CN111434777A - 一种m6A修饰RNA检测方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测生物或医学样品中m6A修饰RNA的方法。该方法的特征在于其是基于利用YTHDF2蛋白结合RNA分子m6A的特性，分离带有m6A修饰的RNA分子，进而通过PCR扩增技术检测m6A修饰的RNA分子。本方法可以用于生物或医学样品中m6A修饰RNA的检测分析。
Description
技术领域 本发明属于生物医药领域，具体涉及m6A修饰RNA检测方法及其应用。
背景技术 RNA的碱基修饰超过100种，其中最为普遍存在的是N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰，其发生在原核生物和真核生物的多种RNA中，包括mRNA、rRNA、tRNA和miRNA等。研究发现m6A修饰影响RNA的剪接、翻译、定位和降解等重要生物学进程。在人体免疫、造血功能、神经细胞的发育等过程中具有重要的调控作用，在包括肿瘤在内多种疾病发生和发展过程中同样发挥重要作用。在细胞和生物体内m6A修饰水平处于动态变化过程中，因此，检测分析m6A修饰RNA变化可以阐释其生物学功能，对疾病的诊断和治疗靶标分子的发现具有重要意义。
目前已发展出了不同的检测m6A修饰RNA的检测方法，且各具特点，但也存在着不足。最为常用的分离m6A修饰的RNA分子的方法是使用抗m6A的抗体对m6A修饰的RNA进行亲和纯化分离制备，再进行后续的检测分析。但是，由于现有m6A抗体的价格昂贵，筛选新的特异性m6A抗体难度大，限制了其在大规模样本检测分析中的应用。因此，建立m6A抗体的替代分离m6A修饰RNA方法就十分必要。
近来研究已经表明含有YTH(YT521-B)结构域家族蛋白被鉴定为m6A的“读码器”，特别是YTHDF2(YTH domain-containing family protein 2)具有天然特异性结合m6A的功能(Zhu T，et al.Crystal structure of the YTH domain of YTHDF2 revealsmechanism for recognition of N6-methyladenosine.Cell Res.2014，24(12)：1493-1496；Li F，et al.Structure of the YTH domain of human YTHDF2 in complex withan m(6)A mononucleotide reveals an aromatic cage for m(6)A recognition.CellRes.2014，24(12)：1490-1492)。YTHDF2结合m6A的特点为建立分离纯化m6A修饰RNA分子的新方法提供了有利条件。
发明内容 本发明的目的是建立一种简便的分离纯化m6A修饰RNA分子的方法，并在此基础上实现对m6A修饰RNA进行反转录反应和PCR反应的检测分析。本发明的分离纯化和检测分析方法，其特征在于利用YTHDF2蛋白结合m6A修饰RNA的特性，使用YTHDF2蛋白替代已有方法中使用的抗m6A抗体分离纯化m6A修饰的RNA分子，通过反转录和PCR反应检测分析m6A修饰的RNA分子。
该m6A修饰RNA检测方法包括三个主要步骤，(1)YTHDF2蛋白结合并分离m6A修饰的RNA分子；(2)反转录反应；(3)PCR反应。依据PCR反应检测扩增产物方式的不同，可以采用普通PCR反应，也可以加入荧光染料或分子信标采用实时定量PCR反应。在PCR反应中可以可以使用一组引物对特定RNA分子进行PCR反应，也可以进行多重PCR反应检测不同的RNA分子，或同一RNA分子的不同片段。
在本发明中的方法中，YTHDF2蛋白的来源为经分离纯化获得的人YTHDF2蛋白，或为重组表达的YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白。YTHDF2蛋白可以从培养的人细胞及组织中制备，重组表达的YTHDF2蛋白还可以带有常用的His标签、myc标签、flag标签，以及其他方便分离纯化的标签，重组蛋白可以在大肠杆菌、昆虫细胞和人细胞中表达。
在本发明的方法中，为了便于分离结合m6A修饰的RNA分子，YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白可以通过共价交联、融合蛋白标签结合等方式与载体结合，便于对结合RNA的分离。载体可以是磁性微球、琼脂糖微珠等常用载体。例如，带有His标签的融合蛋白可以用具有结合His标签的磁球或琼脂糖珠实现分离纯化。同样可以使用抗YTHDF2蛋白抗体实现分离纯化，对融合蛋白还可以使用抗融合蛋白标签的抗体实现分离纯化。在具体的分离纯化反应中，YTHDF2或YTHDF2融合蛋白的使用量依据RNA的量而定。
在本发明的方法中，YTHDF2可以加入纯化的RNA分子中，实现对m6A修饰的RNA分子的分离纯化，也可以加入细胞裂解液、组织裂解液中，实现对m6A修饰的RNA分子的分离纯化。
本发明的m6A修饰RNA检测方法适用于体液样本检测，包括尿液、唾液、血液、血液衍生物等，以及检测细胞和组织样本等。
为了检测使用方便，可依据本方法组装成试剂盒使用，试剂盒由常规的反转录试剂、PCR或实时定量PCR试剂，以及YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白组成，可以包括结合YTHDF2蛋白或融合蛋白的载体。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
结合附图说明本发明的具体实施方法。
附图说明
图1：m6A修饰RNA分离纯化和检测方法示意图
图2：m6A修饰28srRNA分离纯化和检测结果
实施例
实施例一
重组人YTHDF2融合蛋白表达和His-YTHDF2磁球制备
1.YTHDF2基因扩增及重组质粒的构建：针对人YTHDF2 mRNA设计PCR引物，上游引物YTHDF2-F(P1)：5′-GATCGGATCCATGTCGGCCAGCAGCCTCTT GGA-3′(划线部分为BamH I酶切位点)，下游引物YTHDF2-R(P2)：5′-AGTGCTCGAGTTATTTCCCACGACCTTGACGTTC-3′(划线部分为Xho I酶切位点)。用PCR扩增法从HEK293细胞cDNA中获得了约为1800bp的YTHDF2目的片段，双酶切后连接pET-28a质粒，测序结果表明构建的重组pET-28a-YTHDF2载体DNA序列正确。
2.重组His-YTHDF2融合蛋白诱导表达和磁球制备：将pET-28a-YTHDF2重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，在LB培养基中用IPTG诱导表达后进行电泳分析。SDS-PAGE结果显示，表明重组蛋白在E.coli中表达。进一步分析表明重组融合蛋白主要以包涵体形式存在。因此，采用Ni2+-NTA磁球进行YTHDF2融合蛋白的纯化和固相复性，获得His-YTHDF2磁球。
实施例二
分离纯化并检测m6A修饰的28s rRNA
1.m6A修饰RNA的制备：采用TRI reagent从培养的HEK293T细胞中制备细胞总RNA，分别用抗m6A抗体和His-YTHDF2磁球对m6A修饰RNA进行纯化。
抗体纯化，磁球纯化：取4个1.5ml无RNA酶EP管，分别加入400μl 1×IP缓冲液，1μg细胞提取的总RNA，以及1μl RNA酶抑制剂(40U/μl)。在抗体组的两支EP管中，分别加入2μgm6A抗体(Synaptic Systems，202003)和兔IgG作为对照；在His-YTHDF2磁球纯化组的两只EP管中分别加入50μl His-YTHDF2磁球及空载磁球对照。于4℃在混匀仪上孵育2h，随后向抗体组中加入20μl Protein A/G琼脂糖珠(Santa cruz，sc-2003)，继续于4℃在混匀仪上孵育30min。分别用离心与磁力架分离琼脂糖珠与磁球，PBS洗涤3次，每次5min。随后向每管中加入100μl PBS重悬，加入3μl蛋白酶K(20mg/μl)，37℃金属浴孵育30min，随后用水饱和酚抽提RNA，乙醇沉淀。RNA溶于20μl无RNase水中。
2.反转录反应：取5μl RNA分别作为反转录模板，加入1μl 28s rRNA反向扩增引物5′-AATCAAGATCAAGCGAGCTT-3′(0.5μg/μl)，加入5×RT缓冲液4μl，25mM MgCl22.4μl，10mMdNTP 1μl，0.5μl RNase抑制剂(40U/μl)、1μl GoScriptTM反转录酶(Promega)，用无RNase水补齐至20μl。于42℃孵育60min，72℃孵育15min，20℃孵育5min。
3.实时定量PCR反应：以上述cDNA作为模板，用SYBR Premix ExTaq试剂在MX3000P实时定量PCR仪上进行实时定量PCR。取2×SYBR 10μl，28s rRNA PCR扩增引物混合物1μl(28s-F：5′-GGCGCGACCCGCTCCGGGGA-3′，28s-R：5′-AATCAAGATCAAGCGAGCTT-3′)(20nM)，Rox0.4μl，cDNA 1μl，水7.6μl。PCR反应条件为于95℃反应5min，95℃反应10s，60℃反应20s。扩增45个循环。检测结果如图2所示，His-YTHDF2磁球和抗m6A抗体均可以有效纯化m6A修饰的RNA分子，实现通过RT-PCR进行m6A修饰RNA的检测分析。
Claims (9)
1.一种m6A修饰RNA分子检测法，其特征在于：利用YTHDF2蛋白结合m6A修饰RNA的特性，分离纯化m6A修饰的RNA分子，通过反转录和PCR反应检测分析m6A修饰的RNA分子。
2.根据权利要求1中所述的检测方法，其特征在于：包括三个主要步骤，(1)YTHDF2蛋白结合并分离m6A修饰的RNA分子：(2)反转录反应：(3)PCR反应。
3.根据权利要求1中所述的YTHDF2蛋白，其特征在于：YTHDF2蛋白为经分离纯化获得的人YTHDF2蛋白，或为重组表达的YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白。
4.根据权利要求1中所述的YTHDF2蛋白，其特征在于：YTHDF2蛋白或YTHDF2融合蛋白通过共价交联、融合蛋白标签结合等方式与载体结合，便于对结合RNA的分离；同样可以使用抗YTHDF2融合蛋白的标签抗体进行分离。
5.根据权利要求4中所述的YTHDF2蛋白结合载体，包括磁性微球、琼脂糖微珠等常用载体。
6.权利要求1中所述的PCR反应，其特征在于：可以使用一组引物对特定RNA分子进行PCR反应，也可以进行多重PCR反应检测不同的RNA分子，或同一RNA分子的不同片段。
7.权利要求1中所述的PCR反应，其特征在于：在PCR反应体系中加入荧光染料或分子信标进行实时定量PCR反应。
8.权利要求1-6中任一所述的检测方法在m6A修饰RNA分子检测分析中的应用。
9.权利要求1-6中任一所述的检测方法，其特征在于：所述检测样本包括细胞、尿液、唾液、血液、血液衍生物或组织样本。
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| CN201910025924.XA CN111434777A (zh) | 2019-01-11 | 2019-01-11 | 一种m6A修饰RNA检测方法及用途 |
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN112899238A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-04 | 中国药科大学 | 基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用 |
| CN113061648A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-02 | 中山大学 | 一种采用Tn5转座酶辅助构建微量样品m6A修饰检测文库的方法及其应用 |
| CN114457077A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-05-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 靶向新型冠状病毒rna及其反义链utr的脱氧核酶及其应用 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN105018617A (zh) * | 2015-07-20 | 2015-11-04 | 浙江大学 | 单个基因mRNA甲基化水平检测方法 |
-
2019
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018617A (zh) * | 2015-07-20 | 2015-11-04 | 浙江大学 | 单个基因mRNA甲基化水平检测方法 |
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| Title |
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| CN112899238B (zh) * | 2021-04-01 | 2023-09-26 | 中国药科大学 | 基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用 |
| CN114457077A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-05-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 靶向新型冠状病毒rna及其反义链utr的脱氧核酶及其应用 |
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