CN108251444A - 基于pcr的无缝构建小rna表达载体的方法 - Google Patents

基于pcr的无缝构建小rna表达载体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于PCR的无缝构建小RNA表达载体的方法。具体地，本发明的方法包括步骤：(1)提供目的载体和用于扩增的第一引物和第二引物，其中第一引物为正向引物而第二引物为反向引物，所述的目的载体是环化的载体；(2)以所述目的载体为模板，用所述第一引物和第二引物，在聚合酶存在下进行扩增反应，从而获得扩增产物；(3)在无缝克隆重组酶作用下，对扩增产物进行环化反应，从而形成环化的表达载体，即为用于表达小RNA的表达载体。本发明的方法大大简化shRNA、sgRNA和crRNA等常用小RNA表达载体克隆过程，节省实验者的时间，降低劳动量，提高成功率，降低构建成本。

Description

基于PCR的无缝构建小RNA表达载体的方法
技术领域
本发明属于生物学领域，具体涉及基于PCR的无缝构建小RNA表达载体的方法，尤其是一种基于低循环数聚合酶链式反应(PCR)和无缝克隆技术的快速构建shRNA、sgRNA和crRNA等小RNA表达载体的方法。
背景技术
传统shRNA、sgRNA和crRNA载体构建方法主要是将退火后的双链DNA片段通过T4DNA连接酶连入经过特定限制性内切酶线性化的载体中，涉及包括寡核苷酸链加磷酸基，寡核苷酸链退火，载体酶切，酶切产物电泳，回收酶切目的片段，测定回收DNA的浓度，T4连接酶连接，转化大肠杆菌等多个步骤。
传统构建方法具有一些明显的有待改进的缺点。(1)传统构建方法步骤繁多，费时费力；(2)T4DNA连接酶由于稳定性较差，连接反应一般置于16℃(非最适温度)进行，因此需要连接较长时间，导致整个克隆过程十分漫长；(3)此方法必须合成全长的两条DNA寡核苷酸，如果shRNA载体发夹结构中的茎较长(≥22碱基)，则需要合成的寡核苷酸链长度将会变得很长(≥60碱基)，合成长链的带有茎环结构的寡核苷酸不仅容易出错，而且价格昂贵；(4)长寡核苷酸链的退火过程不仅耗费时间长而且容易出现错配或者单链自身退火形成发夹结构，导致克隆失败或者效率低下。
综上所述，目前本领域尚缺乏令人满意的构建小RNA表达载体的方法。
因此，本领域迫切需要开发新的、快速、高效、简便地构建小RNA表达载体的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的、快速、高效、简便地构建小RNA表达载体的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种构建用于表达小RNA的表达载体的方法，包括步骤：
(1)提供目的载体和用于扩增的第一引物和第二引物，其中第一引物为正向引物而第二引物为反向引物，所述的目的载体是环化的载体；
第一引物具有5'到3'如式(Ia)所示的结构，
U0-U1-U2-U3
式(Ia)
式中，
U0为无或选定长度的5'端的额外序列；
U1为小RNA的正义链全部或部分的序列(或小RNA的全部或部分编码序列)；其中，U0与全部或部分U1共同构成同源互补区，所述同源互补区互补于下述的第二引物的5'端，并且所述同源互补区的长度为8-20nt；
U2为无或连接序列；和
U3为与目的载体结合的正向引物结合区序列；
第二引物具有5'到3'如式(Ib)所示的结构，
D0-D1-D2-D3
式(Ib)
式中，
D0为无或选定长度的5'端的额外序列；
D1为小RNA的反义链全部或部分的序列(或小RNA的全部或部分编码序列)；其中，D0与全部或部分D1共同构成同源互补区，所述同源互补区互补于所述的第一引物的5'端，并且所述同源互补区的长度为8-20nt；
D2为无或连接序列；和
D3为与目的载体结合的反向引物结合区；
(2)以所述目的载体为模板，用所述第一引物和第二引物，在聚合酶存在下进行扩增反应，从而获得扩增产物；和
(3)在无缝克隆重组酶作用下，对扩增产物进行环化反应，从而形成环化的表达载体，即为用于表达小RNA的表达载体。
在另一优选例中，所述同源互补区的长度为8-20nt，更佳地9-15nt。
在另一优选例中，所述的正向引物结合区和反向引物结合区在所述目的载体上是相邻的，(其中，间隔长度为S1nt，其中S1为1-20nt，较佳地1-10nt)、邻接的(间隔为0nt)。
在另一优选例中，所述的正向引物结合区和反向引物结合区在所述目的载体上是重叠的(其中重叠长度为S2nt，其中S2为1-10nt，较佳地2-5nt)。
在另一优选例中，所述的中间间隔序列为用于将载体线性化的限制性酶切酶的酶切位点序列。
在另一优选例中，所述的正向引物结合区和反向引物结合区是在所述目的载体上是相邻的，其中，间隔长度为S1nt，S1为6-100，较佳地6-18。
在另一优选例中，所述的正向引物结合区对应于所述目的载体的目的序列插入位点的3'区。
在另一优选例中，所述的反向引物结合区对应于所述目的载体的目的序列插入位点的5'区。
在另一优选例中，在所述的环化的表达载体中，所述的小RNA编码序列位于启动子的下游以及终止子的上游。
在另一优选例中，所述的启动子包括人U6启动子(hU6)、小鼠U6启动子(mU6)，人H1启动子(hH1)及最小CMV启动子(mCMV)等各种三型与二型RNA聚合酶启动子。
在另一优选例中，所述的同源互补区在所述第一引物上的互补区位于所述第一引物的U0和/或U1区域。
在另一优选例中，所述的互补区为完全互补的互补区。
在另一优选例中，U0为无。
在另一优选例中，U0的长度为1-30nt，较佳地1-20nt。
在另一优选例中，U1的长度为20-30nt。
在另一优选例中，U2为无。
在另一优选例中，U2的长度为1-20nt，较佳地2-10nt。
在另一优选例中，U3的长度为12-35nt，较佳地15-25nt。
在另一优选例中，D0为无。
在另一优选例中，所述的同源互补区位于所述第二引物的5'末端。
在另一优选例中，所述的同源互补区对应于所述第一引物的5'末端。
在另一优选例中，D2为无，或长度为1-20nt(较佳地2-10nt)的连接序列。
在另一优选例中，D3的长度为12-35nt，较佳地15-25nt。
在另一优选例中，所述的小RNA选自下组：shRNA、sgRNA、crRNA、基于内源microRNA结构的shRNA(shRNAmir)。
在另一优选例中，所述的小RNA的长度为65nt。
在另一优选例中，U1为shRNA反义链的序列，用于形成长度为63nt的shRNAmir。
在另一优选例中，所述的小RNA针对的靶基因包括：致病相关基因、代谢相关基因等。
在另一优选例中，所述的小RNA针对的靶基因包括原核生物的基因、真核生物的基因、病毒的基因。
在另一优选例中，所述的靶基因包括人、非人哺乳动物、或植物的基因。
在另一优选例中，所述的目的载体的长度为3-20kb，较佳地5kb-10bp。
在另一优选例中，还包括步骤：将所述环化的表达载体导入到体外细胞，从而在所述细胞中产生小RNA。
在另一优选例中，所述方法为体外方法。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在本发明第二方面，提供了一种试剂产品，所述的产品包括：
(a)目的载体；
(b)第一引物；
(c)第二引物；
(d)任选的聚合酶；和
(e)任选的无缝克隆重组酶，
其中，所述的目的载体、第一引物和第二引物如上所述。
在本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器以及位于所述第一容器中的目标载体；
(b)第二容器以及位于所述第二容器中的第一引物；
(c)第三容器以及位于所述第三容器中的第二引物；
(d)任选的第四容器以及位于所述第四容器中的聚合酶；和
(e)任选的第五容器以及位于所述第五容器中的无缝克隆重组酶；
其中，所述的目的载体、第一引物和第二引物如上所述。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(f)第六容器以及位于第六容器中的冷藏的细菌感受态细胞。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：缓冲液、dNTP。
在另一优选例中，所述的第一、第二、第三、第四、和第五容器中任何二个是不同或相同的容器。
在另一优选例中，所述的第一、第二、第三、第四、和第五容器中的任何二个、三个、四个或全部是同一容器。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了小RNA表达载体构建过程示意图。
图2显示了传统方法和本发明方法的克隆步骤和时间的对比。
图3显示了载体PCR扩增的最佳引物对确定方法。
图4显示了用EcoRI线性化的普通pLKO.1载体作为模板克隆新的shRNA载体。
图5显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SH-MX克隆新的shRNA载体。
图6显示了shNT1和shNT2载体的测序结果。
图7显示了利用茎长21nt的shRNA载体在SUM159细胞系中稳定敲低GAPDH。
图8显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SH-MX克隆新的茎长29nt的shRNA载体。
图9显示了shNT1和shNT2载体测序结果。
图10显示了利用茎长29nt的shRNA载体在SUM159细胞系中稳定敲低GAPDH。
图11显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.30-MX克隆基于miR-N的shRNAmir载体。
图12显示了基于miR-N的shRNAmir非靶向载体shNT测序结果。
图13显示了利用基于miR-N的shRNAmir载体在SUM159细胞系中稳定敲低GAPDH。
图14显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SG-MX克隆sgRNA载体。
图15显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SH-MX克隆crRNA载体。
图16显示了利用构建的sgRNA载体介导CRISPR/SpCas9敲入绿色荧光蛋白。
图17显示了利用构建的crRNA载体介导CRISPR/AsCpf1敲入红色荧光蛋白。
图18显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.crLwa-MX为模板克隆CRISPR/LwaCas13a的crRNA载体。
图19显示了用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.crPsp-MX为模板克隆CRISPR/PspCas13b的crRNA载体。
图20显示了应用本发明构建的分别用于LwaCas13a和PspCas13b的非靶向crRNA载体测序结果。
图21显示了构建裸露shRNA载体的引物设计。
图22显示了构建基于miR-N的shRNA载体的引物设计。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种以低循环数聚合酶链式反应(PCR)和无缝克隆为技术特征的构建小RNA表达载体的方法。通过采用具有特定结构的第一引物和第二引物，对环化的目的载体进行低循环数的快速PCR扩增，并对扩增产物进行重组环化，即可获得用于表达小RNA的表达载体。将该环化产物快速转化进入感受态大肠杆菌即可大量扩增相应质粒。基于本发明方法，可以快速、准确、不遗留任何酶切位点相关碱基的完成克隆，从而将克隆速度和成功率大大提高。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明引物”指具有式(Ia)的第一引物和/或具有(Ib)结构的第二引物。
如本文所用，术语“本发明引物对”指具有式(Ia)的第一引物和具有(Ib)结构的第二引物所构成的引物对。
表达载体
本发明通过三个步骤克隆小RNA表达载体，包括shRNA、sgRNA、crRNA以及克隆用的中间载体。第一步，用一对引物扩增载体骨架(载体骨架最好事先用限制性内切酶线性化)，正向引物和反向引物的3'端用于与模板退火，5'端携带需要插入的序列，并且两条引物5'末端在PCR扩增后形成同源互补序列(互补区)。第二步，PCR得到的线性载体骨架两端各带有一部分插入序列，且末端是一段同源互补序列，在无缝克隆试剂的作用下，发生同源重组，环化成环状载体。第三步，将得到的环状载体直接转化到大肠杆菌中，利用大肠杆菌扩增目的质粒。
第一引物和第二引物
本发明用于克隆茎长为21nt的shRNA载体的引物设计方法：
用EcoRI线性化的普通pLKO.1载体作为模板克隆新的shRNA载体：应用本发明构建shRNA载体时，如果使用现成的普通的载体(即非专门的中间克隆载体)并用EcoRI酶切线性化，则按照图4所示，将shRNA相关序列放在最佳引物对5'端(最佳引物对如表一pLKO.1条目所示)并在5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。图4中大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，包括正义链、反义链、终止信号等序列。正向引物长度为52nt，反向引物长度为52-53nt。
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SH-MX克隆新的shRNA载体：应用本发明构建shRNA载体时，如果使用现成专门设计的中间克隆载体作为模板，则按照图5所示，将shRNA相关序列放在最佳引物对5'端(最佳引物对如表一pLKO.SH-MX条目所示)并在5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。图5中，大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，包括正义链、反义链、终止信号等序列。正向引物长度为49nt，反向引物长度为48-49nt。
本发明用于克隆茎长为29nt的shRNA载体的引物设计方法：
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SH-MX克隆新的茎长29nt的shRNA载体：应用本发明构建shRNA载体时，如果使用现成专门设计的中间克隆载体作为模板，则按照图5所示，将shRNA相关序列放在最佳引物对5'端(最佳引物对如表一pLKO.SH-MX条目所示)并在5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。图8中，大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，包括正义链、反义链、终止信号等序列。正向引物长度为57nt，反向引物长度为57-58nt。
本发明用于克隆基于miR-N的shRNAmir载体的引物设计方法：
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.30-MX克隆基于miR-N的shRNAmir载体：应用本发明构建基于miR-N的shRNAmir载体时，使用MluI和XbaI双酶切中间克隆载体pLKO.30-MX将其线性化作为PCR模板。shRNA相关序列放在最佳引物对5'端(最佳引物对如表一pLKO.30-MX条目所示)并在5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。图11中，大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，包括正义链、中间环、反义链等序列。正向引物长度为53nt，反向引物长度为53nt。
本发明用于克隆sgRNA载体的引物设计方法：
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SG-MX克隆sgRNA载体：应用本发明构建sgRNA载体时，使用MluI和XbaI双酶切中间克隆载体pLKO.SG-MX将其线性化作为PCR模板。sgRNA相关序列放在最佳引物对中反向引物的5'端(最佳引物对如表一pLKO.SG-MX条目所示)并在5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。本例中，正向引物由于本身较长(30nt)，因此被用作通用克隆引物，以减少合成引物的碱基数。图14中，大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的向导序列。正向引物长度为30nt，反向引物长度为47-48nt。
本发明用于克隆AsCpf1的crRNA载体的引物设计方法：
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.SH-MX克隆crRNA载体：应用本发明构建crRNA载体时，使用MluI和XbaI双酶切中间克隆载体pLKO.SH-MX将其线性化作为PCR模板。crRNA相关序列放在最佳引物对正向引物的5'端(最佳引物对如表一pLKO.SH-MX条目所示)并在两条引物的5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。本例中，我们将AsCpf1的直接重复序列(DR)放在最佳反向引物的5'端，共同构成通用反向引物，以减少合成引物的碱基数，避免浪费。图15中，大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，包括向导序列和DR序列。正向引物长度为52nt，反向引物长度为38nt。
本发明用于克隆AsCpf1的crRNA载体的引物设计方法：
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.crLwa-MX为模板克隆CRISPR/LwaCas13a的crRNA载体：应用本发明构建LwaCas13a-crRNA载体时，使用MluI和XbaI双酶切中间克隆载体pLKO.crLwa-MX将其线性化作为PCR模板。crRNA相关序列放在最佳引物对中反向引物的5'端(最佳引物对如表一pLKO.crLwa-MX条目所示)并在两条引物的5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。本例中，我们向导序列全部放在反向引物5'端，正向引物作为通用引物使用，以减少合成引物的数目、避免浪费。图18大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，即28nt的向导序列。正向引物长度为22nt，反向引物长度为58nt。
用MluI和XbaI线性化的中间克隆载体pLKO.crPsp-MX为模板克隆CRISPR/PspCas13b的crRNA载体：应用本发明构建PspCas13b-crRNA载体时，使用MluI和XbaI双酶切中间克隆载体pLKO.crPsp-MX将其线性化作为PCR模板。crRNA相关序列放在最佳引物对中反向引物的5'端(最佳引物对如表一pLKO.crPsp-MX条目所示)并在两条引物的5'末端保留10nt的同源序列用于后续的无缝克隆。本例中，我们向导序列全部放在反向引物5'端，正向引物作为通用引物使用，以减少合成引物的数目、避免浪费。图19中，大写英文字母表示最佳引物对相关序列，小写字母表示通过引物引入的序列，即30nt的向导序列。正向引物长度为21nt，反向引物长度为58nt。
构建裸露shRNA载体的引物设计：如图21所示，应用本方法构建裸露shRNA载体时，反向引物3'端与载体上的启动子结合，其5'端包含全部正义链、一段环和一段反义链序列(可不包括)；正向引物3'端与载体转录终止信号下游的一段序列结合，其5'端包含一段正义链(可不包括)、一段环和全部反义链序列以及转录终止信号(由5-6个连续胸腺嘧啶组成)。环的长度一般为6-9nt，而茎(正反义链)长度一般为19-29nt。正、反向引物的5'端同源互补，其互补区长度10-15nt即可满足克隆需求。
构建基于miR-N的shRNA载体的引物设计：如图22所示，应用本方法构建基于miR-N的shRNA载体时，反向引物3'端与载体上的miR-N骨架的5'侧翼序列结合，该引物5'端包含全部正义链、一段环序列；正向引物3'端与miR-N骨架的3'侧翼序列结合，其5'端包含一段环序列和全部反义链序列。环的长度一般为19nt，而茎(正反义链)长度一般为22nt。正、反向引物的5'端同源互补，其互补区长度10-15nt即可满足克隆需求。
构建小RNA表达载体的方法
本发明提供了一种构建小RNA表达载体的方法，其以低循环数聚合酶链式反应(PCR)和无缝克隆连接为特征，同时也包括一个快速的转化步骤，将克隆产物转化到大肠杆菌感受态细胞中进行质粒扩增。
PCR反应
在本发明方法中，以目的载体为模板，采用本发明上述的第一引物和第二引物进行PCR，从而获得扩增产物，其中，所述扩增产物不仅含有原目的载体的全部序列或基本上全部序列，而且还含有通过第一引物和第二引物所引入的小RNA编码序列。
此外，所述的扩增产物的两端还含有同源互补区，从而可以在连接酶作用下环化，形成表达小RNA的表达载体。
在本发明中，表达载体的长度没有特别限制。典型地为5kb-20kb。通常，由于小RNA表达载体骨架长度普遍大于7500bp，因此，为了达到快速扩增、快速构建载体的目的，本发明优选使用具有较快延伸速度的DNA聚合酶。
在本发明中，试验表明，采用高保真DNA聚合酶，足以使得扩增长度较大的DNA片段，而且很少或几乎不会引入突变。
重组反应
在本发明中，由于所述的扩增产物的两端还含有源自本发明引物对的同源互补区，从而可以在无缝克隆重组酶作用下环化，形成表达小RNA的表达载体。无缝克隆重组酶一般为一组酶混合物，包括5'DNA外切酶，DNA聚合酶，可以包含DNA连接酶，但连接酶不是必须的。无缝克隆重组酶要求需要连接的片段具有特定长度的同源互补区，其长度通常为8-25nt。重组反应一般发生在37℃，用时5-10分钟。
采用本发明方法，可以快速、准确、不遗留任何酶切位点相关碱基(无缝)，并且大幅提高克隆速度和成功率。
快速转化
本发明中，上述PCR产物经重组反应后，需要转化进入大肠杆菌感受态细胞中以获得单克隆。以便后续的测序验证、保存、提取质粒等。本发明的转化过程采用一种快速转化方案，仅需5分钟。本发明采用高效大肠杆菌感受态细胞，要求感受态转化效率达到109pfu/μg DNA以上。
应用
在实验室中快速构建shRNA、sgRNA、crRNA等小RNA表达载体，用于研究生命过程的分子机理、癌症等疾病的分子病理机制等。可以用于教学过程中，方便学生快速、高效地完成上述小RNA表达载体的克隆，加快教学效率。
本发明的主要优点包括：
(a)传统构建方法往往需要1-2天完成整个克隆过程，本发明最短仅需30分钟。
(b)本发明独创的利用中间克隆载体的构建方法可以使用更短的引物构建shRNA表达载体。在构建最常用的21nt的shRNA载体时，最短仅需合成49个碱基的两条引物，可以大大降低成本。
(c)本发明的两条引物含有相同的序列，相比于传统构建方法中两条寡核苷酸的互补关系，有助于提高shRNA载体构建的成功率。
(d)本发明可以大大减少shRNA、sgRNA、crRNA载体构建过程的操作步骤，从传统方法的约8步减少到了3步，大大降低了使用者的劳动量。
(e)本发明的版本特别限定的限制性内切酶，可以让实验者从任何载体出发构建小RNA表达载体或者以此为基础构建中间克隆载体。本发明用来线性化模板的酶切位点的唯一要求只是它们不在除插入位点的其他位置切割载体骨架。
(f)本发明的克隆成功率比传统构建方法大大提高，高达95％的克隆包含正确的序列。
(g)应用本发明构建小RNA表达载体的成功率十分稳定，抵抗实验者不利操作的性能较强，实验中的一些微小的失误一般不会导致失败。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
1.最佳引物对确定方法：
为了确定最佳PCR引物对，需要在小RNA插入位点两侧设计一系列不同长度的反向引物，然后进行PCR和凝胶电泳。本发明选择产量高并且条带特异的引物对，同时兼顾引物长度，以便控制最终的克隆引物长度尽可能短。
2.PCR反应体系：
5ul 2×PrimeStar MasterMix；40ng DNA模板；上下游引物(存储浓度10uM)各0.6ul；加水补至10ul，震荡混匀并离心。
PCR反应条件：
98℃，2分钟(预变性)；9-12个热循环(98℃，10秒；55℃，10秒；72℃，40秒)；72℃，3分钟。
3.无缝克隆(诺唯赞，C112-01/02)：
反应体系：1ul PCR产物；0.5ul重组酶；1ul 5×缓冲液；2.5ul去离子水。震荡混匀并离心，37℃反应5分钟，反应结束立即放在冰水浴中。
4.快速转化
将无缝克隆产物全部加入到100ul感受态细菌中，轻柔混匀。将混合物在冰上放置2分钟，然后在42℃水浴锅中热激45-60秒。热激后立即放入冰水浴中2分钟，然后直接涂板即可。
5.克隆鉴定
由于反应体积比较小，一般长出的菌落克隆数目也较少。平均菌落克隆数在100个左右，少数情况下会低至30-50个。根据我们的实验结果，本发明的克隆成功率大于95％，因此只需挑取1-2个克隆直接送样测序即可，不需进行预实验鉴定阳性菌落(菌落PCR等)。
实施例1.
克隆中间克隆载体：①pLKO.SH-MX,②pLKO.30-MX,③pLKO.sg-MX,④pLKO.crLwa-MX,⑤pLKO.crPsp-MX.分别用于克隆①shRNA载体和CRISPR/AsCpf1的crRNA载体，②基于microRNA30的shRNAmir载体，③CRISPR/SpCas9的sgRNA载体，④CRISPR/LwaCas13a的crRNA载体和⑤CRISPR/PspCas13b的crRNA载体。
各中间克隆载体的克隆方式：为了克隆中间克隆载体①、③、④、⑤，分别设计了一对引物用于扩增pLKO.1载体骨架，然后将PCR产物通过无缝克隆环化，转化大肠杆菌后得到中间克隆载体。为了克隆中间载体②，先用一对引物(引物对1)从HEK293T细胞的基因组中扩增出microRNA30a的编码区，并且两端各包含侧翼序列135bp。将microRNA30a编码片段插入pLKO.1载体中后，设计了另外一对引物(引物对2)并利用本发明描述的方法克隆得到中间克隆载体。
克隆引物如下：
①pLKO.SH-MX克隆引物：
pLKO.SH-MX-Fd:ACGCGTTCTAGATTTTTGAATTCTCGACCTCGAG(SEQ ID No.:1)
pLKO.SH-MX-Rv:AAATCTAGAACGCGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCC(SEQ ID No.:2)
②pLKO.30-MX克隆引物：
引物对1：GAAAGGACGAAACACCATTGCTGTTTGAATGAGGCT(SEQ ID No.:3)
引物对2：TGTCTCGAGGTCGAGAATTCAAAAAGACATGGTTTTAAAGTGATT(SEQ ID No.:4)
引物对2：pLKO.SH-MX-Fd:TGCCTACTGCCTCGGAC(SEQ ID No.:5)
引物对2：pLKO.SH-MX-Rv:CCGAGGCAGTAGGCATCTAGAACGCGTGTCGCTCACTGTCAACAG(SEQ ID No.:6)
③pLKO.SG-MX克隆引物：
pLKO.SG-MX-Fd:TAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAG(SEQ ID No.:7)
pLKO.SG-MX-Rv：
ACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCTAGAACGCGTCGGTGTTTCGTCCTTTCC(SEQ ID No.:8)
④pLKO.crLwa-MX克隆引物：
pLKO.crLwa-MX-Fd：
GGACTAAAACACGCGTTCTAGATTTTTGAATTCTCGACCTCGAG(SEQ ID No.:9)
pLKO.crLwa-MX-Rv：
GTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCGGTGTTTCGTCCTTTCC(SEQ ID No.:10)⑤pLKO.crPsp-MX克隆引物：
pLKO.crPsp-MX-Fd：
GTTGTGGAAGGTCCAGTTTTGAGGGGCTATTACAACTTTTTGAATTCTCGACCTCGAG(SEQ IDNo.:11)
pLKO.crPsp-MX-Rv：CTTCCACAACTCTAGAACGCGTCGGTGTTTCGTCCTTTCC(SEQ ID No.:12)
对于上述构建的克隆中间载体，都确定了最佳的PCR引物对，以达到高效、特异地扩增载体骨架的目的。设计克隆引物时，只需将需要引入的序列按照适当的方式放在最佳引物对的5'端，并在末端保留10nt的同源序列即可。最佳引物对如表一所示：
表一.各中间克隆载体的最佳扩增引物对序列列表
实施例2.
利用中间克隆载体pLKO.SH-MX构建茎长21nt的shRNA载体。此例中，shRNA的茎长为21nt，环长为6nt，最初为载体shRNA框架TRC组织(The RNAi Consortium)构建(Ref)。为了克隆靶向GAPDH shRNA载体，根据TRC组织提供的shRNA序列，设计了如表二所示引物用于克隆(其中shNT1和shNT2为非靶向shRNA，利用经EcoRI酶切线性化的pLKO.1载体构建)。注意：如果shRNA正义链第一个碱基为A或G，则其前面不添加用于起始转录的G，反向引物长度可减少一个碱基。
表二.克隆茎长为21nt的shRNA载体所用引物列表
在确定shRNA载体序列正确之后，对构建的质粒进行测序并在乳腺癌细胞系SUM159中建立了GAPDH的稳定敲低细胞系，结果如图6所示，以shNT1和shNT2的测序结果为代表，成功构建了茎长为21nt、环长为6nt的shRNA敲低载体。
利用本发明构建的靶向GAPDH的shRNA载体，在SUM159中建立了稳定的敲低细胞系，并用Western Blot实验验证敲低效果，以β-tubulin为内参。对于靶基因GAPDH，构建5个shRNA载体中至少有3个取得较好的敲低效果(敲低比例大于70％)，结果如图7所示。
实施例3.
利用中间克隆载体pLKO.SH-MX构建茎长29nt的shRNA载体。此例中，shRNA的茎长为29nt，环长为7nt。为了克隆靶向GAPDH的shRNA载体，根据Origene公司提供的shRNA序列，设计了如表三所示引物用于克隆。其中，如果shRNA正义链第一个碱基为A或G，则其前面不添加用于起始转录的G，反向引物长度可减少一个碱基。
表三.克隆茎长29nt的shRNA载体所用引物列表
结果如图9所示，以shNT载体的测序结果为代表，成功构建了茎长为29nt、环长为7nt的shRNA敲低载体。
利用本发明构建的靶向GAPDH shRNA载体，在SUM159中建立了稳定的敲低细胞系，并用Western Blot实验验证敲低效果，以β-tubulin为内参，如图10所示。
实施例4.
构建基于miR-N的shRNAmir载体。利用中间克隆载体pLKO.30-MX构建了基于miR-N的敲低GAPDH的载体。基于miR-N的shRNA序列来源于网站(https://felixfadams.shinyapps.io/miRN/)。对该网站提供的靶向GAPDH的所有shRNA序列都设计引物(表四)并构建了敲低载体，同时也构建了非靶向载体(miR-N shNT)。
表四.克隆基于miR-N的shRNAmir敲低载体所用引物列表
结果如图12所示，以miR-N shNT载体的测序结果为代表，展示本发明成功构建了基于miR-N的茎长为22nt、环长为19nt的shRNAmir敲低载体。
利用本发明构建的基于miR-N的靶向GAPDH的shRNAmir载体，在SUM159中建立了稳定的敲低细胞系，并用Western Blot实验验证敲低效果，以β-tubulin为内参，如图13所示。
实施例5.
构建用于CRISPR/SpCas9的sgRNA载体和用于CRISPR/AsCpf1的crRNA载体用于基因编辑。利用中间克隆载体pLKO.SG-MX构建了靶向FBL和LMNB1的sgRNA载体，而用中间克隆载体pLKO.SH-MX构建了靶向CBX和H2B的crRNA载体。接着在HEK293T细胞中共转染构建的引导RNA载体、相应的Cas蛋白以及标签基因DNA，成功给靶基因添加了荧光蛋白标签。构建上述载体的引物以及扩增相应的标签蛋白基因的PCR引物如表五所示：
表五.sgRNA及crRNA载体构建引物以及相应的标签基因扩增引物列表
其中试验中所用的靶位点序列如下表六所示：
表六.CRISPR敲入标签基因所用靶位点序列列表：
利用本方法成功构建了靶向FBL和LMNB1的sgRNA载体，将sgRNA载体、SpCas9表达载体和绿色荧光蛋白标签DNA共同转染HEK293T细胞。FBL和LMNB1蛋白分别定位到核仁和核膜，绿色荧光信号的特异性定位标明敲入是成功的，证明本方法构建的sgRNA载体可以介导SpCas9的基因编辑功能。图16中展示了敲入位点及其所用的引导RNA序列(guide)。
利用本方法成功构建了靶向CBX和H2B的crRNA载体，将crRNA载体、AsCpf1表达载体和红色荧光蛋白标签DNA共同转染HEK293T细胞。CBX和H2B蛋白分别定位到核仁和核膜，绿色荧光信号的特异性定位标明敲入是成功的，证明本方法构建的crRNA载体可以介导AsCpf1的基因编辑功能。图17示了敲入位点及其所用的引导RNA序列(guide)。
实施例6.
构建用于CRISPR/LwaCas13a和CRISPR/PspCas13b介导的RNA相关实验的crRNA载体。利用中间克隆载体pLKO.crLwa-MX和pLKO.crPsp-MX分别构建非靶向的crRNA载体。其中LwaCas13a的引导序列长度为28nt，PspCas13b的引导序列长度为30nt。克隆所用引物序列如下表七所示：
表七.克隆LwaCas13a和PspCas13b的非靶向crRNA(crNT)所用引物列表
应用本发明所述方法成功构建了LwaCas13a和PspCas13b的非靶向crRNA载体(crRNA-NT)，表明本方法可以快速构建这两种新兴的CRISPR家族中的RNA操作工具的向导RNA载体。LwaCas13a的向导RNA长度为28nt，且其向导RNA在LwaCas13a框架序列的3'端。而PspCas13b的向导RNA长度为30nt，其位于PspCas13b的crRNA框架序列的5'端。最末端的5个T为U6启动子的转录终止序列，如图20所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 柳, 素玲
<120> 基于PCR的无缝构建小RNA表达载体的方法
<130> P2018-0005
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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aagccacaga tgtattgatg gcaacaatat ccactttgcc tactgcctcg gac 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tctgtggctt cactattgat ggcaacaata tccactgcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 57
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aagccacaga tgtattgatg tcatcatatt tggcagtgcc tactgcctcg gac 53
<210> 58
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tctgtggctt cactattgat gtcatcatat ttggcatcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 59
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagccacaga tgtattgaca aagtggtcgt tgagggtgcc tactgcctcg gac 53
<210> 60
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tctgtggctt cactattgac aaagtggtcg ttgaggtcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 61
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aagccacaga tgtattgtca tggatgacct tggccatgcc tactgcctcg gac 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tctgtggctt cactattgtc atggatgacc ttggccgcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aagccacaga tgtatgagct tgacaaagtg gtcgtttgcc tactgcctcg gac 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tctgtggctt cactatgagc ttgacaaagt ggtcgtgcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 65
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aagccacaga tgtatgttgt catacttctc atggtttgcc tactgcctcg gac 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tctgtggctt cactatgttg tcatacttct catggtgcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 67
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
aagccacaga tgtatacatg gcaactgtga ggagggtgcc tactgcctcg gac 53
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tctgtggctt cactatacat ggcaactgtg aggaggtcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 69
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagccacaga tgtatgattt tggagggatc tcgctctgcc tactgcctcg gac 53
<210> 70
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctgtggctt cactatgatt ttggagggat ctcgcttcgc tcactgtcaa cag 53
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 30
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gctctaaaac tggggggtgg cctgtgagag cggtgtttcg tcctttcc 48
<210> 73
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tcacctatct tcctctcaca ggccaccccc caaggtgaag aaccccgcca tgaagatcg 59
<210> 74
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcaatcctga cagcgctgaa cttcagttct tcaccttggg cttatcgtcg tcatccttg 59
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 30
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctctaaaac gccatggcga ctgcgacccc ggtgtttcgt cctttcc 47
<210> 77
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgctcgcggc ctcgccgccc cgctgtctcc gccgcccgcc atgcccgcca tgaagatcg 59
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggctgcccat ccgcggcggc acgggggtcg cagtcgccat cttatcgtcg tcatcctt 58
<210> 79
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tcttgtagat caccagaaag ctggcgggca tttttgaatt ctcgacctcg ag 52
<210> 80
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
atctacaaga gtagaaatta cggtgtttcg tcctttcc 38
<210> 81
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gcagcgtcac cctttagtgc agaaagctgg cgggcgccac catggtgagc aagggcgag 59
<210> 82
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ctcctccact ttcttcttgt tttgtttttt ccccaaagtc ttgtacagct cgtccatgc 59
<210> 83
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tcttgtagat gagtcaagca gccggcgact tttttgaatt ctcgacctcg ag 52
<210> 84
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
atctacaaga gtagaaatta cggtgtttcg tcctttcc 38
<210> 85
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ccaagactgt ccctgccggg acctggcgct cgctcgctcg agtgagcaag ggcgaggag 59
<210> 86
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gctctgaaaa gagcctttgc tctcaagcag ccggcgactc acttgtacag ctcgtccat 59
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctcacagg ccacccccca 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ggggtcgcag tcgccatggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccagaaag ctggcgggca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagtcaagca gccggcgact 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttttgaatt ctcgacctcg ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattcaaaaa tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgt tttagtcccc ttcgtttt 58
<210> 93
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gttgtggaag gtccagtttt g 21
<210> 94
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
cttccacaac ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg cggtgtttcg tcctttcc 58

Claims (10)

1.一种构建用于表达小RNA的表达载体的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供目的载体和用于扩增的第一引物和第二引物，其中第一引物为正向引物而第二引物为反向引物，所述的目的载体是环化的载体；
第一引物具有5'到3'如式(Ia)所示的结构，
U0-U1-U2-U3
式(Ia)
式中，
U0为无或选定长度的5'端的额外序列；
U1为小RNA的正义链全部或部分的序列(或小RNA的全部或部分编码序列)；其中，U0与全部或部分U1共同构成同源互补区，所述同源互补区互补于下述的第二引物的5'端，并且所述同源互补区的长度为8-20nt；
U2为无或连接序列；和
U3为与目的载体结合的正向引物结合区序列；
第二引物具有5'到3'如式(Ib)所示的结构，
D0-D1-D2-D3
式(Ib)
式中，
D0为无或选定长度的5'端的额外序列；
D1为小RNA的反义链全部或部分的序列(或小RNA的全部或部分编码序列)；其中，D0与全部或部分D1共同构成同源互补区，所述同源互补区互补于所述的第一引物的5'端，并且所述同源互补区的长度为8-20nt；
D2为无或连接序列；和
D3为与目的载体结合的反向引物结合区；
(2)以所述目的载体为模板，用所述第一引物和第二引物，在聚合酶存在下进行扩增反应，从而获得扩增产物；和
(3)在无缝克隆重组酶作用下，对扩增产物进行环化反应，从而形成环化的表达载体，即为用于表达小RNA的表达载体；
在另一优选例中，所述同源互补区的长度为8-20nt，更佳地9-15nt。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正向引物结合区和反向引物结合区在所述目的载体上是相邻的，(其中，间隔长度为S1nt，其中S1为1-20nt，较佳地1-10nt)、邻接的(间隔为0nt)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中间间隔序列为用于将载体线性化的限制性酶切酶的酶切位点序列；
在另一优选例中，所述的正向引物结合区和反向引物结合区是在所述目的载体上是相邻的，其中，间隔长度为S1nt，S1为6-100，较佳地6-18；
在另一优选例中，所述的正向引物结合区对应于所述目的载体的目的序列插入位点的3'区；
在另一优选例中，所述的反向引物结合区对应于所述目的载体的目的序列插入位点的5'区。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的环化的表达载体中，所述的小RNA编码序列位于启动子的下游以及终止子的上游；
在另一优选例中，所述的启动子包括人U6启动子(hU6)、小鼠U6启动子(mU6)，人H1启动子(hH1)及最小CMV启动子(mCMV)等各种三型与二型RNA聚合酶启动子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的同源互补区在所述第一引物上的互补区位于所述第一引物的U0和/或U1区域；
在另一优选例中，所述的互补区为完全互补的互补区；
在另一优选例中，U0为无；
在另一优选例中，U0的长度为1-30nt，较佳地1-20nt；
在另一优选例中，U1的长度为20-30nt；
在另一优选例中，U2为无；
在另一优选例中，U2的长度为1-20nt，较佳地2-10nt；
在另一优选例中，U3的长度为12-35nt，较佳地15-25nt；
在另一优选例中，D0为无；
在另一优选例中，所述的同源互补区位于所述第二引物的5'末端；
在另一优选例中，所述的同源互补区对应于所述第一引物的5'末端；
在另一优选例中，D2为无，或长度为1-20nt(较佳地2-10nt)的连接序列；
在另一优选例中，D3的长度为12-35nt，较佳地15-25nt。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小RNA选自下组：shRNA、sgRNA、crRNA、基于内源microRNA结构的shRNA(shRNAmir)；
在另一优选例中，所述的小RNA的长度为65nt；
在另一优选例中，U1为shRNA反义链的序列，用于形成长度为63nt的shRNAmir；
在另一优选例中，所述的小RNA针对的靶基因包括：致病相关基因、代谢相关基因等；
在另一优选例中，所述的小RNA针对的靶基因包括原核生物的基因、真核生物的基因、病毒的基因；
在另一优选例中，所述的靶基因包括人、非人哺乳动物、或植物的基因。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目的载体的长度为3-20kb，较佳地5kb-10bp。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：将所述环化的表达载体导入到体外细胞，从而在所述细胞中产生小RNA；
在另一优选例中，所述方法为体外方法；
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
9.一种试剂产品，其特征在于，所述的产品包括：
(a)目的载体；
(b)第一引物；
(c)第二引物；
(d)任选的聚合酶；和
(e)任选的无缝克隆重组酶，
其中，所述的目的载体、第一引物和第二引物如上所述。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)第一容器以及位于所述第一容器中的目标载体；
(b)第二容器以及位于所述第二容器中的第一引物；
(c)第三容器以及位于所述第三容器中的第二引物；
(d)任选的第四容器以及位于所述第四容器中的聚合酶；和
(e)任选的第五容器以及位于所述第五容器中的无缝克隆重组酶；
其中，所述的目的载体、第一引物和第二引物如上所述；
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(f)第六容器以及位于第六容器中的冷藏的细菌感受态细胞；
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：缓冲液、dNTP；
在另一优选例中，所述的第一、第二、第三、第四、和第五容器中任何二个是不同或相同的容器；
在另一优选例中，所述的第一、第二、第三、第四、和第五容器中的任何二个、三个、四个或全部是同一容器。
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