CN108350045B

CN108350045B - 具有马铃薯Y病毒属抗性的Pvr4基因及其用途

Info

Publication number: CN108350045B
Application number: CN201580080240.XA
Authority: CN
Inventors: 崔度一; 金晨星; 金达洙
Original assignee: SNU R&DB Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2035-05-22
Also published as: KR101996891B1; CN108350045A; WO2016190452A1; KR20170129186A

Abstract

本发明提供对马铃薯Y病毒属(potyvirus)具有抗性的Pvr4基因及其用途。本发明中使用利用Pvr4基因序列的分子标记，由此能够对马铃薯Y病毒属抗性辣椒的培育做出贡献。此外，本发明具有对马铃薯Y病毒属导致的经济上显示出生产量的大幅减少的异种作物马铃薯或番茄也能够进行转化的特征，通过这种转化可以期待作物的生产量的增加和经济效果。

Description

具有马铃薯Y病毒属抗性的Pvr4基因及其用途

技术领域

本发明涉及具有马铃薯Y病毒属(Potyvirus)抗性的Pvr4基因及其用途。

背景技术

辣椒(capsicum annuum)在分类学上是属于茄科(Solanaceae)的植物，是含有辣味成分辣椒素(capsaicin)的作物，由于维生素含量高，从而被利用为生食，并且干辣椒大部分使用为调味料。根据联合国粮食及农业组织(FAO，United Nations Food andAgriculture Organization of the United Nations)的统计，据报道，以2012年为基准，干辣椒的全世界生产量为335万吨，生食用辣椒的生产量为3100万吨，并且生产量正处于逐渐增加的趋势。

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae spp.)病毒，在植物病毒中包含最多种类的病毒，能感染包含于59科的503个植物(Quenouille et al.,MolPlant Pathol 14,439-452(2013),http://pvo.bio-mirror.cn/genus039.htm#Range)。据报道，被马铃薯Y病毒属感染的宿主植物体(host)在分类学上主要属于茄科(Solanaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、豆科-蝶形花亚科(Leguminosae-Papilionoideae)、苋科(Amaranthaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、禾本科(Gramineae)(VIDE项目(病毒识别数据交换项目(Virus Identification DataExchange project)；http://pvo.bio-mirror.cn/genus039.htm#Range)。马铃薯Y病毒属通过蚜虫传播到植物体，也可以通过被病毒感染的植物组织的汁液(sap)以物理方式接种于寄主植物体。据报道，在如马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Solanum lycopersicum)及辣椒(Capsicum annuum)等茄科(Solanaceae)作物的栽培中，马铃薯Y病毒属在经济上引起大约为45％的损失(Abdalla et al.,Plant disease,1991,vol.75,No.10,1019-1023)。马铃薯Y病毒属中，辣椒斑驳病毒(pepper mottle virus，PepMoV)是700～900nm的长度、12～15nm的宽度的杆状(rod shape)，具有约10Kb的(+)ssRNA结构。PepMoV表达多聚蛋白(polyprotein)，并通过多聚蛋白中存在的蛋白酶(proteinase)被切割为11个蛋白质。此外，在5′末端上具有VPg(病毒基因组连接蛋白(genome-linked protein))结构，在3′末端上具有多聚腺苷酸尾(poly(A)tail)结构(Quenouille et al.,Mol Plant Pathol.,2013,vol.14,439-452)。在韩国、欧洲及美国等地方，报道有辣椒及灯笼椒(Capsicum annuum)中的马铃薯Y病毒属的自然发生(Green et al.,Asian Vegetable Research andDevelopment Center,1991,vol.9,No.18,Technical Bulletin 18；Kenyon,L.,Kumar,S.,Tsai,W.S.,&Hughes,J.D.A.(2014).Virus Diseases of Peppers(Capsicum spp.)andTheir Control.Control of Plant Virus Diseases:Seed-Propagated Crops,vol.9,297-354)。PepMoV通过汁液的接种容易传染至辣椒和烟草，也通过各种蚜虫传染。被该病毒感染的辣椒叶子出现斑点(mottle)现象，并引起叶子和果实的畸形，感染严重的辣椒会萎缩且辣椒果实的数量会减少。关于PepMoV的研究，开发了如下的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒，即，当绿色荧光蛋白(GFP，green fluorescent protein)插入PepMoV的基因组内，导致宿主植物被PepMoV感染时，不仅是在自然状态下观察到的斑点现象，而且在紫外光(UV light，ultra violet light)下也能够确认PepMoV的感染范围的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒(Lee etal.,Virus Research,2011,vol.155,487-494)。由于SP6PepMoV-Vb1/GFP的开发，能够利用分子生物学的方法清楚且容易地分析PepMoV的病状。

据报道，至今为止从辣椒中分离且报道的马铃薯Y病毒属除了PepMov之外还有马铃薯Y病毒(PVY，Potato virus Y)，烟草蚀纹病毒(TEV，Tobacco etch virus)或辣椒重型花叶病毒(PepSMV，Pepper severe mosaic virus)等多种病毒，但是，据报道目前主要分布在韩国辣椒中的是PepMoV，并且会造成重大损失(Han et al.,Plant Pathol.J,2006,vol.22,155-160)。为了PepMoV的防除，需要防除蚜虫、消毒土壤、农机和种子的彻底管理。但是，防除方法是间接性的，并且需要付出很多努力，因此，培育对PepMoV具有抗性的品种会成为更有效、更经济的防除方法。

作为降低辣椒生产量的主要病毒的包括辣椒斑驳病毒(PepMoV，Pepper mottlevirus)、辣椒重型花叶病毒(PepSMV，Pepper severe mosaic virus)、辣椒黄花叶病毒(PeYMV，Pepper yellow mosaic virus)、厄瓜多尔rocoto病毒(ERV，Ecuadorian rocotovirus)、秘鲁番茄病毒(PTV，Peru tomato virus)和马铃薯Y病毒(PVY，Potato virus Y)的马铃薯Y病毒属(potyvirus)不仅是引起辣椒生产量的减少的病毒，而且是引起包括马铃薯在内的茄科作物的生产量的减少的病毒，为了增强这种作物的生产性，迫切需要辣椒和茄科作物的抗性品种的培育和开发(SCHOLTHOF et al.,Mol.Plant Pathol,2011,vol.12,938-954；Quenouille et al.,Mol.Plant Pathol.,2013,vol.14,439-452)。

在辣椒中发现的马铃薯Y病毒属抗性似乎是由pvr基因遗传，至今为止已报道有7个主要的抗性基因和多个数量性状基因座(quantitative trait locus；QTL)(Kang etal.,Annu.Rev.Phytopathol,2005,vol.42,392-405)。已知利用分子标记(molecularmarker)制作遗传图谱(genetic map)的结果，3号染色体和10号染色体中分别存在抗性基因簇(gene cluster)(Kang et al.,Annu.Rev.Phytopathol,2005,vol.42,392-405)。据报道，3号染色体中有如pvr1和pvr2等隐性抗性基因，并报道有辣椒的CM334的10号染色体中的单显性抗性Pvr4基因的位置(Revers,Fre′de′ric；and Nicaise,Vale′rie(August2014)Plant Resistance to Infection by Viruses.In：eLS.John Wiley&Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0000757.pub3)。已知位于10号染色体的端粒(telomere)区域的Pvr4基因而言，通过现有的研究显示出在辣椒的CM334和易感性个体的F2群体中以3:1分离，并确认了其作为单显性抗性基因对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV和PVY产生如完全抗性(extreme resistance)或过敏反应(hypersensitive response)等抗性反应(resistance response)(Grube et al.,TAG,2000,vol.101,852-589；Janzac etal.,Plant Pathol.,2009,vol.58,443-449；Kim et al.,TAG,2011,vol.122,1051-1058)。由Pvr4基因诱导的抗性而言，从报道Pvr4基因的存在后经过30多年的至今为止，对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV和PVY病毒的抗性没有被破坏过，并且是强且持续性的(Kang etal.,Annu.Rev.Phytopathol,2005,vol.42,392-405；Janzac et al.,Plant Pathol.,2009,vol.58,443-449)。此外，由Pvr4基因诱导的的抗性不仅对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV和PTV显示出抗性，而且还对目前为止已报道的所有PVY品系(strain)显示出抗性(Dogimont et al.,Euphytica,1996,vol.88,231-239)，因此，推断为通过导入Pvr4基因来转化的马铃薯、番茄等植物体能够获得对多种马铃薯Y病毒属的抗性，并且判断由此带来的经济波及效果会很大。

利用最近完成的辣椒CM334的基因组序列(genome sequence，Kim et al.,NatGenet,2014,vol.46,270-278)来开发对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV和PVY显示出稳定且广谱抗性的Pvr4基因(Dogimont et al.,Euphytica,1996,vol.88,231-239；Janzac etal.,Plant Pathol.,2009,vol.58,443-449)相关分子标记，并利用分子生物学方法将通过其鉴定的Pvr4基因导入至马铃薯、番茄等植物体中，由此使用于开发马铃薯Y病毒属抗性品种时，判断能够大幅缩短传统培育时间和努力，结果上能够实现显著的生产量的增大。

到目前为止仅报道有如下假设：Pvr4基因是对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV和PVY等马铃薯Y病毒属具有单显性抗性的基因中的一种(Kyle et al.,Euphytica,1997,vol.97,183-188；Grube et al.,Theor Appl Genet,2000,vol.101,852-859)。至今为止还没有报道关于Pvr4基因的准确的DNA碱基序列等的基因组或分子生物学水平上的信息。因此，还没有关于利用Pvr4基因的分子标记的开发，也没有分子生物学水平上的关于基因的信息，因此没有关于通过导入Pvr4基因来得到对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV、PVY等具有抗性的马铃薯，番茄等植物体的发明。

本说明书中参考了多篇论文和专利文献，并标记了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容整体上加入到本说明书中以作为参考，因此，更清楚地说明了本发明所属技术领域的水平和本发明的内容。

发明内容

要解决的技术问题

本发明是基于如上所述的背景提出的，本发明人为了寻找能够预防或改善PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV、PVY等马铃薯Y病毒属的感染引起的辣椒、马铃薯、番茄等的感染和损伤所导致的经济损失且源自植物体的作为马铃薯Y病毒属单显性抗性基因的Pvr4基因而做出了努力。其结果，在马铃薯Y病毒属抗性与Pvr4基因具有广泛相关性的假设的基础上，在基因组水平上对Pvr4基因进行探索后找出了准确的碱基序列，并查明了由本发明中具体提出的Pvr4基因转化的植物体直接提供对马铃薯Y病毒属PepMoV、PepSMV、PVY等的抗性的客观事实，由此完成了本发明。通过以下发明的详细说明、权利要求书及附图更加明确地说明本发明的目的及优点。

技术方案

为了实现所述目的，本发明提供马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列相似性，并且具有马铃薯Y病毒属(potyvirus)抗性的氨基酸序列组成。

本发明提供对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因。

本发明提供重组载体，其包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因。

本发明提供宿主细胞，其由重组载体转化，所述重组载体包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因。

本发明提供与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，增加植物体对马铃薯Y病毒属的抗性的方法，其包括如下步骤：将包含编码Pvr4蛋白质的基因的重组载体导入植物细胞中以进行转化，在转化植物细胞中使Pvr4基因过表达。

本发明提供与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，马铃薯Y病毒属抗性得到增加的转化植物体的制备方法，其包括如下步骤：(a)以重组载体对植物细胞进行转化，所述重组载体包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因；以及(b)由通过所述步骤(a)制备的转化的植物细胞再分化成转化的植物。

本发明提供马铃薯Y病毒属抗性得到增加的转化植物体及其转化的种子，所述转化植物体是通过所述马铃薯Y病毒属抗性得到增加的转化植物体的制备方法来制备。

本发明提供用于增加植物体的马铃薯Y病毒属抗性的组合物，其包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因，所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4由SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列相似性，并且具有马铃薯Y病毒属(potyvirus)抗性的氨基酸序列组成。

本发明提供正向或反向引物(primer)，其由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列中的10个以上的连续核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列组成。

本发明提供探针(probe)，其由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列中的10个以上的连续核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列组成。

本发明提供用于检测马铃薯Y病毒属抗性Pvr4基因的试剂盒，其包含所述引物或探针。

本发明提供与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，用于增加马铃薯Y病毒属抗性的基因的用途，所述基因对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码，其中所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4由SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列相似性，并且具有马铃薯Y病毒属(potyvirus)抗性的氨基酸序列组成。

有益效果

本发明提供对马铃薯Y病毒属(potyvirus)具有抗性的Pvr4基因、Pvr4蛋白质及其用途。

本发明中使用利用Pvr4基因序列的分子标记，由此能够对马铃薯Y病毒属抗性辣椒的培育做出贡献。

此外，本发明具有对PepMoV、PepSMV、PeYMV、ERV、PTV和PVY等马铃薯Y病毒属导致的经济上显示出生产量的大幅减少的马铃薯、番茄等宿主植物体进行转化的特征，通过这种转化植物体能够期待作物的生产量的增加和经济效果。

附图说明

图1为在本氏烟(Nicotiana benthamiana：N.benthamiana)中Pvr4基因对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的抗性结果(Lee et al.,Virus Research,2011,vol.155,487-494)。图1中，Pvr4基因为抗性基因，将作为易感等位基因的pvr4基因和作为空质粒的空白组(Empty)作为阳性对照组。(A)为利用识别SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒(Lee et al.,VirusResearch,2011,vol.155,487-494)的外壳蛋白的抗体来进行ELISA的结果。(B)为利用用于检测SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的VPg的引物来进行实时聚合酶链式反应(real-time PCR，RTPCR)的结果。共进行了5次。

图2为示出在本氏烟(N.benthamiana)中Pvr4基因对马铃薯病毒Y-0(马铃薯Y病毒(Potato virus Y)：PVY-0)和辣椒重型花叶病毒(Pepper severe mosaic virus：PepSMV)的抗性的结果。利用农杆菌同时浸润Pvr4和空载体(Empty vector)后，以感染PVY-0和PepSMV的烟草接种液进行摩擦(rubbing)，并在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天及第6天从5个植物体分别任意地采集5个烟草叶片来进行取样。对于样品，利用分别识别PVY-0和PepSMV的外壳蛋白的抗体并通过ELISA进行分析。(A)：PVY-O，(B)：PepSMV。

图3为示出由Pvr4基因转化的马铃薯对PVY的抗性的结果。在由Pvr4转化的马铃薯中接种马铃薯Y病毒(PVY-0)，然后利用用于检测PVY-0的Vpg的引物，并利用RT-PCR(上面图片)和识别外壳蛋白的抗体，通过ELISA(下面图表)进行分析的结果。

图4为示出将农杆菌同时浸润(co-infiltration)于辣椒Jupiter(C.annuumcv.Jupiter)及本氏烟(N.benthamiana)中并鉴定Pvr4基因的结果。(A)为利用农杆菌将源自CM334辣椒的Pvr4基因Pvr4-R、或者易感等位基因Pvr4-S分别与源自SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)(NIb)一起同时浸润于辣椒Jupiter(C.annuum cv.Jupiter)中的图。在同时浸润(co-infiltration)的时刻回收Jupiter叶子，然后为了确认结果，用乙醇进行脱色。(B)为利用农杆菌将源自CM334辣椒的Pvr4基因Pvr4-R、或者源自易感性辣椒的等位基因Pvr4-S和源自SP6PepMoV-Vb1/GFP的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)(NIb)、作为阴性对照组的源自番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus，TSWV)的NS基因，同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)叶子中。利用R3a和Avr3a作为阳性对照组。浸润后的7天后，回收本氏烟(N.benthamiana)叶子，并用紫外线确认了病毒感染。作为阳性对照组，R3a是源自马铃薯基因的马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)抗性基因，Avr3a是马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)效应分子(effector)，NPI是源自大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)的坏死诱导蛋白(necrosis induced protein)。

图5为确认利用农杆菌将Pvr4基因和马铃薯Y病毒属SP6PepMoV-Vb1/GFP、PepSMV、PVY、TEV的NIb同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)叶子中而表达的结果图像。将空载体(Empty vector)和SP6PepMoV-Vb1/GFP、PepSMV、PVY、TEV的NIb基因作为阴性对照组。利用R3a和Avr3a作为阳性对照组。圆形形状表示叶面上被浸润的部位。该叶子是将本实施例中进行分析及实验的内容代表性地示出的。浸润后的第4天拍摄了图像。

图6为示出被SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒感染的辣椒和烟草的疾病症状的图像，所述SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒是作为荧光蛋白质的绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein)插入到马铃薯Y病毒属PePMoV的基因组中而能够在紫外光(UV light)下用荧光来确认PePMoV的增殖的病毒(Lee et al.,Virus Research,2011,vol.155,487-494)。A表示对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒显示出抗性表型(resistance phenotype)的辣椒landraceCM334(C.annuum landrace CM334)(TC06495，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)和显示出斑点现象的作为易感性辣椒(susceptible phenotype)的辣椒ECW(C.annuumcv.ECW)(TC06444，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)和辣椒Jupiter(C.annuum cv.Jupiter)(TC05533，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)。用感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草组织的接种液对辣椒进行摩擦(rubbing)，然后在第14天进行拍照。B为使烟草Xanti NC(Nicotiana tabaccum cv.Xanti NC)感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒后在第14天照射紫外线(UV)来确认已感染病毒，并进行拍照。

图7为本发明中与Pvr4基因最密切相关的分子标记，即SNP61786分子标记的结果图像。使用CM334作为抗性个体，使用ECW123R作为易感性个体。制作了F1个体与易感性个体进行回交而获得的作为三世代的BC1F3，其中所述F1个体是CM334和ECW123R的杂交体(Kim,Han et al.,TAG.2011,vol.122,1051-1058)。Phe表示表型(phenotyping)，Gen表示基因分型(genotyping)。基因分型中，R表示抗性基因型(resistant genotype)，H表示杂合基因型(hetero genotype)，S表示易感性基因型(susceptible genotype)。表型中，R表示抗性表型，S表示易感性表型。

图8为示出本发明中进行的基于基因的克隆的图。

图9为示出本发明中Pvr4基因和等位基因pvr4基因的同源性。图9a中示出Pvr4基因为卷曲螺旋-核苷酸结合位点-亮氨酸富集重复(coiled-coil nucleotide-bindingsite leucine-rich repeat，CC-NBS-LRR)型，共具有5238个核苷酸(nucleotide)的ORF(开放阅读框(open reading frame))序列，并包含1745个氨基酸序列。图9b为利用NCBI(美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))的Blast程序对Pvr4基因和pvr4基因的整体氨基酸序列进行比较分析的结果。

图10为示出本发明中Pvr4基因的基因组DNA区域的图。图10(a)中示出作为Pvr4基因的基因组DNA区域，由7个外显子(exon)和6个内含子(intron)组成，从起始密码子到终止密码子是由13,870个核苷酸组成。图10(b)表示Pvr4基因的2号、3号、4号、5号、6号外显子碱基序列具有95％的同源性。图10(c)表示2号、3号、4号、5号内含子的碱基序列具有99％的高同源性。

图11为示出本氏烟(N.benthamiana)中的细胞凋亡症状的图。A为在本氏烟(N.benthamiana)的叶子上以3ml/g浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草接种液进行摩擦(rubbing)，左侧为在第2天利用农杆菌浸润空载体(Empty vector)pCAMBIA2300的结果图像，右侧为在第2天利用农杆菌浸润Pvr4基因的结果图像。B为在本氏烟(N.benthamiana)中以3ml/g浓度的感染PepSMV的烟草接种液进行摩擦(rubbing)，左侧为在第2天利用农杆菌浸润空载体(Empty vector)pCAMBIA2300的结果图像，右侧为在第2天利用农杆菌浸润Pvr4基因的结果图像。C为在本氏烟(N.benthamiana)中以3ml/g浓度的感染PVY的烟草接种液进行摩擦(rubbing)，左侧为在第2天利用农杆菌浸润空载体(Emptyvector)pCAMBIA2300的结果图像，右侧为在第2天利用农杆菌浸润Pvr4基因的结果图像。

图12为将源自CM334的马铃薯Y病毒属抗性基因Pvr4编码的氨基酸序列和源自ECW的易感等位基因pvr4基因编码的氨基酸序列进行比较的结果。

具体实施方式

本发明为了实现目的，提供马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列相似性，并且具有马铃薯Y病毒属抗性的氨基酸序列组成。

本发明人为了寻找能够改善马铃薯Y病毒属感染引起的作物的疾病和由此引起的作物的损伤所导致的经济损失的源自植物体的马铃薯Y病毒属抗性分子而做出了努力，在马铃薯Y病毒属抗性与Pvr4基因具有广泛相关性的假设的基础上，在基因组(genome)水平上对Pvr4基因进行分离和鉴定，并查明了由Pvr4基因转化的植物体直接对马铃薯Y病毒属(辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus，PepMoV)；辣椒重型花叶病毒(Pepper severemosaic virus，PepSMV)；马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY))具有抗性的客观事实。

本发明是对马铃薯Y病毒属具有特异性抗性的蛋白质。

本发明的说明书中的表述“特异性抗性”是指能够抑制马铃薯Y病毒属的增殖或活性、免疫系统(immune system)活性、免疫反应增强或免疫反应活性、或杀灭的特性，是指导入至植物细胞或植物体时，能够特异性地抑制马铃薯Y病毒属的增殖或杀灭马铃薯Y病毒属的特性。

本发明是对马铃薯Y病毒属具有特异性抗性的蛋白质，可以不受限制地包含自然界中存在的马铃薯Y病毒属，优选地，马铃薯Y病毒属包含选自PepMoV(辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus))、PepSMV(辣椒重型花叶病毒(Pepper severe mosaic virus))及PVY(马铃薯Y病毒(Potato virus Y))中的一种以上的马铃薯Y病毒属。

本发明的Pvr4蛋白质具有目前没有被公开的氨基酸序列，因此，本发明的Pvr4蛋白质的范围包括具有以SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的蛋白质及所述蛋白质的功能性等同物。

术语“功能性等同物”是指氨基酸的添加、取代或缺失的结果，与所述SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列同源性，优选具有90％以上的序列同源性，更优选具有95％以上的序列同源性，与以SEQ ID NO：3表示的蛋白质显示出实质上同质的生理活性的蛋白质。“实质上同质的生理活性”是指对马铃薯Y病毒属的抗性。此外，本发明中包含Pvr4蛋白质的片段、衍生物及类似物(analogues)。本文所使用的术语“片段”、“衍生物”及“类似物”是指与本发明的Pvr4多肽具有实质上相同的生物学功能或活性的多肽。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供对所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因。

本发明的Pvr4基因的特征在于，具有目前没有被公开的核苷酸序列，并且对马铃薯Y病毒属具有抗性。本发明的Pvr4基因包含编码Pvr4蛋白质的基因组DNA、cDNA及合成DNA。

优选地，本发明的基因可以包含以SEQ ID NO：1(基因组DNA)或SEQ ID NO：2(cDNA)表示的多核苷酸序列。此外，所述碱基序列的同源物包含在本发明的范围内。具体而言，所述基因可以包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多核苷酸序列分别具有80％以上的序列同源性，更优选具有85％以上的序列同源性，进一步优选具有90％以上的序列同源性，最优选具有95％以上的序列同源性的多核苷酸序列。

本发明中，对于多核苷酸的“序列同源性的％”是通过比较两个最佳排列的序列和比较区域来确认，与两个序列的最佳排列的参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较区域中的多核苷酸序列的一部分可以包含添加或缺失(即，缺口(gap))。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供包含本发明的Pvr4基因的重组载体。本发明的重组载体中，所述Pvr4基因优选可以由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多核苷酸序列组成。

本发明的说明书中，术语“重组”是指细胞复制异种核酸或表达所述核酸，或者表达由肽、异种肽或异种核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以将所述细胞在天然状态下没有被发现的基因或基因片段表达为正义(sense)或反义(antisense)形态中的一种。此外，重组细胞可以表达从天然状态的细胞中发现的基因，然而，所述基因是变形的，是通过人为手段重新导入细胞内的。

本发明的说明书中，术语“载体”是指传递到细胞内的DNA片段(们)、核酸分子时使用。载体可以复制DNA，可以独立地在宿主细胞中再生产。术语“转运体”通常与“载体”互换使用。术语“表达载体”是指如下的重组DNA分子，即，包含用于表达目标编码序列和特定宿主生物中可启动地连接的编码序列所必需的合适的核酸序列的重组DNA分子。大体上，可以使用能够在宿主内进行复制及稳定化的任意的质粒和载体。所述表达载体的重要特性为具有复制起点、启动子、标记基因及转译控制要素(translation control element)。真核细胞中可利用的作为转译控制要素的增强子(enhancer)、核糖体结合位点、终止信号、多腺苷酸化信号及启动子是本领域公知的。

本发明中的表达载体可以通过本领域常规的方法来构建。所述方法包括试管内重组DNA技术、DNA合成技术及体内重组技术等。为了引导mRNA合成，所述DNA序列可以有效地连接在表达载体内的适当的启动子上。此外，表达载体可以包含作为转译起始位点的核糖体结合位点及转录终止子。

本发明中重组载体的优选例为如下的Ti质粒载体，即，存在于如根癌农杆菌等适当的宿主中时，可以将其自身的一部分，所谓T区域转移到植物细胞中的Ti质粒载体。其他类型的Ti质粒载体(参见EP0116718B1号)是能够将植物细胞、或杂合DNA适当地插入植物的基因组内的能够生产新的植物的原生质体，目前用于转移杂合DNA序列。Ti质粒载体的最优选形态为如同EP0120516B1号及美国专利第4,940,838号中公开的所谓双元(binary)载体。本发明中的可利用于将DNA导入植物宿主中的其他适合的载体可以选自源自双链植物病毒(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV))及单链病毒、双生病毒等的病毒载体，例如，可以选自非完整性植物病毒载体。对于这种载体的使用而言，在难以适当地转化植物宿主时尤其有利。

本发明的重组载体中，启动子为适合转化的启动子，优选可以为CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、pEMU启动子、MAS启动子或组蛋白启动子，优选可以为CaMV35S启动子，但并不限定于此。

术语“启动子”是指始于结构基因的DNA上游的区域，是指为了开始转录而结合RNA聚合酶的DNA分子。“植物启动子”是指可以在植物细胞中开始转录的启动子。“组成型(constitutive)启动子”是指在大部分环境条件及发达状态或细胞分化下具有活性的启动子。由于转化体的选择可以在各个阶段通过各种组织来实现，因此本发明中优选可以为组成型启动子。因此，并不限制组成型启动子的选择可能性。

本发明的重组载体中，终止子可以使用常规的终止子，例如有胭脂碱合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmy1 A终止子、菜豆碱(phaseoline)终止子、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因的终止子等，但并不限定于此。关于终止子的必要性，通常已知为终止子区域会增加植物细胞中的基因转录的确定性及效率。因此，在本发明的内容中终止子的使用是非常优选的。

本发明的重组载体可以包含一种以上的选择性标记。所述标记为具有通常能够以化学方法来选择的特性的核酸序列，其相当于能够从非转化细胞中分辨转化细胞的所有基因。例如有草甘膦(glyphosate)或草丁膦(phosphinothricin)等除草剂抗性基因，卡那霉素、G418、博来霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐性基因，但并不限定于此。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供由所述重组载体转化的宿主细胞。本发明的能够稳定且连续地克隆及表达载体的宿主细胞可以使用本领域公知的任何宿主细胞，原核细胞的例为，如大肠杆菌(E.coli)JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110、枯草芽抱杆菌、苏云金芽胞杆菌等芽孢杆菌属菌株，以及鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌属等肠杆菌科菌株等。

将本发明的载体转化至真核细胞中时，作为宿主细胞可以利用酵母(酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae))、昆虫细胞、人细胞(例如，CHO细胞株(中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary))、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等。优选地，本发明中的宿主细胞为植物细胞。

就本发明的重组载体而言，宿主细胞为原核细胞时，可以通过CaCl₂方法、Hanahan方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166：557-580(1983))及电穿孔方法等搬运至宿主细胞内。此外，宿主细胞为真核细胞时，可以通过显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、DEAE-葡聚糖处理法及基因枪等将载体注入至宿主细胞内。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，增加植物体对马铃薯Y病毒属的抗性的方法，其包括如下步骤：将包含编码Pvr4蛋白质的基因的重组载体导入植物细胞中以进行转化，在转化植物细胞中使Pvr4基因过表达。

根据本发明的一个具体实施方式，本发明的基因可以包含以SEQ ID NO：1或SEQID NO：2表示的多核苷酸序列。此外，所述碱基序列的同源物包含在本发明的范围内。具体而言，所述基因可以包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多核苷酸序列分别具有80％以上的序列同源性，更优选具有85％以上的序列同源性，进一步优选具有90％以上的序列同源性，最优选具有95％以上的序列同源性的多核苷酸序列。

将本发明的载体转化至植物细胞中时，宿主细胞优选为辣椒属(Capsicum sp.)或茄属(Solanum sp.)植物细胞，更优选可以为辣椒细胞、马铃薯细胞、番茄细胞或茄子细胞，但并不限定于此。对所述植物细胞进行转化的方法如前所述。

本发明是利用所述Pvr4基因来增加植物细胞或植物体对马铃薯Y病毒属的抗性的方法，在制作本发明的说明书时，为了避免过度的记载，省略两者之间共同内容的记载。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，马铃薯Y病毒属抗性得到增加的转化植物体的制备方法，其包括如下步骤：(a)以重组载体对植物细胞进行转化，所述重组载体包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因；以及(b)由通过所述步骤(a)制备的转化的植物细胞再分化成转化的植物。

对所述植物细胞进行转化的方法如前所述，由所述转化的植物细胞再分化成转化植物的方法可以利用本领域公知的任意方法。

本发明是利用所述Pvr4基因来制备马铃薯Y病毒属抗性得到增加的转化植物体的方法，在制作本发明的说明书时，为了避免过度的记载，省略两者之间共同内容的记载。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供通过所述方法制备的对马铃薯Y病毒属的抗性得到增加的转化植物体及其转化种子。

优选地，本发明中对马铃薯Y病毒属的抗性得到增加的转化植物体是分类学上作为被马铃薯Y病毒属感染的宿主植物体(host)的茄科(Solanaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、豆科-蝶形花亚科(Leguminosae-Papilionoideae)、苋科(Amaranthaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、禾本科(Gramineae)，优选为茄科植物体。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供用于增加植物体的马铃薯Y病毒属抗性的组合物，其包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因，所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4由SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列相似性，并且具有马铃薯Y病毒属(potyvirus)抗性的氨基酸序列组成。

优选地，本发明包含对具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白质Pvr4进行编码的基因，并且将所述基因转化至植物中，从而能够增加植物体的马铃薯Y病毒属抗性。

本发明中利用对所述Pvr4蛋白质进行编码的基因，在制作本发明的说明书时，为了避免过度的记载，省略两者之间共同内容的记载。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供正向或反向引物(primer)，其由SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列中的10个以上的连续核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列组成。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供探针(probe)，其由SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的核苷酸序列中的10个以上的连续核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列组成。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供用于检测马铃薯Y病毒属抗性Pvr4基因的试剂盒，其包含：(i)正向或反向引物，其由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列中的10个以上的连续核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列组成；或者(ii)探针，其由SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列中的10个以上的连续核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列组成。

本说明书中使用的术语“引物”是指寡核苷酸，在诱导与核酸链(模板)互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合剂的存在，并且在适合的温度和pH的条件下，可以起到合成的起始点的作用。优选地，引物为脱氧核糖核苷酸，并且为单链。本发明中利用的引物可以包含自然(naturally occurring)dNMP(即，dAMP、dGMP、dCMP及dTMP)、变形核苷酸或非自然核苷酸。此外，引物还可以包含核糖核苷酸。就这种引物的设计来说，本领域技术人员可以参考上述的核苷酸序列容易地进行，例如，可以利用用于设计引物的程序(例：PRIMER 3程序)来进行。

引物应充分长，以使在聚合剂的存在下能够引发延长产物的合成。引物的合适的长度取决于多种因素，例如，取决于温度、应用领域及引物的来源(source)，并且例如由10个以上的核苷酸序列组成，优选由10～100个核苷酸序列组成，更优选由10～50个核苷酸序列组成，进一步优选由10～30个的核苷酸序列组成。术语“退火”或“引发”是指在模板核酸中并置(apposition)寡脱氧核苷酸或核酸，就所述并置而言，通过聚合酶使核苷酸进行聚合，从而在模板核酸或其的一部分形成互补的核酸分子。

本发明中利用的引物包含实质上与目标核酸序列互补的序列。术语“互补”是指在预定的退火或杂交条件下引物或探针以能够与目标核酸序列选择性地杂交的程度充分互补，包括实质上互补(substantially complementary)和完全互补(perfectlycomplementary)，优选是指完全互补。优选地，引物为脱氧核糖核苷酸，并且为单链。本发明中利用的引物可以包含自然(naturally occurring)dNMP(即，dAMP、dGMP、dCMP及dTMP)、变形核苷酸或非自然核苷酸。

本发明中使用的术语“探针(probe)”是包含实质上与目标核酸序列互补的序列的单链核酸分子。优选地，探针为脱氧核糖核苷酸，并且为单链。本发明中利用的探针可以包含自然(naturally occurring)dNMP(即，dAMP、dGMP、dCMP及dTMP)、变形核苷酸或非自然核苷酸。此外，探针也可以包含核糖核苷酸。就探针的长度而言，例如，由10个以上的核苷酸序列组成，优选由10～100个核苷酸序列组成，更优选由10～50个核苷酸序列组成，最优选由10～30个核苷酸序列组成。

本说明书中术语“杂交(hybridization)”是指两个单链核酸通过互补的碱基序列的配对(pairing)来形成双链体结构(duplex structure)。杂交可以在单链核酸序列之间的互补性完全匹配(perfect match)时进行，或者存在一部分错配(mismatch)碱基时也可以进行。杂交所需的互补性程度可根据杂交反应条件有所不同，尤其，可以通过温度来调节。

本发明的说明书中，术语“退火”和“杂交”没有差异，在本发明的说明书中混用。

本发明中，对引物及探针进行退火或杂交的方法可以通过本领域公知的杂交方法来进行。本发明中，适合的杂交条件可通过优化步骤以一系列过程来决定。为了在研究室中树立关于使用的流程，这种步骤是由本领域技术人员以一系列过程来进行。例如，温度、成分的浓度、杂交及反应时间、缓冲液成分及它们的pH及离子强度等条件是依赖于寡核苷酸的长度及GC量和目标核苷酸序列等多种因素。

根据本发明的优选的具体实施方案，产生可检测信号的标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或金属标记(例如，金)。

所述化学标记包含生物素。链霉亲和素(或亲和素(avidin))和生物素的结合特异性会产生显示目标核酸序列的间接信号。

所述酶标记包含碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、荧光素酶、细胞色素P450及辣根过氧化物酶。通过利用对所述酶标记的基质，能够获得显示目标核酸序列的信号。

本发明是能够与本发明的SEQ ID NO：1或与其互补的多核苷酸进行互补杂交的引物、探针或包含其的试剂盒，为了避免在本说明书中的过度的记载，省略与本发明共同的内容。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4的抗体。

本发明的说明书中，术语“抗体”是指单克隆抗体、多特异性(multispecific)抗体、人源抗体、人源化抗体、胳盤化抗体(camelised antibody)、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab)片段、二硫键Fvs(sdFv)及抗独特型(抗-Id)抗体，以及所述任意表位(epitope)结合片段。尤其，抗体包含免疫球蛋白分子和免疫学上有活性的免疫球蛋白分子片段，即，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以为任意种类(例：IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、分类(class)(例：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子类(sub class)。

本发明的抗体可通过如下方法来制备：通过常规的方法将本发明的基因克隆至表达载体中，从而获得Pvr4蛋白质，并从所获得的蛋白质以常规的方法来制备。其中还包含能够从所述蛋白质制备的一部分肽，本发明的一部分肽包含至少7个氨基酸，优选为9个氨基酸，更优选为12个以上的氨基酸。本发明的抗体的形态不受特别的限制，包含多克隆抗体、单克隆抗体，或者如果是具有抗原结合性的，则其的一部分也包含在本发明的抗体中，包含所有免疫球蛋白抗体。进而，本发明的抗体中也包含人源化抗体等特殊抗体。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供用于检测马铃薯Y病毒属抗性Pvr4蛋白质的试剂盒，其包含本发明的Pvr4蛋白质抗体。

本发明的试剂盒包含用于免疫分析的试剂盒。所述免疫分析包括放射性免疫分析、放射性免疫沉淀、免疫沉淀、ELISA(酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbentassay))、捕获ELISA、抑制或竞争分析、夹心(sandwich)分析、流式细胞分析(flowcytometry)、免疫荧光染色及免疫亲和纯化，但并不限定于此。

例如，本发明的试剂盒根据放射性免疫分析来进行时，可以利用以放射性同位素(例如，¹⁴C、¹²⁵I、³²P及³⁵S)表记的抗体(与所述标记特异性地结合的抗体)。

本发明中利用二次抗体时，与二次抗体结合的酶包含催化显色反应、荧光反应、发光反应或紫外线反应的酶，但并不限定于此，例如，包含碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶及细胞色素P450。

所述检测抗体具有产生可检测信号的标记物(label)。所述标记物包含化学物质(例如，生物素)、酶(碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶及细胞色素P450)、放射性物质(例如，¹⁴C、¹²⁵I、³²P及³⁵S)、荧光物质(例如，荧光素)、发光物质、化学发光物质(chemiluminescent)及FRET(荧光共振能量转移，fluorescence resonance energytransfer)，但并不限定于此。

本发明的用于检测马铃薯Y病毒属抗性Pvr4蛋白质的试剂盒可以制作成公知的多种类的试剂盒，例如，包含用于免疫分析(immunoassay)的试剂盒、基因扩增试剂盒，但并不限定于此。

根据本发明的另一个实施方式，本发明提供用于增加植物体的马铃薯Y病毒属抗性的基因的用途，所述基因对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码，其中所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4由SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列具有85％以上的序列相似性，并且具有马铃薯Y病毒属(potyvirus)抗性的氨基酸序列组成。

本发明是所述本发明中的具有抗性的蛋白质Pvr4和对其进行编码的基因的用途，为了避免本说明书过于复杂，省略两者之间共同内容的记载。

以下，通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的要点，本发明的范围并不限定于这些实施例，这对于本领域具有通常知识的技术人员来说是显而易见的。

实验材料及方法

植物体

作为PepMov抗性辣椒植物体的个体使用了CM334(Pvr4/Pvr4，TC06495，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)，作为易感性个体使用了ECW123R(pvr4/pvr4，新墨西哥大学(New Mexico University)，美国)和Jupiter(pvr4/pvr4，TC05533，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)。作为用于进行Pvr4基因的基于基因组的克隆(genome-based cloning)的手段，DNA分析应用及病毒抗性分析中使用了两种辣椒群体。第一次利用了在先行研究(Kim,Han et al.,TAG.2011,vol,122,1051-1058)中使用的ECW123R与CM334的回交杂交体BC1F3群体。第二次利用了杂交Jupiter和CM334而生成的F2群体。为了分析准确的表型，接种后保持1468个体1个月。对于这些植物体，在25℃下维持16小时的光条件和8小时的暗条件的周期来进行了栽培。

PepMoV、PepSMV、PVY的增殖及接种

为了使PepMoV中标记(tagged)有GFP(绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein))的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒增值，购买了感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的冷冻干燥形态的烟草组织，并在研钵中加入约5ml的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer；Phosphate buffered salts，Takara)，将所述烟草组织进行研磨破碎，并混合对植物组织诱导伤口的金刚砂(carborundum)(400目)，从而制备了接种液。在播种后栽培4～5周的本氏烟(Nicotianabenthamiana：N.benthamiana)或烟草(Nicotianatabaccum：N.tabaccum)的叶子上通过摩擦(rubbing)来接种在研钵中破碎的接种液(Lee et al.,Virusresearch,2011,vol.155,487-494)。通过相同的方法制备了感染PepSMV、PVY的烟草接种液。

进行感染后，经过14天后采集本氏烟(N.benthamiana)的上部叶子组织，并利用为接种液。病毒的接种液是通过如下方法制备：采集10g的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的本氏烟(N.benthamiana)并放入研钵中，添加30ml的磷酸盐缓冲溶液并进行破碎，从而先制备了3ml/g浓度的接种液。通过相同的方法制备了感染PepSMV、PVY的烟草接种液。播种405个体的Jupiter与CM334的F2杂交体和1063个体的通过CM334与ECW123R的回交的BC1F3，然后经过4～5周时，在辣椒的真叶上洒金刚砂(400目)来诱导伤口。然后将所述以3ml/g的浓度制备的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的接种液摩擦(rubbing)在全部1468个体的辣椒真叶上。

对于SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的感染与否，利用能够检测GFP的紫外线照射器(UVilluminator)和Agdia公司的DAS-ELISA(双抗体夹心酶联免疫吸附分析(double-antibodysandwich enzyme linked immunosorbent assay)；SRA 38000)来确认。

提取辣椒的核酸

接种PepMoV后经过14天时，摘取2片1cm长度的接种PepMoV的所述1468个体的辣椒(405个体的Jupiter与CM334的F2杂交体和1063个体的通过CM334与ECW123R的回交的BC1F3的植物体)的上部叶子的嫩叶，放入1.7ml的微量离心分离管中。装有植物体的微量离心分离管中放入两个4mm的不锈钢珠，并利用组织研磨机(Tissuelyser；莱驰公司(Retsch)，QIAGEN)变换方向的同时进行粉碎2分钟，然后加入600μl的60℃的CTAB核酸提取缓冲液(2％的CTAB；20mM的EDTA；100mM的Tris-Cl，pH为8.0；1.4M的NaCl)。再次加入0.5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Polyvinylpyrrolidone)、12.5μl的β-巯基乙醇后上下均匀混合，然后在65℃的恒温水槽中反应1～2小时。

反应结束后冷却一段时间，然后加入700μl的氯仿:异戊醇(24:1)溶液。在4℃下以12,000rpm进行离心分离15分钟，仅取上清液并放入新的微量离心分离管中。加入与上清液相同量的异丙醇，在-20℃下反应1～2小时。反应结束后，以4℃、12,000rpm进行离心分离10分钟后倒掉上清液。加入800μl的70％的乙醇，以4℃、12,000rpm进行离心分离10分钟后倒掉上清液。再次用70％的乙醇洗涤核酸沉淀物，然后在空气中干燥5小时。待干燥结束后，加入50μl的TE缓冲液(1mM的EDTA、10mM的Tris-Cl)和RNase(10U/μl)，在37℃下进行反应1小时。用分光光度计(ND-1000，Nanodrop技术有限公司)对核酸进行定量。

利用CAPS分子标记的基因型的决定

基因型的检查是利用PCR(聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction))设备来进行。PCR反应液由2X PCR PreMix(EmeraldAmp GT PCR Master Mix)、10uM的引物、50ng的模板核酸组成，并使其总体积达到20μl。PCR反应是在95℃下加热5分钟后重复40次循环(cycle)(95℃下30秒，58℃下30秒，72℃下1分钟)，然后在70℃下反应5分钟，并在4℃下进行保管。对于标记的分子标记，在10μl的PCR产物中加入0.5μl的限制酶MboI和2μl的限制酶缓冲液、7.5μl的DW，然后在37℃下反应4小时。将以限制酶处理的核酸产物加样(loading)于1.5％的琼脂糖凝胶中，然后进行电泳来确认了条带(band)。对于SNP61786分子标记，将有1000bp和550bp的条带的作为纯合(homo)抗性(R)，有500bp和350bp的条带的作为纯合易感性(S)，并且上面的4个条带为1000bp、550bp、500bp和350bp的作为杂合(hetero)抗性(H)，标记在凝胶照片上来进行区分。

(1)将对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒为抗性的CM334和易感性的Jupiter进行杂交的F2(405个体)，(2)将CM334与ECW123R进行杂交后所生成的F1个体再次与ECW123R进行回交的三世代BC1F3(1063个)的全部1468个体植物体上，以3ml/g浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草接种液进行摩擦(rubbing)来接种，然后调查表型，提取核酸并利用开发的SNP61786分子标记分析了基因型。BC1F3是指将CM334作为母本、ECW123R作为父本而获得的F1个体再次与ECW123R进行回交的个体进行三次自花授粉的个体。

用于基于基因组的克隆(Genome-based cloning)的基因组的比较

根据已报道的辣椒在番茄的基因组中形成良好的同线性(synteny)(Wu et al.,TAG,2009,vol.118,1279-1293)，以现有的番茄分子标记TG420为基准，确保了番茄10号染色体序列区域中位于端粒(telomere)方向的50Mb～60Mb的区域的序列，并将所确保的番茄的序列作为查询序列(query)分离了CM334的支架(scaffold)。对于确保的序列，利用生物信息学技术预测了位于支架上的基因的结构。

利用辣椒基因组文件(Pepper genome paper)的NBARC基因家族(gene family)信息，分析了在筛选的支架中预测的NBARC基因组(Kim et al.,Nat Genet,2014,vol.46,270-278)。在预测的NBARC基因的序列中开发了与Pvr4基因相关的SNP61786分子标记。

Pvr4候选基因的克隆

筛选了包含如下的SNP61786分子标记的支架，即，与SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的抗性和易感性以3:1的比例产生分离的1468个体的基因型的表型一致的SNP61786分子标记。筛选了2个支架，并利用生物信息学程序(FGENESH，Softberry公司)预测了位于支架内的8个基因的结构，考虑到起始密码子(start codon)和终止密码子(stop codon)，制作了能够分离整体基因(full gene)的引物。为了使Pvr4候选基因过表达，使用了具有花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)的35S启动子的pCAMBIA2300载体(可免费提供给研究人员的载体，并且是已被商用化的载体，购至澳大利亚的http：//www.cambia.org/daisy/cambia/653.html)，为了利用不依赖于连接反应的克隆(ligation independentcloning)，在5和3区域的引物中增加了adapter序列(Oh et al.,Mol Cells,2010,vol.30,557-562)：5'-CGACGACAAGACCCT(adapter序列)基因特异性序列(Gene specificsequence)-3'及5'-GAGGAGAAGAGCCCT(adapter序列)基因特异性序列序列-3'。

将扩增的PCR片段(fragment)进行纯化(purification)后，分别添加5～10μl的PCR产物(product)、1μl的T4DNA聚合酶(NEB)及1μl的10mM的dATP。加入蒸馏水，以使总体积达到20μl，并在22℃下反应30分钟，然后在70℃下反应20分钟。将以PstI处理的pCAMBIA2300载体进行纯化后，添加1μl的T4DNA聚合酶和1μl的10mM的dTTP。加入蒸馏水，以使总体积达到20μl，并在22℃下反应30分钟，然后在70℃下反应20分钟。

最后，加入5μl的具有黏性末端(sticky end)的PCR产物和3μl的载体进行混合，然后在常温下反应30分钟。然后，使用所制备的用于转化的载体对DH10b进行转化，然后在NICEM(首尔，韩国)进行测序(sequencing)。确认序列后，为了在植物体中的过表达实验，对C58C1的农杆菌进行转化。

Pvr4基因与SP6PepMoV-Vb1/GFP、PepSMV、PVY的NIb的相互作用

在具有Pvr4基因的辣椒CM334中通过农杆菌浸润SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(NIb)时，会诱导过敏反应(HR，hypersensitive response)-相似细胞凋亡(cell death)，基于此将筛选的8个Pvr4候选基因与SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb一起同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)的叶子中。

将Pvr4候选基因和转化有SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb的农杆菌C58C1分别培养2天并进行离心分离，然后在由10mM的MgCl₂、10mM的MES(pH为5.6)及200μM的乙酰丁香酮(Acetosyringone)组成的缓冲液中混合两个细胞，以使光学浓度(OD)值分别达到1.0和0.5，然后进行悬浮。在常温下培养2小时，从而增加病原性，然后同时浸润(co-infiltrate)于生长4～5周的Jupiter或本氏烟(N.benthamiana)叶子。同时浸润后，经过2～3天后观察了细胞坏死反应。以相同的方法，使Pvr4基因和SP6PepMoV-Vb1/GFP、PepSMV、PVY的NIb的光学浓度(OD，optical density)值分别为1.0和0.5，并与根癌农杆菌(A.tumefaciens)C58C1一起同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)叶子中。作为阴性对照组，将搬运空载体(Emptyvector)pCAMBIA2300的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1、搬运NIbs(表达包含ATG的成熟形态的蛋白质)的根癌农杆菌(A.tumefaciens)C58C1分别浸润于本氏烟(N.benthamiana)的左侧部分。作为阳性对照组(Positive control)，使用了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)分泌的毒素(toxin)NIP(Qutob et al,Plant J,2002,vol.32,361-373)。此外，已报道有同时浸润马铃薯致病疫霉的抗性基因R3a(OD₆₀₀：0.5)和马铃薯致病疫霉分泌的RxLR效应分子Avr3a(无毒蛋白(Avirulence protein)3a；OD₆₀₀：0.3)时，会产生细胞坏死反应(Jorunn et al.,Plant J,2006,vol.48,165-176)，以此为根据，为了用作抗性基因与病原菌的分泌蛋白质之间的相互作用所引起的阳性对照组，利用农杆菌进行同时浸润。在100％的乙醇(EtOH)中加入烟草或辣椒叶而去除叶绿素，然后可用肉眼确认细胞坏死。

对马铃薯Y病毒属的Pvr4基因的抗性

为了在植物中诱导过表达，所筛选的8个Pvr4基因转化至农杆菌C58C1中，在YEP液体培养基中培养1天，然后通过离心分离将农杆菌分离成微球(Pellet)形状。将由10mM的MgCl₂、10mM的MES(pH为5.6)及200μM的乙酰丁香酮(Acetosyringone)组成的缓冲液添加到装有已去除YEP液体培养基的微球的管中进行稀释，以使OD值达到1.0。在常温下培养2小时，从而增加病原性，然后浸润于生长4～5周的本氏烟(N.benthamiana)叶子。

经过1天后，在Pvr4基因过表达的叶子上，以3g/ml的浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草接种液进行摩擦(rubbing)。接种后，在第1、2、3、4及5天时，从接种叶子中采集5个叶片(disc)后，利用ELISA反应和能够检测病毒的VPg的引物，通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)确认了PepMoV的增殖。

以相同的方法，利用农杆菌将8个Pvr4基因浸润于生长4～5周的本氏烟(N.benthamiana)叶子，然后经过1天时，以3g/ml的浓度的PVY-O或PepSMV进行摩擦(rubbing)。接种后，在第1、2、3、4、5及6天时，从接种叶子中采集5个叶片，并进行ELISA反应。

作为另一个抗性反应的实验，将分别感染SP6PepMoV-Vb1/GFP、PVY-O及PepSMV的烟草接种液以3g/ml的浓度在本氏烟(N.benthamiana)的叶子上进行摩擦(rubbing)，然后经过2天时，在叶子的左侧浸润(infiltrate)空载体(Empty vector)，在右侧叶子中利用农杆菌浸润Pvr4基因。对空载体和包含Pvr4基因的农杆菌进行稀释，以使OD值达到1.0，然后进行浸润。接种后的第3～4天开始可以观察到细胞坏死，加入到100％的乙醇中去除叶绿素后用肉眼确认。

总RNA分离

从接种SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的本氏烟(N.benthamiana)的植物体(Pvr4基因)、易感性辣椒ECW中分离的pvr4基因(Pvr4的易感等位基因(susceptible allele))和空载体(Empty vector)分别转化至农杆菌中并进行浸润，然后1天后在过表达的叶子上摩擦(rubbing)将SP6PepMoV-Vb1/GFP制成3ml/g浓度的烟草接种液，从而在感染的本氏烟(N.benthamiana)植物体的接种叶子中采集5个叶片，并利用TRIzol(英杰公司(Invitrogen))来分离总RNA。为了进行RT PCR(实时聚合酶链式反应(real-time PCR))，用Superscript逆转录酶(Superscript reverse transcriptase；英杰公司(Invitrogen))，以3μg的总RNA作为模板，合成第一链(First)cDNA。将合成的cDNA作为模板，利用能够检测SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的VPg的引物来进行RT PCR。

RT PCR是以利用SYBR Green(英杰公司(Invitrogen))的Rotor-Gene 6000(Qiagen)来进行。为了测定病毒的增殖量，以本氏烟(N.benthamiana)或马铃薯(Solanumtuberosum)的肌动蛋白(actin)为基准进行了定量化。

实施例1：对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的Pvr4基因的抗性测试

如果Pvr4基因是对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的抗性基因，则Pvr4基因过表达时，SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的增殖应得到抑制。因此，为了确认CM334显示的抗性是否会因单显性抗性Pvr4基因而对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒显示抗性，利用农杆菌将单显性抗性基因Pvr4、易感等位基因pvr4及空载体分别浸润(OD₆₀₀为1.0)于易感性本氏烟(N.benthamiana)中，并通过花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)35S启动子临时进行过表达，然后在经过1天时，在同样的叶子上摩擦(rubbing)3ml/g的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草接种液。接种后，在第1、2、3、4及5天时，从接种叶子中分别采集5个叶片，并利用Agdia公司的ELISA(SRA 38000)来进行。SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的增殖是使用能够检测SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的外壳蛋白(coat protein)的抗体来进行ELISA(SRA 38000)。接种后，在第4天时，病毒增殖的抑制程度最高，抗性维持至第5天。为了确认在RNA转录水平上是否也能够诱导相同的抗性，在同一时期采集的相同量的接种叶子中分离总RNA，合成了cDNA，并以能够检测SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的VPg的引物来进行实时聚合酶链式反应(real-time PCR，RT PCR)。

Pvr4基因在接种后的第4天对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒显示出最大的抗性。在ELISA和RT PCR结果中，Pvr4的抗性均在接种后的第4天显示为最有效。结论为，这个实验结果可以作为如下证据，即，鉴定的Pvr4基因仅通过在本氏烟(N.benthamiana)中的单独表达也能够抑制SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的增殖，从而诱导抗性(图1)。

实施例2：对多种类的马铃薯Y病毒属的Pvr4基因的抗性测试

为了确认Pvr4基因实际上是否能够抑制除SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒以外的其他马铃薯Y病毒属的增殖，利用农杆菌将单显性抗性基因Pvr4、易感等位基因pvr4及空载体(Empty vector)分别浸润(OD₆₀₀为1.0)于易感性本氏烟(N.benthamiana)中，并通过花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)35S启动子临时进行过表达，然后在经过1天时，在同样的叶子上摩擦(rubbing)3ml/g浓度的分别感染PepSMV、PVY的烟草接种液。接种后，在第1、2、3、4、5及6天时，分别采集5个叶片，并利用Agdia公司的ELISA(PepSMV：SRA27200，PVY：SRA 20600)来进行。

在ELISA的结果中，Pvr4基因的抗性是在接种后的3天以后开始显示为最有效。PVY的增殖是使用了利用能够检测PVY的外壳蛋白(coat protein)的抗体的ELISA(SRA20600)，观察到Pvr4基因抑制PVY的增殖直到接种后的第6天。就PepSMV的增殖而言，由于能够特异性地检测PepSMV的抗体还没有商用化，因此使用了能够广泛地检测马铃薯Y病毒属外壳蛋白(potyvirus coat protein)的ELISA(PepSMV：SRA 27200)。

观察到对PepSMV增殖的抑制相对少的理由被推断为是为了检测PepSMV而使用了特异性差的抗体。尽管如此，从第4天开始也能够确认PepSMV的增殖得到抑制。结论为，可作为如下证据：Pvr4基因不仅诱导对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的抗性，而且如同现有的具有Pvr4基因的辣椒显示出的抗性，还诱导对PepSMV和PVY的抗性。因此，推断如下内容：开发由Pvr4基因转化的作物时，不仅是辣椒，而且在如马铃薯和番茄等超出分类学的种类(species)的作物中也能够由Pvr4基因来诱导对PepMoV、PepSMV和PVY的马铃薯Y病毒属抗性(图2)。

实施例3：由Pvr4基因转化的马铃薯(Solanum tuberosum)对PVY的抗性测试

根据所述实施例1及2的结果，为了确认由Pvr4基因转化的马铃薯(Solanumtuberosum)感染PVY时实际上是否会显示抗性，开发了通过花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaic virus)(CaMV)35S启动子来过表达Pvr4基因的马铃薯转化体。将Pvr4基因转化至对PVY显示易感性的马铃薯Daeji(S.tuberosum spp.Daeji)品种中，并在驯化后经过4～5周时，在马铃薯的真叶上以3ml/g浓度的感染PVY的烟草组织的接种液进行摩擦(rubbing)，从而进行接种。作为阳性对照组，使用了用作接种液的本氏烟(N.benthamiana)，作为阴性对照组，使用了没有接种病毒的马铃薯Daeji(S.tuberosum spp.Daeji)。作为转化体的阳性对照组，使用了空载体(Empty vector)转化至马铃薯Daeji(S.tuberosum spp.Daeji)中的个体和具有与Pvr4基因相似性高的序列的NBARC575基因转化至马铃薯Daeji(S.tuberosumspp.Daeji)中的个体。

基因的转化与否是通过如下方法来确认：提取马铃薯的总RNA并合成cDNA，然后利用能够分别检测Pvr4基因和NBARC575基因的引物来进行RT-PCR。为了定量，使用了马铃薯的肌动蛋白。PVY接种后经过一个月时，分别采集5个上部叶子的叶片，并使用了Agdia公司的PVY检测ELISA(PVY：SRA 20600)。只有在由Pvr4基因转化的马铃薯中确认了与阴性对照组相似程度的病毒增殖。利用能够检测PVY的VPg的引物进行了RT-PCR。并确认了只有在用作阴性对照组的马铃薯和由Pvr4基因转化的马铃薯中没有检测到PVY的增殖(图3)。

该结果可以作为如下证据，即，不仅在辣椒或烟草中，而且在异种植物马铃薯中，Pvr4基因的过表达也诱导对PVY的抗性。这表示在Pvr4基因过表达的转化体，即，在马铃薯或番茄等中也能够确保对马铃薯Y病毒属具有抗性的个体。通过利用分子标记的培育也能够开发抗性品种，但具有所需时间长且会同时导入不需要的性状的缺点。此外，作为对多种类马铃薯Y病毒属的抗性基因来分离的只有Pvr4基因，并且只存在于辣椒中，因此，以传统培育是不可能在不能杂交的马铃薯或番茄等作物中导入Pvr4基因。因此，将强且持续的抗性基因Pvr4基因转化至由马铃薯Y病毒属引起的损害较大的马铃薯或番茄中，从而在短时间内有效地开发抗性品种，则能够预期作物生产量会增加，由此在经济方面能够获得很多利益。

实施例4：Pvr4基因的原位转化(in planta)功能分析

为了在4个Pvr4候选基因中鉴定Pvr4基因，利用农杆菌C58C1分别将之前研究中已知为Pvr4的效应分子(effector)的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的NIb(RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase))(OD₆₀₀为0.5)与Pvr4候选基因(OD₆₀₀为1.0)同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)中。其结果，确认了只有具有图3的结构的候选基因在与SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的NIb同时浸润时，在第3天产生过敏反应(hypersensitiveresponse：HR)。确认了不仅在本氏烟(N.benthamiana)叶子，而且在易感性辣椒Jupiter的叶子，利用农杆菌C58C1同时浸润Pvr4基因(OD₆₀₀为1.0)和SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb(OD₆₀₀为0.5)也产生过敏反应。

作为阳性对照组使用了两组(set)。第一次是同时浸润马铃薯致病疫霉的抗性基因R3a和马铃薯致病疫霉分泌的Avr3a，第二次是浸润了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)分泌的毒素(toxin)。作为阴性对照组，浸润了从易感性辣椒中分离的pvr4基因。已知，如用作阳性对照组的例子，将植物的抗性基因(例：马铃薯致病疫霉的抗性基因，R3a)和病原菌的效应分子(例：马铃薯致病疫霉的效应分子，Avr3a)同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)中时，会产生过敏反应。核苷酸结合位点亮氨酸富集重复(Nucleotide-binding siteleucine rich repeat，NBSLRR)类型的抗性基因识别效应分子而产生过敏反应是基于Flor的基因对基因(gene-for-gene)的假设(Flor,Annual reviews,1971)，已知这种识别关系会诱导抗性。结论为，可以推断出Pvr4基因识别SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb，从而产生过敏反应，并由此诱导抗性(图4)。

实施例5：Pvr4基因与马铃薯Y病毒属的NIb的原位转化(in planta)表达分析

根据实施例3的实验结果，树立了Pvr4基因所显示出的广谱抗性是通过识别马铃薯Y病毒属的NIb而被诱导的假设。因此，为了确认Pvr4基因是否识别不显示毒性的马铃薯Y病毒属的NIb而诱导过敏反应，利用农杆菌将PepSMV或PVY的NIb和Pvr4基因同时浸润于本氏烟(N.benthamiana)中。实验结果，可以确认Pvr4基因只有在显示抗性的病毒的NIb同时浸润时，才会产生过敏反应。Pvr4基因不仅对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒显示抗性，而且还对PepSMV和PVY显示抗性，但对TEV不会显示抗性(Janzac et al.,Plant Pathol.2009,vol.58,443-449)。对Pvr4基因显示易感性的TEV的NIb和Pvr4基因同时浸润的情况下，没有观察到过敏反应。这种结果能够支持广谱的马铃薯Y病毒属的NIb通过与Pvr4基因的相互作用来介导抗性的假设(图5)。

实施例6：对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒显示抗性的CM334辣椒和显示易感性的ECW、Jupiter和烟草(N.tabaccum)

为了确认对PepMoV的抗性，在CM334(TC06495，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)、ECW(TC06444，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)及Jupiter(TC05533，农业遗传资源信息中心，农村振兴厅，大韩民国)上摩擦(rubbing)3ml/g的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草接种液，所述SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒是PepMoV的基因组中插入作为荧光蛋白质的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，从而能够在紫外光(UV light)下通过荧光来确认PepMoV增殖的病毒(Lee,Song et al.,Virus research,2011,vol.155,487-494)。使辣椒发芽并经过约4～5周后，将3ml/g浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草组织的接种液接种于辣椒的真叶上。接种后，经过14天后在易感性个体的上部叶子观察到斑点(mottling)病状。CM334具有Pvr4基因，从而抑制SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的增殖，因此在上部叶子显示出ER(完全抗性(extreme resistance))。由于易感性辣椒ECW和Jupiter没有抗性基因Pvr4基因，因此显示出上部叶子的颜色不规则的斑点(mottling)现象(图6的A)。

实验中使用的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒具有如下优点，即，由于在病毒的基因组内插入了GFP，从而SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒增殖时，能够在UV光下观察GFP的表达。因此，为了用作用于确认SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的增殖的接种液，在烟草(N.tabaccum)中接种SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒并在UV光下观察的结果，在上部叶子中能够观察到作为SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒增殖的证据的GFP。这种GFP的表达在辨别辣椒的SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒抗性时，提供了实验的便利性。(图6的B)。

实施例7：分别杂交抗性辣椒CM334和易感性辣椒ECW123R和Jupiter来制备的群体对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的遗传学分析

为了开发与Pvr4基因最密切相关的分子标记，使用了两个群体。作为抗性个体使用了CM334，作为易感性个体使用了ECW123R和Jupiter。作为第一群体，在BC1F3的1063个体的各个真叶上以3ml/g浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草组织的接种液进行摩擦(rubbing)的结果，确认了抗性和易感性的分离个体数分别为812:251，显示出3:1的分离比，其中所述BC1F3是CM334与ECW123R的杂交体F1个体和易感性个体进行回交而获得的(表1)。

此外，以Jupiter作为母本、CM334作为父本进行杂交获得的F1对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒显示出抗性，这表示抗性基因为显性基因。在F1杂交体进行自花授粉而获得的405个体的F2群体上，通过相同的方法以3ml/g浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒的烟草组织的接种液进行摩擦(rubbing)的结果，确认了抗性和易感性的分离个体数为309:96，显示出3:1的分离比。这种分离比表示对SP6PepMoV-Vb1/GFP的抗性是根据孟德尔的遗传定律由单显性抗性基因来诱导。该结果显示出与如下的现有报道相同的结果，即，具有Pvr4基因的CM334与对包括PVY在内的马铃薯Y病毒属(potyvirus)显示易感性的RNaky或ECW进行杂交而获得的F1杂交体显示抗性，在F1进行自花授粉而获得的F2个体中，因单显性抗性基因，显示抗性的分离比为3(抗性):1(易感性)(Dogimont et al.,Euphytica,1996,vol.88,231-239；Boiteux et al.,Euphytica,1996,vol.87,53-58)。因此，可以知道在此实验中使用的辣椒的杂交群体是适合用于开发分子标记或鉴定Pvr4基因的实验材料。此外，通过卡方(chi-square)检验，能够确认分离比为3:1，在统计上的预期值与实测值是相同的(表1)。BC1F3是指将CM334作为母本、ECW123R作为父本而获得的F1个体再次与ECW123R回交的个体进行三次自花授粉的个体。此外，预期比例(Expected ratio)是指由单显性抗性基因诱导对病毒的抗性时所产生的分离比的预期比例，观察频率(Observed frequency)是指在各个辣椒群体中接种PepMoV病毒后通过ELISA显示的实验结果。R是指显示抗性表型(resistance phenotype)的个体，S是指显示易感性表型(Susceptible phenotype)的个体。为了示出预期比例(Expected ratio)和观察频率(Observed frequency)是否在统计学上具有显著性的结果，进行了卡方检验，而这就是X²。最后检验了卡方检验是否基于P值(Pvalue)而显示出显著比例。

表1

实施例8：用于分离Pvr4基因的BC1F3的32个体的基因型分析结果

辣椒和番茄是属于茄科的作物，染色体之间的同线性(synteny)保存完好。在现有的很多论文和之前的实验中报道，12个染色体中，马铃薯Y病毒属抗性基因Pvr4在10号染色体的端粒区域中位于番茄的TG420分子标记附近(Wu,Eannetta et al.,TAG,2009,vol.118,1279-1293；Kim,Han et al.,TAG.2011,vol.122,1051-1058)。包含TG420的区域在番茄和辣椒的序列水平上保存完好，基于此在10号染色体的87Mb的整体区域中分离了50～60Mb的一部分序列。对于包含TG420分子标记的一定区域的序列，通过将CM334的支架序列作为查询序列(query)的Blast，分离了同一性(identity)高的支架。利用FGENESH程序，在分离的序列中预测了基因，并在基因的外显子区域中制作了引物，将CM334和Jupiter的gDNA作为模板进行了PCR。通过测序确认了PCR产物的SNP及插入缺失(Indel)，并利用序列的差异开发了与Pvr4基因共分离的SNP61786分子标记(图7)。

SNP61786分子标记使用于实施例6的两个群体时，对1468个辣椒个体显示出表型与基因型一致的0cM。以共显性(Co-dominant)分子标记进行PCR扩增后以MboI限制酶处理时，抗性(R)显示1000bp和550bp的条带，易感性(S)显示500bp和350bp的条带，杂合(H)显示所有4种类的条带(1000bp、550bp、500bp和350bp)。结果可以确认，Pvr4基因位于SNP61786分子标记所在的CM334的支架区域中。将SNP61786分子标记使用于马铃薯Y病毒属抗性品种的培育时，能够更准确且快速确认Pvr4基因，从而能够在产业上用于缩短培育过程(图7)。

实施例9：在辣椒的10号染色体中示出Pvr4基因区域的遗传学或物理距离的模式图

与Pvr4基因相关的31个分子标记中，作为与Pvr4基因最接近的位置的分子标记筛选了SNP20172、SNP575、SNP61786、SNP1072、SNP1983，并确保包含分子标记的支架的核苷酸序列，然后通过FGENESH预测基因。据报道，通常植物的抗性基因具有核苷酸结合位点(NBS，nucleotide-binding site)和亮氨酸富集重复(LRR，leucine-rich repeat)的结构(Moffett,Advances in virus research,2009,vol.75,1-33,228-229)。马铃薯X病毒(Potato virus X)的抗性基因Rx是在N-末端上具有卷曲螺旋(CC，coiled-coil)域的NBSLRR结构的基因，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的抗性基因Bs2也具有CC-NBS-LRR结构，烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)的抗性基因N是N-末端上具有TIR(Toll/白介素1受体样(Toll/interleukin-1receptor-like))域的NBSLRR基因(Kang etal.,Annu.Rev.Phytopathol,2005,vol.43,581-621；Moffett,Advances in virusresearch,2009,vol.75,1-33,228-229)。

因此，推断Pvr4基因也具有NBS-LRR结构，并寻找位于该区域的NBLRR基因的结果，分析出存在8个NBLRR基因。该区域的8个Pvr4抗性候选基因通过NBARC的核苷酸同源性比较被分为两组，推断以NBSLRR基因重复(duplication)的形态存在。具有抗性基因所需的所有必要结构的NBSLRR基因是以端部为方形的箭头来表示，分析为4个基因具有完整的结构。此外，筛选包含该区域的BAC，确认了基因的信息。以红色表示的箭头是表示Pvr4基因，并示出Pvr4基因的结构是由7个外显子和6个内含子组成(图8)。表示易感等位基因pvr4基因是由6个外显子和5个内含子组成的基因(图8)。

实施例10：Pvr4基因的碱基序列及结构特异性

从通过上述实验鉴定的CM334中分离的Pvr4基因为卷曲螺旋-核苷酸结合位点-亮氨酸富集重复(coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat，CC-NBS-LRR)型，共具有5238个核苷酸(nucleotide)的ORF(开放阅读框(open reading frame))序列，并包含1745个氨基酸序列。对马铃薯Y病毒属显示易感性的辣椒ECW(C.annuum cv.ECW)中以Pvr4基因的易感等位基因鉴定的pvr4基因具有4806个核苷酸的ORF序列，并包含1601个氨基酸序列(图9a)。对Pvr4基因和pvr4基因的多核苷酸整体序列进行比较分析的结果，显示95％的同源性，易感等位基因pvr4显示为缺失432个核苷酸。图9b中，对Pvr4基因和pvr4基因的氨基酸整体序列进行比较分析的结果，N-末端的CC域和NBS域(1～600氨基酸区域)显示出98％以上的同源性，但在氨基酸序列的c-末端(c-terminal)区域(始于GFKLQDDFFDGMSEL的氨基酸序列至终止密码子区域的1205个氨基酸)显示出85％以上的序列相似性(图12)。因此，能够推断对PepMoV的抗性是由Pvr4基因的LRR域来诱导。这是再次确认如下的现有报道的结果，即，抗性基因的LRR域识别病原菌的效应分子(effector)，从而介导过敏反应或抗性(图9a～9b)。

实施例11：Pvr4基因的基因组(genomic)的DNA结构

通过CM334的支架和BAC文库筛选(Library Screening)能够确保包含内含子的Pvr4基因的整体核苷酸序列。Pvr4基因由7个外显子和6个内含子组成，并且是具有整体13870bp的核苷酸的大尺寸的抗性基因(图10a)。包含CC-NBS的外显子1具有2673bp的核苷酸，除最后两个外显子之外的外显子2至外显子5的4个外显子相互间的同源性显示为94％(图10b)。此外，内含子区域中，除了第一个内含子1之外，内含子2至内含子5的4个内含子相互间的同源性显示为99％(图10c)。预测为外显子2和内含子2作为一个重复单元串联重复(tandem duplication)4次的结构。到目前为止还没有关于这种抗性基因结构的报道，并且由于显示高同源性的重复性，认为通过PCR来分离基因组(genomic)DNA是在技术上无法实现的部分。推断为由于这种结构特异性，Pvr4基因诱导对马铃薯Y病毒属的各种病毒的广谱抗性(图10a～10c)。

实施例12：对马铃薯Y病毒属的Pvr4基因的抗性测试

为了确认Pvr4基因不仅在与马铃薯Y病毒属的NIb以1:1同时过表达的情况下，而且在接种病毒的情况下是否也会产生过敏反应，在本氏烟(N.benthamiana)上以3ml/g浓度的感染SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒、PepSMV和PVY的烟草组织的接种液进行摩擦(rubbing)，然后经过2天时，在左侧利用农杆菌浸润空载体，在右侧浸润Pvr4基因，从而进行过表达。摩擦(rubbing)后经过3天后，可以确认在分别接种SP6PepMoV-Vb1/GFP、PepSMV和PVY的所有叶子的Pvr4基因过表达的右侧区域中诱导了过敏反应。该结果与在本氏烟(N.benthamiana)中使Pvr4基因和马铃薯Y病毒属的NIb同时过表达时所诱导的过敏反应相似。通过病毒的接种来诱导的过敏反应表示因Pvr4基因病毒的增殖得到抑制，并确认了Pvr4基因在体内(invivo)对SP6PepMoV-Vb1/GFP病毒、PepSMV及PVY显示出抗性(图11)。

实施例13：对马铃薯Y病毒属显示抗性的Pvr4和易感等位基因pvr4的氨基酸序列的差异

位于源自CM334的马铃薯Y病毒属抗性基因Pvr4编码的氨基酸序列的c-末端(c-terminal)的1205个氨基酸(相当于SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第541～1745位序列)和位于源自ECW的易感等位基因pvr4基因编码的氨基酸序列的c-末端(c-terminal)的1062个氨基酸进行比较的结果。利用NCBI(美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information))的Blast程序对Pvr4氨基酸和pvr4氨基酸的序列进行比较的结果，分析出两个蛋白质的相似度为85％(图12)。在决定马铃薯Y病毒属抗性功能所需的重要的氨基酸位置及序列的方面，两个蛋白质的氨基酸序列差异提供重要信息。

序列表

<110> 首尔大学校产学协力团

<120> 具有马铃薯Y病毒属抗性的Pvr4基因及其用途

<130> KHP172111219.5

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13870

<212> DNA

<213> 辣椒CM334(Capsicum annuum cv. CM334)

<400> 1

atggaaatcg taactgctat tttgagccca gtcgcagaac acttgatgat actgccagtt 60

gcgcgacaga ttggatattt gttttactat aggcgcaaca tcaggtcttt ggaaaatgaa 120

aataagaagc tggagggtat cagaagcggg gtgcagcaca gaaaggatgc tgaatggaga 180

aacttacaag tcatgccacc ccatgtcgag aattggttaa aggatgttaa tgaaactact 240

gctgaggtgg cggttttact acgacgtaga gctgaggttg aaagaggttg cttctacggt 300

tggtgtccaa acttgaagtc acgtcactcg ctgagcagga aagctaagaa aattgaacag 360

gctatgattg gtcttcaaga tgaaggcaca cgttatgctc cttcctcctg tccagcacca 420

cttgcagtta cagtgataca cagtgatgag tttgactcta gaaaacagaa ggaggaagag 480

gtcatgacag ctttgaaaga tgaggggatc actattgttg ggatatgtgg tatgggtggt 540

gttggtaaaa caacactggc tgagaaagta agagcaaggg caaaacaaga aaggttgttt 600

gattatgttg ttgtgctaac tatcagtcaa caacaaccag acattaaaaa aatacagcgc 660

gagatcgccg aaggagtcgg tctatcatta gagggggacg atttgttgga gcgtggagat 720

cggctgcgtt caaggttaat gcagaaggac agtcgcgtcc ttgtaatttt ggatgatgtt 780

tggaagaagg ttgatctaaa gagggttgga attcccagtg gtagcgatcg caactactgg 840

tgcaaagtga tattgacgac gcgtctccga gatgtttgtg acgatatgga ggctaaaaag 900

aaagtacatg ttgaaatctt atgtgaaaat gaagcatggc tcctttttag gcagaaagcc 960

ggtaattcag ctgatgatct ctctcttcct gatatagcag aagccgttgc caaagaatgc 1020

aaggggctgc cacttgcaat tgttactgtt gcaggagcac taaagggtaa aaccaagcgt 1080

tcatgggagg atgccctttt agaattaaaa aaagcagcac caagaaatat tcgaggagtg 1140

cttgcagatg tgtatcaacc tctgaagata agctataatc acttagggag tgatgaagcc 1200

aaggatgcct ttttgctttg ttccttgttt gaggaagata gtaatatttg gactgaagaa 1260

ttacttagat acggaatggg gcttggcatc ttttcggaac tcgaaaattt agaatgtgca 1320

agaaataggg tgtctaatct gttagaaaca ttgaaaaatt gtttcttgtt atcccaagtt 1380

ccaggcaaag attatgtcaa aatgcatgat gtggtccggg acatggctat acatattgca 1440

tctgagggta accatatttt tttggtgagc cacaatgtga actcaaaaga gttcccaaga 1500

aaagactctt acaagcaata cagtcatatg tcaattgttg caaataaatt tgatgcgcgt 1560

cccagaccaa tatcttgccc acgattgaag cttctgatgt taaaactccg tttcgaagag 1620

ggtttcaaat tacaggatga tttttttgat ggaatgagtg aactcagtgt cataaaactg 1680

agtggatatg atcgaaactc cattctgccc tttccatcat ccattcagag gttgtcaaat 1740

ctgagcacgc tttggctgag taatctaagg ttggatgacg tgtccattat tggggaactt 1800

gtcactttag aaattctcag catcagaggt tctgacttac aggagcttcc agtggagatc 1860

ggaaacttgg ccaatctaac tatgttagag tattggaata ctggttacag aaaccgtatg 1920

aggatttcac caggggtctt atcaagacta gttcgattgg aggaactaca tatggtggga 1980

gtagaagatt gtagttactc caccttgagg gagctggaat cgttatcgag attgactgca 2040

ctgacattag atggatgttc caaagatgtg atttacagta acttgggcct ttcctccaag 2100

ttgacacggt acgctcttaa aatgggtaga cactacacgt ttacttcatt catgcaaact 2160

tacaacaagg ctatctatct agacgtcacc aagggcaccc cattgggtga ttggatccgc 2220

ctcctgttga ggaatagcga atgtgtaagt tcaagcggaa aggggtccaa gaatgtagtg 2280

ttcgagttgc agaatgtgaa agatctcagg ctgtcttttt gtgattcatt gaatatccac 2340

tgtcagaata atattccatt ccccaaactt gaaaggctga aagtaaatgg gtgtgatcat 2400

ctacggcatc ttttttgtgt gtccttggct tgccctgatg aggggacctc tcgaaggaca 2460

cacatcagac ctgacgtaat caagttcccc aatttatatt acttggaact gggatttctg 2520

aaatgcttca cacacttttt cagtgacacc gttgagggca ttgagttccc tctgttacgg 2580

aaaatgcatt tctggagttt acaaaagttc caaaatttct ggcctagagt caacaatgct 2640

atcaccgact caaatcctct ttttaatgaa aaggtttgct tctacacgaa taagttttta 2700

tttgaagggg ttttatgaat taacatttta gctttaactt gagcaatcat atttataaga 2760

tgttattctc tttgttcaaa cttttgtaat attgataatt aattgggggt gacataataa 2820

aattacgatt gaagcagcaa atgatacatg tcttaaatta tttataataa ctaattagaa 2880

gtgatgtagc aaaattactt taaaaaatac ttgtggaaaa ataattaagt gggcgccata 2940

taagacaggt ttgacattaa attttattaa ttttttaata cttagatgac tttataataa 3000

gtttttaata ttaaattttt taatacttaa atgaattgta ataattaatt aggggtgata 3060

gtaaaattat ggttgaagca gatatgtcaa aaatgtttat tttacttttt caattaaata 3120

ttaataattt tctaattcgt caatgctatg taataattaa ttaggattga tatagaaaaa 3180

tcatggagca agcaactgaa tggtcgacaa gcaggacgac tagaagctgc tcactccctt 3240

ttataatata agagaatgcc tattttttaa attatataca acaacatacc tagttcttta 3300

tcgtattttt tttaattgta attaataaaa catttttcaa cttataattt gaaattctat 3360

tgaagtacaa tagagtagcc gttgtcaata tttttaatgc gtgattagag agactgtgtg 3420

tacatgggac ttttttgatc ttatgtcaca tgaacattat ttcaatctta attttatgga 3480

gttacaaata aagttttaat aaatctataa aagtttagtg gtaactggca aattgacaaa 3540

tacatatata ctgttaaaca catagtagtt attattttaa gtctaacaat aactttgcaa 3600

tgatgtacgt attcaaactt gaccaaattt taaaataata tataaaagtc attaaaaacc 3660

caaaaactaa taaactttgt tcaattttaa aaattaccga taattcatca tctcaaattc 3720

gaagaacata tcttgaaata tgaatatgag tttgaaagaa caaatgaatt gatacttttc 3780

accctctttt tgatgaaaag gtgtatttct actgttctaa ttgatcatta agaaaaaata 3840

atttctttga atgtttctca agtagaatct ttattaactt ctacatttta ttagaaatag 3900

agcggtcaaa ttcataatta aatggatagt acaattaatt tatatattgc atattcatat 3960

atttacattt tattgatatc taatgattta gtctaaaaaa gatttaactt agtgtaataa 4020

aataacatta aaagacacac cagaaataag aatttcatta gtaattcttt gcaagacatg 4080

agaaatggag ttgatacctt gtcaatgttt gtaggtttct tgtcccaacc tggaattgct 4140

acgactctgt gaggccaaca gcttaactgc tctatgctct caccaacttc caactgccta 4200

cttcagcaaa cttgtaacct tgaatgtact taggtgtgga aaactgagaa acttgatgtc 4260

tccatcagtg gccagaggtc ttctgaatct ccgaatatta ctattagaag actgtgaatc 4320

aatggaagaa gtgatcacag aagaggaaca acaaggagat gaaatcatgt gtaatgaacc 4380

cttatttccc caattggaag agctgggact tgaaaatctg ccaaatctga ggcatttcat 4440

tttgacaaag caagctcttg aatttccatt cctcagagaa gtgcagattc gtaactgccc 4500

tgaaacgaag atatttgtcc aacagagatc tgtcagtaca tcaagtctca aaagtgtgaa 4560

caatgatgat gagttgaaag ttgttgatct caacaaagcg atgtttaatt ctaaggtttg 4620

tcttgtgccg ctttataact aaatgatata catatttgag taatgcacta acagatccct 4680

cgtctatttc tctctttctg gtttaagaaa tggtgcttat gaaaaatgcc acataagcag 4740

accatcttgt ttgattgctt gttcaattgt cttgatgaca aaattttgag aatttcctaa 4800

cccaaattca agaattaaac acacccacac taaataaacc acagaccaat acaaagcaag 4860

ccaaagattt ctagactgaa accatgctat tcagccattt ttatgttcat ttagtcaaac 4920

ataggaatgt tttaagtatt agacatagat cggggatgaa agtaatatca cgccccaagt 4980

ttgggattgt ttacaccagt tcaatctaat tgtaatagta atcttcatgt agttattttt 5040

tgtttgtcac ctgataccta tgttgatgga ggtaacaaac attggtgaat ctacaatatt 5100

ataatccaag ggttcatgtg aacccaataa ctttttttca ttgacttttt atttgtatta 5160

ataatatcta gagatttctt gaggtcattg aagatttcga taaatttcag attttaaatc 5220

tacctctcgt tctaaactct tctttcatta tatgtaacaa ctaatatatg gatttgtttt 5280

tctcatttca tcttgcattc ttcgtcattt taaaagatct tagagaatgc tattttaaag 5340

atgcttttta aaatacttct tctatttgag taaacacctc aactaaataa gcacttttga 5400

cttctcaact tatcacttag ggcgtgtttg gtatgaagga aaatgttttc atggaaagca 5460

agttgatttt tttttatttt cttatgtttg gttattgagt ggaaaatatt tttcgaaaaa 5520

tattttctag tgtttagttt gtgaatgaaa atatattttt cagaaaatac attctagtat 5580

ttagctaaag aaaatacttt tgtagaaaat aagtttgacg ctgaaaaata ttttttaggg 5640

tgtgttaggt ggaaaacatt ttttttataa aaataagttg tttcttgttt atattcttgt 5700

gttcgttatg caagtattaa aatatttttt taaagtattt gtatatgttt aacataaaac 5760

aatgggaatg aatagggtaa gaaaaaagtt taaaatattt attaaatatt tttttgagga 5820

gagggttggt agttggaggg atgtgtcaga atatgtggta gggttaggtg tggggtaaga 5880

aaaaagtttt gaattttttt aaaaaaatta ttcttttttt ttgcggtggg ggggggggtt 5940

agtacagggt ggggcataaa aaattgtttt tttggttaat aaatcgtgtg tgttttattg 6000

taattaataa aatattatct aacttgtaat ttgaaattct tttgaagtat aacagagcag 6060

tcgttgagaa tttcttacaa aatatgcctc tattttaaat gcacagttag agagactgtg 6120

gacataagaa gttttggttc aatttttatc aaaatcaaac caaattaact atatcggttt 6180

tttcaaccaa tttatatatt ataaattcat atatttacat tttattgata tctaatgatt 6240

tagtctaaaa atgatttaac ttattgtgat aaaataacat taaaagacac acctgaaata 6300

agaattttag tagtaattat ttgcaagaca tgagaaatgg agttgatacc ttgtcaatgt 6360

ttgtaggttt cttgtcccaa cctggaagtg ctacgactct ataaggctaa cagcataagt 6420

gctctatgct ctcaccaact tccaactgcc tacttcagca aacttaagga actaggagta 6480

gggaattgtg gaaaattgag acacttgatg tctccatcag tggccagagg tcttctgaat 6540

ctccgaaaac tatggatagg agaatgccaa tcaatggaag aagtgatcac agaagaggaa 6600

caacaaggag atgaaatcat gtgtaatgaa cccttatttc cccaattgga agagctggga 6660

cttgaaaatc tgccaaatct gaggcatttc attttgacaa agcaagctct tgaatttcca 6720

ttcctcagag aagtgctgat tcgtaactgc cctgaaacga agatatttgt ccaacagaga 6780

tctgtcagta catcaagtct caaaagtgtg aacaatgatg atgagttgaa agttgttgat 6840

ctcaacaaag cgatgtttaa ttctaaggtt tgtcttgtgc cgctttataa ctaaatgata 6900

tacatatttg agtaatgcac taacagatcc ctcgtctatt tctctctttc tggtttaaga 6960

aatggtgctt atgaaaaatg ccacataagc agaccatctt gtttgattgc ttgttcaatt 7020

gtcttgatga caaaattttg agaatttcct aacccaaatt caagaattaa acacacccac 7080

actaaataaa ccacagacca atacaaagca agccaaagat ttctagactg aaaccatgct 7140

attcagccat ttttatgttc atttagtcaa acataggaat gttttaagta ttagacatag 7200

atcggggatg aaagtaatat cacgccccaa gtttgggatt gtttacacca gttcaatcta 7260

attgtaatag taatcttcat gtagttattt tttgtttgtc acctgatacc tatgttgatg 7320

gaggtaacaa acattggtga atctacaata ttataatcca agggttcatg tgaacccaat 7380

aacttttttt cattgacttt ttatttgtat taataatatc tagagatttc ttgaggtcat 7440

tgaagatttc gataaatttc agattttaaa tctacctctc gttctaaact cttctttcat 7500

tatatgtaac aactaatata tggatttgtt tttctcattt catcttgcat tcttcgtcat 7560

tttaaaagat cttaaagaat gctattttaa agatgctttt taaaatactt cttctatttg 7620

agtaaacacc tcaactaaat aagcactttt gacttctcaa cttatcactt agggcgtgtt 7680

tggtatgaag gaaaatgttt tcatggaaag caagttgatt ttttttttat tttcttatgt 7740

ttggttattg agtggaaaat atttttcgaa aaatattttc tagtgtttag tttgtgaatg 7800

aaaatatatt tttcagaaaa tacattctag tatttagcta aagaaaatac ttttgtagaa 7860

aataagtttg acgctgaaaa atatttttta gggtgtgtta ggtggaaaac atttttttta 7920

taaaaataag ttgtttcttg tttatattct tgtgttcgtt atgcaagtat taaaatattt 7980

ttttaaagta tttgtatatg tttaacataa aacaatggga atgaataggg taagaaaaaa 8040

gtttaaaata tttattaaat atttttttga ggagagggtt ggtagttgga gggatgtgtc 8100

agaatatgtg gtagggttag gtgtggggta agaaaaaagt tttgaatttt tttaaaaaaa 8160

ttattctttt tttttgcggt gggggggggg gggggttagt acagggtggg gcataaaaaa 8220

ttgttttttt ggttaataaa tcgtgtgtgt tttattgtaa ttaataaaat attatctaac 8280

ttgtaatttg aaattctttt gaagtataac agagcagtcg ttgagaattt cttacaaaat 8340

atgcctctat tttaaatgca cagttagaga gactgtggac ataagaagtt ttggttcaat 8400

ttttatcaaa atcaaaccaa attaactata tcggtttttt caaccaattt atatattata 8460

aattcatata tttacatttt attgatatct aatgatttag tctaaaaatg atttaactta 8520

ttgtgataaa ataacattaa aagacacacc tgaaataaga attttagtag taattatttg 8580

caagacatga gaaatggagt tgataccttg tcaatgtttg taggtttctt gtcccaacct 8640

ggaagtgcta ctactctata aggctaacag cataagtgct ctatgctctc accaacttcc 8700

aactgcctac ttcagcaaac ttaaggaact aggagtatgg aattgtggaa aattgagaca 8760

cttgatgtct ccatcagtgg ccagaggtct tctgaatctc cgaaaactat ggatacgaga 8820

atgccaatca atggaagaag tgatcacaga agaggaacaa caaggagatg aaatcatgtg 8880

taatgaaccc ttatttcccc aattggaaga gctgggactt gaaaatctgc caaatctgag 8940

gcatttcatt ttgacaaagc aagctcttga atttccattc ctcagagaag tgctgattcg 9000

taactgccct gaaacgaaga tatttgtcca acagagatct gtcagtacat caagtctcaa 9060

aagtgtgaac aatgatgatg agttgaaagt tgttgatctc aacaaagcga tgtttaattc 9120

taaggtttgt cttgtgccgc tttataacta aatgatatac atatttgagt aatgcactaa 9180

cagatccctc gtctatttct ctctttctgg tttaagaaat ggtgcttatg aaaaatgcca 9240

cataagcaga ccatcttgtt tgattgcttg ttcaattgtc ttgatgacaa aattttgaga 9300

atttcctaac ccaaattcaa gaattaaaca cacccacact aaataaacca cagaccaata 9360

caaagcaagc caaagatttc tagactgaaa ccatgctatt cagccatttt tatgttcatt 9420

tagtcaaaca taggaatgtt ttaagtatta gacatagatc ggggatgaaa gtaatatcac 9480

gccccaagtt tgggattgtt tacaccagtt caatctaatt gtaatagtaa tcttcatgta 9540

gttatttttt gtttgtcacc tgatacctat gttgatggag gtaacaaaca ttggtgaatc 9600

tacaatatta taatccaagg gttcatgtga acccaataac tttttttcat tgacttttta 9660

tttgtattaa taatatctag agatttcttg aggtcattga agatttcgat aaatttcaga 9720

ttttaaatct acctctcgtt ctaaactctt ctttcattat atgtaacaac taatatatgg 9780

atttgttttt ctcatttcat cttgcattct tcgtcatttt aaaagatctt aaagaatgct 9840

attttaaaga tgctttttaa aatacttctt ctatttgagt aaacacctca actaaataag 9900

cacttttgac ttctcaactt atcacttagg gcgtgtttgg tatgaaggaa aatgttttca 9960

tggaaagcaa gttgattttt tttttatttt cttatgtttg gttattgagt ggaaaatatt 10020

tttcgaaaaa tattttctag tgtttagttt gtgaatgaaa atatattttt cagaaaatac 10080

attctagtat ttagctaaag aaaatacttt tgtagaaaat aagtttgacg ctgaaaaata 10140

ttttttaggg tgtgttaggt ggaaaacatt ttttttataa aaataagttg tttcttgttt 10200

atattcttgt gttcgttatg caagtattaa aatatttttt taaagtattt gtatatgttt 10260

aacataaaac aatgggaatg aatagggtaa gaaaaaagtt taaaatattt attaaatatt 10320

tttttgagga gagggttggt agttggaggg atgtgtcaga atatgtggta gggttaggtg 10380

tggggtaaga aaaaagtttt gaattttttt aaaaaaatta ttcttttttt ttgcggtggg 10440

gggggggggg gttagtacag ggtggggcat aaaaaattgt ttttttggtt aataaatcgt 10500

gtgtgtttta ttgtaattaa taaaatatta tctaacttgt aatttgaaat tcttttgaag 10560

tataacagag cagtcgttga gaatttctta caaaatatgc ctctatttta aatgcacagt 10620

tagagagact gtggacataa gaagttttgg ttcaattttt atcaaaatca aaccaaatta 10680

actatatcgg ttttttcaac caatttatat attataaatt catatattta cattttattg 10740

atatctaatg atttagtcta aaaatgattt aacttattgt gataaaataa cattaaaaga 10800

cacacctgaa ataagaattt tagtagtaat tatttgcaag acatgagaaa tggagttgat 10860

accttgtcaa tgtttgtagg tttcttgtcc caacctggaa gtgctactac tctataaggc 10920

taacagcata agtgctctat gctctcacca acttccaact gcctacttca gcaaacttaa 10980

ggaactagga gtatggaatt gtggaaaatt gagacacttg atgtctccat cagtggccag 11040

aggtcttctg aatctccgaa aactatggat acgagaatgc caatcaatgg aagaagtgat 11100

cacagaagag gaacaacaag gagatgaaat catgtgtaat gaacccttat ttccccaatt 11160

ggaagagctg ggacttgaaa atctgccaaa tctgaggcat ttcattttga caaagcaagc 11220

tcttgaattt ccattcctca gagaagtgct gattcgtaac tgccctgaaa cgaagatatt 11280

tgtccaacag agatctgtca gtacatcaag tctcaaaagt gtgaacaatg atgatgagtt 11340

gaaagttgtt gatctcaaca aagcgatgtt taattctaag gtttgtcttg tgccgcttta 11400

taactaaatg atatacatat ttgagtaatg cactaacaga tccctcgtct atttctctct 11460

ttctggttta agaaatggtg cttatgaaaa atgccacata agcagaccat cttgtttgat 11520

tgcttgttca attgtcttga tgacaaaatt ttgagaattt cctaacccaa attcaagaat 11580

taaacacacc cacactaaat aaaccacaga ccaatacaaa gcaagccaaa gatttctaga 11640

ctgaaaccat gctattcagc catttttatg ttcatttagt caaacatagg aatgttttaa 11700

gtattagaca tagatcgggg atgaaagtaa tatcacgccc caagtttggg attgtttaca 11760

ccagttcaat ctaattgtaa tagtaatctt catgtagtta ttttttgttt gtcacctgat 11820

acctatgttg atggaggtaa caaacattgg tgaatctaca atattataat ccaagggttc 11880

atgtgaaccc aataactttt tttcattgac tttttatttg tattaataat atctagagat 11940

ttcttgaggt cattgaagat ttcgataaat ttcagatttt aaatctacct ctcgttctaa 12000

actcttcttt cattatatgt aacaactaat atatggattt gtttttctca tttcatcttg 12060

cattcttcgt cattttaaaa gatcttaaag aatgctattt taaagatgct ttttaaaata 12120

cttcttctat ttgagtaaac acctcaacta aataagcact tttggcttct caacttatca 12180

cttagggcgt gtttggtatg aaggaaaatg ttttcatgga aagcaagttg attttttctt 12240

attttcttat gtttggttat tgagtggaaa atatttttcg aaaaatattt tctagtgttt 12300

agttagtgaa tgaaaatata tttttcagaa aatacatttt agtatttagc taaagaaaat 12360

acttttgtag aaaataagtt tgacgctgaa aaatattttt tagggtgtgt taggtggaaa 12420

acattttttt tataaaaata agttgtttct tgtttatatt cttgtgttcg ttatgcaagt 12480

attaaaatat ttttttaaag tatttgtata tgtttaacat aaaacaatgg gaatgaatag 12540

ggtaagaaaa aagtttaaaa tatttattaa atattttttt gaggagaggg ttggtagttg 12600

gagggatgtg tcagaatatg tggtagggtt aggtgtggga taagaaaaaa gttttgaatt 12660

tttttaaaaa aattattctt tttttttgcg gggggggggg tcagtacagg gtggggcgta 12720

aaaaattatt tttttggtta acaaatcgtg tgtgttttat tgtaattaat aaaatattat 12780

ctaacttgta atttgaaatt cttttgaagt ataacagagc agtcgttgag aatttcttac 12840

aaaatatgcc tctattttaa atgcacagtt agagagactg tggacataag aagttttggg 12900

tcacttttca tcaaaatcaa accaaattaa ctatatcggt tttttcaacc aatttatata 12960

ttataaattc atacatttac attttattga tatctaatga tttaacttac tgtgataaaa 13020

taacattaaa agacacacct gaaataagaa ttttattagt aattatttgc aagacatgag 13080

aaatggagtt gatatcttgt caatgttttg caggtttctt gtcccaacct ggaaaagcta 13140

tatatctatt cggacataac tgctctatac tctcaccaac ttccaactac ctacttcagc 13200

aaacttggga cattgaaagt agaaaattgt ggaaaattga gacacttgat atctccatca 13260

gtggccagag gtcttctgaa tctccgaaaa ctacggatag gagaatgcca atcaatggaa 13320

gaagtgatca cagaagagga acaacaagga gatgaaatca tgtgtaatga acccttattt 13380

ccccaattgg aaaagctgaa acttgaaaat ctgccaaagc tgaggcattt cattttgacg 13440

aagcaagctc ttgaatttcc attcctcaaa ttagtggtga ttcgtaaatg ccctgaaatg 13500

aagatatttg tccaacatgg atatgtgagt acaccaagtc ttgaaattgt gaacgatgat 13560

gatgaggtaa aagtagatga tttgaacgaa tggatacatc agaggttcaa ttctaaggtt 13620

tgtcttgtgg tgctaaatga ctgtataact aattaactgt attgctctct ttccatctta 13680

acttgatagt aatagtaata tttacatact cgtttatgtt tgtcacttga attagcttcc 13740

ttttaccttc ccccaaatgt ttatctttca acgaaatatt gtaatgtctg ttttttgtaa 13800

tctctactct caggaagaag atggaagtga atctgaatct tctcagggag aagattggaa 13860

tcgaatctga 13870

<210> 2

<211> 5238

<212> DNA

<213> 辣椒CM334(Capsicum annuum cv. CM334)

<400> 2

atggaaatcg taactgctat tttgagccca gtcgcagaac acttgatgat actgccagtt 60

gcgcgacaga ttggatattt gttttactat aggcgcaaca tcaggtcttt ggaaaatgaa 120

aataagaagc tggagggtat cagaagcggg gtgcagcaca gaaaggatgc tgaatggaga 180

aacttacaag tcatgccacc ccatgtcgag aattggttaa aggatgttaa tgaaactact 240

gctgaggtgg cggttttact acgacgtaga gctgaggttg aaagaggttg cttctacggt 300

tggtgtccaa acttgaagtc acgtcactcg ctgagcagga aagctaagaa aattgaacag 360

gctatgattg gtcttcaaga tgaaggcaca cgttatgctc cttcctcctg tccagcacca 420

cttgcagtta cagtgataca cagtgatgag tttgactcta gaaaacagaa ggaggaagag 480

gtcatgacag ctttgaaaga tgaggggatc actattgttg ggatatgtgg tatgggtggt 540

gttggtaaaa caacactggc tgagaaagta agagcaaggg caaaacaaga aaggttgttt 600

gattatgttg ttgtgctaac tatcagtcaa caacaaccag acattaaaaa aatacagcgc 660

gagatcgccg aaggagtcgg tctatcatta gagggggacg atttgttgga gcgtggagat 720

cggctgcgtt caaggttaat gcagaaggac agtcgcgtcc ttgtaatttt ggatgatgtt 780

tggaagaagg ttgatctaaa gagggttgga attcccagtg gtagcgatcg caactactgg 840

tgcaaagtga tattgacgac gcgtctccga gatgtttgtg acgatatgga ggctaaaaag 900

aaagtacatg ttgaaatctt atgtgaaaat gaagcatggc tcctttttag gcagaaagcc 960

ggtaattcag ctgatgatct ctctcttcct gatatagcag aagccgttgc caaagaatgc 1020

aaggggctgc cacttgcaat tgttactgtt gcaggagcac taaagggtaa aaccaagcgt 1080

tcatgggagg atgccctttt agaattaaaa aaagcagcac caagaaatat tcgaggagtg 1140

cttgcagatg tgtatcaacc tctgaagata agctataatc acttagggag tgatgaagcc 1200

aaggatgcct ttttgctttg ttccttgttt gaggaagata gtaatatttg gactgaagaa 1260

ttacttagat acggaatggg gcttggcatc ttttcggaac tcgaaaattt agaatgtgca 1320

agaaataggg tgtctaatct gttagaaaca ttgaaaaatt gtttcttgtt atcccaagtt 1380

ccaggcaaag attatgtcaa aatgcatgat gtggtccggg acatggctat acatattgca 1440

tctgagggta accatatttt tttggtgagc cacaatgtga actcaaaaga gttcccaaga 1500

aaagactctt acaagcaata cagtcatatg tcaattgttg caaataaatt tgatgcgcgt 1560

cccagaccaa tatcttgccc acgattgaag cttctgatgt taaaactccg tttcgaagag 1620

ggtttcaaat tacaggatga tttttttgat ggaatgagtg aactcagtgt cataaaactg 1680

agtggatatg atcgaaactc cattctgccc tttccatcat ccattcagag gttgtcaaat 1740

ctgagcacgc tttggctgag taatctaagg ttggatgacg tgtccattat tggggaactt 1800

gtcactttag aaattctcag catcagaggt tctgacttac aggagcttcc agtggagatc 1860

ggaaacttgg ccaatctaac tatgttagag tattggaata ctggttacag aaaccgtatg 1920

aggatttcac caggggtctt atcaagacta gttcgattgg aggaactaca tatggtggga 1980

gtagaagatt gtagttactc caccttgagg gagctggaat cgttatcgag attgactgca 2040

ctgacattag atggatgttc caaagatgtg atttacagta acttgggcct ttcctccaag 2100

ttgacacggt acgctcttaa aatgggtaga cactacacgt ttacttcatt catgcaaact 2160

tacaacaagg ctatctatct agacgtcacc aagggcaccc cattgggtga ttggatccgc 2220

ctcctgttga ggaatagcga atgtgtaagt tcaagcggaa aggggtccaa gaatgtagtg 2280

ttcgagttgc agaatgtgaa agatctcagg ctgtcttttt gtgattcatt gaatatccac 2340

tgtcagaata atattccatt ccccaaactt gaaaggctga aagtaaatgg gtgtgatcat 2400

ctacggcatc ttttttgtgt gtccttggct tgccctgatg aggggacctc tcgaaggaca 2460

cacatcagac ctgacgtaat caagttcccc aatttatatt acttggaact gggatttctg 2520

aaatgcttca cacacttttt cagtgacacc gttgagggca ttgagttccc tctgttacgg 2580

aaaatgcatt tctggagttt acaaaagttc caaaatttct ggcctagagt caacaatgct 2640

atcaccgact caaatcctct ttttaatgaa aaggtttctt gtcccaacct ggaattgcta 2700

cgactctgtg aggccaacag cttaactgct ctatgctctc accaacttcc aactgcctac 2760

ttcagcaaac ttgtaacctt gaatgtactt aggtgtggaa aactgagaaa cttgatgtct 2820

ccatcagtgg ccagaggtct tctgaatctc cgaatattac tattagaaga ctgtgaatca 2880

atggaagaag tgatcacaga agaggaacaa caaggagatg aaatcatgtg taatgaaccc 2940

ttatttcccc aattggaaga gctgggactt gaaaatctgc caaatctgag gcatttcatt 3000

ttgacaaagc aagctcttga atttccattc ctcagagaag tgcagattcg taactgccct 3060

gaaacgaaga tatttgtcca acagagatct gtcagtacat caagtctcaa aagtgtgaac 3120

aatgatgatg agttgaaagt tgttgatctc aacaaagcga tgtttaattc taaggtttct 3180

tgtcccaacc tggaagtgct acgactctat aaggctaaca gcataagtgc tctatgctct 3240

caccaacttc caactgccta cttcagcaaa cttaaggaac taggagtagg gaattgtgga 3300

aaattgagac acttgatgtc tccatcagtg gccagaggtc ttctgaatct ccgaaaacta 3360

tggataggag aatgccaatc aatggaagaa gtgatcacag aagaggaaca acaaggagat 3420

gaaatcatgt gtaatgaacc cttatttccc caattggaag agctgggact tgaaaatctg 3480

ccaaatctga ggcatttcat tttgacaaag caagctcttg aatttccatt cctcagagaa 3540

gtgctgattc gtaactgccc tgaaacgaag atatttgtcc aacagagatc tgtcagtaca 3600

tcaagtctca aaagtgtgaa caatgatgat gagttgaaag ttgttgatct caacaaagcg 3660

atgtttaatt ctaaggtttc ttgtcccaac ctggaagtgc tactactcta taaggctaac 3720

agcataagtg ctctatgctc tcaccaactt ccaactgcct acttcagcaa acttaaggaa 3780

ctaggagtat ggaattgtgg aaaattgaga cacttgatgt ctccatcagt ggccagaggt 3840

cttctgaatc tccgaaaact atggatacga gaatgccaat caatggaaga agtgatcaca 3900

gaagaggaac aacaaggaga tgaaatcatg tgtaatgaac ccttatttcc ccaattggaa 3960

gagctgggac ttgaaaatct gccaaatctg aggcatttca ttttgacaaa gcaagctctt 4020

gaatttccat tcctcagaga agtgctgatt cgtaactgcc ctgaaacgaa gatatttgtc 4080

caacagagat ctgtcagtac atcaagtctc aaaagtgtga acaatgatga tgagttgaaa 4140

gttgttgatc tcaacaaagc gatgtttaat tctaaggttt cttgtcccaa cctggaagtg 4200

ctactactct ataaggctaa cagcataagt gctctatgct ctcaccaact tccaactgcc 4260

tacttcagca aacttaagga actaggagta tggaattgtg gaaaattgag acacttgatg 4320

tctccatcag tggccagagg tcttctgaat ctccgaaaac tatggatacg agaatgccaa 4380

tcaatggaag aagtgatcac agaagaggaa caacaaggag atgaaatcat gtgtaatgaa 4440

cccttatttc cccaattgga agagctggga cttgaaaatc tgccaaatct gaggcatttc 4500

attttgacaa agcaagctct tgaatttcca ttcctcagag aagtgctgat tcgtaactgc 4560

cctgaaacga agatatttgt ccaacagaga tctgtcagta catcaagtct caaaagtgtg 4620

aacaatgatg atgagttgaa agttgttgat ctcaacaaag cgatgtttaa ttctaaggtt 4680

tcttgtccca acctggaaaa gctatatatc tattcggaca taactgctct atactctcac 4740

caacttccaa ctacctactt cagcaaactt gggacattga aagtagaaaa ttgtggaaaa 4800

ttgagacact tgatatctcc atcagtggcc agaggtcttc tgaatctccg aaaactacgg 4860

ataggagaat gccaatcaat ggaagaagtg atcacagaag aggaacaaca aggagatgaa 4920

atcatgtgta atgaaccctt atttccccaa ttggaaaagc tgaaacttga aaatctgcca 4980

aagctgaggc atttcatttt gacgaagcaa gctcttgaat ttccattcct caaattagtg 5040

gtgattcgta aatgccctga aatgaagata tttgtccaac atggatatgt gagtacacca 5100

agtcttgaaa ttgtgaacga tgatgatgag gtaaaagtag atgatttgaa cgaatggata 5160

catcagaggt tcaattctaa ggaagaagat ggaagtgaat ctgaatcttc tcagggagaa 5220

gattggaatc gaatctga 5238

<210> 3

<211> 1745

<212> PRT

<213> 辣椒CM334(Capsicum annuum cv. CM334)

<400> 3

Met Glu Ile Val Thr Ala Ile Leu Ser Pro Val Ala Glu His Leu Met

1 5 10 15

Ile Leu Pro Val Ala Arg Gln Ile Gly Tyr Leu Phe Tyr Tyr Arg Arg

20 25 30

Asn Ile Arg Ser Leu Glu Asn Glu Asn Lys Lys Leu Glu Gly Ile Arg

35 40 45

Ser Gly Val Gln His Arg Lys Asp Ala Glu Trp Arg Asn Leu Gln Val

50 55 60

Met Pro Pro His Val Glu Asn Trp Leu Lys Asp Val Asn Glu Thr Thr

65 70 75 80

Ala Glu Val Ala Val Leu Leu Arg Arg Arg Ala Glu Val Glu Arg Gly

85 90 95

Cys Phe Tyr Gly Trp Cys Pro Asn Leu Lys Ser Arg His Ser Leu Ser

100 105 110

Arg Lys Ala Lys Lys Ile Glu Gln Ala Met Ile Gly Leu Gln Asp Glu

115 120 125

Gly Thr Arg Tyr Ala Pro Ser Ser Cys Pro Ala Pro Leu Ala Val Thr

130 135 140

Val Ile His Ser Asp Glu Phe Asp Ser Arg Lys Gln Lys Glu Glu Glu

145 150 155 160

Val Met Thr Ala Leu Lys Asp Glu Gly Ile Thr Ile Val Gly Ile Cys

165 170 175

Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Glu Lys Val Arg Ala

180 185 190

Arg Ala Lys Gln Glu Arg Leu Phe Asp Tyr Val Val Val Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Gln Gln Gln Pro Asp Ile Lys Lys Ile Gln Arg Glu Ile Ala Glu

210 215 220

Gly Val Gly Leu Ser Leu Glu Gly Asp Asp Leu Leu Glu Arg Gly Asp

225 230 235 240

Arg Leu Arg Ser Arg Leu Met Gln Lys Asp Ser Arg Val Leu Val Ile

245 250 255

Leu Asp Asp Val Trp Lys Lys Val Asp Leu Lys Arg Val Gly Ile Pro

260 265 270

Ser Gly Ser Asp Arg Asn Tyr Trp Cys Lys Val Ile Leu Thr Thr Arg

275 280 285

Leu Arg Asp Val Cys Asp Asp Met Glu Ala Lys Lys Lys Val His Val

290 295 300

Glu Ile Leu Cys Glu Asn Glu Ala Trp Leu Leu Phe Arg Gln Lys Ala

305 310 315 320

Gly Asn Ser Ala Asp Asp Leu Ser Leu Pro Asp Ile Ala Glu Ala Val

325 330 335

Ala Lys Glu Cys Lys Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val Thr Val Ala Gly

340 345 350

Ala Leu Lys Gly Lys Thr Lys Arg Ser Trp Glu Asp Ala Leu Leu Glu

355 360 365

Leu Lys Lys Ala Ala Pro Arg Asn Ile Arg Gly Val Leu Ala Asp Val

370 375 380

Tyr Gln Pro Leu Lys Ile Ser Tyr Asn His Leu Gly Ser Asp Glu Ala

385 390 395 400

Lys Asp Ala Phe Leu Leu Cys Ser Leu Phe Glu Glu Asp Ser Asn Ile

405 410 415

Trp Thr Glu Glu Leu Leu Arg Tyr Gly Met Gly Leu Gly Ile Phe Ser

420 425 430

Glu Leu Glu Asn Leu Glu Cys Ala Arg Asn Arg Val Ser Asn Leu Leu

435 440 445

Glu Thr Leu Lys Asn Cys Phe Leu Leu Ser Gln Val Pro Gly Lys Asp

450 455 460

Tyr Val Lys Met His Asp Val Val Arg Asp Met Ala Ile His Ile Ala

465 470 475 480

Ser Glu Gly Asn His Ile Phe Leu Val Ser His Asn Val Asn Ser Lys

485 490 495

Glu Phe Pro Arg Lys Asp Ser Tyr Lys Gln Tyr Ser His Met Ser Ile

500 505 510

Val Ala Asn Lys Phe Asp Ala Arg Pro Arg Pro Ile Ser Cys Pro Arg

515 520 525

Leu Lys Leu Leu Met Leu Lys Leu Arg Phe Glu Glu Gly Phe Lys Leu

530 535 540

Gln Asp Asp Phe Phe Asp Gly Met Ser Glu Leu Ser Val Ile Lys Leu

545 550 555 560

Ser Gly Tyr Asp Arg Asn Ser Ile Leu Pro Phe Pro Ser Ser Ile Gln

565 570 575

Arg Leu Ser Asn Leu Ser Thr Leu Trp Leu Ser Asn Leu Arg Leu Asp

580 585 590

Asp Val Ser Ile Ile Gly Glu Leu Val Thr Leu Glu Ile Leu Ser Ile

595 600 605

Arg Gly Ser Asp Leu Gln Glu Leu Pro Val Glu Ile Gly Asn Leu Ala

610 615 620

Asn Leu Thr Met Leu Glu Tyr Trp Asn Thr Gly Tyr Arg Asn Arg Met

625 630 635 640

Arg Ile Ser Pro Gly Val Leu Ser Arg Leu Val Arg Leu Glu Glu Leu

645 650 655

His Met Val Gly Val Glu Asp Cys Ser Tyr Ser Thr Leu Arg Glu Leu

660 665 670

Glu Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ala Leu Thr Leu Asp Gly Cys Ser Lys

675 680 685

Asp Val Ile Tyr Ser Asn Leu Gly Leu Ser Ser Lys Leu Thr Arg Tyr

690 695 700

Ala Leu Lys Met Gly Arg His Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Met Gln Thr

705 710 715 720

Tyr Asn Lys Ala Ile Tyr Leu Asp Val Thr Lys Gly Thr Pro Leu Gly

725 730 735

Asp Trp Ile Arg Leu Leu Leu Arg Asn Ser Glu Cys Val Ser Ser Ser

740 745 750

Gly Lys Gly Ser Lys Asn Val Val Phe Glu Leu Gln Asn Val Lys Asp

755 760 765

Leu Arg Leu Ser Phe Cys Asp Ser Leu Asn Ile His Cys Gln Asn Asn

770 775 780

Ile Pro Phe Pro Lys Leu Glu Arg Leu Lys Val Asn Gly Cys Asp His

785 790 795 800

Leu Arg His Leu Phe Cys Val Ser Leu Ala Cys Pro Asp Glu Gly Thr

805 810 815

Ser Arg Arg Thr His Ile Arg Pro Asp Val Ile Lys Phe Pro Asn Leu

820 825 830

Tyr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe Leu Lys Cys Phe Thr His Phe Phe Ser

835 840 845

Asp Thr Val Glu Gly Ile Glu Phe Pro Leu Leu Arg Lys Met His Phe

850 855 860

Trp Ser Leu Gln Lys Phe Gln Asn Phe Trp Pro Arg Val Asn Asn Ala

865 870 875 880

Ile Thr Asp Ser Asn Pro Leu Phe Asn Glu Lys Val Ser Cys Pro Asn

885 890 895

Leu Glu Leu Leu Arg Leu Cys Glu Ala Asn Ser Leu Thr Ala Leu Cys

900 905 910

Ser His Gln Leu Pro Thr Ala Tyr Phe Ser Lys Leu Val Thr Leu Asn

915 920 925

Val Leu Arg Cys Gly Lys Leu Arg Asn Leu Met Ser Pro Ser Val Ala

930 935 940

Arg Gly Leu Leu Asn Leu Arg Ile Leu Leu Leu Glu Asp Cys Glu Ser

945 950 955 960

Met Glu Glu Val Ile Thr Glu Glu Glu Gln Gln Gly Asp Glu Ile Met

965 970 975

Cys Asn Glu Pro Leu Phe Pro Gln Leu Glu Glu Leu Gly Leu Glu Asn

980 985 990

Leu Pro Asn Leu Arg His Phe Ile Leu Thr Lys Gln Ala Leu Glu Phe

995 1000 1005

Pro Phe Leu Arg Glu Val Gln Ile Arg Asn Cys Pro Glu Thr Lys Ile

1010 1015 1020

Phe Val Gln Gln Arg Ser Val Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Val Asn

1025 1030 1035 1040

Asn Asp Asp Glu Leu Lys Val Val Asp Leu Asn Lys Ala Met Phe Asn

1045 1050 1055

Ser Lys Val Ser Cys Pro Asn Leu Glu Val Leu Arg Leu Tyr Lys Ala

1060 1065 1070

Asn Ser Ile Ser Ala Leu Cys Ser His Gln Leu Pro Thr Ala Tyr Phe

1075 1080 1085

Ser Lys Leu Lys Glu Leu Gly Val Gly Asn Cys Gly Lys Leu Arg His

1090 1095 1100

Leu Met Ser Pro Ser Val Ala Arg Gly Leu Leu Asn Leu Arg Lys Leu

1105 1110 1115 1120

Trp Ile Gly Glu Cys Gln Ser Met Glu Glu Val Ile Thr Glu Glu Glu

1125 1130 1135

Gln Gln Gly Asp Glu Ile Met Cys Asn Glu Pro Leu Phe Pro Gln Leu

1140 1145 1150

Glu Glu Leu Gly Leu Glu Asn Leu Pro Asn Leu Arg His Phe Ile Leu

1155 1160 1165

Thr Lys Gln Ala Leu Glu Phe Pro Phe Leu Arg Glu Val Leu Ile Arg

1170 1175 1180

Asn Cys Pro Glu Thr Lys Ile Phe Val Gln Gln Arg Ser Val Ser Thr

1185 1190 1195 1200

Ser Ser Leu Lys Ser Val Asn Asn Asp Asp Glu Leu Lys Val Val Asp

1205 1210 1215

Leu Asn Lys Ala Met Phe Asn Ser Lys Val Ser Cys Pro Asn Leu Glu

1220 1225 1230

Val Leu Leu Leu Tyr Lys Ala Asn Ser Ile Ser Ala Leu Cys Ser His

1235 1240 1245

Gln Leu Pro Thr Ala Tyr Phe Ser Lys Leu Lys Glu Leu Gly Val Trp

1250 1255 1260

Asn Cys Gly Lys Leu Arg His Leu Met Ser Pro Ser Val Ala Arg Gly

1265 1270 1275 1280

Leu Leu Asn Leu Arg Lys Leu Trp Ile Arg Glu Cys Gln Ser Met Glu

1285 1290 1295

Glu Val Ile Thr Glu Glu Glu Gln Gln Gly Asp Glu Ile Met Cys Asn

1300 1305 1310

Glu Pro Leu Phe Pro Gln Leu Glu Glu Leu Gly Leu Glu Asn Leu Pro

1315 1320 1325

Asn Leu Arg His Phe Ile Leu Thr Lys Gln Ala Leu Glu Phe Pro Phe

1330 1335 1340

Leu Arg Glu Val Leu Ile Arg Asn Cys Pro Glu Thr Lys Ile Phe Val

1345 1350 1355 1360

Gln Gln Arg Ser Val Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Val Asn Asn Asp

1365 1370 1375

Asp Glu Leu Lys Val Val Asp Leu Asn Lys Ala Met Phe Asn Ser Lys

1380 1385 1390

Val Ser Cys Pro Asn Leu Glu Val Leu Leu Leu Tyr Lys Ala Asn Ser

1395 1400 1405

Ile Ser Ala Leu Cys Ser His Gln Leu Pro Thr Ala Tyr Phe Ser Lys

1410 1415 1420

Leu Lys Glu Leu Gly Val Trp Asn Cys Gly Lys Leu Arg His Leu Met

1425 1430 1435 1440

Ser Pro Ser Val Ala Arg Gly Leu Leu Asn Leu Arg Lys Leu Trp Ile

1445 1450 1455

Arg Glu Cys Gln Ser Met Glu Glu Val Ile Thr Glu Glu Glu Gln Gln

1460 1465 1470

Gly Asp Glu Ile Met Cys Asn Glu Pro Leu Phe Pro Gln Leu Glu Glu

1475 1480 1485

Leu Gly Leu Glu Asn Leu Pro Asn Leu Arg His Phe Ile Leu Thr Lys

1490 1495 1500

Gln Ala Leu Glu Phe Pro Phe Leu Arg Glu Val Leu Ile Arg Asn Cys

1505 1510 1515 1520

Pro Glu Thr Lys Ile Phe Val Gln Gln Arg Ser Val Ser Thr Ser Ser

1525 1530 1535

Leu Lys Ser Val Asn Asn Asp Asp Glu Leu Lys Val Val Asp Leu Asn

1540 1545 1550

Lys Ala Met Phe Asn Ser Lys Val Ser Cys Pro Asn Leu Glu Lys Leu

1555 1560 1565

Tyr Ile Tyr Ser Asp Ile Thr Ala Leu Tyr Ser His Gln Leu Pro Thr

1570 1575 1580

Thr Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Thr Leu Lys Val Glu Asn Cys Gly Lys

1585 1590 1595 1600

Leu Arg His Leu Ile Ser Pro Ser Val Ala Arg Gly Leu Leu Asn Leu

1605 1610 1615

Arg Lys Leu Arg Ile Gly Glu Cys Gln Ser Met Glu Glu Val Ile Thr

1620 1625 1630

Glu Glu Glu Gln Gln Gly Asp Glu Ile Met Cys Asn Glu Pro Leu Phe

1635 1640 1645

Pro Gln Leu Glu Lys Leu Lys Leu Glu Asn Leu Pro Lys Leu Arg His

1650 1655 1660

Phe Ile Leu Thr Lys Gln Ala Leu Glu Phe Pro Phe Leu Lys Leu Val

1665 1670 1675 1680

Val Ile Arg Lys Cys Pro Glu Met Lys Ile Phe Val Gln His Gly Tyr

1685 1690 1695

Val Ser Thr Pro Ser Leu Glu Ile Val Asn Asp Asp Asp Glu Val Lys

1700 1705 1710

Val Asp Asp Leu Asn Glu Trp Ile His Gln Arg Phe Asn Ser Lys Glu

1715 1720 1725

Glu Asp Gly Ser Glu Ser Glu Ser Ser Gln Gly Glu Asp Trp Asn Arg

1730 1735 1740

Ile

1745

Claims

1.马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

2.对权利要求1所述的马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQ ID NO：2的碱基序列组成。

4.Pvr4基因，其由SEQ ID NO:1的碱基序列组成。

5.重组载体，其包含权利要求2所述的对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因。

6.宿主细胞，其由权利要求5所述的重组载体转化，所述重组载体包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因，其中所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，所述原核细胞为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)菌株细胞，所述真核细胞选自酵母，昆虫细胞、人细胞和植物细胞，所述昆虫细胞不是胚胎干细胞、生殖细胞或受精卵细胞且不能发育为昆虫个体，所述人细胞不是胚胎干细胞、生殖细胞或受精卵细胞且不能发育为人个体，所述植物细胞不能发育成植物个体。

7.与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，增加植物体对马铃薯Y病毒属的抗性的方法，其包括如下步骤：将包含编码Pvr4蛋白质的基因的重组载体导入植物细胞中以进行转化，在转化植物细胞中使Pvr4基因过表达，所述Pvr4蛋白质由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

8.与对马铃薯Y病毒属的易感性植物体或非转化植物体相比，马铃薯Y病毒属抗性得到增加的转化植物体的制备方法，其包括如下步骤：

(a)以重组载体对植物细胞进行转化，所述重组载体包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因；以及

(b)由通过所述步骤(a)制备的转化的植物细胞再分化成转化的植物，所述Pvr4蛋白质由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

9.用于增加植物体的马铃薯Y病毒属抗性的组合物，其包含对马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4进行编码的基因，所述马铃薯Y病毒属抗性蛋白质Pvr4由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。