白色或黑色等不透明类型酶标板)，采用酶标仪对酶标板进行数据采集，通用检测波长为激发波长479nm，发射波长520nm。
本发明所述3’UTR区域是指：mRNA的3’非翻译区。
本发明技术方案具有以下优点：
相较于传统的荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等检测手段，该方法具有操作简单、成本较低、通量高、灵敏度强。可通过酶标仪进行检测，能够快速大规模地从天然化合物或合成化合物中筛选出潜在的m6A抑制剂或激活剂。
附图说明
图1为筛选模型工作原理图。
图2为ADGRE5基因PCR产物跑胶结果，1#与2#两条泳道均为ADGRE5 PCR产物，注：1％琼脂糖。
图3为EGFP-C1载体酶切产物跑胶结果，注：1％琼脂糖。
图4为EGFP-ADGRE5-3’UTR单克隆酶切验证跑胶结果，1#、2#、3#、4#为随机挑取的单克隆，注：1％琼脂糖。
图5为筛选模型在细胞内表达后的荧光图像及相对应的白光图像，注：图像为10×10(物镜×目镜)及20×10(物镜×目镜)拍摄。
图6为EGFP-ADGRE5-3’UTR稳定株荧光强度与总蛋白含量之间的关系。N＝3，实验结果以means±SD显示。
图7为32/64μM大黄酸处理EGFP-ADGRE5-3’UTR细胞40小时后，细胞荧光强度的变化，*p<0.05：两组之间有显著性差异；**p<0.01：两组之间具有较大显著性差异。N＝6，实验结果以means±SD显示。
图8为64μM大黄酸处理EGFP-ADGRE5-3’UTR细胞24小时、48小时、72小时后，细胞荧光强度的变化，*p<0.05：两组之有显著性差异；**p<0.01：两组之间具有较大显著性差异。N＝6，实验结果以means±SD显示。
图9为不同浓度的大黄酸处理EGFP-ADGRE5-3’UTR细胞40小时后，细胞内EGFPmRNA的变化，***p<0.001：两组之间具有极显著性差异。N＝3，实验结果以means±SD显示。
图10为64μM大黄酸处理细胞40小时后，细胞内EGFP mRNA在加入放线菌素D后0-4小时过程中的降解速率变化，***p<0.001：两组之间具有极显著性差异。N＝3，实验结果以means±SD显示。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用
包括以下步骤：
1、选取符合要求的候选基因
用于筛选候选基因的高通量数据库内包括了RNA上的m6A位点分布、敲减Ythdf2基因后RNA半衰期变化以及YTHDF2蛋白结合的RNA序列等数据，设置筛选条件为：候选基因的3’UTR上具有多个m6A位点、候选基因的3’UTR能与YTHDF2蛋白结合、Ythdf2基因敲减后候选基因半衰期增大、候选基因3’UTR区域长度小于1000bp。通过对高通量测序数据进行筛选以及对候选基因的验证，发现其中粘附G蛋白偶联受体E5基因(Homo sapiens adhesion Gprotein-coupled receptor E5，ADGRE5)的3’UTR区域完全符合所有要求，最终选择ADGRE5基因的3’UTR区域用于构建EGFP-ADGRE5-3’UTR筛选模型。
2、EGFP-ADGRE5-3’UTR模型的构建
EGFP-ADGRE5-3’UTR模型主要由CMV启动子、EGFP蛋白基因编码区及ADGRE5基因的3’UTR区域构成。携带m6A修饰基序的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体构建方法为：
a、引物设计
利用primer 5.0软件以及SnapGene软件设计引物
Figure BDA0003002781780000051
b、ADGRE5基因3’UTR的获取
使用hADGRE5(F)和hADGRE5(R)引物从HEK-293细胞构建的cDNA库(800ng/μl)中通过PCR技术扩增得到ADGRE5基因的3’UTR序列，PCR后的琼脂糖凝胶电泳结果显示ADGRE5基因的3’UTR片段大小在500bp到600bp之间(图2)，随后将PCR产物从琼脂糖凝胶中进行回收，并使用BamH I和EcoR I限制性内切酶对回收产物进行双酶切，获得具有BamH I和EcoR I粘性末端的ADGRE5基因的3’UTR序列。
PCR反应体系以及条件如下:
Figure BDA0003002781780000061
PCR运行程序：
Figure BDA0003002781780000062
c、载体及克隆片段的酶切、连接
用BamH I和EcoR I限制性内切酶对EGFP-C1载体进行双酶切后的片段大小为5000bp左右，(图3所示)，同时在酶切结束后，载体进行去磷酸化处理，防止载体在后续的实验中发生载体自连。对酶切产物进行回收并测定浓度，并将酶切后的具有BamH I和EcoR I粘性末端的EGFP-C1载体和具有相同粘性末端的ADGRE5基因3’UTR序列进行过夜连接反应。
d、连接产物的转化、涂板及挑取单克隆并测序
20μl连接产物转化到50μl DH5α感受态细胞中，无抗性LB培养基摇菌1小时后均匀地涂在具有卡那霉素抗性的LB固体培养板中，37℃恒温培养箱过夜培养(16小时)。第二天观察菌落大小，挑取4个单克隆菌落，编号为1#、2#、3#、4#，扩大培养后进行质粒提取，并通过BamH I和EcoR I限制性内切酶对重组质粒进行双酶切验证，结果显示，编号为1#、2#、3#、4#的4个单克隆菌落中ADGRE5基因的3’UTR序列都成功连接到EGFP-C1载体上(图4所示)。将EGFP-ADGRE5-3’UTR单克隆(1#)质粒送测序公司进行测序，测序结果表明EGFP-ADGRE5-3’UTR单克隆(1#)的序列完全正确且无任何突变，所述EGFP-AD GRE5-3’UTR单克隆(1#)即携带m6A修饰基序的表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3、筛选模型转染HEK-293细胞及细胞稳定株筛选
在3.5cm细胞培养皿内接种HEK-293细胞，贴壁24小时后进行质粒转染，每个3.5cm细胞培养皿可以转染1μg质粒。首先将200μl的Opti-MEM培养基与1μg质粒混合，同时将200μl的Opti-MEM培养基与2μl Lipofectamine 2000混合，室温放置5分钟，随后充分混匀，室温静置20分钟，随后温和地加到含有1ml Opti-MEM培养基的3.5cm细胞培养皿中，转染4小时后换成含10％(体积比)胎牛血清的完全DMEM培养基继续培养，36-48小时后使用荧光显微镜观察细胞荧光。
构建的EGFP-ADGRE5-3’UTR筛选模型上具有新霉素抗性，而G418硫酸盐能筛选掉无新霉素抗性的细胞，由于筛选模型与新霉素抗性在同一载体上，具有新霉素抗性的细胞内也会含有筛选模型的序列，使用800ng/μl G418硫酸盐对转染48小时后的细胞进行筛选，就能同时获得具有表达新霉素抗性以及筛选模型的细胞，连续筛选至细胞不发生大量死亡。
随后将含800ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基换成含400ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基进行培养，待细胞株稳定后，使用荧光显微镜拍摄细胞株荧光图片，荧光图片显示经过G418硫酸盐溶液筛选，绝大多数存活的细胞内都具有筛选模型表达后发出的绿色荧光，且荧光强度较为均匀(图5所示)。最后，通过将细胞株稀释并种到96孔细胞培养盘，确保每孔仅含有1个细胞，待培养两周后，单个细胞长至一团细胞，将具有荧光的单克隆扩大培养并保存，即为筛选模型的单克隆细胞株。
实施例2验证筛选模型的可行性
为了检测所构建的EGFP-ADGRE5-3’UTR筛选模型是否可用于m6A相关化合物的筛选，选择了大黄酸(m6A去甲基化酶抑制剂)进行模拟筛选实验，验证筛选模型能否对由大黄酸所引起的m6A水平上升产生正确的响应。
a、大黄酸处理后的荧光强度的变化
(1)准备工作：将生长状态良好的细胞稳定株消化后，用DMEM培养基悬浮，按照每3.5cm细胞培养皿加入1.5ml DMEM培养基，种4×105个细胞，按照下表格所示接种4盘细胞，并加入相应化合物处理40小时。
Figure BDA0003002781780000081
注：DMSO的体积与实验组中大黄酸的体积相同。
(2)样品检测：处理40小时后，消化细胞并离心弃上清(5000rpm、5分钟)，用PBS清洗两次，再加入200μl RIPA细胞裂解液，裂解15分钟，加入两倍体积的50mM Tris-Hcl(pH10.0)，充分混匀后，按照每孔80μl体积加入到白色无盖的酶标板中，每个样品三个复孔，重复两次检测。检测条件：EGFP荧光波长激发波长479nm，发射波长520nm。
(3)实验结果：EGFP-ADGRE5-3’UTR筛选模型细胞株荧光强度与总蛋白含量之间的关系如图6所示，实验结果表明筛选模型细胞荧光强度与细胞总蛋白之间存在线性关系，证明采用先裂解细胞再使用酶标仪检测荧光强度的方法具有良好的重复性及稳定性。以DMSO为对照组，分别用32μM、64μM的大黄酸(溶剂为DMSO)处理筛选模型细胞株40小时后，细胞荧光强度的变化结果如图7所示，结果表明在加入64μM大黄酸后，细胞株荧光强度出现明显降低，随后同样以DMSO为对照组，使用64μM大黄酸(溶剂为DMSO)处理筛选模型细胞株24小时、48小时、72小时后，结果显示的细胞荧光强度随着处理时间的延长而逐渐降低(如图8所示)。
b、大黄酸处理后筛选模型细胞内EGFP基因的mRNA水平变化
(1)准备工作：将生长状态良好的筛选模型细胞株消化后，用DMEM培养基悬浮，按照每3.5cm细胞培养皿加1.5ml DMEM培养基，种4×105个细胞，按照下图所示接种4盘细胞，并加入相应化合物处理40小时。
Figure BDA0003002781780000082
注：DMSO的体积与实验组中大黄酸的体积相同。
(2)样品检测：细胞处理40小时后，消化细胞并离心弃上清(5000rpm、5分钟)，PBS清洗两次，用1ml Trizol收取样品。荧光定量PCR检测GAPDH基因(内参)及EGFP基因水平，引物信息如下图所示：
Figure BDA0003002781780000091
(3)实验结果：不同浓度大黄酸处理EGFP-ADGRE5-3’UTR细胞株40小时后，细胞内EGFP mRNA的变化结果如图9所示，在加入64μM大黄酸后，细胞株内的EGFP mRNA水平出现显著降低，符合预期实验结果。
c、64μM大黄酸处理40小时后，EGFP基因降解速率变化
(1)准备工作：将生长状态良好的稳定株细胞消化后，用DMEM培养基悬浮，按照每3.5cm细胞培养皿加1.5ml DMEM培养基，种4×105个细胞，按照下图所示接种8盘细胞，并加入相应化合物处理40小时。
Figure BDA0003002781780000092
注：DMSO的体积与实验组中大黄酸的体积相同。
(2)样品检测：细胞处理40小时后，在1小时、2小时、4小时等6盘细胞中加入终浓度为5μM的放线菌素D，在相应时间点收取样品并细胞计数，以保证细胞数一致，用1ml Trizol(含10ng/ml Luciferase RNA)收取样品(0-4小时)。荧光定量PCR检测Luciferase基因及EGFP基因，引物信息如下图所示：
Figure BDA0003002781780000093
(3)实验结果：64μM大黄酸处理EGFP-ADGRE5-3’UTR细胞40小时后，细胞内EGFPmRNA在加入放线菌素D的0小时、1小时、2小时、4小时后的变化如图10所示，结果显示实验组的EGFP mRNA较于对照组的EGFP mRNA更易被降解，降解速率明显高于对照组。
综上，本发明能对现有m6A抑制剂(大黄酸)产生符合预期的反应。除此之外，在该筛选模型的基础上，也尝试了进行进一步优化，包括通过实验找出富含m6A核心序列、增加3’UTR上的m6A修饰位点等手段，但是上述改造都未能进一步增强检测的灵敏性。相较于传统的荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等检测手段，该模型可以使用酶标仪进行筛选，具有操作简单，能高通量并快速的对化合物进行筛选的特点。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1808
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta gcgctaccgg 240
tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 300
agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 360
ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 420
ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 480
acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 540
ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 600
acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 660
tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 720
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 780
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 840
acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 900
acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 960
acaagtccgg actcagatct cgagctcaag cttcgaattc ggcatcagag tccggcatat 1020
gaaggcgcat ggttctggac ggcccagcag ctcctgtggc cacagcagct ttgtacacga 1080
agaccatcca tcctcccttc gtccaccact ctactccctc caccctccct ccctgatccc 1140
gtgtgccacc aggagggagt ggcagctata gtctggcacc aaagtccagg acacccagtg 1200
gggtggagtc ggagccactg gtcctgctgc tggctgcctc tctgctccac cttgtgaccc 1260
agggtgggga caggggctgg cccagggctg caatgcagca tgttgccctg gcacctgtgg 1320
ccagtactcg ggacagacta agggcgcttg tcccatcctg gacttttcct ctcatgtctt 1380
tgctgcagaa ctgaagagac taggcgctgg ggctcagctt ccctcttaag ctaagactga 1440
tgtcagaggc cccatggcga ggccccttgg ggccactgcc tgaggctcac ggtacagagg 1500
cctgccctgc ctggccgggc aggaggttct cactgttgtg aaggttgtag acgttgtgga 1560
tccaccggat ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt 1620
gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 1680
gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 1740
ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 1800
gtatctta 1808
<210> 2
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcatcagag tccggcatat gaaggcgcat ggttctggac ggcccagcag ctcctgtggc 60
cacagcagct ttgtacacga agaccatcca tcctcccttc gtccaccact ctactccctc 120
caccctccct ccctgatccc gtgtgccacc aggagggagt ggcagctata gtctggcacc 180
aaagtccagg acacccagtg gggtggagtc ggagccactg gtcctgctgc tggctgcctc 240
tctgctccac cttgtgaccc agggtgggga caggggctgg cccagggctg caatgcagca 300
tgttgccctg gcacctgtgg ccagtactcg ggacagacta agggcgcttg tcccatcctg 360
gacttttcct ctcatgtctt tgctgcagaa ctgaagagac taggcgctgg ggctcagctt 420
ccctcttaag ctaagactga tgtcagaggc cccatggcga ggccccttgg ggccactgcc 480
tgaggctcac ggtacagagg cctgccctgc ctggccgggc aggaggttct cactgttgtg 540
aaggttgtag acgttgtg 558
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattcggc atcagagtcc ggcat 25
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcggatcca caacgtctac aaccttcac 29
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagctgaccc tgaagttcat ctgc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttgtagttg ccgtcgtcct tgaa 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acccagaaga ctgtggatgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcagctcagg gatgaccttg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gccaaaagca ctctgattga c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatatcctt gcctgatacc tg 22

Claims (10)

1.一种基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)构建携带m6A修饰基序的表达载体：将ADGRE5基因的3’UTR区域插入EGFP-C1报告载体的EGFP序列后的多克隆位点中，获得携带m6A修饰基序的表达载体；
(2)构建基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型：将(1)构建的携带m6A修饰基序的表达载体转染HEK-293细胞，用G418硫酸盐筛选具有新霉素抗性的细胞株，再通过稀释法获取筛选模型单克隆细胞株，所述单克隆细胞株即基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述ADGRE5的3’UTR区域序列是以HEK-293细胞的cDNA为模板，通过PCR技术，使用特异性引物扩增得到的；所述特异性引物为：
hADGRE5-F：5’-GGAATTCGGCATCAGAGTCCGGCAT-3’(SEQ ID NO.3)，
hADGRE5-R：5’-CGCGGATCCACAACGTCTACAACCTTCAC-3’(SEQ ID NO.4)。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体操作为：
(1-1)采用EGFP-C1载体序列上的BamH I和EcoR I多克隆位点，并用BamH I和EcoR I限制性内切酶对扩增后的ADGRE5基因片段两端进行双酶切，获得具BamH I和EcoR I粘性末端的ADGRE5基因的3’UTR片段；
(1-2)用BamH I和EcoR I限制性内切酶对EGFP-C1载体进行双酶切，回收EGFP-C1载体酶切产物；
(1-3)连接扩增产物和EGFP-C1载体酶切产物，获得携带m6A修饰基序的表达载体。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述ADGRE5基因的3’UTR区域核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述携带m6A修饰基序的表达载体的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作为：
(2-1)转染HEK-293细胞：取两份等量的与Opti-MEM培养基，一份与(1)构建的携带m6A修饰基序的表达载体以5μg/ml的浓度混合，另一份与Lipofectamine 2000以10μl/μl的浓度混合，将两份混合产物充分混匀，加入贴壁培养HEK-293细胞的细胞培养皿中转染4小时，换成体积百分比为10％的胎牛血清的完全DMEM培养基继续培养，36-48小时后观察细胞荧光；
(2-2)用G418硫酸盐进行细胞筛选：在转染HEK-293细胞48小时后加入含800ng/μlG418硫酸盐溶液的完全培养基，连续筛选至细胞不发生大量死亡；
(2-3)获取单克隆细胞：将(2-2)中的含800ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基换成含400ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基进行培养，将细胞株用培养基稀释并种到96孔细胞培养盘中，确保每孔仅含有1个细胞，待培养两周后，单个细胞长至一团细胞，将具有荧光的单克隆扩大培养并保存，即为筛选模型的单克隆细胞株。
6.一种基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型，其特征在于，所述基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型是通过权利要求1至5任一项权利要求所述的构建方法构建得到的。
7.权利要求6所述的基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型在筛选影响m6A修饰水平的化合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将待筛选化合物与所述细胞模型混合后，检测细胞荧光强度，如细胞荧光强度有变化，则所述待筛选化合物为对m6A修饰水平有影响的化合物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，如细胞荧光强度增强，则所述待筛选化合物为m6A激活剂，如细胞荧光强度减弱，则所述待筛选化合物为m6A抑制剂。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
(1)向细胞培养皿中加入DMEM培养基，所述DMEM培养基的加入量为1.5ml DMEM培养基/3.5cm细胞培养皿，将所述基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型以4×105个细胞/3.5cm细胞培养皿的比例接种，培养至细胞汇合度达到60％；
(2)向培养基中加入待筛选化合物，所述待筛选化合物的加入量为0.1-1.5μl/3.5cm细胞培养皿，继续培养40小时；
(3)培养结束后，收集细胞并使用PBS缓冲液清洗，再加入200μl RIPA细胞裂解液，裂解15分钟后，加入RIPA裂解液两倍体积的50mM Tris-Hcl，充分混匀，所述50mM Tris-Hcl的pH＝10.0；
(4)按照每孔80μl体积将步骤(3)的混合产物加入到无盖的96孔酶标板中，采用酶标仪对酶标板进行数据采集，通用检测波长为激发波长479nm，发射波长520nm。
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