CN109487005A

CN109487005A - 用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物

Info

Publication number: CN109487005A
Application number: CN201811489981.5A
Authority: CN
Inventors: 林裕胜; 胡奇林; 江锦秀; 游伟; 张靖鹏
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2019-03-19

Abstract

本发明提供用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒的全基因组序列的引物。本发明利用7对引物扩增出山羊地方性鼻内肿瘤病毒的7个核苷酸片段，然后对7个核苷酸片段进行胶回收，回收目的片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列一次进行拼接、编辑及校正，最终得到山羊地方性鼻内肿瘤病毒。本发明获得的山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列有利于山羊地方性鼻内肿瘤病毒病毒致病机制、分子流行病学、反向遗传学等进一步研究，从而对山羊地方性鼻内肿瘤病毒的诊断试剂开发和今后疫苗研制等奠定重要的数据支持和理论基础。

Description

用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物。

背景技术

山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus，ENTV) 是线性单股正链RNA，全长7 440 bp左右基因组结构简单，两端为非编码区LTR序列，中间编码区由相互重叠的gag、pro、pol、env基因构成，分别编码芯髓衣壳(VA蛋白)、蛋白酶、反转录酶和囊膜蛋白。ENTV 属于反转录病毒科正反转录病毒亚科的β反转录病毒属，与绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)及普遍分布于山羊和绵羊细胞基因组中的内源性反转录病毒(ERVs)高度同源。

山羊地方性鼻内肿瘤（Enzootic nasal tumor，ENT）是由ENTV引起的一种慢性、进行性、接触传染性的肿瘤性疾病，被感染山羊主要表现食欲减退、极度消瘦、呼吸困难、鼻漏，最终衰竭而死，死亡率高达100 %，给养羊业造成了较大的经济损失。

从该病病原的发现至今，没有找到一个合适的病毒体外培养体系，使得病毒的大量生物学特性的研究都显得滞后。本发明拟通过RT－PCR技术，从含有病毒的鼻液中获得ENTV基因组，构建该病毒的cDNA文库，并借助生物信息学分析病毒基因组的结构特征及其功能，为进一步研究其致病机制、诊断试剂开发和疫苗研制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物，通过RT－PCR技术，从含有病毒的鼻液中获得ENTV基因组，构建该病毒的cDNA文库，并借助生物信息学分析病毒基因组的结构特征及其功能。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

用于RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物组合，由7对引物组成，分别用于RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的7个核苷酸序列片段：E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7，所述引物序列如下：

（1）用于RT-PCR扩增E1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ ID No:2的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:3的DNA序列。

（2）用于RT-PCR扩增E2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ IDNo:4的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:5的DNA序列。

（3）用于RT-PCR扩增E3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ IDNo:6的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:7的DNA序列。

（4）用于RT-PCR扩增E4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ IDNo:8的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:9的DNA序列。

（5）用于RT-PCR扩增E5核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ IDNo:10的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:11的DNA序列。

（6）用于RT-PCR扩增E6核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ IDNo:12的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:13的DNA序列。

（7）用于RT-PCR扩增E7核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列表中SEQ IDNo:14的DNA序列，其下游引物如序列表中SEQ ID No:15的DNA序列。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组序列GenBank登录号为：MK210250，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的方法，包括以下步骤：

1）提取山羊地方性鼻内肿瘤病毒的总RNA；

2）将总RNA进行反转录，以转录后的cDNA为模板，在上述引物组合的引导下，用RT-PCR方法扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的7个核苷酸序列片段：E1（1211 bp）、E2（1233bp）、E3（1104 bp）、E4（1192 bp）、E5（1178 bp）、E6（1268 bp）和E7（926 bp）；

3）将7个目的片段进行胶回收、连接、转化，挑取阳性克隆菌测序；

4）利用DNAStar软件一次将步骤3）中得到的7个核苷酸序列片段的DNA序列重叠部分进行拼接、编辑及校正，得到山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列，并将全基因组序列上传到NCBI上。

所述步骤2) RT体系为：GoScriptTM Reverse Oligo dT 4μL, GoscrtptTMEnzyme Mix 2μL, Nuclease-Free Water 12μL，RNA 2μL；PCR体系为：cDNA 2μL，TaKaRa ExTaq 10μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，无RNA酶水(RNase Free dH₂O)6μL。

所述步骤2）中的RT反应程序为25℃ 5min, 42℃20min, 85℃5min后。PCR反应程序为94℃预变性4min；然后94℃变性30s、52℃-55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min。

本发明的优点在于：

本发明提供了用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒的全基因组序列的引物对。本发明先用RT-PCR方法扩增出ENTV的7个核苷酸片段（E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7），然后对7个核苷酸片段进行胶回收，回收目的片段进行克隆测序，再将7个核苷酸序列片段的DNA序列一次进行拼接、编辑及校正，最终得到山羊地方性鼻内肿瘤病毒（命名为ENTV/CH/GT/2015）的全基因组序列。本发明引物对可用于获得的山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列有利于山羊地方性鼻内肿瘤病毒病毒致病机制、分子流行病学、反向遗传学等进一步研究，从而对山羊地方性鼻内肿瘤病毒的诊断试剂开发和今后疫苗研制等奠定重要的数据支持和理论基础。

附图说明

图1为山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的引物1、引物2和引物3特异性扩增电泳图，其中M: DL2000 bp DNA Marker，泳道1、泳道7、泳道13、：分别对应引物1、引物2和引物3对山羊地方性鼻内肿瘤病毒的扩增产物，泳道2-6、8-12、14-18：分别为引物1、引物2和引物3对羊口疮病毒，绵羊肺炎支原体，溶血性曼氏杆菌，山羊痘病毒，无菌去离子水的扩增产物。

图2为山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的引物4、引物5、引物6和引物7特异性扩增电泳图，其中M: DL2000 bp DNA Marker，泳道19、泳道25、泳道31、泳道37：分别对应引物4、引物5、引物6和引物7对山羊地方性鼻内肿瘤病毒的扩增产物，泳道、20-24、26-30、32-36、38-42：分别为引物4、引物5、引物6和引物7对羊口疮病毒，绵羊肺炎支原体，溶血性曼氏杆菌，山羊痘病毒，无菌去离子水的扩增产物。

图3为山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015全基因组的7个核苷酸序列片段(E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7)的RT-PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中M: DL5000 bpDNA Marker，泳道1：E1，1211 bp，泳道2：E2，1233 bp，泳道3：E3，1104 bp，泳道4：E4，1192bp，泳道5：E5，1178 bp，泳道6：E6，1268 bp，泳道7：E7，926 bp。

图4为山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015与NCBI中动物反转录病毒科(甲型反转录病毒属、乙型反转录病毒属、丙型反转录病毒属、丁型反转录病毒属和戊型反转录病毒属)38株参考毒株全基因组核苷酸序列的遗传进化树。

具体实施方式

实施例1、设计用于RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组7个核苷酸序列片段的引物组合

利用本发明引物对组合可获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒的全基因组序列，从而对山羊地方性鼻内肿瘤病毒的分子遗传演化趋势及流行情况在全基因组序列的水平上有更全面、系统地了解，以进一步深入研究。

根据NCBI中山羊地方性鼻内肿瘤病毒参考毒株的全基因组核苷酸序列，发明人应用生物信息学DNAStar软件进行分析、比对、筛选和优化，最终确定将山羊地方性鼻内肿瘤病毒的全基因组序列分成7个核苷酸序列片段：E1（1211 bp）、E2（1233 bp）、E3（1104 bp）、E4（1192 bp）、E5（1178 bp）、E6（1268 bp）和E7（926 bp），并进而分别在保守序列区域内设计RT-PCR扩增7个核苷酸序列片段的引物组合，经分析、比对、筛选和优化，最终确定的引物组合各序列如表1所示。

表1用于RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的引物组合

实施例2、获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组序列

基于实施例1得到的引物组合，本发明能够获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组序列，获得方法包括以下步骤：

1、提取山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的总RNA

按照Trans EasyPure Viral DNA/RNA Kit(购自北京全式金生物技术股份有限公司)说明书，提取山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的总RNA，具体步骤如下：

(1)试剂准备：在试剂WB5中添加48mL的无水乙醇。

(2)取200μL待检样品(从山羊鼻液中分离获得的山羊地方性鼻内肿瘤病毒，将其命名为山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015)加入1.5mL离心管中，同时加入20μLProtein K。

(3)加入200μL BB5（包含5.6ug Carrier RNA），漩涡混合15s，56℃孵育15min。

(4)加入250μL无水乙醇，漩涡混合15s，室温静置 5min。

(5)将溶液转移至新的2mL离心管柱(试剂盒内提供)中，12000 rpm，离心1min,弃掉流出液。

(6)加入 500μL WB5，12000 rpm，离心1min，弃掉流出液。

(7)重复步骤（6）1次。

(8)室温12000rpm离心1min，彻底去除残留的乙醇。

(9)将离心柱转入洁净的1 .5mL离心管中，在离心柱中央加40μL无酶水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱RNA，-70℃冻存备用。

2、RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015全基因组的7个核苷酸序列片段

将步骤1提取的山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的总RNA进行反转录，转录后的cDNA在实施例1中的引物组合的引导下，用PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015全基因组的7个核苷酸序列片段：E1（1211 bp）、E2（1233 bp）、E3（1104 bp）、E4（1192 bp）、E5（1178 bp）、E6（1268 bp）和E7（926 bp），具体步骤如下：

（1）按照Promega GoscriptTM Reverse Transcription Mix试剂盒(购自Progerma公司)说明书中的试剂比例配制反转录反应体系，具体组分如表2所示。

表2山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015全基因组的RT反应体系

（2）将上述配制好的试剂放入PCR仪中进行RT扩增，RT反应程序为25℃ 5min，42℃20min，85℃5min。

（3）PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015 cDNA全基因组的7个基因片段的反应体系，具体组分如表3所示。

表3山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015全基因组的PCR反应体系

（4）将上述配制好的试剂放入PCR仪中进行PCR扩增， PCR反应程序为94℃预变性4min；然后94℃变性30s、52℃-55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min。

（5）为了验证7对引物对的特异性，本发明对7对引物对进行特异性鉴定，将7对引物对同时对羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体、溶血性曼氏杆菌、山羊痘病毒的核酸和无菌去离子水进行扩增，检验引物对的特异性。检测结果如图1、图2所示，7对引物对除了能扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒外，对羊口疮病毒、绵羊肺炎支原体、溶血性曼氏杆菌、山羊痘病毒的核酸和无菌去离子水均无扩增，表明设计的引物对具有良好的特异性。

3、7个目的核苷酸序列片段的回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌测序

3.1 回收目的核苷酸序列片段

将步骤2中RT-PCR扩增的山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015全基因组的7个核苷酸序列片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3 (泳道1 ：E1（1211 bp）、泳道2：E2（1233 bp）、泳道3：E3（1104 bp）、泳道4：E4（1192 bp）、泳道5：E5（1178 bp）、泳道6：E6（1268 bp）、泳道7：E7（926 bp）)所示，RT-PCR扩增的7个目的核苷酸序列片段的长度与预期结果相符。

按照OMEGA公司的Gel DNA Extraction kit 200的说明书进行，回收并纯化7个目的核苷酸序列片段。具体步骤如下：

（1）琼脂糖电泳分离DNA片段，在紫外灯下迅速切取所需目的条带，装入高压灭菌过的离心管内。

（2）称量胶块的重量，以1mg=1µl进行计算；加入Binding Buffer，70℃水浴加热至凝胶溶解，间隔3分钟振荡一次。

（3）将HiBind DNA柱子安置于Collection Tube上。

（4）将DNA凝胶混合液全部转移至HiBind DNA中，10000rpm离心1min，弃去将滤液。

（5）加入300µLBindingBuffer，10000rpm离心1min，弃去将滤液。（6）加700µL SPWWash Buffer，10000rpm离心1min，弃去将滤液。

（7）重复上（6）一次。

（8）13000rpm空离心2min，弃去将滤液。

（9）把HiBind DNA柱子安置于新的1.5mL的离心管上，加入30-50µL65℃预热的Elution Buffer，室温静置2min。

（10）13000rpm离心2min洗脱出DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3.2 连接目的基因片段

将步骤3.1回收纯化的7个目的核苷酸序列片段分别连接到pMD19-T载体(购

自TaKaRa公司)中，按照pMD19-T 载体说明书中的试剂比例配制反应体系。

具体操作如下：取纯化冋收产物2.0µL加入2.5µL dH₂O 、5.0µL Solution Ⅰ和0.5µL PMD18-T vector，混合均匀后16℃水浴选接过夜。E基因、M基因、N基因和0RF3基因纯化回收的产物连接：取纯化冋收产物2.0µL加入2.5µL dH₂O、5.0µL SolutionⅠ和0.5µLPMD18-T vector，混合均匀后16℃水浴选接1h。

3.3转化

将7个目的基因片段的连接产物分别转化到E .Coli JM109感受态细胞(购自TaKaRa公司)中，具体步骤如下：

(1)将E .Coli JM109感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰盒上融化。

(2)将6μL连接产物移至100μL E .Coli JM109感受态细胞中，混匀，冰浴30min。

(3)42℃热激45s，迅速置于冰上至少2分钟。

(4)加入800μL SOC液体培养基(购自TaKaRa公司)，37℃、150rpm振摇培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

(5)取200μL步骤(4)中的菌液，转移到含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，均匀涂板，待全部菌液被吸收后，37℃温箱倒置培养12-14h。

3.4筛选阳性克隆

挑取LB琼脂平板上长出的白色单一菌落，分别接种于3mL LB液体培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm振摇培养过夜(12-16h)。

3.5测序

选取阳性单克隆菌液，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

3.6序列拼接、编辑及校正

将步骤3.5测序得到的7个核苷酸序列片段：E1（1211 bp）、E2（1233 bp）、E3（1104 bp）、E4（1192 bp）、E5（1178 bp）、E6（1268 bp）和E7（926 bp）的DNA序列的重叠部分用生物信息学DNAStar软件进行DNA序列拼接、信息编辑和校正分析，得到山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组序列，山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组的核苷酸(DNA)序列如序列表中SEQ ID No:1所示，序列表中的SEQ ID No:1由7506个核苷酸组成。

将山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组序列与NCBI(美国国家生物技术信息中心)中动物反转录病毒科(甲型反转录病毒属、乙型反转录病毒属、丙型反转录病毒属、丁型反转录病毒属和戊型反转录病毒属)38株参考毒株的全基因组序列，进行核苷酸同源性比较，可以看出山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015与乙型反转录病毒属中国参考毒株ENTV-2CHN1 (GenBank No.KU258870)、ENTV-2CHN2 (GenBankNo.KU258871)、ENTV-2CHN3(GenBankNo.KU258872) 、ENTV-2CHN4(GenBankNo .KU258873)、ENTV-2CHN5(GenBankNo .KU258874)的核苷酸同源性相对最高，为95.3％-95.9％之间。山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015与乙型反转录病毒属美国参考毒株的同源性比较，与其他参考株的同源性为92.6％-93.4％。ENTV/CH/GT/2015与甲型反转录病毒属参考株的同源性仅为31.4%-38.5%；与丙型反转录病毒属参考株的同源性为31.7%-32.3%；与丁型反转录病毒属参考株的同源性为29.9%-31.5%；与戊型反转录病毒属参考株的同源性为31.5%。由此表明ENTV/CH/GT/2015与乙型反转录病毒属株的同源性最好，属于乙型反转录病毒属中山羊地方性鼻内肿瘤病毒。

将山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015的全基因组序列与NCBI(美国国家生物技术信息中心) 中动物反转录病毒科（甲型反转录病毒属、乙型反转录病毒属、丙型反转录病毒属、丁型反转录病毒属和戊型反转录病毒属）38株参考毒株的全基因组序列制作遗传进化树，结果如图4所示，可以看出ENTV/CH/GT/2015与乙型反转录病毒属的参考毒株位于同一分支内，表明ENTV/CH/GT/2015位于乙型反转录病毒属内，属于乙型反转录病毒属。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 用于扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物

<130> 16

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7506

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaaggcatc agccattttg gtctgatcct ctcaacccca tcttttgtct ctctcttatt 60

tttcttagcg gggacgctcc gttttctccc tatgcaggtg tgactccttg cttgtgctgg 120

ccgcggcagg tggcgcccaa cgtggggctc gagttcgaca gttttcctcg ccactactct 180

tattagctaa aaagagtgag tatacgtata caagtgaatt taaattgagg aggagtagta 240

aggtttatag ttgagagtat aaatatggga cagacgcata gtcgtcaatt gtttgtacat 300

atgttatctg tgatgttaaa acatcgggga attactgttt ccaaacctaa attaatcaat 360

tttctttcat ttattgagga agtttgccct tggttcccca gagaaggtac agtaaattta 420

gaaacatgga aaaaggtagg ggaacaaatt cgggctcatt atactctaca tggccctgaa 480

aaggtgcctg ttgaaacttt atccttttgg acactaattc gtgattgtct ggactttgat 540

aatgatgaat taaaacgttt agaaaattta ttgaaacagg aagaaaatcc tctgcatgtt 600

cctgatccgg aacccaggta tgctgttccc aagggagtcg aaggcgaccc tccgttttct 660

aaattatcgc gtccttcaga taatgatgat tcactttcat ccacagatgg ggcggaatta 720

gacgaagaag ctgctaaata ccatcaagaa gattggggtt ttttagcaca agaaaagggg 780

gcatcaacat ctaaagatga tttgattgaa tgtttaaaaa acctcactgt tgttttacag 840

aattcaggaa ttaagcttcc cattagcaac tctaaacctt ctgctccacc tctaccccct 900

gcctatgctc cttccattat agcaggtctc gatccccctc cgggggctcc tcctcctcct 960

cctcctccat ctgagattgt gtctccgctg caaaaggcat tgaaacaagc acaacgactt 1020

ggtgaggttg tctctgactt ttcttttgcc tttcctgtct ttgaaaataa caaccagcgt 1080

ttttatgaag cgccgccttt taaacaatta aaagagttaa agattgcttg ctcacaatac 1140

ggtcctaccg ctccattcac tattgctatg atagaaagtt tgggtactca aaatctaccc 1200

ccaaatgact ggaaacaaat agctagggcc tgtctttcgg ggggagatta tctactatgg 1260

aaatctgaat atgctgaaca gtgtgctcgt atagccgatg tcaatcagca acaaggtata 1320

caaacttcct acgaaatgtt ggctggtgaa ggtgctttcc aggctactaa tactcaactt 1380

aactttttac ctggtgcata tgcacaaata tcaaatgcgg ctcgacaggc atggaaaaaa 1440

cttcctagct ctagtattaa gacagaagat ctctcaaaag tccgacaggg acctgatgag 1500

ccttatcagg acttcgtggc atggctctta gatactatag gtaagataat gtcagatgaa 1560

aaggctggga tggtattagc aaaacaattg gcttttgaaa acgctaactc tgcctgtcaa 1620

gctgctttac gaccttatcg aaaaaaggga gatctgtctg attttattcg catttgtgct 1680

gacattggac cctcctacat gcaaggcatt gctatggcag cggcatcaca aggaaaaagc 1740

attaaagagg tactttttca gcaacaagcc aagaacaaga aaggatatca aaagtcaggt 1800

aattcgggtt gctttgtttg tggtcagcct ggccatcggg ctgcagtgtg ccctcaaaaa 1860

cgacaaatcc ctgctaatac tcctaattta tgcccacgat gtaaaaaggg gaagcattgg 1920

gcccgggatt gtcgttccaa aacggatgtt caaggtaatc ctttaccccc ggtttcggga 1980

aactgggtga ggggccagcc cctggccccg aaacaatgtt atggggcaac actgcaggtt 2040

ccaaaagaac cattgcagac ctctgtcgag ccacaagagg cagcgcagga ttggacctct 2100

gtgccacctc ctacacagta ttaacacccg agatgggggt tcaaaccctt gccacaggag 2160

tgtttgggcc tttacctcca ggaactgctg gattgctttt agggcgcagc agtgcgtctt 2220

taaaaggaat acttattcat cctggtgtga ttgactctga ttatacagga gagataaaaa 2280

tattagcctc cgctcctaac aaaattattg tgattaatgc aggacaacgt atagctcaac 2340

ttcttttagt tccattagtt atacaaggaa aaacaattaa ccgagatcgt caagaaagag 2400

gcttcgggtc ctctgacgcc tattgggtgc aaaatgttac cgaggcacga ccagaacttg 2460

agctacgcat tgatggtaag cttttccgcg gagtgcttga tacaggggcc gatattagcg 2520

ttatttctga aaaatactgg cctactacat ggcctaaaca aatagctatt tccactcttc 2580

aaggtattgg ccaaactacc aatccagaac aaagttcgtc ccttcttact tggagggata 2640

aagatggcca tacaggccaa tttaaacctt atattctgcc ccatcttcca gttaatctat 2700

gggggcgtga tatattaagc aaaatgggtg tttatttata tagtccttca cccaccgtaa 2760

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cctagggacc tctgattctc ctgtgacaca tgccgatcct attgattgga aatctgagga 2940

accggtatgg gtcgatcagt ggcccctaac acaagagaaa ctttctgccg cacaacagct 3000

ggtgcaagaa cagctgagac ttgggcatat tgaaccctct acctctgcgt ggaattcccc 3060

aatttttgtt attaaaaaga agtctggaaa atggagattg ctacaagacc ttcgtaaggt 3120

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acctgacaaa tcctatatca ttattataga tttaaaagat tgtttttaca ctattcctct 3240

tgcacctcaa gattgtaaaa gatttgcctt tagtttgccc tctgttaatt ttaaagaacc 3300

tatgcaacgc tatcaatgga gagtcctccc acaaggaatg actaatagcc ctacgttatg 3360

tcaaaaattt gttgctacag cattagctcc cgttcgtcaa cgttttcctc agttatattt 3420

agttcattat atggatgata tattactagc tcatgctgac gaacatctat tgtatcaagc 3480

tttttctatt ctaaagaaac acttgagtct taatggtctt gtcatagctg atgaaaaaat 3540

tcaaactcat tttccctata attatttggg tttctcctta tatcctcgcg tttataatac 3600

ccaattagta aaattacaga ctgaccattt aaaaactcta aatgatttcc aaaaacttct 3660

aggagacatt aattggatac gcccttattt aaaactaccc acttatacct tgcagccttt 3720

atttgatatc cttaaaggtg actctgaccc tgcgtcaccc cgaacacttt cttcagaagg 3780

acgatcagcc ttacaatcaa tagaagaagc tattagacaa caacagatta cttattgtga 3840

ttaccaacgg ccatggggtt tgtatatact tcctacccct cgagcaccca caggggttct 3900

ttatcaagat aaacctttgc gatggatata tctatgtgct actccaacta aacatctgct 3960

cccttattat gagcttgttg caaaaattgt agcaaaagga cgtcatgagg ccatccaata 4020

ttttggtata gaaccccctt tcatttgtat tccttatgct ttagaacaac aagattggct 4080

ttttcaattt tcaggtaatt ggtctatagc ttttgcaaac tacccaggac ggattactca 4140

tcattatcct tctgataaat tgttacaatt tgctagcttt catgccttta tttttcccaa 4200

aatagtccgc cgacaaccca ttcctgaagc gacacttata tttacagatg gatcttctaa 4260

tggtactgca gctttaatta ttaaccatca aacttattat gcacatacca gtttctcttc 4320

tgcccaggtt gtggaattat ttgcagtcca ccaagcatta ctaactgtac ctacttcctt 4380

taatttattt acagacagct cctatgtggt cggtgcctta cagatgattg aaactgttcc 4440

aattattggc accacctctc ctgaagttct taacttattt acattaattc aacaggtcct 4500

ccactgtcgc caacacccct gtttctttgg gcatattcgt gcacactcca cccttcctgg 4560

tgccctcgta caaggcaatc acactgcgga cgttcttact aaacaagtgt tttttcaatc 4620

agctattgat gcagctcgaa aatcccataa cttacatcac caaaatagtc attctttacg 4680

gttgcaattt aaaatttccc gtgaagctgc acggcaaatt gttaaatctt gctctacttg 4740

tcctcaattc tttgttctcc ctcaatatgg tgtcaaccct cgaggtttac gccctaatca 4800

cctctggcaa acagatgtta ctcgcattcc tcaatttggg cgtcttaaat atgttcatgt 4860

ctctattgac actttttcca attttctcat ggcctctctt catactggag aatcgacacg 4920

tcgctgtatt caacatttgc tgttttgctt ttctatttca ggaatcccac aaacccttaa 4980

aacagataat ggacctggtt atactagccg ttcttttcaa cgtttttgtc tttcttttca 5040

aattcatcat aaaacaggaa ttccatataa cccacagggc caaggtattg tggaacgagc 5100

tcatcagcgt ctcaaacatc aactattaaa acagaaaaag gggaatgact tgtatagccc 5160

ctcaccgcat aatgccttga atcatgctct ttatgtttta aattttttaa ctttagacgc 5220

agaaggcaat tcagcagccc agcgtttttg gggagaacgg tcctcatgca aaaaaccact 5280

tgtacgatgg aaggatccac ttaccaatct gtggtatggg ccagaccctg tattaatatg 5340

gggacgcggg catgtttgtg tttttccaca ggatgccgaa gcgccgcgct ggataccgga 5400

gaggctggta cgcgcggcgg aggaactccc taacgcatca aatgcgtcgc atgacattga 5460

gcgagcctac gagtgagctg cctactcaga ggcaaattga ggcgttgatg cgacatgctt 5520

ggaatgaggc tcatgtgcaa cctccagtga caccgagtaa catactgatc atgctattgt 5580

tattgctaca gcgaatgcag aacggggagg ctgcagcttt ttgggcatac atccccgatc 5640

cacccatgat ccaatcctta ggatgggaca aagaggtagt acccgtatat gctaacgata 5700

caagtctttt aggcgggaaa tcagacagcc acatttctcc tcaacaagcc aatatttcct 5760

tctatggtct tacgactcaa taccctatgt gtttttctta tcagttacaa catcctcatt 5820

gtatacaagt gtcagctgat atttcctatc ctcgggtgac tatttcaggt attgatgaaa 5880

aaacaggaca caaatcgtac cgtgacggaa ctggaccctt ggacattcca ttctgcgata 5940

aaaatttaag tattggcata gggatagaca ctccttggac tttatgtcga gcacgagttg 6000

catcagtgta taatattaac aatgccaata ccaccttttt atgggattgg gcacccggag 6060

gaacacctga tttccctgaa taccgaggac agcatccacc catcctttca gtaaacactg 6120

ctcctatatt ccaaactgaa ctgtggaaac ttttggccgc ttttggtcat ggcaatagtt 6180

tatatctgca atccaatagt agtgggagta aatatggaga tgtaggtgtt acgggattct 6240

tgtatcctcg agcttgtgtt ccttatccat ttatgttgat acaaggccat ctagaaataa 6300

cactgtcatt gaacatttat catttaaatt gctctaattg tatacttact aattgtataa 6360

gaggtgttgc taaaggagaa caagttataa tagtgaaaca acctgctttt gtaatgctac 6420

ctgttgagat aactgaagag tggtacgatg agactgcctt agagttatta caacgtatta 6480

atacggctct tagccgcaag gaaagaagtg tgagcctgat tattttgggc atagtatctt 6540

taatcaccct tatagcaact gctgtcactg cttctgtatc tttagcgcag tccattcaag 6600

ctgctcatac tgtagattcc ttgtcatata atgttactaa agtaatggga acacaagaag 6660

atatagatag aaaaatagaa gatagactat cagctttata tgatgtggtt agagttctag 6720

gagaacaagt tcagagcatt agtttccgca tgaaaatcca atgtcatgct aattataagt 6780

ggatttgtgt tacaaaaaag gcttataatg catctgattt tccgtgggat aaggtgaaaa 6840

aacatctaca aggaatatgg tttaatacta atgtgtctct agatctattg caattgcata 6900

atgaaattct taatattgaa aattctccaa aagctacttt gaacatagct gatactgttg 6960

ataatttttt acaaaattta ttttctaact tccctagcct tcattcactg tggcgtagca 7020

taattgctgt gggtgcggtt ctgactgttg tgcttatatt gatttgttta gctccttgcc 7080

ttattcgtag cattgttaaa gaatttttac atatgagagt tctgatacat aaaaacatgt 7140

tgcaacaccg acatcttatg gagcttttaa aaaataaaga gaggggagct gcgggggact 7200

gcccgtgaag ggttaagtct tgggagctgc taggcgttat gcagagcctt aggcacgtcc 7260

ctaagctccc tgtcccgccc ccctgaagaa tttactaccc ttaaggctcc gggacgtctc 7320

ggtcttgcaa catttcatag aagatagatt agcttattga tagaagatag attatctatt 7380

tgtgatgtac acaacggtaa gggtcttgtg attgtatttg gagattaaga acaatcttgt 7440

gaatgtcaga agtcacgtac tttatcctat atatactgca gcacaataaa acaacaaggc 7500

atcagc 7506

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaaggcatc agccattttg gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agacaggccc tagctatttg tt 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaaagattg cttgctcaca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaaaaggag ttgagctata 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attgactctg attatacagg aga 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagggctatt agtcattcct tgt 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgtttttaca ctattcctct tgca 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgaccacata ggagctgtct 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttctcttct gcccaggttg t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgggtaggc agctcactcg t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgggcatgtt tgtgtttttc c 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacagtatga gcagcttgaa tgga 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attcaagctg ctcatactgt ag 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agctgatgcc ttgttgtttt attgt 25

Claims

1.用于RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的引物，其特征在于：所述引物由7对引物组成，分别用于RT-PCR扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的7个核苷酸序列片段：E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7；所述引物序列如下：

（1）用于RT-PCR扩增E1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如SEQ ID No:2所示，其下游引物如序列SEQ ID No:3所示；

（2）用于RT-PCR扩增E2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列SEQ ID No:4所示，其下游引物如序列SEQ ID No:5所示；

（3）用于RT-PCR扩增E3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列SEQ ID No:6所示，其下游引物如序列表中SEQ ID No:7所示；

（4）用于RT-PCR扩增E4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列SEQ ID No:8的DNA序列，其下游引物如序列SEQ ID No:9所示；

（5）用于RT-PCR扩增E5核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列SEQ ID No:10所示，其下游引物如序列SEQ ID No:11所示；

（6）用于RT-PCR扩增E6核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列SEQ ID No:12所示，其下游引物如序列SEQ ID No:13所示；

（7）用于RT-PCR扩增E7核苷酸序列片段的引物对，其上游引物如序列SEQ ID No:14所示，其下游引物如序列SEQ ID No:15所示。

2.一种利用权利要求1所述引物获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取山羊地方性鼻内肿瘤病毒的总RNA；

2）将总RNA进行反转录，以转录后的cDNA为模板，在权利要求1所述引物的引导下，用RT-PCR方法扩增山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组的7个核苷酸序列片段：E1（1211 bp）、E2（1233 bp）、E3（1104 bp）、E4（1192 bp）、E5（1178 bp）、E6（1268 bp）和E7（926 bp）；

4）利用DNAStar软件一次将步骤3）中得到的7个核苷酸序列片段的DNA序列重叠部分进行拼接、编辑及校正，得到山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中的RT体系为：GoScriptTMReverse Oligo dT 4μL，GoscrtptTM Enzyme Mix 2μL，Nuclease-Free Water 12μL，RNA 2μL；PCR体系为：cDNA 2μL， TaKaRa Ex Taq Mix 10μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，无RNA酶水6μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中的RT反应程序为25℃ 5min,42℃20min, 85℃5min后；PCR反应程序为94℃预变性4min；然后94℃变性30s、52℃-55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min。