CN109134633A

CN109134633A - 抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用

Info

Publication number: CN109134633A
Application number: CN201811118191.6A
Authority: CN
Inventors: 陈学伟; 朱立煌; 陈智雄; 赵文; 尹俊杰; 朱孝波; 李伟滔; 王静; 贺闽
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109134633B

Abstract

本发明公开了一种抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明公开的抗稻瘟病蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，抗稻瘟病基因如SEQ ID NO:1所示。该抗稻瘟病基因蛋白和基因具有稻瘟病抗性，转化该基因的植物体具有稻瘟病抗性，该基因可以用于培育抗稻瘟病植物品种。

Description

抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用。

背景技术

植物已经进化出了精细的先天免疫系统，能感知病原微生物的侵袭并启动免疫防卫反应。由抗病基因(又叫R基因)介导的免疫反应能产生强烈的抗性，且依赖于植物对病原菌效应蛋白的识别，具有小种特异性。通常认为大多数R基因介导的免疫过程伴随超敏反应(HR)且符合基因对基因学说。水稻中的R蛋白大多包含一个NBS-LRR结构域，这些R基因有独特的进化模式，是植物免疫系统中的关键产物。

稻瘟病是破坏性严重的水稻病害，由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起。稻瘟病菌主要侵染水稻叶片和穗部，造成粮食减产。挖掘并应用R基因培育抗性品种是最经济有效的防治策略，然而由于水稻遗传不稳定性或者稻瘟病菌遗传变异，R基因的抗性会迅速丧失。因此，筛选并利用更多的抗稻瘟病基因是解决抗性迅速丧失的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗稻瘟病蛋白，该蛋白具有稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸分子，其编码上述的抗稻瘟病蛋白，转化该分离的核酸分子的植物体，能够赋予该植物体稻瘟病抗性。

本发明的再一目的在于提供一种抗稻瘟病基因，该基因具有稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组细胞或重组菌。

本发明的另一目的在于提供上述抗稻瘟病蛋白、分离的核酸分子、抗稻瘟病基因、载体、重组细胞或重组菌的应用。

本发明是这样实现的：

地谷(Oryza sativa indica Digu)是我国籼稻品种，对稻瘟病具有广谱持久抗性，已被广泛用于抗稻瘟病育种。

传统的R基因挖掘主要运用图位克隆法，该方法需构建庞大的分离群体，耗时费力且会受到亲本间遗传多样性不高等阻碍。当前，通过高通量测序已经能够快速解析大量基因组序列，全基因组关联分析(GWAS)已经成为筛选复杂表型下遗传变异的一种有效手段。在水稻中，运用GWAS已经找到了数百个有效关联信息。此外，基于HapMap的GWAS已经找到了大量的稻瘟病抗性位点。然而，作为自交植物，水稻有一定连锁不平衡的概率，这种连锁不平衡通常包含几百kb的区域，导致对候选基因的分辨率降低。因此，在此基础上引入其它手段将有助于候选基因的鉴定。

为了更有效地搜寻导致表型差异的基因，GWAS通常会与基因表达谱分析，同源基因功能分析，遗传变异分析以及转基因功能分析等相结合。鉴于OsSPL13,GL7和GH3-2等基因转录水平的差异会导致表型差异，GWAS结合转录组分析的策略有望提高抗病基因或防卫相关基因的鉴定效率，类似的策略已在杂种优势相关研究中有报道。我们先前已利用基因芯片的手段，对抗病品种地谷和感病品种丽江在接种稻瘟菌前后的转录组水平进行了分析。

本发明在此基础上筛出在地谷中特异表达的R基因，并结合全基因组序列分析数据筛出与地谷抗性相关的单核苷酸变异(SNP)所对应的R基因，进而挖掘并鉴定出了一种新的抗稻瘟病基因及其编码的蛋白。本发明使用不同的思路或策略进行抗病基因的快速鉴定，为进一步解析水稻抗病分子机制以及推动抗性基因的育种应用打下物质基础。

基于此，一方面，本发明提供了一种抗稻瘟病蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

该抗稻瘟病蛋白命名为PID4蛋白，结构如图6B所示，PID4蛋白包含3个主要的结构域：CC、NBS和LRR结构域，其中NBS结构域含有5个保守的蛋白基序分别为：P-loop(aa 189–198,GMGGLGKTSL),WalkerB(aa 277-283,VVLDDMW),Kinase3a(aa 303-311,GSRIIVTTR),GLPL(aa 368-373,GGLPLA)以及RNBS-D(aa 421-432,PSHLKPCFLYLS)。

PID4蛋白的NBS和LRR结构域可能具有独立的功能，因此，将编码PID4蛋白的核酸序列中的编码不同结构域的核酸片段与其它核酸片段重组，可构成嵌合基因，使之具有新的功能，其也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码如上所述的抗稻瘟病蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。SEQ ID NO:3为SEQ ID NO:2所示抗稻瘟病蛋白的编码序列。

该分离的核酸分子可作为外源DNA片段，通过插入到表达载体上后，再转化植物，可提高或赋予植物的稻瘟病抗性，培育出具有稻瘟病抗性的植物品种。

其中，被转化的植物可以是单子叶植物和双子叶植物。

例如，单子叶植物可以是：玉米、水稻、小麦、甘蔗、芦苇、高粱、姜、沙姜、草果、砂仁、郁金、莪术、益智、艳山姜、姜花、豆蔻等。

双子叶植物可以是：大豆、花生、向日葵、马铃薯、蕃茄等。

另一方面，本发明还提供了一种抗稻瘟病基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，SEQ ID NO:1所示的为抗稻瘟病的结构基因，其中：

针对SEQ ID NO:1中的各部分区域的起始终止位点说明如下：启动子(1..1883)；编码区(1884..1999，2237..4268)；5’UTR(559..1011，1144..1260，1868..1883)；外显子(559..1011，1144..1260，1868..1999，2237..5148，5255..5393，6130..6618)；内含子(1012..1143，1261..1867，2000..2236，5149..5254，5394..6129)；3’UTR(4269..5148，5255..5393，6130..6618)。

将抗稻瘟病基因命名为Pid4基因。Pid4基因序列连接到任何一种植物转化载体，用转化方法将Pid4抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。

本发明所述的Pid4基因构建到植物转化载体中时，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽或者增强植物对病原菌的抗性。

该抗稻瘟病基因可作为外源基因转化植物，提高或赋予植物的稻瘟病抗性，培育出具有稻瘟病抗性的植物品种。

其中，其他植物细胞可以是单子叶植物细胞和双子叶植物细胞。

例如，单子叶植物可以是：玉米、小麦、甘蔗、芦苇、高粱、姜、沙姜、草果、砂仁、郁金、莪术、益智、艳山姜、姜花、豆蔻等。

另一方面，本发明提供了一种载体，其含有如上所述的分离的核酸分子，或者如上所述的抗稻瘟病基因。

该载体可以是克隆载体例如T载体、λ噬菌体载体、P1噬菌体载体、粘粒载体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、pGEM-T、pUC18，也可以是表达载体例如腺病毒载体、反转录病毒载体或质粒载体；质粒载体可以是植物表达载体例如表达载体选自植物表达载体pBIN19、pBI121、pBI221、pCambia1300、pGreen等，载体的类型可以根据实际需求选择。无论载体，只要含有如上所述的分离的核酸分子或如上所述的水稻抗稻瘟病基因均落入本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供了含有如上所述的分离的核酸分子、如上所述的水稻抗稻瘟病基因、或者如上所述的的载体的重组细胞或重组菌。

例如，重组细胞可以是水稻细胞或其他植物细胞，其他植物细胞可以是单子叶植物细胞和双子叶植物细胞。

例如，重组菌可以是大肠杆菌、农杆菌等。

另一方面，本发明还提供了如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌在培育抗稻瘟病水稻品种或提高水稻抗稻瘟病抗性中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述稻瘟病抗性是指稻瘟病菌抗性。

基于本发明的研究结果，本领域技术人员容易理解到，可以将如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌不仅可以用于培育抗稻瘟病水稻品种，或用于提高水稻抗稻瘟病抗性，也可以将其用于培育其他抗稻瘟病植物品种，提高其稻瘟病抗性。

例如，其他抗稻瘟病植物品种可以是单子叶植物品种，也可以是双子叶植物品种。

只要将如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌用于培育抗稻瘟病植物品种提高其稻瘟病抗性即落入本发明的保护范围。

例如可以通过农杆菌介导法，或基因枪法等将本发明提供的如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因转化受体植物细胞，并使其分化形成完整植株获得稻瘟病抗性。

当然，也可以通过采用基因编辑技术例如锌指蛋白核酸酶技术(Zinc FingerNuclease,ZFN)、TALEN技术(Transcription activator-like effector nucleases)、CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic RepeatSequences)技术等，以如上所述的的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因为模板，修改受体植物基因组的基因组序列使其含有上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因，进而使其获得稻瘟病抗性。

无论通过何种方式使植物体获得稻瘟病抗性，只要其应用了本发明提供的如上所述的抗稻瘟病蛋白、如上所述的分离的核酸分子，如上所述的抗稻瘟病基因、如上所述的载体、或者如上所述的重组细胞或重组菌来使植物体获得稻瘟病抗性即落入本发明的保护范围。

再一方面，本发明还提供了如上所述的分离的核酸分子，或如上所述的抗稻瘟病基因作为分子标记在辅助育种中的应用。

本发明提供的如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因的序列可以有效地与其他同类稻瘟病抗性基因区别。因此，可根据如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因开发分子标记，检测待鉴定水稻品种或其他植物品种的基因组序列是否存在如上所述的分离的核酸分子或如上所述的抗稻瘟病基因，如果存在，则预示该待鉴定水稻品种或其他植物品种有稻瘟病抗性，可以作为亲本进行繁殖。

此外，也可以通过检测待鉴定水稻品种或其他植物品种的RNA是否表达出了如上所述的分离的核酸分子，如果存在，则预示该待鉴定水稻品种或其他植物品种有稻瘟病抗性。

相较于在田间观察的选育稻瘟病抗性的方法，以如上所述的分离的核酸分子，或如上所述的抗稻瘟病基因作为分子标记来辅助育种，可以大大地缩短育种时间和工作量。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述应用包括：用SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的引物扩增来自待鉴定水稻品种的基因组DNA，如果扩增条带大小为279bp，则预示该待鉴定水稻品种具有稻瘟病抗性。

本发明的研究显示，地谷中的Pid4相比于其他四个水稻材料的5’UTR区域缺失一个73bp(或44bp)的片段，从而形成了一个潜在的TATA-box(图7A)。根据其特性，用SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示的引物扩增来自待鉴定水稻品种的基因组DNA，如果扩增条带大小为279bp左右，则预示该待鉴定水稻品种具有稻瘟病抗性。

当然，也可以用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物扩增来自其他待鉴定植物品种的基因组DNA，如果扩增条带大小为279bp左右，则预示该待鉴定植物品种具有稻瘟病抗性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明克隆筛选Pid4基因的流程示意图。

图2为候选基因NBS2在地谷和丽江中的部分基因序列及转录水平分析；

图中：

(A)候选基因NBS2在地谷和丽江中的核苷酸序列比对分析；颜色填充的框代表外显子，其中黑色框为编码区；丽江中的NBS2在编码区由于一个碱基的缺失(+1294,A)引起移码突变，进而导致氨基酸编码的提前终止；

(B)利用实时荧光定量PCR检测NBS2基因在地谷和丽江中的本底及菌诱导后的表达量。

图3为稻瘟病抗性基因Pid4在水稻地谷中的表达谱分析；

图中：

(A)Pid4在地谷中的时空表达谱分析；(B)Pid4在地谷中接种非亲和菌株后的表达量检测。

图4为目的基因Pid4转基因株系的稻瘟病抗性鉴定；

图中：

(A、B)分别以LTH(A)和TP309(B)为背景的Pid4转基因T1代植株的共分离实验；1～5和6～10分别代表同一株系中分离出的感病和抗病单株；基因型检测所用引物为筛选标记潮霉素的检测引物；表型鉴定是在喷雾接种稻瘟病菌8天后进行的，病斑面积是利用Photoshop软件读取病斑的像素点后换算而来的；

(C)以TP309为背景的Pid4转基因T2代纯合植株的穗颈瘟抗性鉴定。注射接种稻瘟病菌是在孕穗期进行的，表型鉴定是在接种14天后完成的。

图5为携带候选基因NBS2的21个重组自交系基因型示意图；

图中：

黑色和灰色条分别代表地谷和丽江基因型，根据基因型将21个重组自交系分别为A和B两组，右边的数字(9和12)分别代表具有相应基因型的单株数。

图6为抗性基因Pid4的转录本及氨基酸序列分析；

图中：

(A)Pid4的转录本分析，ATG和TGA分别表示氨基酸编码的起始和终止密码子；黑框代表氨基酸编码区，空白框代表5’-UTR或3’-UTR区，折线代表内含子；

(B)PID4的蛋白序列和保守结构域分析。红色标注为两个CC基序；蓝色标注了六个位于NBS结构域的保守基序，按顺序依次为P-loop、WalkerB、Kinase3a、GLPL、RNBS-D和MHD；LRR区域由六个LRR重复序列组成，其中的亮氨酸残基已用斜体加下划线的方式标注。

图7为抗性基因Pid4的特异分子标记开发及其应用；

图中：(A)分子标记Pid4-GAP是根据地谷和其他材料(9311、LTH、NIP、TP309)序列比对后发现的一段缺失而设计的；TATA-box是启动子区域的重要元件；

(B)应用标记Pid4-GAP对两个亲本(地谷和丽江)及20个水稻材料进行的PCR检测。1到20分别代表：川谷B、9311、恒丰B、粤丰B、宜香1B、绵香1B、中9B、晋23B、广8B、D83B、明恢86、绵恢523、绵恢725、成恢3203、蜀恢498、蜀恢527、R1088、R06、P88S、Y58S。

图8为21个携带候选基因NBS2的重组自交系RILs进行的接菌试验结果。

图9为实施例10中的PID4的亚细胞定位及蛋白表达检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

在本发明的实施例部分，我们阐述了Pid4基因的克隆过程(图1)和该基因的一系列特征，分离的Pid4基因能够与转化载体连接，导入植物体中，赋予该植物体一定的抗性。

本发明所涉及的水稻材料地谷、丽江、川谷B、9311、恒丰B、粤丰B、宜香1B、绵香1B、中9B、晋23B、广8B、D83B、明恢86、绵恢523、绵恢725、成恢3203、蜀恢498、蜀恢527、R1088、R06、P88S、Y58S均可从中国水稻研究所或中国农科院等公开渠道获取。

实施例1

地谷(Oryza sativa indica Digu，以下可简称为Digu)与丽江新团黑谷(Oryzasativa japonica Lijiangxintuanheigu，以下可简称为丽江或LTH)中NBS-LRR基因转录组数据的比较分析。

我们之前的研究表明，在稻瘟病菌入侵的早期，水稻材料地谷和丽江(LTH)的转录谱存在明显差异。为了探究在地谷抗性中可能涉及的R基因，我们在微阵列芯片(microarray)数据中进行了R基因类似物(RGAs)的筛选，筛选那些被注释为抗病蛋白(或NBS-LRR domain protein)的基因。共筛到511个符合目标注释的基因探针。其中，在地谷中特异表达的基因被认为是地谷稻瘟病抗性的潜在来源。虽然我们并没有发现地谷中任何NBS-LRR基因在接菌后明显且特异地受诱导，但在地谷中共检测到特异表达的44个NBS-LRR基因(LTH中没有检测到)。为确保一致性，每个探针在微阵列分析中测试了18次。我们利用经验性的检测阈值(Signal Log Ratio>1and P Times≥6)对所获得的数据进行筛查，共10个基因通过了筛查，再经T检验验证后最终剩下九个候选基因(表1)。我们将这九个NBS-LRR基因作为参与地谷抗性的候选基因，并暂时命名为NBS1～NBS9(表1)。

表1

实施例2

通过全基因组序列分析筛选含有特异SNP的NBS-LRR基因

我们先前通过比较地谷和66个非持久抗性材料的全基因组序列，共鉴定到了2576个地谷特异的SNP(Digu-specific SNPs)(Li et al.2017)。为了确定地谷中的NBS-LRR基因和其他水稻材料之间是否存在特异的核苷酸差异，我们对这2576个Digu-specific SNPs进行了筛查。其中有108个SNPs位于基因外显子或启动子区域，我们从中发现了7个SNPs位于4个被注释为NBS-LRR蛋白的基因上。在这4个NBS-LRR基因中，基因LOC_Os06g17950(即表1中的提到的NBS2)在全基因组序列分析和比较转录组分析中均被鉴定到，暗示地谷中的NBS2基因可能在其稻瘟病抗性中发挥作用。

实施例3

NBS2的基因组序列和转录水平分析

基因组序列分析显示，地谷中NBS2基因(SEQ ID NO:1)全长约7kb，包括6个外显子和5个内含子。比较NBS2的核苷酸序列结果显示，地谷和丽江之间存在99.59％的序列一致性和1.96％的序列缺失差异。最明显的差别存在于两个等位基因的外显子(图2A)。除了前文筛出的地谷特异SNP(+1886，A-Digu/G-LTH，即地谷NBS2基因中，第1886位为A，丽江NBS2基因中为G)外，在NBS2的启动子和编码区中存在5个InDels。最重要的是，一个1-bp的缺失(+1294，A)导致丽江中的NBS2发生移码突变(图2A)。这种突变导致氨基酸编码提前终止进而形成一个不完整的蛋白，暗示丽江中的NBS2可能是一个假基因。此外，丽江中NBS2启动子的甲基岛区域存在6-bp的缺失(-1155，CCGCCG)和73-bp的插入(-1020)，该变异也可能导致转录水平的差异。

我们分别在地谷和丽江接稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)后的4个时间点(0、5、10、20hpi)进行叶片组织取样，提取总RNA后进行qRT-PCR检测，以验证地谷和丽江中NBS2的不同表达模式。

水稻总RNA的提取采用改良Trizol法，具体步骤如下：

将样品用液氮冷冻磨碎，装入管中。加入Trizol试剂(原则上每100mg材料加入1mlTrizol)；再将粉末和Trizol溶液充分混合后，室温放置5min，使核蛋白复合物完全分离。

加入0.2ml氯仿(以下数据均按1ml Trizol计算)，剧烈震荡20sec，室温放置3min；

经12000g，4℃离心15min，RNA完全溶于上层水相，将上层水相转入新的EP管中(约0.6ml)；

再次加入等体积的氯仿，震荡20sec,12000g，4℃离心15min，转移上层水相进入新的EP管；加入等体积的异丙醇，室温放置10min,12000g，4℃离心10min，沉淀RNA；去除上清，RNA吸附于管底，加入0.75ml 70％乙醇清洗沉淀，用手轻轻弹一下，让沉淀充分被洗净，7000g，4℃离心5min，去除上清；

重复清洗一次后将EP管放在通风橱中，使酒精挥发干净，沉淀呈透明状，加入30ulRNAase Free water待RNA充分溶解。

总RNA反转录为cDNA的方法如下：

反转录(Reverse Transcription，RT)按照Fermentas公司的RevertAidTM FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒的操作说明合成cDNA第一条链。

在DEPC处理过的20μl PCR管中，依次加入下列组分：

Oligo dT(0.5μl)，RNA(5μl)，轻微混匀并离心后，在65℃变性5min，冰上放置2min，然后加入以下组分：5×Reaction Buffer，2μl；RNase Inhibitor，0.5μl；10mM dNTP，1μl；Reverse Transcriptase，0.5μl。42℃，反应60min，72℃，延伸10min后终止反应。

最后经荧光定量PCR检测结果表明，地谷中的NBS2所有时间点均有高表达，且不受菌诱导，而在丽江中未检测到NBS2的表达(图2B)。该结果表明，地谷中NBS2可能编码一个有功能的R蛋白，而LTH中NBS2则是一个不表达的假基因。

实施例4

重组自交系(RILs)接菌鉴定地谷中NBS2的稻瘟病抗性

为了评估NBS2的稻瘟病抗性，我们利用分子标记从地谷×丽江的3685个重组自交系(RILs)中选出21个含Digu-NBS2的RILs，且根据它们的基因型将其分为A和B两组(图5)。我们用对地谷不致病，但对丽江致病的10个稻瘟病生理小种(99-20-2/B04/FJ08-9-1/Guy11/HN41/NC10/NC34/ZB15/Zhong10-8-1/ZE1)(以上10个菌株均由中科院遗传与发育生物学研究所提供)分别对这21个携带NBS2的RILs进行接菌试验。结果如图8所示，这21个RILs均对稻瘟病生理小种FJ08-9-1、Guy11和NC34具有抗性。表明NBS2可能对FJ08-9-1、Guy11和NC34具有小种特异性抗性，是一个有功能的抗性基因。鉴于之前已在地谷染色体的其他位置鉴定了三个R基因Pid(t)1、Pid2和Pid3，在此我们将NBS2基因命名为Pid4基因。

实施例5

转基因互补试验鉴定Pid4的稻瘟病抗性

为了确定Pid4的稻瘟病抗性，我们将完整的包含自身启动子的Pid4基因(SEQ IDNO:1)转入到感病品种LTH和TP309中。我们分别在LTH背景和TP309背景的转基因材料中获得了9个和11个独立的抗病株系，这些抗病株系均对稻瘟病生理小种NC34具有抗性。共分离分析实验证实了Pid4基因与稻瘟病抗性的关联；如图4A(LTH背景)和图4B(TP309背景)中所示，含有Pid4的T1代分离单株均表现出对稻瘟病菌NC34的抗性，而不含有Pid4的分离单株均感病。我们还对Pid4的转基因纯合株系以及7个参考水稻材料进行抗谱鉴定。结果如表2所示，LTH和TP309对收集自全国各地的15个菌株均表现出感病性状，而Pid4的转基因纯合株系则对其中5个菌株07-31-1-2、B71-2、B84、FJ-08-9-1、NC34表现出抗病性状。此外，在我们用到的15个菌株中，四个水稻单基因系IRBLz-Fu、IRBLzt-T、IRBL9-W和IRBLz5-CA均对其中10个菌株表现出抗性，其中包括一个对Pid4不致病的B71-2，以及九个对Pid4致病的菌株。综上所述，Pid4具有小种特异性抗性且其抗谱与R基因Pi-z、Pi-zt、Pi-9、Pi-z⁵均不相同。与叶瘟抗性相比，穗颈瘟抗性相关的报道则相对较少，但这种类型的抗性对水稻生产更为关键。为了确定Pid4是否能介导穗颈瘟抗性，我们对孕穗期的Pid4-TP309纯合植株、地谷以及TP309注射接种了NC34的孢悬液，两周后观察并量取病斑长度。结果表明，Pid4-TP309和地谷对NC34具有穗颈瘟抗性，而TP309则感染了穗颈瘟(图4C)。以上结果表明，Pid4基因对叶瘟和穗颈瘟都具有抗性。

表2 Pid4转基因株系以及7个参考材料对15个稻瘟病菌株的抗性鉴定

^a TG代表转基因株系；^b R代表抗病；^c S代表感病；

^d IRBLz-Fu,IRBLzt-T,IRBL9-W and IRBLz5-CA是四个以水稻LTH为背景的单基因系，它们各自携带的R基因分别是Pi-z、Pi-z^t、Pi-9、Pi-z⁵。

实施例6

Pid4基因的表达谱分析

为了研究Pid4的时空表达模式，我们分别采集了地谷在幼苗期、分蘖期、拔节期、孕穗期和成熟期的叶片组织，同时还单独采集了孕穗期的根、茎、叶、穗四个部位的组织，全部提取总RNA后进行qRT-PCR检测。检测结果表明，Pid4在地谷所有生长发育阶段和所有组织中均有表达(图3A)。孕穗期叶和茎中Pid4表达量最高，而孕穗期的根和成熟期的叶中Pid4表达量相对较低。这些结果表明，Pid4在地谷大多数组织和各生长发育阶段都有表达且起着一定作用。

为了确定地谷中Pid4的表达是否受非亲和稻瘟病菌的诱导，我们用非亲和菌株NC34对地谷进行接菌和空白处理，并分别在两种处理后6个时间点(0、10、20、48、72、96小时)采取地谷的叶片，提取总RNA后进行了qRT-PCR检测。结果显示，经稻瘟病菌处理和空白对照处理后的Pid4表达水平无显著差异(图3B)。这表明Pid4在地谷中是组成型表达，其表达量几乎不受菌诱导。

实施例7

Pid4基因结构分析

通过RACE-PCR和RT-PCR分析，获得了Pid4的全长cDNA(SEQ ID NO:3)。cDNA与基因组DNA序列的比较结果显示，Pid4包含一个2145bp的编码区，一个585bp的5’UTR区和一个1508bp的3’UTR区。在5’UTR中有两个内含子，分别为132bp和607bp，在3’UTR中也有两个内含子，分别为106bp和736bp(图6A)。

实施例8

PID4蛋白结构分析

Pid4基因编码一个包含715个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:2)，其分子量为82kDa，pI为8.66。保守基序分析表明，该蛋白(SEQ ID NO:2)的N端包含两个可能的CC结构域(aa68-84，aa 100-130)；NBS结构域包含五个保守的基序，分别为P-loop(aa 189-198，GMGGLGKTSL)，Walker B(aa 277-283，VVLDDMW)，kinase 3a(aa 303-311,GSRIIVTTR)，GLPL(aa 368-373，GGLPLA)，RNBS-D(aa 421-432，PSHLKPCFLYLS)；C端是LRR结构域，包含6个不规则的LRR重复结构(aa 542-715)；MHD基序(aa 495-510,VLHDIMRDIAISISAE)存在于NBS结构域与LRR结构域之间(图6B)。因此，Pid4基因编码典型的CC-NBS-LRR蛋白，即PID4蛋白。该PID4蛋白是一种新的蛋白，与现有的PID2(SEQ ID NO:6)和PID3(SEQ ID NO:7)存在明显的差异。

实施例9

Pid4基因的分子标记开发

为了开发Pid4基因用于分子标记辅助选择(MAS)育种的标记，我们对Digu、LTH、NIP、TP309和9311中的Pid4等位基因进行了序列比较。结果发现，地谷中的Pid4相比于其他四个水稻材料的5’UTR区域缺失一个73bp(或44bp)的片段，从而形成了一个潜在的TATA-box(图7A)。我们据此设计了Indel分子标记Pid4-GAP(SEQ ID NO:8)来检测Pid4的存在(图7A)。为了检验该标记的效果和特异性，我们利用Pid4-GAP对20个重要骨干亲本进行了基因型检测，用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物进行PCR扩增，结果如图7B所示，仅从材料川谷B中扩增出与地谷(279-bp)一致的条带，而其他19个水稻材料中扩增出的DNA片段均比地谷的大(>279-bp)。我们还用此标记对19份来自中国农科院的材料以及174份核心资源材料进行了PCR检测，结果显示共有26份材料检测出与地谷一致的带型，且其中有16份来自非洲国家。因此，Pid4基因的特异性序列和Pid4-GAP可作为分子标记应用到辅助育种中，例如快速筛选出具有稻瘟病抗性的育种材料。

实施例10

PID4在水稻细胞中的表达定位

为了确定PID4蛋白在水稻中的亚细胞定位，将PID4全长CDS融合到GFP的N端。在水稻叶片原生质体中瞬时表达时。

检测方法：取生长旺盛的水稻幼苗切取幼嫩的叶鞘部组织，用刀片将幼茎切成小段，加入酶解液酶解4-5h；酶解后，加入等体积的W5溶液，然后通过尼龙过滤网收集滤液并离心移除上清；重悬沉淀使原生质体浓度达到2×10⁶个细胞；在2ml离心管中加入5-10μg质粒，再加入100μl原生质体轻轻混合；沿管壁加入110μl PEG溶液，充分混合，放置于28℃避光孵育15min；沿管壁加入440μl W5溶液，充分混匀，终止转化反应，去除上清；加入1mlIncubation Solution重悬原生质体，28℃避光培养10-16h后在激光共聚焦显微镜下观察。

结果如图9A所示，PID4-GFP融合蛋白分布在细胞核和细胞质中，而GFP对照则均匀分布在整个原生质体。通过免疫印迹实验，用anti-GFP抗体对原生质体中瞬时表达的蛋白进行检测，结果如图9B所示，大小约110kDa的全长PID4-GFP融合蛋白被成功检测到。以上结果表明，PID4蛋白在细胞核和细胞质中均有表达。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 抗稻瘟病蛋白和基因、分离的核酸及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6618

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggatccggtg gaggaggtgg cacaagtgag gttggcggaa gagaggagtc ggcgtgggcg 60

aaggagcgcg ggggagagga ggtggcgcag acgagagagg cgggggagag gagatgatgc 120

ggaatgaggc gatgcgaaag aagcccgata cttttgttcg acgtcggtcg cccgaggcag 180

aacattatcg atatgagtta actaaaattg caacaagtct acgagagctt gtttgaggag 240

cttatagcag ctttttctct ccgaatttcc agttacataa atcatgtaaa ttctcaccaa 300

taatctatag ttatagtaga atttacaaca tcaaaataat caagtatata taatctataa 360

gtaaaattca tagctaagaa atctagcttt ccgatattct cgaggactga ctaccaacct 420

tttttataat cttaaaaatc ctctagacat gacctaaaat tgtatggaat gtaaaaaaat 480

acgggatttt cacatgttca attcccctaa aaatgttggg cgcatgacca aattgcaaaa 540

tgtaccaggc ccgagatcga tcgatctgaa cggacgcacg aaggaagaaa aagtgtagga 600

gttgcggcac atcaccgccg ccgctcctac accgtccgcc atagcgattc ccttccatct 660

cgcagccatc caaagtgagt ccttcgccgt ctccgatctg gaacttcacc gccgccgccg 720

ccgccgccgc cgcatctcct ccttcctctc ttggcaactg tcggcggcag ccaacggctc 780

tcttcccccc ttgttcctcc tgctatcgcg agtcaacggg atgctcgatt cgttacattt 840

tttttaagta ctagtattgc taatagttgc gacagagaaa aaaaaaagaa agtgtgggac 900

ggaagggaaa ggggggaatt cgctataaaa gcactcggaa ttggcctgct cgatgcgccg 960

aggctgactg atctcctgca gttccaagac tgaacagcga gatctctgca ggtatgtgcc 1020

cgttagctga ctccacgagt tctttttttc ctggttcaat gtttccactg ctctctctct 1080

ctctctttta aaattcggca agagctgaac acttcggctg tgaatctatg atgtcttcag 1140

cagatctggg tgcagtgatt tgattcgcag gtgtaagctt gattagccat tacttgagga 1200

gttaggtttc atgcttggat aataatcagg cctacaaagt tttggtattg tcgtactaag 1260

gtgattattg ccgcgttccc cccccctccc cccccctttt tttttcattt acatttgaac 1320

tttggcatgt gtattggatc atgcttatgg ttcaaaacaa ttacggtact aaagtttact 1380

tgcattagta ttaactttta cagtatatat gtagttatgt acaaactaca aacaatcgca 1440

tgcttgttaa ctgtaattag gctttgccag catctacgaa ttttctagct ttgtaattat 1500

tttgagacaa attttgaatg ataaaagttg ctatattttg ggacggaaag gtagatatcc 1560

acgaggtgac ttaactcttt ccgctggctt ttggacgtgc tacattctga taaaaataac 1620

cgcatctagt cactctgtac atattccaac cttgcaagga aatagatact acctccgttt 1680

caggttataa gactttctag cattgtccac attcatataa atattaatga atttaggcat 1740

acatatatgt ctagattcat taatatatat atgaatatgg gcaatgctag aaagtctttt 1800

aatattaaac ggaggaagta caatttaacg gaataggctt cgattctgag atccattgtt 1860

ctaacaggac tgatctggtg gtaatggcgg agacggtgtt gagcatggca aggtcgctgg 1920

tggggaatgc catcacgaag gccggagagg cagctgctgc agagataagc ttactgattg 1980

gtgtgaacaa ggagatctgg taggttttct ttaattactt acgcaaacaa aatattggtt 2040

taggaaaacg ttaaccctaa actttccaaa ctggttattt tcaaacaccc acccccaccc 2100

cccaaaaaaa gaaacaaaac tcctggtacc aagtggtaaa accattttaa gtgattattc 2160

gaattgattt tcatacttta ggtgatagaa taaatttaag ccatgtaatg tcctaaaatt 2220

gtcctttcat tattaggttt atcaaagacg agctgaaaac gatgcaagca ttcctgatga 2280

cagctgaaga gatggagaaa aaacccaggc tgttgaaagc gtgggtggag caagtaaggg 2340

atttatcttt tgacattgaa gattgcctcg ctgagtttat ggttcacgtg gggagcaaaa 2400

gcttgtcaca acagttgatg aagctcaaac atcgccatcg cattgccatc cagattcgtg 2460

acctcaaatc aagagttgaa gaagtgagcg ataggaattc acggtactca ttaatcagcc 2520

ctaacactga tgagcatgac accttgaggg atgaatttcg ctactggtca gctaagaaca 2580

ttgatgaggc tgaacttgtg ggttttgatg atgcaaagga aagtatactt aatttgatcg 2640

atgtccatgc taaccatggt cttgctaaag tgatctttgt agttggcatg ggcggtctag 2700

ggaagacaag tcttgttaaa aaggtttacc atagtattaa tattgttaat aatttctcat 2760

gccgtgcttg ggtcactgtg tcacagtcat ttgtcaggac agagctcctg agaggactaa 2820

tcaagcaact tttgggtggt gattcggaaa atgaacactt caaaggtctt cagagcatgc 2880

aaaggaatga gaaagtggaa gacctcgtgg aagacttgaa gcaaggtcta aaagagaaaa 2940

ggtactttgt tgttctagat gacatgtgga gcatagatgc attgaattgg cttaatgaat 3000

ctgtttttcc tgactctaaa aatggaggaa gtcgcataat agtaaccacg agagatgcca 3060

gcataattca aaactgtgct tatccttctt atctgtaccg ccttgaaccc ttaaaaacag 3120

atgatgctaa acaattgctg ctgagaaaat caaataaaag ttatgaggac ataaaaagag 3180

gcaaggctga gaaggtgttt gataggatac tagaaagatg tggaggctta ccactagctc 3240

ttgttgcgat aggagctgtc cttcgcacga aatgcataga agattgggaa aaactgtctc 3300

tgcagctatc ttcagggctc aaaacaaagt caagtcttga agaaatgact agagtaatta 3360

cacttagtta tacacacttg ccatctcatc tcaagccatg ttttctgtac cttagcattt 3420

tcccagagga ttttccaata aaaaggaggt gtatggtaaa tagatggata gccgagggtt 3480

ttgtggatgc aaagtttgga atggctatgg aggatgttgg aaatagttat ttcgatgaac 3540

tcatcaatag aagcatgatt caaccatgta ggttttatag tcatggagta gtacagtcct 3600

gtgtactcca tgatatcatg cgtgatatcg caatttctat ttccgcagag gagaatttcg 3660

tattcatgac gaaagggttt gtctctggta ttccacctga aaacatccgt cacctttcta 3720

ttgatgggag acaggattca tacctaagct ttgatctaag ccatgtccag tcattaagtt 3780

tcttttacaa tcctaaagag caactagctt cactgtgttc accacagcta aggatgctcc 3840

gagtgttgga tctagagttt agtctatgtc gtgtaacaca gaacgacatc agtaacatag 3900

gatcattttg ccacttaagg tatctatctg tgaagaaagg ttcatatatt taccatattc 3960

caagatccat caggaaattg caaggattgc aaactttaaa cctgaaaaga tcattaatta 4020

ctaaagtgcc cgcagaagtc actgaacttc gtagtttccg cagtctccgg tgtagcaccc 4080

ttggagttta cagtcacttc gaatttacta cccgtgagcc caaaaaatcc ttagtaacta 4140

caatgaaatt gcccttgata ttgccacatt tgattagcgg agacaaatcc tcggaggtgg 4200

tggcggagtt ccgcaagggt gagcgtacca aaaggaatag ggagcctgaa ggagttacag 4260

attcttgagc ttgtggatat cgcacgaagc aacaagaaag cagtccacga gttgggggaa 4320

cttagctgaa aaaattaggc gtggcagggg tcaccgagag gaatgtcaat tatctctgtg 4380

aagcccttca gaagctttct tctctctgtt cccttcgtgt ggaggccaaa cccttccgag 4440

gcctccacat gcttgagcag cttgcttccc cacctccctt cctccacacc ctcaaattga 4500

aaggctccct tcatgaaatc cccagttggg tcggaaagct cgagaagttg gtaaaggttc 4560

agctagtttt caccaaactg aaggatactg aatccataca agtactcggg gaattgcccg 4620

gcctcaaatg cctccgtctt attttaaatg cctacattgg aaaagagcta gttctttgcc 4680

atgggaagtt ccgagggcta aagactcttc gacttgactc tttggaggag ctgagaaagg 4740

ttacattcga ggagaggacc tcgcccaagc tggaaacaat aaccattcag gattgcagct 4800

cggagttagc agtctgcggc acggctaacc tccaaagcct cgagaaaatt aagtattttg 4860

caaaagggaa actggtgaag ggggacatgc atggcgagcg tcctgtggtg caagcgggtc 4920

agagccaaag tgcgcatcat cgggaggaca tcaaagctgc agagataata gagaaatctc 4980

aaacatcatc actagagaaa ggcgagagtt cacaatcaat acctaggcct gatgtccttc 5040

gtactcttcc acccatctct gcaacaacca agctgaagag aagtctgtcc tgcccagcat 5100

caacatctat cgtcatgtga actatagatc aaagactctc aacatcaagt aagttttatc 5160

taattggtat atatacagcc tttctttatt ccattttgtt tttttgctgt tctcgcaaca 5220

atcttatttg ttaaaaaacg tttaatatgt gtagatgttg atgccaccat cttgtagaac 5280

tcatgacgca tcgtagagct gtgataattg tagaactcat gacacatcag agagctgtgg 5340

ttgttgtaga gagctatttt cagggactga acttacctcc atggtggtaa ctggtatgtg 5400

ataaaccttg actcttaatt gtatttaact ttacaattga aactagtttt aattctctca 5460

tcattattgc ttttactagc attaacaagt aattgaatga gtatttgatt atccttttta 5520

acataagtag gaaggtagcc cgcacgaatg tgcgggtatg tatcgtaggc ggtttcgttt 5580

gagaaactta tatggacgga atatcagcca gatggcatgt gccatgtttc aaaaatatta 5640

tttcttcata tttttttttc atccgcattg cttagatata ttgttgctaa ccgattacat 5700

attccagtag taagatttcc gctaagtttg tagttgctga atgaatatgt tgtttggccg 5760

gcagttgtta tttcaaaagt acattaggta gtctctcaag tacaaaaaga atggcagatc 5820

agaaaagttt tgtccttcat ttattttctc tctgaaagag agtttgctag ggtggagatg 5880

tcgtcatgtg aataatcaaa tggactacat tagacgcatt gcactgtact caacccattg 5940

ctgacaaatg gagtgcaggt ccttaaccag gccagatatt tgttcagtgt ttttgttcaa 6000

aaaaaaaaca ttctggatgg aaggttattt cattataacc tttaccctta tagactgctt 6060

agtataaaca acaaataagg tctcctgcaa aattcatgta cgctgatatc tgtgttttct 6120

gccatgcaga gacttgcaat cttacagact catttatggc tgaatccaaa ttggttgctt 6180

ggagtctgga gctccatgag atcacaatgg ccactttttg ttgccatgag tggtacatgg 6240

atcgtgctgc taagccttta ctctgagcta gcggaaaact ggctggctgt atatcgagtt 6300

cacaatcgcc ctcaactttg tcaatgcgat ggtggtcatg gatagatgta tgtcatatag 6360

cgcaaagtgg agcctccaat gttcgccaac cgtattgtaa acgtgggagg agaaaatttc 6420

tcaagggaca accatggaac agaggtgatg gagcaaacta cttgctatca tttcagagca 6480

caggctgaat tttagctcag ataagagtac taattcttat ttgtctgtca ttgatctatc 6540

ttactccttc cgtccctaaa tataagagat tttgtttgga tacgatatat cctaatacaa 6600

taaatctaga taatctcc 6618

<210> 2

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Glu Thr Val Leu Ser Met Ala Arg Ser Leu Val Gly Asn Ala

1 5 10 15

Ile Thr Lys Ala Gly Glu Ala Ala Ala Ala Glu Ile Ser Leu Leu Ile

20 25 30

Gly Val Asn Lys Glu Ile Trp Phe Ile Lys Asp Glu Leu Lys Thr Met

35 40 45

Gln Ala Phe Leu Met Thr Ala Glu Glu Met Glu Lys Lys Pro Arg Leu

50 55 60

Leu Lys Ala Trp Val Glu Gln Val Arg Asp Leu Ser Phe Asp Ile Glu

65 70 75 80

Asp Cys Leu Ala Glu Phe Met Val His Val Gly Ser Lys Ser Leu Ser

85 90 95

Gln Gln Leu Met Lys Leu Lys His Arg His Arg Ile Ala Ile Gln Ile

100 105 110

Arg Asp Leu Lys Ser Arg Val Glu Glu Val Ser Asp Arg Asn Ser Arg

115 120 125

Tyr Ser Leu Ile Ser Pro Asn Thr Asp Glu His Asp Thr Leu Arg Asp

130 135 140

Glu Phe Arg Tyr Trp Ser Ala Lys Asn Ile Asp Glu Ala Glu Leu Val

145 150 155 160

Gly Phe Asp Asp Ala Lys Glu Ser Ile Leu Asn Leu Ile Asp Val His

165 170 175

Ala Asn His Gly Leu Ala Lys Val Ile Phe Val Val Gly Met Gly Gly

180 185 190

Leu Gly Lys Thr Ser Leu Val Lys Lys Val Tyr His Ser Ile Asn Ile

195 200 205

Val Asn Asn Phe Ser Cys Arg Ala Trp Val Thr Val Ser Gln Ser Phe

210 215 220

Val Arg Thr Glu Leu Leu Arg Gly Leu Ile Lys Gln Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Asp Ser Glu Asn Glu His Phe Lys Gly Leu Gln Ser Met Gln Arg Asn

245 250 255

Glu Lys Val Glu Asp Leu Val Glu Asp Leu Lys Gln Gly Leu Lys Glu

260 265 270

Lys Arg Tyr Phe Val Val Leu Asp Asp Met Trp Ser Ile Asp Ala Leu

275 280 285

Asn Trp Leu Asn Glu Ser Val Phe Pro Asp Ser Lys Asn Gly Gly Ser

290 295 300

Arg Ile Ile Val Thr Thr Arg Asp Ala Ser Ile Ile Gln Asn Cys Ala

305 310 315 320

Tyr Pro Ser Tyr Leu Tyr Arg Leu Glu Pro Leu Lys Thr Asp Asp Ala

325 330 335

Lys Gln Leu Leu Leu Arg Lys Ser Asn Lys Ser Tyr Glu Asp Ile Lys

340 345 350

Arg Gly Lys Ala Glu Lys Val Phe Asp Arg Ile Leu Glu Arg Cys Gly

355 360 365

Gly Leu Pro Leu Ala Leu Val Ala Ile Gly Ala Val Leu Arg Thr Lys

370 375 380

Cys Ile Glu Asp Trp Glu Lys Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ser Gly Leu

385 390 395 400

Lys Thr Lys Ser Ser Leu Glu Glu Met Thr Arg Val Ile Thr Leu Ser

405 410 415

Tyr Thr His Leu Pro Ser His Leu Lys Pro Cys Phe Leu Tyr Leu Ser

420 425 430

Ile Phe Pro Glu Asp Phe Pro Ile Lys Arg Arg Cys Met Val Asn Arg

435 440 445

Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Asp Ala Lys Phe Gly Met Ala Met Glu

450 455 460

Asp Val Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Glu Leu Ile Asn Arg Ser Met Ile

465 470 475 480

Gln Pro Cys Arg Phe Tyr Ser His Gly Val Val Gln Ser Cys Val Leu

485 490 495

His Asp Ile Met Arg Asp Ile Ala Ile Ser Ile Ser Ala Glu Glu Asn

500 505 510

Phe Val Phe Met Thr Lys Gly Phe Val Ser Gly Ile Pro Pro Glu Asn

515 520 525

Ile Arg His Leu Ser Ile Asp Gly Arg Gln Asp Ser Tyr Leu Ser Phe

530 535 540

Asp Leu Ser His Val Gln Ser Leu Ser Phe Phe Tyr Asn Pro Lys Glu

545 550 555 560

Gln Leu Ala Ser Leu Cys Ser Pro Gln Leu Arg Met Leu Arg Val Leu

565 570 575

Asp Leu Glu Phe Ser Leu Cys Arg Val Thr Gln Asn Asp Ile Ser Asn

580 585 590

Ile Gly Ser Phe Cys His Leu Arg Tyr Leu Ser Val Lys Lys Gly Ser

595 600 605

Tyr Ile Tyr His Ile Pro Arg Ser Ile Arg Lys Leu Gln Gly Leu Gln

610 615 620

Thr Leu Asn Leu Lys Arg Ser Leu Ile Thr Lys Val Pro Ala Glu Val

625 630 635 640

Thr Glu Leu Arg Ser Phe Arg Ser Leu Arg Cys Ser Thr Leu Gly Val

645 650 655

Tyr Ser His Phe Glu Phe Thr Thr Arg Glu Pro Lys Lys Ser Leu Val

660 665 670

Thr Thr Met Lys Leu Pro Leu Ile Leu Pro His Leu Ile Ser Gly Asp

675 680 685

Lys Ser Ser Glu Val Val Ala Glu Phe Arg Lys Gly Glu Arg Thr Lys

690 695 700

Arg Asn Arg Glu Pro Glu Gly Val Thr Asp Ser

705 710 715

<210> 3

<211> 2148

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcggaga cggtgttgag catggcaagg tcgctggtgg ggaatgccat cacgaaggcc 60

ggagaggcag ctgctgcaga gataagctta ctgattggtg tgaacaagga gatctggttt 120

atcaaagacg agctgaaaac gatgcaagca ttcctgatga cagctgaaga gatggagaaa 180

aaacccaggc tgttgaaagc gtgggtggag caagtaaggg atttatcttt tgacattgaa 240

gattgcctcg ctgagtttat ggttcacgtg gggagcaaaa gcttgtcaca acagttgatg 300

aagctcaaac atcgccatcg cattgccatc cagattcgtg acctcaaatc aagagttgaa 360

gaagtgagcg ataggaattc acggtactca ttaatcagcc ctaacactga tgagcatgac 420

accttgaggg atgaatttcg ctactggtca gctaagaaca ttgatgaggc tgaacttgtg 480

ggttttgatg atgcaaagga aagtatactt aatttgatcg atgtccatgc taaccatggt 540

cttgctaaag tgatctttgt agttggcatg ggcggtctag ggaagacaag tcttgttaaa 600

aaggtttacc atagtattaa tattgttaat aatttctcat gccgtgcttg ggtcactgtg 660

tcacagtcat ttgtcaggac agagctcctg agaggactaa tcaagcaact tttgggtggt 720

gattcggaaa atgaacactt caaaggtctt cagagcatgc aaaggaatga gaaagtggaa 780

gacctcgtgg aagacttgaa gcaaggtcta aaagagaaaa ggtactttgt tgttctagat 840

gacatgtgga gcatagatgc attgaattgg cttaatgaat ctgtttttcc tgactctaaa 900

aatggaggaa gtcgcataat agtaaccacg agagatgcca gcataattca aaactgtgct 960

tatccttctt atctgtaccg ccttgaaccc ttaaaaacag atgatgctaa acaattgctg 1020

ctgagaaaat caaataaaag ttatgaggac ataaaaagag gcaaggctga gaaggtgttt 1080

gataggatac tagaaagatg tggaggctta ccactagctc ttgttgcgat aggagctgtc 1140

cttcgcacga aatgcataga agattgggaa aaactgtctc tgcagctatc ttcagggctc 1200

aaaacaaagt caagtcttga agaaatgact agagtaatta cacttagtta tacacacttg 1260

ccatctcatc tcaagccatg ttttctgtac cttagcattt tcccagagga ttttccaata 1320

aaaaggaggt gtatggtaaa tagatggata gccgagggtt ttgtggatgc aaagtttgga 1380

atggctatgg aggatgttgg aaatagttat ttcgatgaac tcatcaatag aagcatgatt 1440

caaccatgta ggttttatag tcatggagta gtacagtcct gtgtactcca tgatatcatg 1500

cgtgatatcg caatttctat ttccgcagag gagaatttcg tattcatgac gaaagggttt 1560

gtctctggta ttccacctga aaacatccgt cacctttcta ttgatgggag acaggattca 1620

tacctaagct ttgatctaag ccatgtccag tcattaagtt tcttttacaa tcctaaagag 1680

caactagctt cactgtgttc accacagcta aggatgctcc gagtgttgga tctagagttt 1740

agtctatgtc gtgtaacaca gaacgacatc agtaacatag gatcattttg ccacttaagg 1800

tatctatctg tgaagaaagg ttcatatatt taccatattc caagatccat caggaaattg 1860

caaggattgc aaactttaaa cctgaaaaga tcattaatta ctaaagtgcc cgcagaagtc 1920

actgaacttc gtagtttccg cagtctccgg tgtagcaccc ttggagttta cagtcacttc 1980

gaatttacta cccgtgagcc caaaaaatcc ttagtaacta caatgaaatt gcccttgata 2040

ttgccacatt tgattagcgg agacaaatcc tcggaggtgg tggcggagtt ccgcaagggt 2100

gagcgtacca aaaggaatag ggagcctgaa ggagttacag attcttga 2148

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagatctcg ctgttcagtc 20

<210> 6

<211> 845

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gln Met Cys Gly Trp Leu Leu Lys Val Val Arg Trp Glu Asn Leu

1 5 10 15

Asn Cys Val His Met Glu Ala His Gly Asn Arg Arg Ser Ser Pro Thr

20 25 30

Tyr Leu Val Met Leu Trp Met Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Ile Thr

35 40 45

Cys Arg Gly Ser Ile Gln Lys Gln Val Leu Phe Pro Gly Phe Thr Ala

50 55 60

Ala Gln Met Asp Tyr Ile Asp Asn Asp Gly Ile Phe Leu Leu Ser Asn

65 70 75 80

Gly Ser Val Phe Gly Phe Gly Phe Val Thr Ser Asn Val Ser Asp Asn

85 90 95

Thr Phe Tyr Ile Leu Ala Val Val His Met Ala Thr Thr Thr Thr Val

100 105 110

Trp Ser Ala Asn Pro Asn Ser Pro Val Thr His Ser Asp Asp Phe Phe

115 120 125

Phe Asp Lys Asp Gly Asn Ala Phe Leu Gln Ser Gly Gly Gly Ser Asn

130 135 140

Val Trp Ala Ala Asn Ile Ser Gly Lys Gly Thr Ala Thr Ser Met Gln

145 150 155 160

Leu Leu Asp Ser Gly Asn Leu Val Val Leu Gly Lys Asp Ala Ser Ser

165 170 175

Pro Leu Trp Gln Ser Phe Ser His Pro Thr Asp Thr Leu Leu Ser Gly

180 185 190

Gln Asn Phe Ile Glu Gly Met Thr Leu Met Ser Lys Ser Asn Thr Val

195 200 205

Gln Asn Met Thr Tyr Thr Leu Gln Ile Lys Ser Gly Asn Met Met Leu

210 215 220

Tyr Ala Gly Phe Glu Thr Pro Gln Pro Tyr Trp Ser Ala Gln Gln Asp

225 230 235 240

Ser Arg Ile Ile Val Asn Lys Asn Gly Asp Ser Ile Tyr Ser Ala Asn

245 250 255

Leu Ser Ser Ala Ser Trp Ser Phe Tyr Asp Gln Ser Gly Ser Leu Leu

260 265 270

Ser Gln Leu Val Ile Ala Gln Glu Asn Ala Asn Ala Thr Leu Ser Ala

275 280 285

Val Leu Gly Ser Asp Gly Leu Ile Ala Phe Tyr Met Leu Gln Gly Gly

290 295 300

Asn Gly Lys Ser Lys Phe Ser Ile Thr Val Pro Ala Asp Ser Cys Asp

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Met Pro Ala Tyr Cys Ser Pro Tyr Thr Ile Cys Ser Ser Gly Thr Gly

325 330 335

Cys Gln Cys Pro Ser Ala Leu Gly Ser Phe Ala Asn Cys Asn Pro Gly

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Val Thr Ser Ala Cys Lys Ser Asn Glu Glu Phe Pro Leu Val Gln Leu

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Asp Ser Gly Val Gly Tyr Val Gly Thr Asn Phe Phe Pro Pro Ala Ala

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Lys Thr Asn Leu Thr Gly Cys Lys Ser Ala Cys Thr Gly Asn Cys Ser

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Cys Val Ala Val Phe Phe Asp Gln Ser Ser Gly Asn Cys Phe Leu Phe

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Asn Gln Ile Gly Ser Leu Gln His Lys Gly Gly Asn Thr Thr Arg Phe

420 425 430

Ala Ser Phe Ile Lys Val Ser Ser Arg Gly Lys Gly Gly Ser Asp Ser

435 440 445

Gly Ser Gly Lys His Asn Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Leu Gly Thr

450 455 460

Leu Ala Ile Ile Gly Val Leu Ile Tyr Ile Gly Phe Trp Ile Tyr Lys

465 470 475 480

Arg Lys Arg His Pro Pro Pro Ser Gln Asp Asp Ala Gly Ser Ser Glu

485 490 495

Asp Asp Gly Phe Leu Gln Thr Ile Ser Gly Ala Pro Val Arg Phe Thr

500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Arg Ile Ala Val Lys Lys Leu Glu Gly Ile Gly Gln Gly Lys Lys Glu

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Phe Arg Ser Glu Val Thr Ile Ile Gly Ser Ile His His Ile His Leu

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580 585 590

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Lys Leu Lys Tyr Asn Asp Lys Asp Gly Arg Val Glu Thr Ala Ile Lys

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Val Ala Leu Trp Cys Ile Gln Asp Asp Phe Tyr Gln Arg Pro Ser Met

770 775 780

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Pro Val Ser Ser Gln Ile Gly Tyr Arg Leu Tyr Ala Asn Ala Phe Lys

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<210> 7

<211> 924

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Ala Glu Gly Val Val Gly Ser Leu Ile Val Lys Leu Gly Asp Ala

1 5 10 15

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Gly Ser Ala Leu Lys Arg Leu Phe Ser Glu Ile Gly Glu Val Lys Gly

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Glu Leu Glu Ser Ile His Ala Phe Leu Gln Ala Ala Glu Arg Phe Lys

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65 70 75 80

Ala Leu Ser Ile Glu Asp Val Val Asp Glu Phe Thr Tyr Glu Leu Gly

85 90 95

Glu Gly Asp Gly Arg Met Gly Met Ala Val Ala Leu Lys Arg Met Cys

100 105 110

Lys Met Gly Thr Trp Ser Arg Leu Ala Gly Asn Leu Gln Asp Ile Lys

115 120 125

Val Asn Leu Lys Asn Ala Ala Glu Arg Arg Ile Arg Tyr Asp Leu Lys

130 135 140

Gly Val Glu Arg Gly Ala Lys Ser Thr Ala Gly Arg Arg Ser Ser Asn

145 150 155 160

Trp Arg Ser Asp Ser Val Leu Phe Lys Arg Glu Asp Glu Leu Val Gly

165 170 175

Ile Glu Lys Lys Arg Asp Leu Leu Met Lys Trp Val Lys Asp Glu Glu

180 185 190

Gln Arg Arg Met Val Val Ser Val Trp Gly Met Gly Gly Ile Gly Lys

195 200 205

Thr Ala Leu Val Ala Asn Val Tyr Asn Ala Ile Lys Ala Asp Phe Asp

210 215 220

Thr Cys Ala Trp Ile Thr Val Ser Gln Ser Tyr Glu Ala Asp Asp Leu

225 230 235 240

Leu Arg Arg Thr Ala Gln Glu Phe Arg Lys Asn Asp Arg Lys Lys Asp

245 250 255

Phe Pro Val Asp Val Asp Ile Thr Asn Tyr Arg Gly Leu Val Glu Thr

260 265 270

Thr Arg Ser Tyr Leu Glu Asn Lys Arg Tyr Val Leu Val Leu Asp Asp

275 280 285

Val Trp Asn Ala Asn Val Trp Phe Asp Ser Lys Asp Ala Phe Glu Asp

290 295 300

Gly Asn Ile Gly Arg Ile Ile Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Asp Val Ala

305 310 315 320

Leu Leu Ala His Glu Thr His Ile Ile Asn Leu Gln Pro Leu Glu Lys

325 330 335

His His Ala Trp Asp Leu Phe Cys Lys Glu Ala Phe Trp Lys Asn Glu

340 345 350

Ile Arg Asn Cys Pro Pro Glu Leu Gln Pro Trp Ala Asn Asn Phe Val

355 360 365

Asp Lys Cys Asn Gly Leu Pro Ile Ala Ile Val Cys Ile Gly Arg Leu

370 375 380

Leu Ser Phe Gln Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Trp Glu Lys Val Tyr Lys

385 390 395 400

Asn Leu Glu Met Gln Leu Thr Asn Asn Ser Ile Met Asp Met Met Asn

405 410 415

Ile Ile Leu Lys Ile Ser Leu Glu Asp Leu Pro His Asn Ile Lys Asn

420 425 430

Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Met Phe Pro Glu Asn Tyr Val Met Lys Arg

435 440 445

Lys Ser Leu Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Ile Glu Glu Thr

450 455 460

Glu His Arg Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu His Tyr Leu Thr Glu Leu

465 470 475 480

Val Asn Arg Cys Leu Leu Leu Leu Val Lys Arg Asn Glu Ala Gly His

485 490 495

Val His Glu Val Gln Met His Asp Ile Leu Arg Val Leu Ala Leu Ser

500 505 510

Lys Ala Arg Glu Gln Asn Phe Cys Ile Val Val Asn His Ser Arg Ser

515 520 525

Thr His Leu Ile Gly Glu Ala Arg Arg Leu Ser Ile Gln Arg Gly Asp

530 535 540

Phe Ala Gln Leu Ala Asp His Ala Pro His Leu Arg Ser Leu Leu Leu

545 550 555 560

Phe Gln Ser Ser Pro Asn Val Ser Ser Leu His Ser Leu Pro Lys Ser

565 570 575

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Leu Pro Lys Glu Val Phe Gly Leu Phe Asn Leu Arg Phe Leu Gly Leu

595 600 605

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610 615 620

Asn Leu Leu Val Leu Asp Ala Trp Lys Cys Lys Ile Val Lys Leu Pro

625 630 635 640

Leu Ala Ile Thr Lys Leu Gln Lys Leu Thr His Leu Ile Val Thr Ser

645 650 655

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675 680 685

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690 695 700

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725 730 735

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740 745 750

Pro Pro Leu Leu Gln Lys Leu Phe Leu Gln Gly Thr Leu Ser His Glu

755 760 765

Ser Leu Pro His Phe Val Ser Val Ser Asn Leu Asn Asn Leu Thr Phe

770 775 780

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<210> 8

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgcatctcc tccttcctct cttggcaact gtcggcggca gccaacggct ctcttccccc 60

cttgttcctc ctgctatcgc gagtcaacgg gatgctcgat tcgttacatt ttttttaagt 120

actagtattg ctaatagttg cgacagagaa aaaaaaaaga aagtgtggga cggaagggaa 180

aggggggaat tcgctataaa agcactcgga attggcctgc tcgatgcgcc gaggctgact 240

gatctcctgc agttccaaga ctgaacagcg agatctct 278

Claims

1.一种抗稻瘟病蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的抗稻瘟病蛋白。

3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一种抗稻瘟病基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子，或者权利要求4所述的抗稻瘟病基因。

6.含有权利要求2或3所述的分离的核酸分子、权利要求4所述的水稻抗稻瘟病基因、或者权利要求5所述的载体的重组细胞或重组菌。

7.权利要求1所述的抗稻瘟病蛋白、权利要求2或3所述的分离的核酸分子，权利要求4所述的抗稻瘟病基因、权利要求5所述的载体、或者权利要求6所述的重组细胞或重组菌在培育抗稻瘟病水稻品种或提高水稻抗稻瘟病抗性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述稻瘟病抗性为稻瘟病菌抗性。

9.权利要求3所述的分离的核酸分子或权利要求4所述的抗稻瘟病基因的特异序列作为分子标记在辅助育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其包括：用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物扩增来自待鉴定水稻品种的基因组DNA，如果扩增条带大小为279bp，则预示该待鉴定水稻品种具有稻瘟病抗性。