CN111315764B

CN111315764B - 一种花瓣紫斑蛋白及其编码基因

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Publication number: CN111315764B
Application number: CN201980005565.XA
Authority: CN
Inventors: 梁成真; 穆罕默德·阿里·阿比德; 孟志刚; 王远; 张锐
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: WO2021114156A1; CN111315764A

Abstract

本发明公开了一种花瓣紫斑蛋白，该蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成；同时公开了由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的编码该蛋白的基因；本发明还公开了该蛋白及其编码基因在调控植物花瓣紫斑性状上的应用。本发明明确了花瓣紫斑性性状由单显性基因控制，可作为海陆杂交种的标记性状；还可以通过转基因方法将该基因转育到花卉植物中，为花卉植物的丰富多彩提供一种新的基因来源。

Description

一种花瓣紫斑蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种花瓣紫斑蛋白；还涉及该花瓣紫斑蛋白的编码基因及其应用。

背景技术

植物的花、叶、果实和枝干等部位的异色斑点、条纹等统称为彩斑，尤其是花瓣上的彩斑，是构成园艺植物观赏价值的主要组成部分。根据花斑在花瓣上大小、形态和位置的不同，花瓣上的彩斑分为规则彩斑和不规则彩斑两大类，规则彩斑包括花环、花心(花眼)、花斑、花肋和花边等多种形式；不规则彩斑是指花瓣上具有的非固定图案的异色散点或条纹等。规则彩斑通常由基因控制，能在有性杂交过程中按照遗传规律进行遗传传递。

棉花是重要的纤维经济作物，陆地棉(Gossypium hirsutum L.)和海岛棉(Gossypium barbadense L.)是两种主要栽培棉花。虽然二者均由二倍体亚洲棉(A基因组)和雷蒙德氏棉(D基因组)进行种间杂交而形成的异源四倍体棉种，但是在自然选择和人工驯化过程中形成的染色体结构上的差异，使陆地棉和海岛棉之间在形态特征、纤维品质、适应性等存在显著差异。如海岛棉品种的花瓣基部都存在紫色花斑(简称紫斑)，而绝大部分陆地棉品种的花瓣基部都没有紫斑。

目前，对海岛棉花瓣紫斑的遗传调控尚不清楚。

发明内容

本发明人研究发现，海岛棉的花瓣基部紫斑性状由单显性基因控制。

为了利用海岛棉的花瓣基部紫斑性状，本发明提供一种花瓣紫斑蛋白，命名为GhBM，所述的蛋白是如下(1)、(2)或(3)的蛋白质：

(1)由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、和/或缺失、和/或添加得到的、且具有相同功能的蛋白质。

(3)与SEQ ID No：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性、且具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供了上述蛋白在调控植物花瓣紫斑上的应用。

所述植物是指棉花或花卉植物等。

本发明还提供了编码上述花瓣紫斑蛋白的基因，命名为GhBM，所述的基因为如下(a)、(b)、(c)或(d)所述的核酸分子：

(a)由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成；

(b)与SEQ ID No：1所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性，且编码相同功能蛋白的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID No：1所示的核苷酸序列具有95％以上同一性、且编码相同功能蛋白的核苷酸序列；

(d)在严格条件下与(a)、(b)或(c)所限定的核苷酸序列杂交、且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述基因的重组表达载体。

所述的表达载体指pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA2300等植物表达载体。

本发明还提供了含有上述基因或重组表达载体的微生物、细胞系或植物等。

本发明还提供了上述基因或重组表达载体在调控植物花瓣紫斑上的应用。

所述的植物是指棉花或花卉植物等。

所述的花卉植物是指唐菖蒲(Gladiolus gandavensis，又名剑兰)、玫瑰(Rosarugosa Thunb.)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、石竹(Dianthus chinensis L.)、水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem)、月季(Rosa chinensis Jacq)、郁金香(Tulipa gesneriana L.)、玉兰(Magnolia denudata Desr)、牡丹(Paeonia suffruticosaAndr.)、芍药(Paeonia lactiflora Pall.)、丁香(Syringa Linn)、紫荆(Cercischinensis)、仙客来(Cyclamen persicum Mill.)、风信子(Hyacinthus orientalis L.)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica(L.)Spreng.)、长春菊、天竺葵(Pelargoniumhortorum)、报春花(Primula malacoides Franch.)、瓜叶菊(Pericallis hybrida)、矮牵牛(Petunia hybrida)、虞美人(Papaver rhoeas L.)、金鱼草(Antirrhinum majus L.)、扶桑(Hibiscus rosa-sinensis)、木芙蓉(Hibiscus mutabilis Linn.)、夹竹桃(Neriumindicum Mill.)、大丽花(Dahlia pinnata Cav.)、五色梅(Lantana camara L.)、美人蕉(Canna indica L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)、一串红(Salvia splendens Ker-Gawler)、鸡冠花(Celosia cristata L.)、凤仙花(Impatiens balsamina L.)、半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)、雁来红(Amaranthus tricolor)、菊花(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.)、荷花(Nelumbo SP.)或睡莲(Nymphaea L.)等之一种。

本发明还提供了一种培育花瓣具有紫斑的植物品种的方法，包括向目的植物中导入上述基因，得到花瓣具有紫斑的转基因植物。

上述方法中所述的目的植物是指棉花或花卉植物等。

本发明具有的优点和有益效果为：(1)、本发明提供了海岛棉花瓣基部紫斑基性状为单显性基因控制，还对该基因进行了准确定位，并获得了该基因的核苷酸序列，为通过转基因方法将该基因转育到花卉植物中，为花卉植物的丰富多彩提供一种新的基因来源。(2)、本发明明确了海岛棉花瓣基部紫斑性状受单显性基因控制，可作为快速鉴定和筛选海陆杂交种标记形状、以及作为鉴定海陆杂交种纯度的标记性状。

附图说明

图1为海岛棉HaiR和陆地棉P30A花器官表型照片；其中1为陆地棉品种P30A，B为海岛棉品种HaiR。

图2为GhBM基因连锁标记筛选电泳图谱；其中1为陆地棉P30A引物A07INS8的PCR扩增结果；2为海岛棉HaiR引物A07INS8的PCR扩增结果；3为24株F₂无紫斑单株混池引物A07INS8的PCR扩增结果；4为陆地棉P30A引物A07INS13的PCR扩增结果；5为海岛棉HaiR引物A07INS13的PCR扩增结果；6为24株F₂代无紫斑单株混池引物A07INS13的PCR扩增结果。

图3为GhBM基因连锁标记在F₂代无紫斑群体PCR扩增示意图；其中1为海岛棉HaiR引物A07DEL9的PCR扩增结果；2为陆地棉P30A引物A07DEL9的PCR扩增结果；3-25为23株F₂代无紫斑单株混池引物A07DEL9的PCR扩增结果。

图4为GhBM基因连锁标记在F₂代无紫斑群体电泳图谱；其中1为海岛棉HaiR引物A07DEL11的PCR扩增结果；2为陆地棉P30A引物A07DEL11的PCR扩增结果；3-25为23株F₂无紫斑单株混池引物A07DEL11的PCR扩增结果。

图5为不同取样期花蕾大小照片；其中1为幼蕾期；2为花蕾期；3为开花期。

图6为GhBM基因在HaiR和P30A中花瓣不同时期和花瓣不同部位表达量柱形图；其中1为HaiR幼蕾期紫斑区，2为HaiR幼蕾期无紫斑区；3为HaiR花蕾期紫斑区；4为HaiR花蕾期无紫斑区；5为HaiR开花期紫斑区；6为HaiR开花期无紫斑区；7为P30A幼蕾期紫斑区，8为P30A幼蕾期无紫斑区；9为P30A花蕾期紫斑区；10为P30A花蕾期无紫斑区；11为P30A开花期紫斑区；12为P30A开花期无紫斑区；

图7为海岛棉HaiR中抑制GhBM基因的GhBM基因表达量的荧光定量PCR检测柱形图；其中1为HaiR-CK；2为HaiR-BMKO1；3为HaiR-BMKO2；4为HaiR-BMKO3.

图8.为海岛棉HaiR中抑制GhBM基因幼蕾花瓣表型照片；其中1为HaiR-CK；2为HaiR-BMKO。

图9为海岛棉HaiR中抑制GhBM基因开花期花瓣的表型照片；其中1为HaiR-CK；2为HaiR-BMKO。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但是不对本发明的保护范围构成限制。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

TRV-00载体和农杆菌GV3101记载于“Liang,C等.(2016)GhABF2,a bZIPtranscription factor,confers drought and salinity tolerance in cotton(Gossypium hirsutum L.).Sci Rep,6,35040.”一文。

实施例1、海岛棉花瓣基部紫斑性状的遗传分析

(一)、试验材料:陆地棉品种P30A，花瓣基部没有紫色花斑(以下简称为“花瓣紫斑”)(见图1)；海岛棉品种HaiR(曾用名：ISR，本申请人自育海岛棉品种)(见图1)，花瓣基部有紫色花斑。

(二)、试验方法：

以陆地棉品种P30A为母本、以海岛棉品种HaiR为父本杂交，得杂交F₁代；然后F₁代自交，得F₂代；在开花期，调查和统计F₁代和F₂代花瓣基部有紫色花斑和无紫色花斑的单株数量。

结果F₁代所有植株花瓣基部均有紫斑，说明花瓣紫斑性状由显性基因控制。在F₂代共调查5540个单株，结果(见表1)花瓣基部有紫斑的单株为4255株，花瓣基部无紫斑的单株为1285株，有紫斑：无紫斑的单株比例约为3:1，说明花瓣紫斑性状为单显性基因控制。将控制花瓣基部紫斑的基因命名为：GhBM。

表1海岛棉和陆地棉杂交F₂代花瓣基部紫斑性状分离比

实施例2棉花花瓣紫斑GhBM基因的图位克隆

(一)试验材料:实施例1中所得的F₂代分离群体5540株。

(二)试验方法：

(1)DNA提取，采用DNAsecure Plant Kit(购自天根生化科技(北京)有限公司)并按照其说明书提供的方法提取基因组DNA。

(2)GhBM基因初定位：以F₂分离群体中无花瓣紫斑的48株棉花基因组DNA混池为模板，以本申请人开发的陆地棉和海岛棉之间的720对多态性引物为引物进行PCR扩增，进行GhBM基因的初步定位。

上述PCR扩增：所用多态性引物(见表2)，利用2×Taq PCR StarMix with LoadingDye试剂(购自北京康润诚业生物科技有限公司)进行PCR扩增。

所述PCR的反应体系(20μl)为：基因组DNA 1μl，PCR Mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH₂O 7μl。所述的PCR反应程序为：94℃10min；94℃15s，根据引物退火温度设定15s，72℃1min，35个循环；72℃10min，16℃hold。将所得PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果(见图2)A07染色体的引物A07INS8和A07INS13与花瓣紫斑性状明显连锁。说明该基因位于A07染色体上。

(3)GhBM基因精细定位

从NCBI的SRA数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下载南京农业大学发布的海岛棉的全基因组重测序(WGS)数据,用NGSQCToolkit对下载得到的WGS数据进行过滤，排除测序质量低的序列，用BWA软件将海岛棉的测序比对到陆地棉的基因组上(南京农业大学发表的陆地棉基因组)，用Pindel和Samtools软件查找海岛棉-陆地棉之间片段长度差异小于80bp的InDel位点，在每个多态性位点两侧设计引物，用TNT blast检测引物在基因组(NAU)上的匹配情况。利用设计出的多态性引物对(海陆)F₂代群体1285个无紫斑的单株进行PCR扩增，进一步的精细定位。

上述的PCR扩增：所用多态性引物(见表2)，利用2×Taq PCR StarMix withLoading Dye试剂(购自北京康润诚业生物科技有限公司)进行PCR扩增。

所述PCR的反应体系为：DNA 1μl，PCR Mix 10μl，引物F 1μl，引物R 1μl，ddH₂O 7μl,总体积20μl。所述PCR的反应程序为：94℃10min；94℃15s，根据引物退火温度设定15s，72℃1min，35个循环；72℃10min，保持在16℃。将所得PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

表2图位克隆涉及的引物序列

表3图位克隆70kb内7个基因注释

基因编号	基因名称	基因描述
			G1	bHLH	推定的转录因子bHLH
G2	NA	未知
			G3	HMGS	羟甲基戊二酰辅酶A合酶
G4	CML	可能的钙结合蛋白CML
			G5	At1g	可能的果糖激酶-6，叶绿体
G6	CML	可能的钙结合蛋白CML
			G7	MYB	转录因子MYB

结果：进一步的单株PCR扩增分析表明，控制海岛棉花瓣基部紫斑的基因定位于A07INS8和A07INS13两个多态性引物之间(引物序列见表2)。通过扩大F₂群体数量，开发CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)引物(引物序列见表2)，进一步精细定位，通过图位克隆将控制花瓣基部紫斑基因定位到A07INS10.3和A07Del10.1两个引物之间70kb范围内(见图3和图4)。根据CottonFGD(www.cottonfgd.org/)注释结果，该范围内有7个基因(见表3)，依次命名为G1-G7。其中，G7基因编码一个R2R3MYB类转录因子，其他物种中R2R3MYB类转录因子调控植物花、果实、叶片等颜色的形成(Cao X et al,J Exp Bot,2017,68,5745-5758)，因此，推测G7基因是调节花瓣紫斑的最可能的候选基因。利用Clutal W软件比对分析，发现陆地棉和海岛棉之间G7基因编码区域存在一个SNP差异，导致编码蛋白的一个氨基酸残基由天冬氨酸(Asp,D)变成丙氨酸(Ala,A)。

实施例3、棉花花瓣紫斑GhBM基因表达分析试验

(一)试验材料:陆地棉P30A和海岛棉HaiR不同发育时期的花，以及花瓣的不同部位。

(二)试验方法：

1、RNA提取：

用EASYspin植物超纯RNA快速提取试剂盒(购自原平皓(北京)生物技术有限公司)进行RNA的提取。具体操作如下:

a)2ml无菌RNA离心管中加入500μl裂解液RLT(已加β-巯基乙醇)，再加入50μlPLANTaid，混匀备用；

b)取100mg棉花P30A或HaiR花瓣组织，液氮研磨成粉末状，加入550μl配制好的裂解液，立即旋涡震荡1min，室温下静置10min，使其充分裂解；

c)4℃，12000rpm离心10min，取500μl上清到新的1.5ml RNase-free离心管中；

d)加入0.5倍体积的无水乙醇(250μl)，混匀；

e)混合物加入到吸附柱RA中，4℃，12000rpm离心1min，弃废液；

f)加入2μl RNase inhibitor+5μl DNase+20μl DNA Buffer，室温静置10min，加入700μl去蛋白液RW1，室温放置30s，4℃，12000rpm离心1min，弃废液；

g)加入500μl漂洗液RW(确认已事先加入无水乙醇)，4℃，12000rpm离心1min，弃废液。重复洗涤一次；

h)将吸附柱RA放回收集管中，4℃，12000rpm空甩2min，取出吸附柱，放入一个新的1.5ml RNase-free离心管中，超净台中晾干至无酒精残留(5min)；

i)往吸附柱的吸附膜中间滴加30μl RNase-free water(65℃预热)，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min。(取2μl RNA，使用nano仪器检测RNA浓度)。

(2)反转录为cDNA

反转录体系(20μl)：(RNA 3μl，Oligo dT 1μl，RNase-free water 4μl)65℃预热5min，TransScript RT/R1 enzyme mix 1μl，gDNA Remover 1μl，2×TS Reaction Mix 10μl。

PCR反应程序：42℃15min，85℃5s。

(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

具体检测方法、数据处理、内参引物序列以及花瓣紫斑基因检测引物序列如下：

根据Bio-Rad公司提供的使用方法，在PCR体系中加入SYBR greenⅠ荧光染料，在荧光定量PCR仪C1000^TM Thermal Cycler(CFX96 real-time system,Bio-Rad，USA)上检测G1-G7基因的表达情况；以棉花ACTIN7基因为内参，实验设三次重复。其中引物序列如下。

其中，扩增内参ACTIN7的引物序列为：

ACTIN7上游引物：5'-CTCTCTCTGTATGCCAGTGGTC-3'；

ACTIN7下游引物：5'-TTGTCCGTCAGGCAACTCATAG-3'。

扩增GhBM的引物序列为：

GhBM基因上游引物：5'-ACGAACAGCAAACGATGTGA-3'(SEQ ID No.3)；

GhBM基因下游引物：5'-CTATTGTTGCCGCTGTCAGA-3'(SEQ ID No.4)。

数据处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(SAGs)-Ct(ACTIN1)，以2^-ΔCt值衡量基因转录水平，对海岛棉和陆地棉中GhBM基因的表达进行分析

所述PCR的反应体系(20μl)为：cDNA 1μl，KOD SYBR qPCR MIX 10μl，引物F 0.5μl，引物R 0.5μl，ddH₂O 8μl。PCR的反应程序为：98℃2min；98℃10s，60℃10s，68℃30s，40个循环；95℃15s，60℃15s，95℃10s。

结果(见图6)与陆地棉P30A相比较，GhBM基因在海岛棉HaiR花瓣基部紫斑部位表达量显著升高，而非紫斑部位表达量相对较低；而在P30A中，不同花期不同部位GhBM表达量均较低，甚至检测不到，说明GhBM基因是调控海岛棉花瓣基部紫斑的形成的基因。即GhBM基因在海岛棉HaiR花瓣基部表达量的升高导致了紫斑的形成。

实施例4、GhBM基因干涉表达试验

(一)试验材料:海岛棉品种HaiR，VIGS干扰表达载体和农杆菌菌株GV3101(本申请人实验室保藏)。

(二)试验方法：

(1)海岛棉HaiR总RNA的提取及cDNA的获得参见实施例3所述方法。

(2)重组表达载体VIGs-GhBM的构建

(a)引物设计：在GhBM基因的编码区找出一段特异片段设计引物VRB-F和VRB-R，所述的引物序列为：

VRB-F：5'-gtcaggatccAAGGGAAATGGCATCAAGTG-3'(SEQ ID No.5)(下划线斜体部分为BamHI的识别位点)；

VRB-R：5'-ggtaccgacCGGGTTCGAAGTTTTACTGG-3'(SEQ ID No.6)(下划线斜体部分为Kpn I的识别位点)。

(b)PCR扩增：以步骤(1)所得cDNA为模板，以VRB-F和VRB-R为引物进行PCR扩增，得到348bp的DNA片段，将所得PCR产物纯化，并测序，所得片段为序列表序列1中的DNA片段。

(c)用BamHI和Kpn I双酶切上述(b)所得的PCR产物，回收酶切片段，与经过BamHI和Kpn I双酶切的载体TRV-00骨架片段相连，得到重组质粒，即为所述VIGS干扰表达载体(TRVGhBM载体)。将所述重组质粒送样测序，测序表明在TRV载体的酶切位点BamHI和Kpn I之间插入了序列表中DNA片段，将该重组质粒命名为TRVGhBM。携带TRVGhBM基因片段的病毒在侵染棉花叶片后，可诱导棉花GhBM基因发生沉默，从而影响其调控花瓣基部紫斑发育的生物学功能。

上述重组质粒TRVGhBM的构建，也可以人工合成的序列表序列1所示的花瓣紫斑基因为模板。

(3)GhBM基因的VIGS系统干涉棉花的获得

将步骤(2)构建的重组质粒TRVGhBM，通过农杆菌GV3101导入到海岛棉品种HaiR中，具体的转化筛选方法参见“Liang,C等.Sci Rep,2016.(6),35040.”。同时设置转入空载体TRV-00和TRVGbCLA1(由华中农业大学张献龙教授实验室馈赠)的对照。最终获得三种瞬时表达的转基因棉花，即转入TRVGhBM载体的海岛棉植株，统称为HaiR-BMKO，具体所得3株，分别命名为HaiR-BMKO1、HaiR-BMKO2和HaiR-BMKO3；转入TRVGbCLA1的海岛棉植株，命名为HaiR-CLAKO；转入TRV-00空载体的海岛棉植株，命名为HaiR-CK。

(4)转TRVGhBM棉花中GhBM表达分析

收集步骤(3)中获得的棉花TRVGhBM材料花瓣，根据实施例3中RNA提取、反转录、qRT-PCR等方法分析转入TRVGhBM棉花HaiR-BMKO中GhBM的表达量，其中对照组HaiR-CK。

定量荧光PCR结果(见图7)，与HaiR-CK相比较，HaiR-BMKO棉花中GhBM基因的表达量显著降低，说明干涉基因表达的实验成功。

(5)转基因对照组TRV GbCLA1表型分析

注射2周后，观察步骤(3)中获得的TRV-CLAKO棉花新生叶片颜色变化，结果TRV-CLAKO棉花新生叶片出现明显的白化或者斑点状白化，表明VIGS侵染事件成功，菌株和载体均不存在问题。转入TRV-00空载的HaiR-CK为实验对照，观察步骤(3)获得的棉花HaiR-BMKO干涉株系花，观察各干涉棉花株系花瓣基部紫斑的变化，包括紫斑有无、大小和颜色深浅的改变，每个转基因事件至少观测20个花以上。

结果:与HaiR-CK相比较，HaiR-BMKO棉花花瓣基部发育不受任何影响，然而HaiR-BMKO干涉棉花株系中，幼蕾期花瓣基部紫斑发育明显抑制，甚至消失(见图8)；开花期，和对照组HaiR-CK相比较，HaiR-BMKO观测不到紫斑的出现(见图9)。说明GhBM基因是控制花瓣基部紫斑形成的基因。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种花瓣紫斑蛋白及其编码基因

<140> PCT/CN2019/124748

<141> 2019-12-12

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 1

Met Glu Gly Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Glu Glu

1 5 10 15

Glu Asp Leu Leu Leu Lys Lys Cys Ile Glu Lys Tyr Gly Glu Gly Lys

20 25 30

Trp His Gln Val Pro Ala Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser

35 40 45

Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Asn Ile Lys Arg Gly

50 55 60

His Phe Ala Ala Asp Glu Val Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Asn Leu

65 70 75 80

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Leu Lys Lys Asn

100 105 110

Ile Asp Thr Ser Ser Lys Thr Ser Asn Pro Lys Ser His Lys Leu Lys

115 120 125

Pro Asn Thr Lys Val Ile Lys Pro Arg Pro Gln Ile Leu Ser Lys Arg

130 135 140

Ser Phe Leu Val Asn Leu Asp Glu Tyr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

145 150 155 160

Asn Asn Asp Cys Ala Glu Thr Ser Asn Asn Val Val Leu Ala Asp Cys

165 170 175

Ser Asp Asn His Asp Gly Tyr Cys Phe Leu Asp His Asp Glu Met Met

180 185 190

Trp Trp Glu Asn Met Met Met Asn Glu Lys Glu Val Asp Gly His Gln

195 200 205

Leu Gln Cys Ser Ala Asn Asp Ile Asp Gln Ser Val Leu Asp Gln Ile

210 215 220

Met Asn Glu Asp Asn Tyr Gly Lys Thr Met Asp Glu Leu Phe Leu Asp

225 230 235 240

Glu Glu Leu Trp Asn Val Phe Asn Pro

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense)

<400> 2

atggagggct catatttaag agttagaaaa ggtgcatgga ctgaagaaga agacctcctt 60

cttaagaaat gtattgagaa atatggtgaa gggaaatggc atcaagtgcc tgctagagct 120

ggcttgaatc gttgccggaa aagctgtaga ctacggtggc taaattattt gaagcctaat 180

atcaagagag gacattttgc tgctgatgaa gttgacctca ttattcgcct ccataacctc 240

ctaggtaata gatggtcact gattgctggt agactacctg gaagaacagc aaatgatgtg 300

aaaaactatt ggaacaccca cttgcttaaa aaaaatatag atacttccag taaaacttcg 360

aacccgaaat ctcataaact aaaacccaat actaaggtta tcaagcctcg gcctcagatc 420

ttatcaaagc gtagttttct tgtaaattta gatgaataca acaataacaa caataacaat 480

aacaacgact gtgcagaaac aagcaacaac gtggtattgg ctgattgcag tgacaaccac 540

gatggatact gtttccttga ccatgatgag atgatgtggt gggaaaatat gatgatgaat 600

gaaaaggagg ttgatggcca tcagctacaa tgttcagcca atgatattga tcaaagtgtg 660

ttggaccaaa ttatgaatga agacaattat ggcaaaacta tggatgagct ttttcttgat 720

gaggaactgt ggaatgtgtt taaccca 747

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense.)

<400> 3

acgaacagca aacgatgtga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 海岛棉(Gossypium barbadense.)

<400> 4

ctattgttgc cgctgtcaga 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(10)

<223> BamHI的识别位点

<400> 5

gtcaggatcc aagggaaatg gcatcaagtg 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> Kpn I的识别位点

<400> 6

ggtaccgacc gggttcgaag ttttactgg 29

Claims

1.一种花瓣紫斑蛋白在调控海岛棉花瓣紫斑上的应用；其中所述的花瓣紫斑蛋白由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成；所述的调控为通过抑制所述花瓣紫斑蛋白的表达，使得海岛棉花瓣基部紫斑消失。

2.一种基因在调控海岛棉花瓣紫斑上的应用；其中所述的基因由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的调控为将所述的基因沉默，使得海岛棉花瓣基部紫斑消失。