CN108929918B - 一种用于检测prrsv的现场快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒，涉及畜牧领域。本发明利用crRNA的特异性和RPA引物的特异性有效保证对病毒检测的正确度，且在常温下1～2小时之内即可通过试纸确定是否感染及感染蓝耳病病毒的亚型，相比传统基于PCR的检测方法精确度有所提高。本发明可以形成配有纯化的冻干LwaCas13a和crRNA试剂盒，可以在现场，如猪场，屠宰场方便快速地对猪蓝耳病病毒进行检测，且不需要复杂的控温仪器如PCR仪和离心机等复杂设备，只需要一个恒温装置即可快速获得可以用肉眼观测的结果，可以更加高效地了解猪场的健康状况，避免损失，为蓝耳病的检测提供更低成本，快速方便的检测方法。

Description

一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及畜牧领域，具体涉及一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒，具体是利用Cas13/crRNA特异性现场快速识别并检测PRRSV病毒。
背景技术
猪蓝耳病是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)引发的一种传染性猪疾病。猪蓝耳病可以引起母猪出现繁殖障碍并致使仔猪出现严重呼吸道疾病症状，严重影响经济效益。中国是猪蓝耳病的重要疫区，中国分离得到的病毒株多为高致病性株，为中国养猪业带来大量损失。
然而目前该病毒的检测方法检测时间较长，且对仪器的要求较高。对于该病毒的检验较为常用的方法主要有病毒分离，病毒抗原抗体检测，基于PCR等逆转录及核酸扩增的检查方法，血清抗原检测等。这些方法虽然可以有效检验PRRSV病毒，但是存在检查周期长，实验条件要求高等问题，而且这些方法一般需要采取猪的心，脾，肾，肺，淋巴结，血液等组织，难以在缺乏实验设施的检测现场如养殖场，屠宰场实时快速地进行病毒的检测，尤其不适合养殖场所。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法。该方法是一种利用LwaCas13a/crRNA系统进行PRRSV病毒的检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，包括纯化的冻干LwaCas13a、欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、报告RNA分子；
为了更好的实现本发明，所述试剂盒还包括Rehydration Buffer、RNaseInhibitor、冻干RPA反应微球、MgAc、MgCl2、核酸检验缓冲溶液、ATP、GTP、UTP、CTP、T7polymerase mix；
所述的核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
所述的欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为EU-crRNA-1(SEQ ID NO：1)、EU-crRNA-2(SEQ ID NO：2)和EU-crRNA-3(SEQ ID NO：3)中的至少一种；
所述的美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为NA-crRNA-1(SEQ ID NO：4)、NA-crRNA-2(SEQ ID NO：5)和NA-crRNA-3(SEQ ID NO：6)中的至少一种；
所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为EU-RPA-target1-F/R引物组(SEQID NO：7、8)和EU-RPA-target2-F/R引物组(SEQ ID NO：9、10)中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；
所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为NA-RPA-target1-F/R引物组(SEQID NO：11、12)和NA-RPA-target2-F/R引物组(SEQ ID NO：13、14)中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段；
所述的报告RNA分子为SEQ ID NO：15。
一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
1)对PRRSV病毒的两个重要亚型，即欧洲型，美洲型设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1～6所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接合成；
具体的，欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为EU-crRNA-1(SEQ ID NO：1)、EU-crRNA-2(SEQ ID NO：2)和EU-crRNA-3(SEQ ID NO：3)中的至少一种；
美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为NA-crRNA-1(SEQ ID NO：4)、NA-crRNA-2(SEQ ID NO：5)和NA-crRNA-3(SEQ ID NO：6)中的至少一种；
2)LwaCas13a蛋白的表达和纯化；
3)针对步骤(1)所述的两个重要亚型的靶点设计RT-RPA引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：7～14所示，对病毒样品进行预处理并进行RT-RPA反应；
具体的，所述的RT-RPA引物包括针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物，针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物；
所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为EU-RPA-target1-F/R引物组(SEQID NO：7、8)和EU-RPA-target2-F/R引物组(SEQ ID NO：9、10)中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；
所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为NA-RPA-target1-F/R引物组(SEQID NO：11、12)和NA-RPA-target2-F/R引物组(SEQ ID NO：13、14)中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段；
4)将RT-RPA反应产物进行体外转录和纯化；
5)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、RT-RPA体外转录产物、LwaCas13a、报告RNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；
6)反应产物通过侧流免疫层析试纸获得检测结果。
优选的，步骤(1)中所述的将设计的crRNA序列的合成方法为：构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接化学合成，但不限于此。
优选的，步骤(1)中所述的欧洲型PRRSV病毒基因组指NCBI登陆号为AY366525，AY588319，DQ489311，DQ864705，EU076704，GQ461593，JF276430，JF276431，JF276432，JF276433，JF276434，JF276435，JX187609，KC492504，KC492505，KC492506，KM196101，LEYPOLYENV的核酸序列。
优选的，步骤(1)中所述的美洲型PRRSV病毒基因组指NCBI登陆号为AF066183，AF331831，AY032626，AY150312，AY262352，AY457635，DQ459471，EF075945，EF112445，EF112447，EF488739，EF635006，EU106888，EU200961，EU200962，EU262603，EU678352，EU708726，EU807840，EU860248，EU880438，EU880439，EU880442，FJ175688，FJ536165，FJ895329，FJ950744，GQ359108，GU168569，GU269541的核酸序列。
优选的，步骤(3)中所述病毒样品进行预处理方法，为样品加入TCEP与MEDTA至浓度分别为100mM和1mM，95℃处理10分钟或37℃20分钟。
优选的，步骤(3)中所述RT-RPA反应体系为：50μL体系中，上游引物240nM，下游引物240nM，Rehydration Buffer 29.5μL，病毒样品模板，RNase Inhibitor(NEB M3014L)2.5μL，补dH2O至47.5μL；将上述体系混合后加至冻干RPA反应微球，加入MgAc 280mM 2.5μL以启动反应。
优选的，步骤(5)中的报告RNA分子设计为两端分别带有FITC和Biotin基团的polyU RNA分子：5′-FITC-UUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3′(见SEQ ID NO：15)，但不限于此。
优选的，步骤(5)中所述的反应体系为25μL体系中，45nM纯化的LwaCas13a，22.5nMcrRNA，125nM报告RNA分子，2μL RNase inhibitor，1μL RT-RPA体外转录产物；上述体系在核酸检验缓冲溶液中配制，核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
优选的，步骤(5)可与步骤(4)中体外转录合并，体系调整为25μL体系中，45nM纯化的LwaCas13a，22.5nM crRNA，125nM报告RNA分子，2μL RNase inhibitor，1μL RT-RPA反应产物，1mM ATP、1mM GTP、1mM UTP、1mM CTP，0.6μL T7polymerase mix(New EnglandBiolabs)。上述体系在核酸检验缓冲溶液中配制，核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
优选的，步骤(5)可与步骤(3)、(4)合并，体系调整为50μL体系中，0.48μM上游引物，0.48μM下游引物，29.5μL rehydration buffer，依照步骤(3)处理的病毒样品模板，45nM纯化的LwaCas13a蛋白，22.5nM crRNA，200nM RNA报告分子，2μL murine RNaseinhibitor(New England Biolabs)，2mM ATP、2mM GTP、2mM UTP、2mM CTP，1μLT7polymerase mix(New England Biolabs)，5mM MgCl2和14mM MgAc；将冻干RPA反应微球加入体系中混匀以启动反应。
优选的，步骤(6)中侧流免疫层析试纸的设计：测流免疫层析试纸采用商业化MileniaHybridetect 1(TwistDx，Cambridge，UK)试纸，在侧流免疫层析试纸上依次有上样区，Gold-NP抗FITC抗体区，strepavidin条带(即control条带)，抗抗体条带(即阳性条带)。
优选的，步骤(6)中的侧流免疫层析试纸的检测步骤为：将步骤(5)检验反应后的反应体系1：5稀释于Hybridetect Assay Buffer，将试纸上样区沉没于稀释后的样本中，室温下反应5分钟即可见检验条带。
本发明的机理是：
LwaCas13a蛋白是来自Leptotrichiawadei细菌CRISPR系统的一个RNA酶。LwaCas13a酶在crRNA引导下可以特异性识别指定序列并激活产生RNA酶切活性。基于欧洲型和美洲型的猪PRRSV病毒的基因组中的对应的保守序列，利用CRISPR/Cas13a的RNA酶切特异性切割和报告分子检测蓝耳病病毒及分型。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用crRNA的特异性和RPA引物的特异性有效保证对病毒检测的正确度，且在常温下1～2小时之内即可通过试纸确定是否感染及感染蓝耳病病毒的亚型，相比传统基于PCR的检测方法精确度有所提高。本发明可以形成配有纯化的冻干LwaCas13a和crRNA试剂盒，可以在现场，如猪场，屠宰场方便快速地对猪蓝耳病病毒进行检测，且不需要复杂的控温仪器如PCR仪和离心机等复杂设备，只需要一个恒温装置即可快速获得可以用肉眼观测的结果，可以更加高效地了解猪场的健康状况，避免损失，为蓝耳病的检测提供更低成本，快速方便的检测方法。
附图说明
图1是侧流试纸测试检测反应产物所得阳性结果与阴性对照。
图2是欧洲型靶点RPA引物验证；其中，泳道1：Forward：EU-RPA-target1-F，Reverse：EU-RPA-target1-R；泳道2：Forward：EU-RPA-target2-F，Reverse：EU-RPA-target2-R。
图3是北美型靶点RPA引物验证；其中，泳道1：Forward：NA-RPA-target1-F，Reverse：NA-RPA-target1-R；泳道2：Forward：NA-RPA-target2-F，Reverse：NA-RPA-target2-R。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
实施例1
本发明实施例中，基于CRISPR/Cas13a技术现场快速检测PRRSV病毒，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
1)对PRRSV病毒的两个重要亚型，即欧洲型，美洲型设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA的序列如序列表中SEQ ID NO：1～6所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化。
针对欧洲型PRRSV病毒各亚型(NCBI登陆号分别为AY366525，AY588319，DQ489311，DQ864705，EU076704，GQ461593，JF276430，JF276431，JF276432，JF276433，JF276434，JF276435，JX187609，KC492504，KC492505，KC492506，KM196101，LEYPOLYENV)的保守区域设计特异性crRNA，并进行脱靶分析，筛选三条特异性好，低脱靶的crRNA，设计结果如表1所示，即如序列表中SEQ ID NO：1～3所示。
表1针对欧洲型PRRSV病毒各亚型的特异性crRNA序列
名称 crRNA序列(5'-3') 基因组位置
EU-crRNA-1 ugggccaauggaaaccaaaaacauagcg ORF2a
EU-crRNA-2 ggccaauggaaaccaaaaacauagcgua ORF2a
EU-crRNA-3 uaccggccauauuugacgagguuaacca ORF6
针对美洲型PRRSV病毒各亚型(NCBI登陆号分别为AF066183，AF331831，AY032626，AY150312，AY262352，AY457635，DQ459471，EF075945，EF112445，EF112447，EF488739，EF635006，EU106888，EU200961，EU200962，EU262603，EU678352，EU708726，EU807840，EU860248，EU880438，EU880439，EU880442，FJ175688，FJ536165，FJ895329，FJ950744，GQ359108，GU168569，GU269541)的保守区域设计特异性crRNA，并进行脱靶分析，筛选三条特异性好，低脱靶的crRNA，设计结果如表2所示，即如序列表中SEQ ID NO：4～6所示。
表2针对美洲型PRRSV病毒各亚型的特异性crRNA序列
名称 crRNA序列(5'-3') 基因组位置
NA-crRNA-1 guacauucgacgcgacaccauuucauca ORF2
NA-crRNA-2 cgggacgccggacgacaaaugcgugguu ORF6
NA-crRNA-3 ccgggacgccggacgacaaaugcguggu ORF6
crRNA体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应2小时：Nuclease-free water加至20μL，NTP Buffer Mix 10μL，Template DNA1μg，T7 RNA Polymerase Mix 2μL。
crRNA纯化方法：20μL体外转录产物与36μL RNAClean XP及108μL异丙醇混合，置于磁性平台上，直到溶液边清澈，去除上清，仍置于磁性平台，加入现配的85％nondenatured ethanol 600μL，室温放置30秒，去除上清，重复上述85％nondenaturedethanol洗步骤两次，去除上清静置5分钟以挥发吸附微球上的乙醇，加入25μL RNase-free水，吹打均匀在磁性平台外静置2分钟，将体系置于磁性平台2分钟令吸附微球沉淀，取上清即获得纯化产物。
2)针对上述两个重要亚型的靶点设计RT-RPA引物，引物序列如序列表中SEQ IDNO：7～14所示，将病毒样品进行预处理并进行RT-RPA反应。
针对两个重要亚型的靶点设计的RT-RPA引物如表3所示。
表3 RT-RPA引物
Figure BDA0001735855370000071
病毒样品预处理方法：样品加入TCEP(三(2-羧乙基)膦)与MEDTA(α-甲基乙二胺四乙酸)至浓度分别为100mM和1mM，95℃处理10分钟或37℃20分钟。
RT-RPA反应体系：50μL体系中，上游引物240nM，下游引物240nM，RehydrationBuffer 29.5μL，病毒样品模板，RNase Inhibitor(NEB M3014L)2.5μL，补dH2O至47.5μL。将上述体系混合后加至冻干RPA反应微球，加入醋酸镁MgAc 280mM 2.5μL以启动反应。
RT-RPA反应结果如图2、3所示，根据图2、3可知，本发明所设计引物可以对靶点序列进行特异性扩增。
3)将RT-RPA反应产物进行体外转录和纯化。
RT-RPA反应产物进行体外转录方法：在以下体系中37℃反应2小时：NTP BufferMix 10μL，RT-RPA反应产物1μL，T7RNA Polymerase Mix 2μL，Nuclease-free water加至20μL。
RT-RPA体外转录产物纯化方法：20μL RT-RPA体外转录产物与36μL RNAClean XP及108μL异丙醇混合，置于磁性平台上，直到溶液变清澈，去除上清，仍置于磁性平台，加入现配的85％nondenatured ethanol 600μL，室温放置30秒，去除上清，重复上述85％nondenatured ethanol洗步骤两次，去除上清静置5分钟以挥发吸附微球上的乙醇，加入25μL RNase-free水，吹打均匀在磁性平台外静置2分钟，将体系置于磁性2分钟平台令吸附微球沉淀，取上清即获得纯化产物，-80℃或冻干保存。
4)LwaCas13a蛋白的表达和纯化。
LwaCas13a蛋白表达和纯化方法：pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a质粒转化至RosettaTM2(DE3)pLysS Singles Competent Cells(Millipore)感受态细胞，16mL TB培养液培养过夜；转接至4L TB 37℃300rpm培养至OD600＝0.6，加入终浓度为500μM的IPTG，18℃诱导表达16小时，5200g for 15min at 4℃收菌，菌体沉淀保存于-80℃；以lysisbuffer(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，1mM DTT，pH 8.0)重悬菌液，加入蛋白酶抑制剂(Complete Ultra EDTA-free tablets)，溶菌酶，核酸酶，在振幅100％下，每开一秒关两秒进行超声破碎，至超声总时长为十分钟。4℃10000g离心一小时，上清Stericup 0.22μmfilter(EMD Millipore)过滤；使用StrepTactin Sepharose(GE)进行纯化：把上述滤液与StrepTactin Sepharose(GE)混合，摇晃保温1h，以上述裂解缓冲液冲洗凝胶三次，把凝胶在已加有250Units of SUMO protease(ThermoFisher)的SUMO消化液(30mM Tris-HCl，500mM NaCl 1mM DTT，0.15％Igepal(NP-40)，pH 8.0)中重悬，4℃震荡过夜；后续通过5mLHiTrap SP HP及AKTA设备进行脱盐，130mM to 2M NaCl梯度洗脱：elution buffer(20mMTris-HCl，1mM DTT，5％glycerol，pH 8.0)；在S200buffer(10mM HEPES，1M NaCl，5mMMgCl2，2mM DTT，pH 7.0)中，通过离心超滤Centrifugal Filter Unit浓缩至一毫升；浓缩后的蛋白使用gel filtration column(
Figure BDA0001735855370000081
200Increase 10/300GL，GEHealthcare Life Sciences)在akta进行进一步纯化。将纯化好的蛋白换到StorageBuffer(600mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.5，5％glycerol，2mM DTT)，-80℃储存。
5)将上述crRNA体外转录产物、RT-RPA体外转录产物、LwaCas13a、报告RNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。
将上述crRNA体外转录产物、RT-RPA体外转录产物、LwaCas13a、报告RNA分子反应体系为：25μL体系中，45nM纯化的LwaCas13a，22.5nM crRNA，125nM报告RNA分子，2μL RNaseinhibitor，1μL RT-RPA体外转录产物。上述体系在核酸检验缓冲溶液中配制，核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
报告RNA分子的设计：两端分别带有FITC和Biotin基团的polyU RNA分子：5′-FITC-UUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3′(见SEQ ID NO：15)。
6)反应产物通过侧流免疫层析试纸获得检测结果。
反应产物通过侧流免疫层析试纸检测方法：将检验反应后的反应体系1：5稀释于Hybridetect Assay Buffer，将试纸上样区沉没于稀释后的样本中，结果如图1所示，室温下反应5分钟即可见检验条带。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-crRNA-1
<400> 1
ugggccaaug gaaaccaaaa acauagcg 28
<210> 2
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-crRNA-2
<400> 2
ggccaaugga aaccaaaaac auagcgua 28
<210> 3
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-crRNA-3
<400> 3
uaccggccau auuugacgag guuaacca 28
<210> 4
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-crRNA-1
<400> 4
guacauucga cgcgacacca uuucauca 28
<210> 5
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-crRNA-2
<400> 5
cgggacgccg gacgacaaau gcgugguu 28
<210> 6
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-crRNA-3
<400> 6
ccgggacgcc ggacgacaaa ugcguggu 28
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-RPA-target1-F
<400> 7
taatacgact cactataggg cghttyctca gctcacgrct hgtgatgc 48
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-RPA-target1-R
<400> 8
ccargcataa tadccytcaa gyttgagg 28
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-RPA-target2-F
<400> 9
taatacgact cactataggg tgtgttgcct hggccggcga tacatyctgg 50
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EU-RPA-target2-R
<400> 10
cttcccrctg gatgaaagcg acgcag 26
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-RPA-target1-F
<400> 11
ccargcataa tadccytcaa gyttgagggg traggactgg gaggattaya ayg 53
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-RPA-target1-R
<400> 12
tcgbtcacca cctgtttcca ggc 23
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-RPA-target2-F
<400> 13
ccargcataa tadccytcaa gyttgaggga aacctggaaa ttcatcacyt ccagatgccg 60
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NA-RPA-target2-R
<400> 14
acagcytttc tgccacccaa cacgaggc 28
<210> 15
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 报告RNA分子
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FITC修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (14)..(14)
<223> Biotin修饰
<400> 15
uuuuuuuuuu uuuu 14

Claims (9)

1.一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括纯化的冻干LwaCas13a、欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、报告RNA分子；
所述的欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQ ID NO：1所示的EU-crRNA-1、SEQID NO：2所示的EU-crRNA-2和SEQ ID NO：3所示的EU-crRNA-3中的至少一种；
所述的美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQ ID NO：4所示的NA-crRNA-1、SEQID NO：5所示的NA-crRNA-2和SEQ ID NO：6所示的NA-crRNA-3中的至少一种；
所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQ ID NO：7、8所示的EU-RPA-target1-F/R引物组和SEQ ID NO：9、10所示的EU-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；
所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQ ID NO：11、12所示的NA-RPA-target1-F/R引物组和SEQ ID NO：13、14所示的NA-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段；
所述的报告RNA分子为SEQ ID NO：15。
2.根据权利要求1所述的用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括Rehydration Buffer、RNase Inhibitor、冻干RPA反应微球、MgAc、MgCl2、核酸检验缓冲溶液、ATP、GTP、UTP、CTP、T7 polymerase mix；
所述的核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
3.一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
1)对PRRSV病毒的两个重要亚型，即欧洲型，美洲型设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA的序列，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接合成；
其中，欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQ ID NO：1所示的EU-crRNA-1、SEQ IDNO：2所示的EU-crRNA-2和SEQ ID NO：3所示的EU-crRNA-3中的至少一种；
美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQ ID NO：4所示的NA-crRNA-1、SEQ ID NO：5所示的NA-crRNA-2和SEQ ID NO：6所示的NA-crRNA-3中的至少一种；
2)LwaCas13a蛋白的表达和纯化；
3)针对步骤(1)所述的两个重要亚型的靶点设计RT-RPA引物，对病毒样品进行预处理并进行RT-RPA反应；
其中，所述的RT-RPA引物包括针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物，针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物；
所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQ ID NO：7、8所示的EU-RPA-target1-F/R引物组和SEQ ID NO：9、10所示的EU-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；
所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQ ID NO：11、12所示的NA-RPA-target1-F/R引物组和SEQ ID NO：13、14所示的NA-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段；
4)将RT-RPA反应产物进行体外转录和纯化；
5)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、RT-RPA体外转录产物、LwaCas13a、报告RNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；
6)反应产物通过侧流免疫层析试纸获得检测结果。
4.根据权利要求3所述的用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：
步骤(3)中所述病毒样品进行预处理方法，为样品加入TCEP与MEDTA至浓度分别为100mM和1mM，95℃处理10分钟或37℃20分钟。
5.根据权利要求3所述的用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：
步骤(3)中所述RT-RPA反应体系为：50μL体系中，上游引物240nM，下游引物240nM，Rehydration Buffer 29.5μL，病毒样品模板，RNase Inhibitor 2.5μL，补dH2O至47.5μL；将上述体系混合后加至冻干RPA反应微球，加入MgAc280mM 2.5μL以启动反应。
6.根据权利要求3所述的用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：
步骤(5)中的报告RNA分子设计为两端分别带有FITC和Biotin基团的polyU RNA分子：5′-FITC-UUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3′，见SEQ ID NO：15。
7.根据权利要求3所述的用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的反应体系为25μL体系中，45nM纯化的LwaCas13a，22.5nM crRNA，125nM报告RNA分子，2μL RNase inhibitor，1μL RT-RPA体外转录产物；上述体系在核酸检验缓冲溶液中配制，核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
8.根据权利要求3所述的用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：
步骤(5)与步骤(4)中体外转录合并，体系调整为25μL体系中，45nM纯化的LwaCas13a，22.5nM crRNA，125nM报告RNA分子，2μL RNase inhibitor，1μL RT-RPA反应产物，1mM ATP、1mM GTP、1mM UTP、1mM CTP，0.6μL T7 polymerase mix；上述体系在核酸检验缓冲溶液中配制，核酸检验缓冲溶液为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，调pH至7.3。
9.根据权利要求3所述的用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：
步骤(5)与步骤(3)、(4)合并，体系调整为50μL体系中，0.48μM上游引物，0.48μM下游引物，29.5μL rehydration buffer，依照步骤(3)处理的病毒样品模板，45nM纯化的LwaCas13a蛋白，22.5nM crRNA，200nM RNA报告分子，2μL murine RNase inhibitor，2mMATP、2mM GTP、2mM UTP、2mM CTP，1μL T7 polymerase mix，5mM MgCl2和14mM MgAc；将冻干RPA反应微球加入体系中混匀以启动反应。
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