WO2016190452A1 - 포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2016190452A1
WO2016190452A1 PCT/KR2015/005133 KR2015005133W WO2016190452A1 WO 2016190452 A1 WO2016190452 A1 WO 2016190452A1 KR 2015005133 W KR2015005133 W KR 2015005133W WO 2016190452 A1 WO2016190452 A1 WO 2016190452A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pvr4
gene
resistance
fortivirus
seq
Prior art date
Application number
PCT/KR2015/005133
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최도일
김샛별
김달수
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020177029127A priority Critical patent/KR101996891B1/ko
Priority to PCT/KR2015/005133 priority patent/WO2016190452A1/ko
Priority to CN201580080240.XA priority patent/CN108350045B/zh
Publication of WO2016190452A1 publication Critical patent/WO2016190452A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a Pvr4 gene having Pottyvirus resistance and its use.
  • Red pepper Capsicum annuum
  • Solanaceae Solanaceae
  • It is a crop containing spicy capsaicin, which is used for reproduction because of its high vitamin content and dried pepper is mostly used as seasoning.
  • FEO Food and Agriculture Organization of the United Nations
  • dried peppers are producing 335 million tons of global production, 31 million tons of raw red pepper, and production is on the rise. Doing.
  • Potyvirus is a genus of the Potyviridae spp. Virus, which contains the largest number of plant viruses and infects 503 plants in the 59 family (Quenouille et al. , Mol Plant Pathol 14). , 439-452 (2013), http://pvo.bio-mirror.cn/genus039.htm#Range). Host plants infected by fortiviruses are classified taxonomically mainly in Solanaceae , Chenopodiaceae , Leguminosae-Papilionoideae , and Amaranthaceae .
  • pepper mottle virus (PepMoV) is rod-shaped with a length of 700-900 nm and a width of 12-15 nm, and has a positive 10sb (+) ssRNA structure. PepMoV expresses polyprotein and is cut into 11 proteins by proteinases present in the polyprotein.
  • VPg gene-linked protein
  • A poly (A) tail at the 3' end
  • Natural occurrence of fortiviruses of Capsicum annuum has been reported in Korea, Europe and the United States (Green et al ., Asian Vegetable Research and Development Center, 1991, vol. 9, No. 18, Technical Bulletin 18). ; Kenyon, L., Kumar, S., Tsai, WS, & Hughes, JDA (2014). Virus Diseases of Peppers (Capsicum spp.) And Their Control.Control of Plant Virus Diseases: Seed-Propagated Crops , vol.
  • PepMoV is well transmitted to peppers and tobacco by inoculation of juice, and is transmitted by various aphids. Peppers infected with the virus are mottled and cause malformation of leaves and fruits, severely infected peppers shrink, and pepper yields are reduced. PepMoV studies confirm the extent of infection of PepMoV under UV (ultra violet) light as well as the phenomena observed in nature when a green fluorescent protein (GFP) is inserted into the PepMoV genome and host plants are infected with PepMoV. A possible SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus has been developed (Lee et al ., Virus Research, 2011, vol. 155, 487-494). The development of SP6PepMoV-Vb1 / GFP has made the symptom of PepMoV clear and easy to analyze using molecular biological methods.
  • PepMoV Potato virus Y
  • TSV Tobacco etch virus
  • PepSMV Pepper severe mosaic virus
  • PepMoV control requires aphid control, soil disinfection, and thorough care of farm equipment and seeds. However, since the control method is indirect and requires a lot of effort, it is more efficient and economical control method to develop varieties resistant to PepMoV.
  • the main viruses that reduce pepper production are PepMoV ( Pepper mottle virus ), PepSMV ( Pepper severe mosaic virus ), PeYMV ( Pepper yellow mosaic virus ), ERV ( Ecuadorian rocoto virus ), PTV ( Peru tomato virus ) and PVY ( Patoto virus) Potyvirus containing Y ) is a virus that causes a decrease in the production of eggplant crops including potatoes as well as peppers, and the breeding and development of resistant varieties of pepper and eggplant crops is urgently needed to increase productivity of such crops. (SCHOLTHOF et al. , Mol. Plant Pathol, 2011, vol. 12, 938-954; Quenouille et al. , Mol. Plant Pathol., 2013, vol. 14, 439-452).
  • PepMoV As a single dominant gene, PepMoV, PepSMV, and PeYMV , Resistance responses such as extreme resistance or hypersensitive response to ERV, PTV and PVY were found (Grube et al. , TAG, 2000, vol . 101, 852). -589; Janzac et al ., Plant Pathol., 2009, vol. 58, 443-449; Kim et al. , TAG, 2011, vol. 122, 1051-1058).
  • the present invention is derived from the above background, the present inventors prevent economic loss due to infection and damage of pepper, potato, tomato, etc. caused by fortivirus infection such as PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV, PVY Efforts have been made to find a Pvr4 gene, a plant-derived fortivirus single dominant resistance gene that can be improved or improved. As a result, based on the hypothesis that resistance to fortivirus is extensively involved with the Pvr4 gene, the gene was searched for the Pvr4 gene at the genome level, and then the exact nucleotide sequence was transformed into the Pvr4 gene. The present invention was completed by finding the fact that the plant directly provides resistance to the fortiviruses PepMoV, PepSMV, PVY and the like. The objects and advantages of the invention are more clearly illustrated by the following detailed description, claims and drawings.
  • the present invention provides an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or an amino acid sequence having 85% or more of sequence similarity with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having potyvirus resistance; and provides the fortivirus resistance protein Pvr4.
  • the present invention provides genes encoding fortivirus resistant protein Pvr4.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding fortivirus resistant protein Pvr4.
  • the present invention provides a host cell transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding fortivirus resistance protein Pvr4.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding a Pvr4 protein into a plant cell, and transforms the plant cell, thereby overexpressing the Pvr4 gene in the transformed plant cell.
  • the present invention comprises the steps of (a) transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding fortivirus resistance protein Pvr4; And (b) regenerating the transformed plant from the transformed plant cell prepared by step (a), wherein the trait has increased fortivirus resistance compared to the pathogenic or non-transgenic plant for the fortivirus. It provides a method for producing a converted plant.
  • the present invention provides a transgenic plant with increased fortivirus resistance produced by the method for producing a transgenic plant with increased fortivirus resistance and transformed seeds thereof.
  • the present invention provides an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or an amino acid sequence having 85% or more of sequence similarity with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having a potyvirus resistance; and comprising a gene encoding the fortivirus resistance protein Pvr4.
  • a composition for increasing fortivirus resistance is provided.
  • the present invention provides forward or reverse primers consisting of at least 10 consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or nucleotide sequences complementary thereto.
  • the present invention provides a probe consisting of at least 10 consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or nucleotide sequences complementary thereto.
  • the present invention provides a kit for detecting fortivirus resistant Pvr4 gene comprising the primer or probe.
  • the present invention provides an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 for increasing fortivirus resistance compared to pathogenic or non-transgenic plants to fortiviruses; Or an amino acid sequence having 85% or more of sequence similarity with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having a potyvirus resistance; and providing a use of the gene encoding the fortivirus resistance protein Pvr4.
  • the present invention provides a Pvr4 gene, a Pvr4 protein and its use that are resistant to potyvirus.
  • the present invention can contribute to breeding fortivirus resistant pepper by using molecular labeling using the Pvr4 gene sequence.
  • the present invention has the characteristics that can be transformed to host plants, such as potatoes, tomatoes, etc., which are economically reduced by fortiviruses such as PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV, and PVY.
  • the conversion plants can be expected to increase crop yields and economic effects.
  • Figure 1 shows the results of resistance of the Pvr4 gene to SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus in Nicotiana benthamiana ( N. benthamiana) (Lee et al ., Virus Research, 2011, vol. 155, 487- 494).
  • the Pvr4 gene resistance gene from Figure 1, the Empty Susceptible allele of pvr4 gene and empty plasmid was a positive control.
  • A is the result of ELISA using an antibody which recognizes the envelope protein of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus (Lee et al ., Virus Research, 2011, vol. 155, 487-494).
  • (B) shows the results of RT-real PCR using a primer for detecting VPg of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus. 5 times in total.
  • Figure 2 is a potato virus Y-0 (Potato virus Y: PVY-0) in N. benthamiana: the result showing a resistance gene for Pvr4 (PepSMV Pepper severe mosaic virus) and peppers severe mosaic virus. Simultaneous infiltration of Pvr4 and Empty vectors using Agrobacterium, followed by rubbing with tobacco inoculum infected with PVY-0 and PepSMV, followed by 1, 2, 3, 4, 5 and 6 Five tobacco leaf disks each were randomly sampled from five plants on day one. Samples were analyzed by ELISA using antibodies recognizing envelope proteins of PVY-0 and PepSMV, respectively.
  • PepSMV PepSMV
  • FIG 3 is a result showing the resistance to PVY of potatoes transformed with the Pvr4 gene.
  • Potato virus Y (PVY-0) was inoculated on a potato transformed with Pvr4, followed by ELISA using antibodies that recognize RT-PCR (top picture) and envelope proteins using primers for detecting Vpg of PVY-0. (Bottom graph).
  • FIG. 4 shows pepper C. annuum cv. Jupiter and Tobacco in N. bethamiana Co-infiltration of Agrobacterium to identify the Pvr4 gene.
  • A derived from pepper CM334 Pvr4 gene Pvr4-R, or Susceptible allele of each SP6PepMoV Pvr4- S-Vb1 / GFP virus RNA-dependent RNA polymerase (NIb) and with C.annuum derived from cv. Jupiter was co-infiltrated with Agrobacterium. At the time of co-infiltration, the Jupiter lobes were recovered and destained with ethanol to confirm the results.
  • R3a is a potato gene-derived phytophthora infestans Resistant gene, Avr3a , Phtyophthora infestans effector , NIP , Phytophthora sojae Derived necrosis induced protein was used as a positive control.
  • FIG. 5 shows that the Pvr4 gene and NIb of the fortiviruses SP6PepMoV-Vb1 / GFP, PepSMV, PVY, and TEV are co-infiltrated with Agrobacterium in the leaves of N. benthamiana .
  • Negative controls were empty vectors and NIb genes of SP6PepMoV-Vb1 / GFP, PepSMV, PVY, and TEV.
  • R3a and Avr3a were used as positive controls. Circle shapes refer to areas infiltrated on the leaf panels. This leaf is representative of what was analyzed and tested in this example. Images were taken 4 days after infiltration.
  • Figure 6 is an image showing the disease symptoms of pepper and tobacco infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus that can be confirmed by the fluorescent light green fluorescent protein inserted in the genome of the fortivirus PepMoV under UV light fluorescence Lee et al ., Virus Research, 2011, vol. 155, 487-494.
  • A is a C. annuum landrace CM334 (resistance phenotype) that exhibits a resistance phenotype to SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus (TC06495, RDA, Korea), and a susceptible phenotype that exhibits a mottled phenomenon.
  • C. annuum cv is a C. annuum landrace CM334 (resistance phenotype) that exhibits a resistance phenotype to SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus (TC06495, RDA, Korea), and a susceptible phen
  • ECW ECW
  • C. annuum cv. Jupiter TC05533, Agricultural Genetic Resource Information Center, Rural Development Administration, Korea.
  • Pepper was photographed 14 days after rubbing with the inoculum of tobacco tissue infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus.
  • B is a cigarette Nicotiana tabaccum cv.
  • Xanti NC was infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus at 14 days, followed by ultraviolet (UV) irradiation to confirm that the virus was infected and photographed.
  • CM334 was used as a resistant individual and ECW123R was used as a diseased individual.
  • Phe means phenotyping and Gen means genotyping.
  • R stands for resistant genotype
  • H stands for hetero genotype
  • S stands for susceptible genotype.
  • pinot typing R means resistant pinotype and S means pathogenic pinotype.
  • Figure 8 shows the gene based cloning performed in the present invention.
  • Figure 9 shows the homology of the genes and alleles Pvr4 pvr4 gene in the present invention.
  • the Pvr4 gene is a coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat (CC-NBS-LRR) type and has an open reading frame (ORF) sequence of 5238 nucleotides and a 1745 amino acid sequence.
  • Figure 9b is a result of comparing the entire amino acid sequence of the Pvr4 gene and pvr4 gene using the Blast program of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Figure 10 shows the genomic DNA region of the Pvr4 gene in the present invention.
  • Figure 10 (a) is a genomic DNA region of the Pvr4 gene, consisting of seven exons and six introns, and shows that 13,870 nucleotides from the start codon to the stop codon.
  • Figure 10 (b) means that the nucleotide sequence of exon 2, 3, 4, 5, 6 of the Pvr4 gene has 95% homology.
  • 10 (c) means that the introns 2, 3, 4, 5 base sequence has a high homology of 99%.
  • Figure 11 shows apoptosis symptoms in N. benthamiana .
  • A is SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus were infected by tobacco inoculated solution at a concentration of 3ml / g've rubing (rubbing), it has left the empty vector (Empty vector) vector, and the right of pCAMBIA2300 Pvr4 the leaves of N. benthamiana Each of the genes were infiltrated with Agrobacterium on day 2, and the result images.
  • B is in N.
  • benthamiana PepSMV-infected tobacco inoculation was rubbed at a concentration of 3 ml / g, and the empty vector pCAMBIA2300 on the left and the Pvr4 gene on the right were infiltrated with Agrobacterium on day 2, respectively.
  • C rubs the tobacco inoculation with N. benthamiana to PVY at a concentration of 3 ml / g, using the empty vector pCAMBIA2300 on the left side and the Pvr4 gene on the right side using Agrobacterium on day 2. The resultant image is infiltrated.
  • the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or an amino acid sequence having 85% or more of sequence similarity with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having potyvirus resistance; and provides the fortivirus resistance protein Pvr4.
  • Plants isolated and identified at the genome level for the Pvr4 gene and transformed with the Pvr4 gene have been identified using the hypothesis that it is involved in pepper mottle virus (PepMoV; Pepper severe mosaic virus , PepSMV; Potato virus Y , Objective facts of direct resistance to PVY) were identified.
  • the present invention is a protein that is specifically resistant to fortiviruses.
  • specific resistance in the specification of the present invention means a characteristic capable of inhibiting the proliferation or activity of the fortivirus, the immune system activity, the immune response augmentation or the immune response activity, or killing the plant cell or plant. When introduced, it refers to a property that can specifically inhibit proliferation or kill the fortivice.
  • the present invention includes a protein that has specific resistance against fortivirus, but is not limited to a fortivirus existing in nature.
  • the fortivirus is PepMoV ( Pepper mottle virus ), PepSMV ( Pepper severe mosaic virus ), and PVY ( Potato). virus Y ) and one or more fortiviruses selected from the group consisting of.
  • the range of Pvr4 protein according to the present invention includes a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a functional equivalent of the protein.
  • the term "functional equivalent” means 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more sequences with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids. It has homology and refers to a protein that exhibits substantially homogeneous physiological activity with the protein represented by SEQ ID NO: 3. "Substantially homogeneous physiological activity” means resistance to fortiviruses.
  • the present invention also includes fragments, derivatives and analogues of the Pvr4 protein. As used herein, the terms “fragment”, “derivative” and “analogue” refer to a polypeptide that possesses substantially the same biological function or activity as the Pvr4 polypeptide of the invention.
  • the present invention provides a gene encoding the fortivirus resistance protein Pvr4.
  • Pvr4 gene of the present invention has a nucleotide sequence which is currently unknown, and is characterized by having resistance to fortiviruses .
  • the Pvr4 gene of the present invention includes all of genomic DNA, cDNA and synthetic DNA encoding Pvr4 protein.
  • the gene of the present invention may comprise a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (genomic DNA) or SEQ ID NO: 2 (cDNA).
  • SEQ ID NO: 1 genomic DNA
  • SEQ ID NO: 2 cDNA
  • homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene has at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95% homology with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the branch may comprise a polynucleotide sequence.
  • the "% sequence homology" for polynucleotides is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences ( May include additions or deletions (ie, gaps) compared to additions or deletions).
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the Pvr4 gene according to the present invention.
  • the Pvr4 gene may be preferably composed of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the term "recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. In principle, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize in the host.
  • An important feature of the expression vector is that it has a origin of replication, a promoter, a marker gene and a translation control element. Enhancers, ribosomal binding sites, termination signals, polyadenylation signals, and promoters that are translation control elements available in eukaryotic cells are known in the art.
  • Expression vectors in the present invention can be constructed by methods well known in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, DNA synthesis techniques, in vivo recombinant techniques, and the like.
  • the DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in the expression vector to drive mRNA synthesis.
  • the expression vector may also include ribosomal binding moieties and transcription terminators as translation initiation sites.
  • Preferred examples of recombinant vectors in the present invention are Ti-plasmid vectors capable of transferring part of themselves, the so-called T-region, to plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens.
  • a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens.
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0116718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which plant cells or new plants can be produced which properly insert hybrid DNA into the genome of the plant.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0120516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those that can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous, especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the promoter may be a promoter suitable for transformation, preferably a CaMV 35S promoter, an actin promoter, a ubiquitin promoter, a pEMU promoter, a MAS promoter or a histone promoter, preferably a CaMV 35S promoter This is not restrictive.
  • promoter refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in plant cells.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Persistent promoters may be preferred in the present invention because selection of the transformants may be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit the selectability.
  • the terminator may use a conventional terminator, such as nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agrobacterium tumerfaciens ( Terminator of octopine gene of Agrobacterium tumefaciens ), but is not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator phaseoline terminator
  • agrobacterium tumerfaciens Terminator of octopine gene of Agrobacterium tumefaciens
  • the recombinant vector of the present invention may comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by chemical methods, and all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol.
  • herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin
  • antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the present invention provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention may be any host cell known in the art.
  • Examples of prokaryotic cells include E. coli JM109, E. coli BL21, and E. coli. RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus genus strains, such as Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia martensons and various Enterobacteria such as Pseudomonas species and strains.
  • yeast Saccharomyce cerevisiae
  • insect cells e.g., human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2) , 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells and the like
  • human cells e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2) , 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • plant cells and the like e.g., a plant cells.
  • the recombinant vector of the present invention may be prepared by a CaCl 2 method, a Hana method (Hanahan, D., J. Mol. Biol. , 166: 557-580 (1983)), an electroporation method, and the like. Can be transported into cells.
  • the vector can be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, or the like. have.
  • the present invention is a pathogenicity against fortivirus comprising the step of introducing a recombinant vector comprising a gene encoding the Pvr4 protein into plant cells to transform and overexpress the Pvr4 gene in the transformed plant cells
  • the gene in the present invention may include a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene has at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95% homology with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the branch may comprise a polynucleotide sequence.
  • the host cells are preferably Capsicum sp. Or Solanum sp. Plant cells, and more preferably pepper cells, potato cells, tomato cells. Or it may be a branch cell, but is not limited thereto.
  • the method for transforming the plant cells is as described above.
  • the present invention is a method of increasing the resistance of plant cells or plants to fortiviruses using the Pvr4 gene, common information between the two is omitted to avoid excessive description in the specification of the present invention.
  • the present invention comprises the steps of (a) transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding fortivirus resistance protein Pvr4; And (b) regenerating the transformed plant from the transformed plant cell prepared by step (a), wherein the trait has increased fortivirus resistance compared to the pathogenic or non-transgenic plant for the fortivirus. It provides a method for producing a converted plant.
  • the gene in the present invention may include a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene has at least 80%, more preferably at least 85%, more preferably at least 90% and most preferably at least 95% homology with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the branch may comprise a polynucleotide sequence.
  • the method for transforming the plant cells is as described above, and the method for regenerating the transformed plant from the transformed plant cells may use any method known in the art.
  • the present invention is a method for producing a transgenic plant having increased fortivirus resistance using the Pvr4 gene, common information between the two is omitted to avoid excessive description in the specification of the present invention.
  • the present invention provides a transformed plant and its transformed seed having increased resistance to fortivirus produced by the above method.
  • the transformed plant having increased resistance to fortivirus is classified as Solanaceae , Chenopodiaceae , or Regu, which is a host plant infected by Fortivirus.
  • Solanaceae Chenopodiaceae
  • Regu which is a host plant infected by Fortivirus.
  • Minose-Papilionoideae Amaranthaceae
  • Cucurbitaceae Cucurbitaceae
  • Compositae Compositae
  • Cruciferae preferably It is a solanaceae family.
  • the invention provides an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or an amino acid sequence having 85% or more of sequence similarity with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having a potyvirus resistance; and comprising a gene encoding the fortivirus resistance protein Pvr4.
  • a composition for increasing fortivirus resistance is provided.
  • the present invention comprises a gene encoding a protein Pvr4 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, by transforming the gene into a plant can increase the fortivirus resistance of the plant.
  • the present invention uses the gene encoding the Pvr4 protein, common information between the two is omitted to avoid excessive description in the specification of the present invention.
  • the invention provides forward or reverse primers consisting of at least 10 consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or nucleotide sequences complementary thereto.
  • the present invention provides a probe consisting of at least 10 consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence complementary thereto.
  • the present invention relates to a forward or reverse primer consisting of (i) at least 10 consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or nucleotide sequences complementary thereto, or (ii) SEQ ID NO:
  • a kit for detecting a fortivirus resistant Pvr4 gene comprising a probe consisting of 10 or more consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence of 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the term "primer” refers to an oligonucleotide, which is a condition in which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid chain (template) is induced, i.e., the presence of a polymerizer such as nucleotide and DNA polymerase, and It can serve as a starting point for the synthesis at conditions of suitable temperature and pH.
  • the primer is deoxyribonucleotide and single chain.
  • Primers used in the present invention can include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the primer may also include ribonucleotides. Design of such primers can be easily carried out by those skilled in the art with reference to the above-described nucleotide sequence, for example, can be performed using a program for primer design (eg, PRIMER 3 program).
  • a program for primer design eg, PRIMER 3 program.
  • the primer should be long enough to prime the synthesis of the extension product in the presence of the polymerizer. Suitable lengths of the primers depend on a number of factors, such as temperature, application and source of the primer, for example 10 or more, preferably 10-100, more preferably 10-50 Dog, even more preferably 10-30 nucleotide sequences.
  • annealing or “priming” refers to the placement of oligodioxynucleotides or nucleic acids into a template nucleic acid, wherein the polymerase polymerizes the nucleotides to form a nucleic acid molecule that is complementary to the template nucleic acid or portion thereof. Let's do it.
  • the primer used in the present invention includes a sequence substantially complementary to the target nucleic acid sequence.
  • the term "complementary" means that the primer or probe is sufficiently complementary to selectively hybridize to a target nucleic acid sequence under certain annealing or hybridization conditions, and is substantially complementary and perfectly complementary. It has the meaning encompassing all, and preferably means completely complementary.
  • the primer is deoxyribonucleotide and single chain.
  • Primers used in the present invention can include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • probe is a single-chain nucleic acid molecule comprising a sequence substantially complementary to a target nucleic acid sequence.
  • the probe is deoxyribonucleotide and single chain.
  • Probes used in the present invention may include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the probe may also include ribonucleotides.
  • the length of the probe consists, for example, of at least 10, preferably 10-100, more preferably 10-50, even more preferably 10-30 nucleotide sequences.
  • hybridization herein means that two single stranded nucleic acids form a duplex structure by pairing of complementary base sequences. Hybridization may occur when the complementarity between single stranded nucleic acid sequences is perfect or even when some mismatch base is present. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on the hybridization reaction conditions, and in particular, may be controlled by temperature.
  • the method of annealing or hybridizing the primer and the probe may be performed by a hybridization method known in the art.
  • suitable hybridization conditions can be determined in a series of procedures by an optimization procedure. This procedure is carried out by a person skilled in the art in order to establish a protocol for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and reaction time, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as the length and GC amount of the oligonucleotide and the target nucleotide sequence.
  • the label which generates a detectable signal is a chemical label, an enzyme label, a radiolabel, a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label or a metal label (eg gold).
  • the chemical label includes biotin.
  • the binding specificity of streptavidin (or avidin) and biotin causes an indirect signal to be generated that represents the target nucleic acid sequence.
  • Such enzyme labels include alkaline phosphate, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, luciferase, cytochrome P450 and horseradish peroxidase.
  • the present invention is a primer, a probe, or a kit including the same, which can hybridize complementarily with SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide complementary to the present invention, the contents common to the present invention are excessively described herein. It is omitted to avoid.
  • the present invention provides an antibody against the fortivirus resistant protein Pvr4.
  • antibody refers to monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, camelised antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFv), single chain antibodies , Single domain antibodies, Fab fragments, F (ab) fragments, disulfide-binding Fvs (sdFv), and antiidiotype (anti-Id) antibodies, and any epitope binding fragment described above.
  • antibodies include immunoglobulin molecules and immunologically active immunoglobulin molecule fragments, ie molecules containing antigen binding sites.
  • Immunoglobulin molecules can be of any kind (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), classes (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) or subclasses.
  • Antibodies of the invention can be prepared by cloning the genes of the invention into expression vectors according to conventional methods to obtain Pvr4 protein, and from the proteins obtained by conventional methods. Also included are partial peptides that may be made from such proteins, and the partial peptides of the present invention include at least seven amino acids, preferably nine amino acids, more preferably twelve or more amino acids.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding.
  • the antibody of this invention also contains special antibodies, such as a humanized antibody.
  • the present invention provides a kit for detecting fortivirus resistant Pvr4 protein comprising the Pvr4 protein antibody of the present invention.
  • Kits of the invention include kits for immunoassays.
  • the immunoassay includes radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunoaffinity. But not limited to tablets.
  • kits of the present invention when the kit of the present invention is carried out according to radioimmunoassay, an antibody labeled with a radioisotope (eg, 14 C, 125 I, 32 P and 35 S) (an antibody that specifically binds to the marker) ) May be used.
  • a radioisotope eg, 14 C, 125 I, 32 P and 35 S
  • the enzyme bound to the secondary antibody includes, but is not limited to, an enzyme catalyzing a color reaction, a fluorescence reaction, a luminescence reaction, or an infrared reaction.
  • an enzyme catalyzing a color reaction e.g., alkaline phosphatase, ⁇ Galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase and cytochrome P450.
  • the detection antibody carries a label that generates a detectable signal.
  • the labels may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P450), radioactive substances (eg 14 C, 125 I, 32 P and 35 S), fluorescent materials (eg, fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • chemicals eg biotin
  • enzymes alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P450
  • radioactive substances eg 14 C, 125 I, 32 P and 35 S
  • fluorescent materials eg, fluorescein
  • luminescent materials eg, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • Fortivirus resistant Pvr4 protein detection kit of the present invention can be produced in a variety of known kits, for example, but not limited to, for immunoassay (immunoassay) kit, gene amplification kit.
  • the invention provides an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or an amino acid sequence having 85% or more of sequence similarity with the 541-1745th sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having a potyvirus resistance; a plant of a gene encoding a protein Pvr4 having resistance to fortivirus It provides a use for increasing the fortivirus resistance of.
  • the present invention is the use of the resistance protein Pvr4 and the gene encoding the same in the present invention, the common content between the two omit the description in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • CM334 ( Pvr4 / Pvr4, TC06495, RDA, RDA, Korea) was used as a pepper plant species resistant to PepMoV, and ECW123R ( pvr4 / pvr4, New Mexico University, USA) and Jupiter ( pvr4 ) were used as pathogenic individuals. / pvr4, TC05533, Agricultural Genetic Resource Information Center, Rural Development Administration, Korea). Two pepper populations were used for DNA analysis and viral resistance analysis as a means to perform genome-based cloning of the Pvr4 gene. First, we used the BC1F3 population, which is a hybrid of the ECW123R and CM334, used in previous studies (Kim, Han et al ., TAG.
  • N. benthamiana After infection, after 14 days, the upper tissue of N. benthamiana was collected and used as the inoculum. 10 g of N. benthamiana infected with the SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus was collected in a mortar and crushed by adding 30 ml of phosphate buffer to inoculate the solution at a concentration of 3 ml / g. In the same manner, PepSMV, PVY-infected tobacco inoculum was prepared. After inoculation, 405 F2 hybrids of Jupiter and CM334 and 1063 individuals of BC1F3 through female hybridization of CM334 and ECW123R were inoculated with carborundum (400 mesh) at 4-5 weeks after inoculation. Next, the inoculum of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus made at the concentration of 3 ml / g was rubbed into the main leaf of 1468 peppers.
  • the nucleic acid precipitate was washed once more with 70% ethanol and dried in air for 5 hours. After drying, 50 ⁇ l of TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl) and RNase (10 U / ⁇ l) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Nucleic acid was quantified by spectrophotometer (ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc).
  • Genotyping was performed with PCR (Polymerase Chain Reaction) equipment.
  • the PCR reaction solution was composed of 2X PCR PreMix (EmeraldAmp GT PCR Master Mix), 10 uM primer, and 50 ng of template nucleic acid so that the total volume was 20 ⁇ l.
  • PCR reaction was heated for 5 minutes at 95 °C and then repeated 40 cycles (95 °C 30 seconds, 58 °C 30 seconds, 72 °C 1 minutes), and then reacted for 5 minutes at 70 °C and stored at 4 °C.
  • the indicated molecular label was added to the 10 ⁇ l PCR product, 0.5 ⁇ l of restriction enzyme Mbo I restriction enzyme, 2 ⁇ l of restriction enzyme buffer and 7.5 ⁇ l of DW, followed by reaction at 37 ° C. for 4 hours.
  • a 1.5% agarose gel was loaded with a restriction enzyme treated nucleic acid product, followed by electrophoresis to identify the band.
  • SNP61786 molecular label has 1000 bp and 550 bp bands for homo resistance (R), 500 bp and 350 bp bands for homo pathogenicity (S) and 4 bands above 1000 bp, 550
  • the presence of bp, 500 bp and 350 bp was distinguished by marking on a gel photograph with hetero resistance (H).
  • TG420 Based on what pepper has been reported to be well synthesized in the tomato genome (Wu et al. , TAG, 2009, vol. 118, 1279-1293), TG420, a previously reported tomato molecular label, As a reference, a sequence corresponding to the region of 50 Mb to 60 Mb located in the telomere direction in the tomato chromosome 10 sequence region was obtained, and the scaffold of the CM334 was obtained by using the obtained tomato sequence as a query. Was separated. The obtained sequence was predicted by the bioinformatics technique to determine the structure of the gene located on the scaffold.
  • the NBARC gene group predicted in the selected scaffold was analyzed using the NBARC gene family information from the Pepper genome paper (Kim et al. , Nat Genet, 2014, vol. 46, 270-). 278).
  • a SNP61786 molecular label associated with the Pvr4 gene was developed in the predicted sequence of NBARC genes.
  • Scaffolds containing SNP61786 molecular markers that matched the genotype and phenotype of 1468 individuals with a 3: 1 resistance and pathogenicity ratio of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus were isolated. Two scaffolds were selected, and the bioinformatics program (FGENESH, Softberry) predicted the structure of the eight genes located in the scaffold, taking the start codon and the stop codon into account. A primer was prepared to separate full genes.
  • PCAMBIA2300 vector with a 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) to overexpress the Pvr4 candidate gene (a vector that is commercially available as a free distribution to researchers and is available from http://www.cambia.org/daisy/cambia in Australia) /653.html) and an adapter sequence was added to the primers in regions 5 and 3 to utilize ligation independent cloning (Oh et al. , Mol Cells, 2010). , vol. 30, 557-562): 5'-CGACGACAAGACCCT (adapter sequence) Gene specific sequence-3 'and 5'-GAGGAGAAGAGCCCT (adapter sequence) gene specific sequence-3'.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • PCR product After purification of the amplified PCR fragments, 5-10 ⁇ l of PCR product, 1 ⁇ l of T4 DNA polymerase (NEB) and 1 ⁇ l of 10 mM dATP were added, respectively. Distilled water was added so that the total volume was 20 ⁇ l and reacted at 22 ° C. for 30 minutes, followed by reaction at 70 ° C. for 20 minutes.
  • the pCAMBIA2300 vector treated with Pst I was purified and then 1 ⁇ l of T4 DNA polymerase and 1 ⁇ l of 10 mM dTTP were added. Distilled water was added so that the total volume was 20 ⁇ l and reacted at 22 ° C. for 30 minutes, followed by reaction at 70 ° C. for 20 minutes.
  • Agrobacterium C58C1 transformed with Pvr4 candidate gene and SP6PepMoV-Vb1 / GFP-NIb were incubated for 2 days and centrifuged, respectively, and then 10 mM MgCl 2 , 10 mM MES pH so that the OD values were 1.0 and 0.5, respectively.
  • Two cells were mixed and suspended in a buffer having a composition of 5.6 and 200 ⁇ M Acetosyringone. After incubation for 2 hours at room temperature to increase the pathogenicity, co-infiltrate to Jupiter or N. benthamiana leaves grown for 4-5 weeks. 2-3 days after co-infiltration, cell necrosis was observed.
  • OD (optical density) values of NIb of Pvr4 gene and SP6PepMoV-Vb1 / GFP, PepSMV, PVY were set to 1.0 and 0.5, respectively, and co-infiltrated with N. benthamiana leaves with A. tumefaciens C58C1. .
  • NIP a toxin secreted by Phytophthora sojae
  • a positive control Qutob et al, Plant J, 2002, vol. 32, 361-373
  • cell necrosis reaction was reported when R3a (OD 600 : 0.5), a resistance gene of potato blight bacteria, and Avr3a (A 6003: OD 600 : 0.3), an RxLR effector secreted by potato blight bacteria (Jorunn).
  • R3a OD 600 : 0.5
  • Avr3a A 6003: OD 600 : 0.3
  • an RxLR effector secreted by potato blight bacteria Jorunn
  • co-infiltration with Agrobacterium for use as a positive control group due to the interaction of resistance genes with secretory proteins of pathogens. It became.
  • Cell necrosis was confirmed visually after removing chlorophyll by adding tobacco or pepper leaves to 100% ethanol (EtOH).
  • the tobacco inoculum infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus was rubbed at a concentration of 3 g / ml on the leaves overexpressing the Pvr4 gene.
  • five leaf discs were collected from the inoculated leaves on Days 1, 2, 3, 4, and 5, and then RT-PCR (real-) using primers capable of detecting the VPISA of the ELISA reaction and virus. proliferation of PepMoV was confirmed by time PCR).
  • the SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus is transformed with the inoculation of N. benthamiana plants (Pvr4 gene, Susceptible the pvr4 gene isolated from the pepper ECW (susceptible allele of Pvr4) and empty vector (Empty vector) in each of Agrobacterium infiltration After 1 day, 5 leaf disks were taken from the N. benthamiana inoculation leaf infected with the overexpressed leaf by rubbing a tobacco inoculation made with SP6PepMoV-Vb1 / GFP at a concentration of 3 ml / g. Total RNA is isolated using TRIzol (Invitrogen).
  • First cDNA is synthesized using 3 ⁇ g of total RNA as a template with Superscript reverse transcriptase (Invitrogen) for RT time (Real time PCR).
  • RT PCR was performed using primers capable of detecting VPg of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus using the synthesized cDNA as a template.
  • RT PCR was performed using Rotor-Gene 6000 (Qiagen) using SYBR Green (Invitrogen). To determine the amount of proliferation of the virus, it was quantified based on actin of N. benthamiana or Solanum tuberosum .
  • the proliferation of the SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus should be inhibited when the Pvr4 gene is overexpressed.
  • the single dominant resistance gene Pvr4 , the pathogenic allele pvr4 , and the empty vector are affected by the pathogenic N. benthamiana .
  • Proliferation of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus was performed by ELISA (SRA 38000) using an antibody capable of detecting coat protein of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus. After inoculation, virus proliferation was most inhibited on day 4 and resistance was maintained until day 5. To determine whether the same resistance is induced at the level of RNA transcription, total RNA was isolated from the same amount of inoculation leaves collected at the same time, and cDNA was synthesized to detect VPg of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus. real time) PCR was performed.
  • the Pvr4 gene showed the greatest resistance to SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus on day 4 post inoculation. Resistance of Pvr4 was most effective at day 4 post-inoculation, in both ELISA and RT PCR results. As a result, this result is evidence that the identified Pvr4 gene induces resistance by inhibiting the proliferation of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus by expression alone in N. benthamiana (FIG. 1).
  • Pvr4 a single dominant resistance gene, Pvr4 , a pathogenic allele pvr4 and an empty vector, respectively, was recruited to the pathogenic N. benthamiana .
  • Pvr4 gene Resistance of the Pvr4 gene was most effective in the ELISA results from 3 days after inoculation. Proliferation of PVY was performed using ELISA (SRA 20600) using an antibody capable of detecting coat protein of PVY. It was observed that Pvr4 gene inhibited PVY proliferation up to 6 days after inoculation. Since proliferation of PepSMV is not commercially available, an antibody capable of specifically detecting PepSMV is used, and an ELISA (PepSMV: SRA 27200) capable of detecting a broad range of potyvirus coat protein was used.
  • Example 3 Resistance test against PVY of potato ( Solanum tuberosum ) transformed with Pvr4 gene
  • Example 1 and on the basis of the results of two practically when sikyeoteul infection of PVY in Pvr4 potato (Solanum tuberosum) gene is transformed, Pvr4 gene by cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter in order to ensure that represents the resistance Potato transformants were developed that overexpress.
  • S. tuberosum spp. which is pathogenic to PVY.
  • Daeji potato varieties were transformed with the Pvr4 gene and inoculated by rubbing the inoculation solution of PVY-infected tobacco tissue at a concentration of 3 ml / g in the main leaves of potato 4-5 weeks after purifying.
  • N. benthamiana which was used as the inoculum, was used as a positive control, and S.
  • tuberosum spp. Daeji was used.
  • Empty vector Empty vector
  • Transgenic presence or absence of the gene was confirmed by performing a RT-PCR using the respective primer capable of detecting and then to synthesize cDNA by extracting total RNA from potato, Pvr4 genes and gene NBARC575. Actin from potatoes was used for quantification. One month after the PVY inoculation, five leaf disks of the upper lobe were taken and an Agdia PVY detection ELISA (PVY: SRA 20600) was used. Only in the potato transformed with the Pvr4 gene, virus proliferation similar to that of the negative control group was observed . RT-PCR was performed using primers capable of detecting VPg of PVY. Proliferation of PVY was confirmed that the potato used as a negative control and Pvr4 gene was not detected only in the transformed potatoes (Fig. 3).
  • the Pvr4 gene which is a strong and persistent resistance gene, is transformed into potato or tomato that is severely damaged by fortivirus , and develops resistant varieties efficiently in a short period of time, it is expected that the yield of crops can be economically increased. Can be.
  • Example 4 In planta function analysis of Pvr4 gene
  • the NIb (RNA-dependent RNA polymerase) (OD 600 0.5) of SP6PepMoV -Vb1 / GFP virus, known as the effector of Pvr4 in previous studies, was selected from the Pvr4 candidate gene (OD). 600 1.0) and co-infiltration with N. benthamiana using Agrobacterium C58C1, respectively.
  • HR hypersensitive response
  • Pvr4 gene (OD 600 1.0) and SP6PepMoV-Vb1 / GFP-NIb (OD 600 0.5) were co-infiltrated with N. benthamiana leaves as well as Jupiter leaves, which are pathogenic peppers. It was.
  • NBSLRR nucleotide-binding site leucine rich repeat
  • Example 3 Based on the experimental results of Example 3, it was hypothesized that the wide range of resistance seen by the Pvr4 gene was induced by recognizing the NIb of fortivirus . Therefore, in order to recognize the NIb of Fourteen Pvr4 virus genes exhibiting no toxicity to ensure that the induction sensitive emotional reaction, using Agrobacterium the NIb and PVY or PepSMV Pvr4 genes were co-infiltrated in N. benthamiana. As a result, it was confirmed that hypersensitivity reaction occurred only when the Pvr4 gene was co-infiltrated with NIb of resistant virus.
  • the Pvr4 gene shows resistance to PepSMV and PVY as well as to SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus but not to TEV (Janzac et al ., Plant Pathol. 2009, vol. 58, 443-449). No hypersensitivity reaction was observed when NIb of TEV, which is pathogenic to Pvr4 gene, was co-infiltrated with Pvr4 gene. These results support the hypothesis that NIb of a wide range of fortivirus mediates resistance through interaction with the Pvr4 gene (FIG. 5).
  • Example 6 CM334 Pepper with Resistance to SP6PepMoV-Vb1 / GFP Virus and ECW, Jupiter and N. tabaccum
  • CM334 (TC06495, RDA, RDA, Korea), ECW (TC06444, RDA, RDA, Korea) and Jupiter (TC05533, RDA, 3 ml / g of tobacco inoculum infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus, which is inserted into the genome of PepMoV into the genome of PepMoV.
  • was rubbed (Lee, Song et al ., Virus research , 2011, vol. 155, 487-494).
  • CM334 contains the Pvr4 gene , which inhibits the proliferation of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus, resulting in ER (extreme resistance) in the upper lobe.
  • ECW and Jupiter which are pathogenic peppers, showed an irregular mottling phenomenon in the color of the upper lobe because there was no resistance gene Pvr4 gene (FIG. 6A).
  • the SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus used in the experiment has the advantage that GFP is inserted into the genome of the virus, and when SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus is proliferated, the expression of GFP can be observed under UV light. Therefore, inoculation of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus to N. tabaccum for use as an inoculum to confirm the growth of SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus was observed under UV light. As evidence, GFP could be observed. Expression of this GFP provided the convenience of experimentation when determining the SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus resistance of pepper (FIG. 6B).
  • CM334 was used as a resistant individual and ECW123R and Jupiter were used as a pathogenic individual.
  • each leaf of 1063 individuals of BC1F3 obtained by cross-breeding F1 which is a hybrid of CM334 and ECW123R, was infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus at 3 ml / g.
  • the separation ratio of resistance and pathogenicity was 812: 251, respectively, indicating a 3: 1 separation ratio (Table 1).
  • F1 obtained by crossing Jupiter and crossbreeding CM334 showed resistance to SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus, indicating that the resistance gene is the dominant gene.
  • the F2 population of 405 individuals obtained by self-pollinating F1 hybrids was then rubbed with 3 ml / g of the inoculum of tobacco tissue infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus in the same manner, resulting in resistance and pathogenicity
  • the separation ratio of 3: 1 was found to be 309: 96. This isolation ratio meant that resistance to SP6PepMoV-Vb1 / GFP was induced by a single dominant resistance gene based on Mendel's genetic law.
  • BC1F3 refers to an individual who self-pollinated an F1 object obtained by using CM334 as a parent and ECW123R as a parent, three times by re-crosslinking the EC1123 with ECW123R.
  • the Expected ratio refers to the expected ratio of the separation ratio when resistance to a single virus is induced by a single dominant resistance gene
  • the Observed frequency refers to the experimental results shown by ELISA after inoculation of PepMoV virus in each pepper population.
  • R means an individual exhibiting a resistance phenotype
  • S means an individual exhibiting a susceptible phenotype.
  • the chi-square test was performed to show whether the expected ratio and the observed frequency were statistically significant, which is X 2 . Finally, it was verified whether the chi square test showed a significant ratio by the P value.
  • Capsicum and tomato are crops belonging to the family Aubergine, and the chromosomes are well preserved.
  • Pvr4 the resistance gene of the fortivirus, has been reported to be located near the TG420 molecular marker of tomato in the telomere region of chromosome 10 in many previous studies and previous studies (Wu, Eannetta et al ., TAG, 2009, vol. 118, 1279-1293; Kim, Han et al ., TAG. 2011, vol. 122, 1051-1058).
  • Some sequences of 50-60 Mb were isolated from the entire region of 87 Mb of chromosome 10 based on the region containing TG420 well preserved at the sequence level of tomato and pepper.
  • CM334 scaffold sequence was a sequence of a predetermined region including the TG420 molecular label.
  • the gene was predicted through the FGENESH program, and primers were prepared in the exon region of the gene, and PCR was performed using CM334 and gDNA of Jupiter as a template. PCR products were identified SNP and Indel through sequencing, and the SNP61786 molecular label was co-separated from the Pvr4 gene using the sequence difference (Fig. 7).
  • Example 9 Schematic diagram showing the genetic or physical distance of the Pvr4 gene region on Chromosome 10 of red pepper
  • SNP20172 SNP575, SNP61786, SNP1072, and SNP1983 were selected as the molecular markers closest to the Pvr4 gene among 31 molecular markers associated with the Pvr4 gene.
  • FGENESH was selected. Gene was predicted through.
  • plant resistance genes have been reported to have the structure of a nucleotide-binding site (NBS), a leucine-rich repeat (MRRett, Advances in virus research, 2009, vol. 75, 1-33, 228-229). .
  • the potato virus resistance gene Rx on X is a gene that has a structure with NBSLRR CC (coiled-coil) to the N- terminal domain, resistance gene of Xanthomonas campestris Bs2 also had a CC-NBSLRR structure N , the resistance gene of Tobacco mosaic virus , is an NBSLRR gene with a TIR (Toll / interleukin-1 receptor-like) domain at the N -terminus (Kang et al ., Annu. Rev. Phytopathol, 2005). , vol. 43, 581-621; Moffett, Advances in virus research, 2009, vol. 75, 1-33, 228-229).
  • TIR Toll / interleukin-1 receptor-like domain
  • the Pvr4 gene also had an NBS-LRR structure, and the NBLRR gene located in this region was found to have 8 NBLRR genes.
  • Eight Pvr4 resistant candidate genes in this region were divided into two groups by comparison of the nucleotide homology of NBARC, and were estimated to exist in the form of duplication of NBSLRR genes.
  • the NBSLRR gene which has all the structures necessary to function as a resistance gene, is indicated by a square arrow at the end and four genes were analyzed as having a complete structure.
  • BACs containing this region were selected to confirm gene information.
  • the red arrow indicates the Pvr4 gene, indicating that the structure of the Pvr4 gene is a gene consisting of seven exons and six introns (FIG. 8).
  • the Pvr4 gene isolated from the CM334 identified through the above experiments is a coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat (CC-NBS-LRR) type, and a total of 5238 nucleotide open reading frame (ORF) sequences And has 1745 amino acid sequences.
  • the pvr4 gene, identified as the pathogenic allele of the Pvr4 gene in ECW has an ORF sequence of 4806 nucleotides and includes 1601 amino acid sequences (FIG. 9A).
  • the Pvr4 gene is a large sized resistance gene consisting of 7 exons and 6 introns with a total of 13870 bp of nucleotides (FIG. 10A).
  • Exon 1 containing CC-NBS had 2673 bp of nucleotides, and the four exons of exon 2 to exon 5 except the last two exons showed 94% homology with each other (FIG. 10B).
  • the intron region also showed 99% homology between four introns of Intron 2 to Intron 5 (FIG. 10C).
  • Exon 2 and intron 2 are predicted to be tandem duplication with four repeats.
  • the structure of these resistant genes has not been reported to date, and genomic DNA separation by PCR is considered to be technically impossible due to the high homology. Due to this structural specificity, it is assumed that the Pvr4 gene induces a wide range of resistance against various viruses of the fortivirus (FIGS. 10A-10C).
  • N. benthamiana is infected with SP6PepMoV-Vb1 / GFP virus, PepSMV and PVY. After rubbing the inoculum of the tissue at a concentration of 3 ml / g, two days later, the empty vector was infiltrated with Agrobacterium on the left side and overexpressed by infiltration of the Pvr4 gene on the right side.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 포티바이러스(potyvirus)에 대하여 저항성을 가지는 Pvr4 유전자 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명은 Pvr4 유전자 서열을 이용한 분자표지를 사용함으로써 포티바이러스 저항성 고추를 육종하는데 기여할 수 있다. 또한, 본 발명은 포티바이러스에 의해 경제적으로 막대한 생산량 감소를 나타내고 있는 이종 작물인 감자 또는 토마토까지 형질전환시킬 수 있는 특징을 가지며, 이와 같은 형질전환으로 인하여 작물의 생산량 증가 및 경제적인 효과를 기대할 수 있다.

Description

포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도
본 발명은 포티바이러스(Potyvirus) 저항성을 가지는 Pvr4 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
고추(Capsicum annuum)는 분류학적으로 가지과(Solanaceae)에 속하는 식물로, 매운맛 성분인 캡사이신(capsaicin)을 함유하고 있는 작물로 비타민 함량이 높아 생식으로 이용되고 있으며 건고추는 대부분 조미료로 사용되고 있다. FAO(United Nations Food and Agriculture Organization of the United Nations)의 통계에 따르면, 2012년 기준으로, 건고추는 전세계 생산량은 335만톤, 생식용 고추는 3100 만톤이 생산되고 있으며 생산량은 점차 증가 추세에 있다고 보고하고 있다.
포티바이러스(Potyvirus)는 포티비리대 속(Potyviridae spp.) 바이러스로 식물 바이러스 중 가장 많은 종의 바이러스가 포함되며, 59 과에 포함되는 503개 식물을 감염시킨다(Quenouille et al., Mol Plant Pathol 14, 439-452(2013), http://pvo.bio-mirror.cn/genus039.htm#Range). 포티바이러스에 의해 감염되는 숙주식물체(host)은 분류학적으로 주로 솔라나세아 (Solanaceae), 케노포디아세아(Chenopodiaceae), 레규미노세-파필리오노이데아(Leguminosae-Papilionoideae), 아마란타세아(Amaranthaceae), 쿠쿠르비타세아(Cucurbitaceae), 컴포지테(Compositae), 크루시퍼레(Cruciferae), 그라미니에(Gramineae)에 속한다고 보고되어 있다 (VIDE (Virus Identification Data Exchange) project; http://pvo.bio-mirror.cn/genus039.htm#Range). 포티바이러스는 진딧물에 의해 식물체에 전반되는데, 바이러스가 감염된 식물조직의 즙액(sap)에 의해서도 기주식물체에 물리적인 접종이 가능하다. 포티바이러스는 감자(Solanum tuberosum), 토마토 (Solanum lycopersicum) 및 고추 (Capsicum annuum)와 같은 가지과 (Solanaceae) 작물 재배에 있어서 경제적으로 크게는 약 45%의 손실을 유발시킨다고 보고되어 있다(Abdalla et al., Plant disease, 1991, vol.75, No. 10, 1019-1023). 포티바이러스 중 pepper mottle virus (PepMoV)는 700-900 ㎚의 길이, 12-15 ㎚의 폭으로 막대형(rod shape)이며 약 10 Kb의 (+)ssRNA 구조를 가지고 있다. PepMoV는 폴리프로테인(polyprotein)을 발현하고, 폴리프로테인 내에 존재하는 프로테이나제(proteinase)에 의해 11개의 단백질로 잘리게 된다. 그리고 5′말단에 VPg (genome-linked protein), 3′말단에 폴리(A) 테일(poly(A) tail) 구조를 가지고 있다(Quenouille et al., Mol Plant Pathol.,2013, vol.14, 439-452). 한국, 유럽 및 미국 등지에서 고추 및 파프리카 (Capsicum annuum)의 포티바이러스의 자연 발생이 보고되고 있다 (Green et al., Asian Vegetable Research and Development Center, 1991, vol. 9, No. 18, Technical Bulletin 18; Kenyon, L., Kumar, S., Tsai, W. S., & Hughes, J. D. A. (2014). Virus Diseases of Peppers (Capsicum spp.) and Their Control.　Control of Plant Virus Diseases: Seed-Propagated Crops, vol.9, 297-354). PepMoV는 즙액 접종에 의해 고추 및 담배에 전염이 잘 되며, 각종 진딧물에 의해서 전염된다. 이 바이러스에 감염된 고추 잎은 모틀(mottle) 현상이 나타나며 잎과 열매에 기형을 초래하고, 심하게 감염된 고추는 위축되며 고추열매 수량이 감소된다. PepMoV의 연구로써, green fluorescent protein (GFP) 가 PepMoV의 게놈안에 삽입되어 숙주식물이 PepMoV에 감염되었을 때, 자연상태에서 관찰되는 모틀현상 뿐만 아니라 UV (ultra violet) light 아래에서도 PepMoV의 감염범위를 확인할 수 있는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 개발되었다 (Lee et al., Virus Research, 2011, vol. 155, 487-494). SP6PepMoV-Vb1/GFP의 개발로 PepMoV의 병징이 분자생물학적 방법을 이용하여 분명하고 쉽게 분석할 수 있게 되었다.
지금까지 고추에서 분리 보고된 포티바이러스는 PepMoV 이외에도 Potato virus Y (PVY), Tobacco etch virus (TEV) 또는 Pepper severe mosaic virus (PepSMV) 등 많은 바이러스가 보고되고 있으나, 현재 우리 나라의 고추에서는 PepMoV가 주로 분포하며, 큰 피해를 입히는 것으로 보고되고 있다 (Han et al., Plant Pathol. J, 2006, vol.22, 155-160). PepMoV의 방제를 위해서는 진딧물 방제, 토양의 소독, 농기구와 종자의 철저한 관리가 필요하다. 그러나 방제 방법이 간접적이고, 많은 노력이 요구되므로 PepMoV에 저항성을 가진 품종을 육성하는 것이 보다 효율적이고 경제적인 방제 방법이 될 것이다.
고추의 생산량을 감소시키는 주된 바이러스인 PepMoV (Pepper mottle virus), PepSMV (Pepper severe mosaic virus), PeYMV (Pepper yellow mosaic virus), ERV (Ecuadorian rocoto virus), PTV (Peru tomato virus) 그리고 PVY (Potato virus Y)를 포함하는 포티바이러스(potyvirus)는 고추뿐만 아니라 감자를 포함한 가지과 작물의 생산량 감소를 야기하는 바이러스이며, 이와 같은 작물의 생산성 증대를 위하여 고추 및 가지과 작물의 저항성 품종의 육종과 개발이 절실히 요구되고 있다(SCHOLTHOF et al., Mol. Plant Pathol, 2011, vol. 12, 938-954; Quenouille et al., Mol. Plant Pathol., 2013, vol.14, 439-452).
고추에서 발견된 포티바이러스 저항성은 pvr 유전자에 의해 유전되는 것으로 보이며, 지금까지 7개의 주요한 저항성 유전자와 몇 개의 양적인 형질에 관여하는 유전자(quantitative trait locus; QTL)가 보고되었다 (Kang et al., Annu. Rev. Phytopathol, 2005, vol. 42, 392-405). 분자 표지(molecular marker)를 이용해 유전자 지도(genetic map)를 작성한 결과 염색체 3번과 10번에 각각 저항성 유전자 클러스터(gene cluster)가 존재한다는 것이 알려졌다 (Kang et al., Annu. Rev. Phytopathol, 2005, vol. 42, 392-405). 염색체 3번에는 pvr1및 pvr2와 같은 열성저항성 유전자가 위치하고 있고, 고추의 CM334의 염색체 10번에는 단일우성 저항성인 Pvr4 유전자의 위치가 보고되고 있다(Revers, Fre´de´ric; and Nicaise, Vale´rie (August 2014) Plant Resistance to Infection by Viruses. In: eLS. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.DOI: 10.1002/9780470015902.a0000757.pub3). 염색체 10번의 텔로미어(telomere) 영역에 위치한다고 알려진 Pvr4 유전자는 기존의 연구에 의해 고추의 CM334와 이병성 개체의 F2 집단에서 3:1로 분리가 일어남을 보였고, 단일 우성 저항성 유전자로서 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV 그리고 PVY 에 대해 완전저항성(extreme resistance) 또는 과민감성반응(hypersensitive response)과 같은 저항성 반응(resistance response)이 나타남이 확인되었다(Grube et al., TAG, 2000, vol.101, 852-589; Janzac et al., Plant Pathol., 2009, vol.58, 443-449; Kim et al., TAG, 2011, vol.122, 1051-1058). Pvr4 유전자에 의해 유도되는 저항성은 Pvr4 유전자의 존재가 보고된 이후 30 여년이 지난 지금까지 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV 그리고 PVY 의 바이러스에 대해서 저항성이 깨진 적이 없으며, 강력하고 지속적이다 (Kang et al., Annu. Rev. Phytopathol, 2005, vol. 42, 392-405; Janzac et al., Plant Pathol., 2009, vol.58, 443-449). 또한, Pvr4 유전자에 의한 저항성은 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV 그리고 PTV 뿐만 아니라 지금까지 보고된 모든 PVY 스트레인(strain)에 대해 저항성을 나타내기 때문에 (Dogimont et al., Euphytica, 1996, vol.88, 231-239), Pvr4 유전자를 도입하여 형질전환된 감자, 토마토 등의 식물체는 여러가지 포티바이러스에 대한 저항성을 획득할 수 있을 것으로 추측되며 이로 인한 경제적 파급 효과는 대단히 크다고 판단된다.
최근 완성된 고추 CM334의 게놈 시퀀스(genome sequence, Kim et al., Nat Genet, 2014, vol.46, 270-278)를 이용하여 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV 그리고 PVY에 대해 안정적이고 광범위한 저항성을 나타내는 Pvr4 유전자 (Dogimont et al., Euphytica, 1996, vol.88, 231-239; Janzac et al., Plant Pathol., 2009, vol.58, 443-449)와 연관된 분자 표지를 개발하고, 이를 통해 동정된 Pvr4 유전자를 분자생물학적 방법을 이용하여 감자, 토마토 등의 식물체에 도입함으로써 포티바이러스에 대한 저항성 품종을 개발하는데 사용한다면, 전통 육종 시간과 노력을 대폭 줄일 수 있으며 결과적으로 획기적인 생산량 증대를 이룰 것으로 판단된다.
현재까지 Pvr4 유전자는 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV 그리고 PVY 의 포티바이러스에 대한 단일 우성 저항성을 가지는 유전자 중 하나라는 가설만 보고되어 있을 뿐이다(Kyle et al., Euphytica, 1997, vol.97, 183-188; Grube et al., Theor Appl Genet, 2000, vol.101, 852-859). Pvr4 유전자에 대한 정확한 DNA 염기서열 등에 대한 유전체적 또는 분자생물학적 수준에서의 정보는 아직까지 보고된 바 없다. 따라서, Pvr4 유전자를 이용한 분자표지에 대한 개발이 없었고, 분자생물학적 수준에서의 유전자에 대한 정보가 없었기 때문에, Pvr4 유전자를 도입하여 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV, PVY 등에 대한 저항성인 감자, 토마토 등의 식물체 발명이 없었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되었기 때문에 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명은 상기와 같은 배경에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV, PVY 등의 포티바이러스 감염으로 인한 고추, 감자, 토마토 등의 감염과 손상으로 인한 경제적 손실을 예방하거나 개선시킬 수 있는 식물체 유래의 포티바이러스 단일 우성 저항성 유전자인 Pvr4 유전자를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 포티바이러스에 대한 저항성은 Pvr4 유전자와 광범위하게 관여되고 있다는 가설에 기초하여, Pvr4 유전자를 유전체 수준에서 탐색한 후 정확한 염기서열을 찾아내고, 본 발명에서 구체적으로 제시된 Pvr4 유전자로 형질전환된 식물체가 포티바이러스인 PepMoV, PepSMV, PVY 등에 대한 저항성을 직접적으로 제공한다는 객관석 사실을 구명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스저항성 단백질 Pvr4를 제공한다.
본 발명은 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 Pvr4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 형질전환시켜 형질전환 식물세포에서 Pvr4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 포티바이러스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 단계(a)에 의하여 제조된 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물을 재분화시키는 단계를 포함하는 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비해 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 의하여 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 포티바이러스 저항성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머(primer)를 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브(probe)를 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 포티바이러스 저항성 Pvr4 유전자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비하여 포티바이러스 저항성을 증가시키기 위한, 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다.
본 발명은 포티바이러스(potyvirus)에 대하여 저항성을 가지는 Pvr4 유전자, Pvr4 단백질 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명은 Pvr4 유전자 서열을 이용한 분자표지를 사용함으로써 포티바이러스 저항성 고추를 육종하는데 기여할 수 있다.
또한, 본 발명은 PepMoV, PepSMV, PeYMV, ERV, PTV 그리고 PVY 등의 포티바이러스에 의해 경제적으로 막대한 생산량 감소를 나타내고 있는 감자, 토마토 등의 숙주식물체까지 형질전환시킬 수 있는 특징을 가지며, 이와 같은 형질전환 식물체로 인하여 작물의 생산량 증가 및 경제적인 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana: N. benthamiana)에서 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대한 Pvr4 유전자의 저항성에 대한 결과이다(Lee et al., Virus Research, 2011, vol.155, 487-494). 도 1에서 Pvr4 유전자는 저항성 유전자이며, 이병성 대립유전자인 pvr4 유전자와 빈 플라스미드인 Empty는 양성대조군으로 하였다. (A)는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스 (Lee et al., Virus Research, 2011, vol.155, 487-494)의 외피단백질을 인지하는 항체를 이용하여 ELISA를 실시한 결과이다. (B)는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 VPg 검출용 프라이머를 이용하여 RT(Real-time) PCR를 실시한 결과이다. 총 5회 실시하였다.
도 2는 N. benthamiana에서 감자 바이러스 Y-0 (Potato virus Y : PVY-0)와 고추 중증 모자이크 바이러스(Pepper severe mosaic virus: PepSMV)에 대한 Pvr4 유전자의 저항성을 나타낸 결과이다. 아그로박테리움을 이용하여 Pvr4와 Empty vector 를 동시 침윤시킨 후, PVY-0와 PepSMV 가 감염되어 있는 담배 접종액으로 루빙(rubbing)시키고 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일째에 5개 식물체로부터 각각 5개 담배 잎 디스크를 임의적으로 샘플링하였다. 샘플들을 PVY-0와 PepSMV 의 외피단백질을 각각 인지하는 항체를 이용하여 ELISA로 분석하였다. (A): PVY-O, (B): PepSMV
도 3은 Pvr4 유전자로 형질전환된 감자의 PVY에 대한 저항성을 나타낸 결과이다. Pvr4로 형질전환된 감자에 Potato virus Y (PVY-0)를 접종한 후, PVY-0의 Vpg 검출용 프라이머를 이용하여 RT-PCR(상단 그림)과 외피단백질을 인지하는 항체를 이용하여 ELISA(하단 그래프)로 분석한 결과이다.
도 4는 고추 C. annuum cv. Jupiter 및 담배 N. bethamiana에 아그로박테리움을 동시침윤(co-infiltration)시켜 Pvr4 유전자를 동정한 결과이다. (A) CM334 고추 유래 Pvr4 유전자인 Pvr4-R, 또는 이병성 대립유전자인 Pvr4-S를 각각 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스로부터 유래된 RNA-dependent RNA polymerase (NIb)와 함께 C.annuum cv. Jupiter에 아그로박테리움을 이용하여 동시침윤시켰다. 동시침윤(co-infiltration)시킨 시점에서 Jupiter 엽을 회수한 후 결과를 확인하기 위하여 에탄올로 탈염색시켰다. (B) CM334 고추 유래 Pvr4 유전자인 Pvr4-R, 또는 이병성 고추에서 유래한 대립유전자인 Pvr4-S 와 SP6PepMoV-Vb1/GFP로부터 유래된 RNA-dependent RNA polymerase (NIb), 음성대조군으로써 tomato spotted wilt virus (TSWV) 로부터 유래된 NS 유전자를 N. benthamiana 잎에 아그로박테리움을 이용하여 동시침윤시켰다. R3a과 Avr3a을 양성 대조군으로 이용하였다. 침윤시킨지 7일 후, N. benthamiana 잎을 회수하여 자외선으로 바이러스 감염을 확인하였다. R3a은 감자 유전자 유래 감자역병균(Phytophthora infestans) 저항성 유전자, Avr3a은 Phtyophthora infestans 이펙터(effector), NIP은 콩역병균(Phytophthora sojae) 유래 괴사 유도 단백질(necrosis induced protein)를 양성대조군으로 하였다.
도 5는 Pvr4 유전자와 포티바이러스인 SP6PepMoV-Vb1/GFP, PepSMV, PVY, TEV의 NIb가 N. benthamiana의 잎에서 아그로박테리움을 이용하여 동시침윤되어 발현된 것을 확인한 결과 이미지이다. 음성대조군으로 빈 벡터(Empty vector)와 SP6PepMoV-Vb1/GFP, PepSMV, PVY, TEV의 NIb 유전자로 하였다. 양성대조군으로써 R3a과 Avr3a을 이용하였다. 원 모양들은 잎 패널상에 침윤된 부위를 의미한다. 이 잎은 본 실시예에서의 분석 및 실험한 것을 대표적으로 표시한 것이다. 이미지는 침윤시킨 후 4일째 사진촬영하였다.
도 6은 포티바이러스인 PepMoV의 게놈에 형광단백질인 green fluorescent protein 이 삽입되어 PepMoV의 증식을 UV light 아래에서 형광으로 확인할 수 있는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 의해 감염된 고추와 담배의 질병 증상을 나타낸 이미지이다(Lee et al., Virus Research, 2011, vol.155, 487-494). A는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대해 저항성 표현형(resistance phenotype)을 나타내는 C. annuum landrace CM334 (TC06495, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국)와 모틀 현상을 보이는 이병성 고추인 (susceptible phenotype)인 C. annuum cv. ECW (TC06444, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국)와 C. annuum cv. Jupiter (TC05533, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국)를 나타낸다. 고추는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스로 감염된 담배조직의 접종액으로 루빙(rubbing)시킨 후 14일째 사진촬영 하였다. B는 담배인 Nicotiana tabaccum cv. Xanti NC에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스를 감염시킨 후 14일째 자외선(UV)를 조사하여 바이러스가 감염되었음을 확인하고 사진촬영 하였다.
도 7은 본 발명에서 Pvr4 유전자와 가장 가까이 연관되어 있는 분자표지인 SNP61786 분자표지 결과 이미지이다. 저항성 개체로서 CM334를 사용하였고, 이병성 개체로서 ECW123R 를 사용하였다. CM334와 ECW123R의 교배체인 F1개체를 이병성 개체에 여교잡하여 얻어진 3세대인 BC1F3 를 제작하였다(Kim, Han et al., TAG. 2011, vol. 122, 1051-1058). Phe는 피노타이핑(phenotyping)을 의미하며 Gen은 지노타이핑(genotyping)을 의미한다. 지노타이핑에서 R은 저항성 지노타입(resistant genotype), H는 헤테로 지노타입(hetero genotype)을 의미하며, S는 이병성 지노타입(susceptible genotype)을 의미한다. 피노타이핑에서 R은 저항성 피노타입을 의미하며, S는 이병성 피노타입을 의미한다.
도 8은 본 발명에서 수행한 유전자 기반 클로닝을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 Pvr4 유전자와 대립유전자 pvr4 유전자의 상동성을 나타낸 것이다. 도 9a 에서 Pvr4 유전자는 coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat (CC-NBS-LRR) 타입이며, 총 5238개의 뉴클레오타이드 (nucleotide)의 ORF (open reading frame) 서열을 가지고 있으며 1745개의 아미노산 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 도 9b는 Pvr4 유전자와 pvr4 유전자의 아미노산 전체 서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 블라스트(Blast) 프로그램을 이용하여 비교분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에서 Pvr4 유전자의 지노믹 DNA 영역을 나타낸 것이다. 도 10(a)는 Pvr4 유전자의 지노믹 DNA 영역으로, 7개의 엑손 (exon)과 6개의 인트론 (intron)으로 이루어져 있으며, 개시코돈부터 종결코돈까지 13,870 개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있음을 나타낸다. 도 10(b)는 Pvr4 유전자의 엑손 2번, 3번, 4번, 5번, 6번 염기서열이 95%의 상동성을 가진다는 것을 의미한다. 도 10(c)는 인트론 2번, 3번, 4번, 5번의 염기서열이 99%의 높은 상동성을 가진다는 것을 의미한다.
도 11은 N. benthamiana에서의 세포사멸 증상을 나타낸 것이다. A는 N. benthamiana의 잎에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염된 담배 접종액을 3ml/g의 농도로 하여 루빙(rubbing)시켰으며, 왼쪽에는 빈 벡터인(Empty vector) 벡터인 pCAMBIA2300와 오른쪽은 Pvr4 유전자를 각각 2일째에 아그로박테리움을 이용하여 침윤한 결과 이미지이다. B는 N. benthamiana에 PepSMV가 감염된 담배 접종액을 3ml/g의 농도로 루빙(rubbing)시키고, 왼쪽에는 빈 벡터인(Empty vector) pCAMBIA2300와 오른쪽은 Pvr4 유전자를 각각 2일째에 아그로박테리움을 이용하여 침윤한 결과 이미지이다. C는 N. benthamiana에 PVY가 감염된 담배 접종액을 3ml/g의 농도로 루빙(rubbing)시키고, 왼쪽에는 빈 벡터인(Empty vector) pCAMBIA2300와 오른쪽은 Pvr4 유전자를 각각 2일째에 아그로박테리움을 이용하여 침윤한 결과 이미지이다.
도 12는 CM334에서 유래한 포티바이러스 저항성 유전자 Pvr4 가 암호화하는 아미노산 서열과 ECW에서 유래한 이병성 대립형질인 pvr4 유전자가 암호화하는 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 제공한다.
본 발명자들은 포티바이러스 감염으로 인한 작물의 질병과 이에 따른 작물의 손상으로 인한 경제적 손실을 개선시킬 수 있는 식물체 유래 포티바이러스 저항성 분자를 찾고자 노력하였으며, 포티바이러스에 대한 저항성과 관련하여 Pvr4 유전자와 광범위하게 관여되고 있다는 가설에 기초하여 Pvr4 유전자에 대하여 게놈(genome) 수준으로 분리 및 동정하고 Pvr4 유전자로 형질전환된 식물체가 포티바이러스들(Pepper mottle virus, PepMoV; Pepper severe mosaic virus, PepSMV; Potato virus Y, PVY)에 대하여 직접적으로 저항성을 가진다는 객관적 사실을 규명하였다.
본 발명은 포티바이러스에 대하여 특이적으로 저항성을 가지는 단백질이다.
본 발명의 명세서에서 표현 "특이적 저항성"은 포티바이러스의 증식 또는 활성 억제, 면역계(immune system) 활성, 면역반응 증대 또는 면역반응 활성, 또는사멸시킬 수 있는 특성을 의미하며, 식물세포 또는 식물체로 도입되는 경우 포티바이스를 특이적으로 증식을 억제시키거나 사멸시킬 수 있는 특성을 의미한다.
본 발명은 포티바이러스에 대하여 특이적인 저항성을 가지는 단백질로서 자연계에 존재하는 포티바이러스라면 제한없이 포함되나, 바람직하게는 포티바이러스는 PepMoV (Pepper mottle virus), PepSMV (Pepper severe mosaic virus) 및 PVY (Potato virus Y)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 포티바이러스를 포함한다.
본 발명인 Pvr4 단백질은 현재 공지되지 않은 아미노산 서열을 가지고 있음에 따라, 본 발명에 따른 Pvr4 단백질의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 포티바이러스들에 대한 저항성을 의미한다. 또한, 본 발명은 Pvr4 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 Pvr4 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명인 Pvr4 유전자는 현재 공지되지 않은 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있으며, 포티바이러스들에 대한 저항성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명인 Pvr4 유전자는 Pvr4 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1(게놈 DNA) 또는 서열번호 2(cDNA)로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열과 각각 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 폴리뉴클레오타이드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 Pvr4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 Pvr4 유전자는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명의 명세서에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서 (enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0116718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서의 숙주세포는 식물세포이다.
본 발명의 재조합 벡터는 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 숙주세포 내로 운반될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 숙주세포 내로 벡터를 주입할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Pvr4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 형질전환시켜 형질전환 식물세포에서 Pvr4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 포티바이러스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에서의 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열과 각각 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 경우에 숙주세포는 바람직하게는 고추속(Capsicum sp.) 또는 가지속(Solanum sp.) 식물세포이며, 더 바람직하게는 고추세포, 감자세포, 토마토세포 또는 가지세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.
본 발명은 상기 Pvr4 유전자를 이용하여 식물세포 또는 식물체의 포티바이러스에 대한 저항성을 증가시키는 방법임에 따라, 본 발명의 명세서 작성에 있어서 과도한 기재를 회피하고자 이 둘 사이에 공통된 내용은 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및 (b) 상기 단계(a)에 의하여 제조된 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물을 재분화시키는 단계를 포함하는 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비해 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에서의 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열과 각각 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 상기 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 상기 Pvr4 유전자를 이용하여 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법임에 따라, 본 발명의 명세서 작성에 있어서 과도한 기재를 회피하고자 이 둘 사이에 공통된 내용은 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 포티바이러스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에서 포티바이러스에 대한 저항성이 증가된 형질전환된 식물체는 분류학적으로 포티바이러스에 의해 감염되는 숙주식물체(host)인 솔라나세아(Solanaceae), 케노포디아세아(Chenopodiaceae), 레규미노세-파필리오노이데아(Leguminosae-Papilionoideae), 아마란타세아(Amaranthaceae), 쿠쿠르비타세아(Cucurbitaceae), 컴포지테(Compositae), 크루시퍼레(Cruciferae), 그라미니에(Gramineae)이며, 바람직하게는 솔라나세아과 식물체이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 포티바이러스 저항성 증가용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 단백질 Pvr4을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물에 형질전환시킴으로써 식물체의 포티바이러스 저항성을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 상기 Pvr4 단백질을 코딩하는 유전자를 이용함에 따라, 본 발명의 명세서 작성에 있어서 과도한 기재를 회피하고자 이 둘 사이에 공통된 내용은 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머(primer)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브(probe)를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머, 또는 (ii) 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 포티바이러스 저항성 Pvr4 유전자 검출용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 수행할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되며, 예를 들면, 10개 이상, 바람직하게는 10-100개, 더욱 바람직하게는 10-50개, 더더욱 바람직하게는 10-30개 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브(probe)"는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다. 바람직하게는, 프로브는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 프로브의 길이는 예를 들면, 10개 이상, 바람직하게는 10-100개, 더욱 바람직하게는 10-50개, 더더욱 바람직하게는 10-30개 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 명세서 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "어닐링" 과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용되어 사용된다.
본 발명에서 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 검출가능한 시그널을 발생하는 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금)이다.
상기 화학적 표지는 바이오틴을 포함한다. 스트렙타비딘(또는 아비딘)과 바이오틴의 결합 특이성은 타겟 핵산 서열을 나타내는 간접적인 시그널이 발생되도록 한다.
상기 효소 표지는 알카라인 포스페이트, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 루시페라제, 시토크롬 P450 및 호스라디쉬 퍼록시다제를 포함한다. 상기 효소 표지에 대한 기질을 이용함으로써, 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널을 얻을 수 있다.
본 발명은 본 발명에서의 서열번호 1 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오타이드와 상보적으로 혼성화할 수 있는 프라이머, 프로브, 또는 이를 포함하는 키트임에 따라, 본 발명과 공통적인 내용은 본 명세서의 과도한 기재를 회피하기 위해 생략된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4에 대한 항체를 제공한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 다중특이적 (multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체 (camelised antibody), 키메라 항체, 단일 체인 Fvs (scFv), 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab) 프래그먼트, 디설피드-결합 Fvs (sdFv), 및 항이디오타입 (항-Id) 항체, 및 상기 임의의 에피토프 결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역학적으로 활성이 있는 면역글로불린 분자 단편, 즉 항원 결합부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 Pvr4 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에서의 Pvr4 단백질 항체를 포함하는 포티바이러스 저항성 Pvr4 단백질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 면역분석용 키트를 포함한다. 상기 면역분석은 방사능 면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 키트가 방사능면역분석에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S)로 표지된 항체(상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체)가 이용될 수 있다.
본 발명에서 이차 항체를 이용하는 경우 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블(label)을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, 14C, 125I, 32P 및 35S), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 포티바이러스 저항성 Pvr4 단백질 검출용 키트는 공지된 다양한 종류의 키트로 제작될 수 있으며, 예컨대 면역분석(immunoassay)용 키트, 유전자 증폭 키트를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스에 대한 저항성을 가지는 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자의 식물체의 포티바이러스 저항성 증가용 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명에서의 저항성을 가지는 단백질 Pvr4와 이를 코딩하는 유전자의 용도임에 따라, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험재료 및 방법
식물체
PepMoV에 대한 저항성 고추 식물체 개체로서 CM334 (Pvr4/Pvr4, TC06495, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국)가 사용되었으며, 이병성 개체로서 ECW123R (pvr4/pvr4, New Mexico University, USA)과 Jupiter (pvr4/pvr4, TC05533, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국)를 사용하였다. Pvr4 유전자의 게놈-기반 클로닝(genome-based cloning)을 수행하기 위한 수단으로 DNA 분석 활용 및 바이러스 저항성 분석에 2개의 고추 집단을 사용하였다. 첫 번째는 선행연구(Kim, Han et al., TAG. 2011, vol, 122, 1051-1058)에서 사용된 ECW123R과 CM334의 여교잡 교배체인 BC1F3 집단을 이용하였다. 두 번째는 Jupiter 와 CM334를 교배하여 생성된 F2 집단을 이용하였다. 정확한 표현형 분석을 위해 접종 후 1 개월 동안 1468 개체의 개체를 유지하였다. 이들 식물체는 25℃에서 광조건 16 시간과 암조건 8 시간의 주기를 유지하면서 재배하였다.
PepMoV, PepSMV, PVY의 증식 및 접종
PepMoV에 GFP(green fluorescence protein)가 태그(tagged) 되어 있는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스를 증식시키기 위하여, SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염되어 있는 동결건조형태의 담배조직을 분양받아 막자사발에 포스페이트 버퍼(phosphate buffer; Phosphate buffered salts, Takara)를 약 5 ml을 넣고 상기의 담배조직을 갈아 파쇄하고 식물조직에 상처를 유도하는 carborundum (400 mesh)을 섞어 접종액을 제작하였다. 파종한 후, 4-5주 재배된 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana : N. benthamiana) 또는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabaccum : N. tabaccum)의 잎에 막자사발에서 파쇄된 접종액을 루빙(rubbing)을 통하여 접종하였다(Lee et al., Virus research, 2011, vol. 155, 487-494). 같은 방법으로 PepSMV, PVY가 감염된 담배 접종액을 제작하였다.
감염시킨 후, 14 일이 지난 후에 N. benthamiana의 상엽 조직을 채취하여 접종액으로 이용하였다. 바이러스의 접종액으로 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염된 N. benthamiana를 10 g을 채취하여 막자사발에 넣고 포스페이트 버퍼 30 ml을 첨가하여 파쇄하여 3 ml/g의 농도로 접종액을 먼저 제작하였다. 같은 방법으로 PepSMV, PVY가 감염된 담배 접종액을 제작하였다. Jupiter와 CM334의 F2 교배체 405개와 CM334와 ECW123R의 여교잡을 통한 BC1F3의 1063 개체를 파종 후, 4-5 주 지난 시점에서 고추의 본엽에 carborundum (400 mesh)을 뿌려 상처를 유도하였다. 다음으로 상기의 3 ml/g의 농도로 만들어진 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 접종액을 전체 1468 개체의 고추 본엽에 루빙(rubbing)시켰다.
SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 감염여부는 GFP를 검출할 수 있는 UV 일루미네이터(UV illuminator)와 아그디아(Agdia)의 DAS-ELISA(double-antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay; SRA 38000)를 이용하여 확인하였다.
고추의 핵산 추출
PepMoV 접종 후 14일이 지난 시기에, PepMoV가 접종된 상기의 1468 개체의 고추 (Jupiter와 CM334의 F2 교배체 405 개체와 CM334와 ECW123R의 여교잡을 통한 BC1F3의 1063 개체 식물체)의 상엽에 해당하는 1 ㎝ 길이의 어린 잎을 2장 따서 1.7 ml의 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 식물체가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 4 ㎜의 스테인레스 비드를 2개 넣고 티슈라이져(Tissuelyser; Retsch, QIAGEN)을 이용하여 방향을 바꿔주며 2 분 동안 분쇄한 다음, 60℃의 CTAB 핵산 추출 완충액(2% CTAB, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl pH 8.0, 1.4M NaCl)을 600 ㎕ 넣었다. 다시 PVP(Polyvinylpyrrolidone)를 0.5 g, β-머캅토에탄올을 12.5 ㎕ 넣어 위 아래로 잘 섞은 다음 65℃의 항온 수조에서 1-2시간 반응시켰다.
반응이 끝나면 잠시 식힌 후, 클로로포름:이소아밀알코올(24:1) 용액을 700 ㎕ 넣었다. 4℃에서 12,000 rpm 으로 15 분 동안 원심분리하였고, 상징액만을 새로운 마이크로원심분리 튜브에 취하였다. 상징액과 동량의 이소프로판올을 넣고, -20℃에서 1-2 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 4℃, 12,000 rpm 으로 10 분 동안 원심분리한 후 상징액을 버렸다. 70%의 에탄올을 800 ㎕ 넣어, 4℃, 12,000 rpm 으로 10 분 동안 원심분리한 다음 상징액을 버렸다. 한번 더 70% 에탄올로 핵산 침전물을 씻어 준 다음 공기 중에서 5 시간 건조시켰다. 건조가 끝나면 50 ㎕의 TE 완충액(1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl)과 RNase(10 U/㎕)을 넣어 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 핵산은 분광광도계(ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc)로 정량하였다.
CAPS 분자표지를 이용한 유전자형 결정
유전자형 검사는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 장비로 수행하였다. PCR 반응액은 2X PCR PreMix (EmeraldAmp GT PCR Master Mix), 프라이머 10 uM, 주형 핵산 50 ng으로 구성하여 총 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 5 분 동안 가열한 다음 40 사이클(95℃ 30 초, 58℃ 30초, 72℃ 1 분)을 반복한 뒤, 70℃에서 5 분 반응하고 4℃에서 보관하였다. 표기된 분자표지는 10 ㎕ PCR 산물에 제한효소 MboI 제한효소 0.5 ㎕와 제한효소 완충액 2 ㎕, DW 7.5 ㎕를 첨가한 뒤, 37℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 1.5% 아가로스 겔에 제한효소 처리한 핵산 산물을 로딩한 후, 전기영동하여 밴드를 확인하였다. SNP61786 분자표지는 1000 bp와 550 bp의 밴드가 있는 것을 호모(homo) 저항성(R)으로, 500 bp와 350bp의 밴드가 있는 것을 호모 이병성(S)으로 그리고 위의 4 개의 밴드로써 1000 bp, 550 bp, 500 bp 와 350 bp의 가 있는 것을 헤테로(hetero) 저항성(H)으로 젤 사진상에 표시하여 구별하였다.
(1) SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 저항성인 CM334와 이병성인 Jupiter를 교배한 F2 (405 개체) (2) CM334와 ECW123R를 교배한 후, 생성된 F1 개체를 다시 ECW123R에 여교잡한 3세대인 BC1F3 (1063개)의 전체 1468 개체 식물체에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염된 담배 접종액을 3ml/g의 농도로 하여 루빙(rubbing)시켜 접종한 후, 표현형을 조사하고, 핵산을 추출하여 개발된 SNP61786 분자표지로 유전자형을 분석하였다. BC1F3는 CM334를 모계로하고 ECW123R을 부계로 하여 얻어진 F1 개체를 ECW123R에 다시 여교잡을 한 개체를 세 번 자가수분 시킨 개체를 의미한다.
게놈-기반 클로닝(Genome-based cloning)을 위한 유전체의 비교
고추가 토마토의 게놈에서 신터니(synteny)가 잘 이루어져 있다고 보고되어 있는 것에 근거하여(Wu et al., TAG, 2009, vol. 118, 1279-1293), 기존에 보고된 토마토 분자표지인 TG420을 기준으로 토마토 염색체 10 번의 시퀀스 영역에서 텔로미어(telomere) 방향에 위치한 50 Mb - 60 Mb의 영역에 해당되는 시퀀스를 확보하고, 확보된 토마토의 시퀀스를 쿼리(query)로 하여 CM334의 스캐폴드(scaffold)를 분리하였다. 확보된 시퀀스를 생물정보학 기술을 이용하여 스케폴드에 위치한 유전자의 구조를 예측하였다.
고추 게놈 페이퍼(Pepper genome paper)의 NBARC 유전자 패밀리(gene family) 정보를 이용하여 선발된 스캐폴드에서 예측된 NBARC 유전자 그룹을 분석하였다(Kim et al., Nat Genet, 2014, vol.46, 270-278). 예측된 NBARC 유전자의 시퀀스에서 Pvr4 유전자와 연관된 SNP61786 분자표지를 개발하였다.
Pvr4 후보 유전자의 클로닝
SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 저항성과 이병성 비율이 3:1 로 분리가 일어난 1468 개체의 유전자형과 표현형이 일치했던 SNP61786 분자표지가 포함되어 있는 스캐폴드를 선발하였다. 2 개의 스캐폴드를 선발하였고, 생물정보학 프로그램(FGENESH, Softberry사)을 이용하여 스캐폴드 안에 위치한 8 개의 유전자의 구조를 예측하고, 개시코돈(start codon)과 정지코돈(stop codon)을 고려하여 전체 유전자(full gene)를 분리할 수 있는 프라이머를 작성하였다. Pvr4 후보유전자를 과발현 시키기 위해 cauliflower mosaic virus (CaMV)의 35S 프로모터가 있는 pCAMBIA2300 벡터(연구자들에게 무료로 분양되는 벡터로써 상용화되어 있는 벡터이며 호주의 http://www.cambia.org/daisy/cambia/653.html 에서 분양받음)를 사용하였으며, 라이게이션 비의존 클로닝(ligation independent cloning)을 이용하기 위하여 5과 3영역의 프라이머에 아답터(adapter) 시퀀스를 추가하였다(Oh et al., Mol Cells, 2010, vol.30, 557-562): 5'-CGACGACAAGACCCT (아답터 시퀀스) 유전자 특이적 시퀀스(Gene specific sequence)-3' 및 5'-GAGGAGAAGAGCCCT (아답터 시퀀스) 유전자 특이적 시퀀스-3'.
증폭된 PCR 단편(fragment)을 정제(purification)한 후, 5-10 ㎕의 PCR 산물(product), T4 DNA 폴리머라제(NEB) 1 ㎕ 및 10 mM dATP 1 ㎕을 각각 첨가하였다. 전체 볼륨이 20 ㎕가 되도록 증류수를 넣고 22℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 70℃에서 20 분 동안 반응시켰다. PstI으로 처리된 pCAMBIA2300 벡터를 정제한 후 T4 DNA 폴리머라제 1 ㎕, 10 mM dTTP 1 ㎕를 첨가하였다. 전체 볼륨이 20 ㎕가 되도록 증류수를 넣고 22℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 70℃에서 20 분 동안 반응시켰다.
끝으로, 스티키 엔드(sticky end)를 가지는 PCR 산물 5 ㎕와 벡터 3 ㎕를 넣고 혼합시킨 후 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 그 다음, 제조된 형질전환용 벡터로 DH10b에 형질전환시킨 후 NICEM(Seoul, Korea)에서 시퀀싱을 하였다. 시퀀스를 확인한 후, 식물체에서의 과발현 실험을 위해 C58C1의 아그로박테리움을 형질전환시켰다.
Pvr4 유전자와 SP6PepMoV-Vb1/GFP, PepSMV, PVY의 NIb의 상호작용
Pvr4 유전자를 가지고 있는 고추인 CM334에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 RNA-의존 RNA 폴리머라제(NIb)를 아그로박테리움을 통하여 침윤시킨 경우, HR (hypersensitive response)-유사 세포 사멸(cell death)을 유도한다는 것에 기초하여, 선발된 8 개의 Pvr4 후보 유전자를 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb와 함께 N. benthamiana의 잎에서 동시침윤시켰다.
Pvr4 후보 유전자와 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb가 형질전환되어 있는 아그로박테리움 C58C1을 각각 2 일 동안 배양하여 원심분리한 후, OD 값이 각각 1.0과 0.5가 되도록 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6 및 200 μM 아세토시린곤(Acetosyringone)의 조성을 가진 버퍼에 두 개의 세포를 섞은 후 현탁하였다. 상온에서 2 시간 동안 배양시켜 병원성을 증가시킨 후, 4-5 주 자란 Jupiter 또는 N. benthamiana 잎에 동시침윤(co-infiltrate)시켰다. 동시침윤시킨 후 2-3 일이 지나 세포괴사반응을 관찰하였다. 같은 방법으로, Pvr4 유전자와 SP6PepMoV-Vb1/GFP, PepSMV, PVY의 NIb의 OD(optical density, 광학농도) 값을 각각 1.0과 0.5로 하고, A. tumefaciens C58C1와 함께 N. benthamiana 잎에 동시침윤시켰다. 음성대조군으로 빈 벡터(Empty vector)인 pCAMBIA2300을 운반하는 Agrobacterium tumefaciens C58C1, NIbs(ATG를 포함하는 성숙된 형태의 단백질을 발현시키는)를 운반하는 A. tumefaciens C58C1 를 각각 N. benthamiana의 왼쪽부분에 침윤시켰다. 양성 대조군(Positive control)으로서 파이토프토라 소재(Phytophthora sojae)가 분비하는 톡신(toxin)인 NIP 이 사용되었다(Qutob et al, Plant J, 2002, vol.32, 361-373). 또한 감자역병균의 저항성 유전자인 R3a (OD600:0.5)와 감자역병균이 분비하는 RxLR 이펙터인 Avr3a (Avirulence protein 3a; OD600:0.3)가 동시침윤 되었을 때 세포괴사반응이 나타나는 것이 보고(Jorunn et al., Plant J, 2006, vol.48, 165-176)되어 있는 점에 근거하여 저항성 유전자와 병원균의 분비 단백질과의 상호작용으로 인한 양성대조군으로써 사용되기 위하여 아그로박테리움을 이용하여 동시침윤 되었다. 세포괴사는 100%의 에탄올(EtOH)에 담배 또는 고추 잎을 넣어 클로로필을 제거한 후 눈으로 확인할 수 있었다.
포티바이러스에 대한 Pvr4 유전자의 저항성
선발된 8 개의 Pvr4 유전자는 식물에서 과발현을 유도하도록 아그로박테리움 C58C1에 형질전환되었고, YEP 액체배지에서 1 일 배양된 후 원심분리를 통해 아그로박테리움을 펠릿의 형태로 분리하였다. 10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6 및 200 μM 아세토시린곤(Acetosyringone)의 조성을 가진 버퍼를 YEP 액체배지가 제거된 펠릿이 들어 있는 튜브에 첨가하여 OD 값이 1.0 이 되도록 희석하였다. 상온에서 2 시간 동안 배양시켜 병원성을 증가시킨 후, 4-5 주 자란 N. benthamiana 잎에 침윤시켰다.
1 일이 지난 후, Pvr4 유전자가 과발현된 잎위에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염되어 있는 담배 접종액을 3 g/㎖의 농도로 루빙(rubbing)시켰다. 접종 후, 1, 2, 3, 4 및 5 일차에 접종 잎에서 5 개의 잎 디스크(disc)를 채취한 후, ELISA 반응 및 바이러스의 VPg를 검출할 수 있는 프라이머를 이용하여 RT-PCR(real-time PCR)을 통해 PepMoV의 증식을 확인하였다.
같은 방법으로 8 개의 Pvr4 유전자를 4-5주된 N. benthamiana 잎에 아그로박테리움을 이용하여 침윤시킨 후, 1 일이 지난 시점에 PVY-O 또는 PepSMV를 3 g/㎖의 농도로 루빙(rubbing)시켰다. 접종 후, 1, 2, 3, 4, 5 및 6일차에 접종 잎에서 5 개의 잎 디스크를 채취하여 ELISA 반응을 수행하였다.
또 다른 저항성 반응의 실험으로, SP6PepMoV-Vb1/GFP, PVY-O 및 PepSMV가 각각 감염된 담배의 접종액을 N. benthamiana 의 잎에 3 g/㎖의 농도로 루빙(rubbing)시킨 후, 2 일이 지난 시간에 잎의 왼쪽에는 빈 벡터(Empty vector)를 침윤(infiltrate)시켰으며, 오른쪽 잎에는 Pvr4 유전자를 아그로박테리움을 이용하여 침윤시켰다. 빈 벡터와 Pvr4 유전자를 포함하는 아그로박테리움의 OD 값이 1.0 이 되도록 희석하여 침윤시켰다. 접종후 3-4 일 후부터 세포괴사를 관찰할 수 있었으며, 100%의 에탄올에 넣어 클로로필을 제거한 후 눈으로 확인하였다.
총 RNA 분리
SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 접종된 N. benthamiana의 식물체(Pvr4 유전자, 이병성 고추인 ECW에서 분리된 pvr4 유전자 (Pvr4 의 susceptible allele)와 빈 벡터(Empty vector)를 각각 아그로박테리움에 형질전환하여 침윤시킨 후, 1일 후에 과발현된 잎에 SP6PepMoV-Vb1/GFP를 3 ml/g의 농도로 만들어진 담배 접종액을 루빙(rubbing)시킴으로써 감염시킨 N. benthamiana의 식물체) 접종엽에서 잎 디스크 5 장을 채취하여 TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 분리한다. RT PCR(Real time PCR) 수행을 위하여 수퍼스크립트 리버스 트랜스크립타제(Superscript reverse transcriptase; Invitrogen)로 3 ㎍의 총 RNA를 주형으로 하여 퍼스트(First) cDNA를 합성한다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 VPg를 검출할 수 있는 프라이머를 이용하여 RT PCR을 실시하였다.
RT PCR은 SYBR 그린(Invitrogen)을 이용하는 Rotor-Gene 6000(Qiagen)를 이용하여 실시하였다. 바이러스의 증식양을 측정하기 위해, N. benthamiana 또는 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)의 액틴(actin)을 기준으로 정량화하였다.
실시예 1 : SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대한 Pvr4 유전자의 저항성 테스트
Pvr4 유전자가 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대한 저항성 유전자라면 Pvr4 유전자가 과발현되었을 때, SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 증식이 억제되어야 한다. 따라서, CM334가 보이는 저항성이 단일 우성저항성인 Pvr4 유전자에 의해 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대해 저항성을 나타내는지 확인하기 위하여, 이병성인 N. benthamiana에 단일 우성저항성 유전자 Pvr4, 이병성 대립 유전자 pvr4 및 빈 벡터를 각각 아그로박테리움을 이용하여 침윤시킴으로써 (OD600 1.0) cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 일시적으로 과발현시킨 후, 1 일이 지난 시점에 같은 잎에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염되어 있는 담배 접종액의 3 ㎖/g을 루빙(rubbing)시켰다. 접종 후, 1, 2, 3, 4 및 5 일차에 접종엽의 잎 디스크를 5개씩 채취하여 아그디아(Agdia)사의 ELISA(SRA 38000)를 이용하여 실시하였다. SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 증식은 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 외피 단백질(coat protein)을 검출할 수 있는 항체를 사용하여 ELISA(SRA 38000)를 수행하였다. 접종 후, 4 일차에 바이러스의 증식이 가장 많이 억제되었으며 저항성은 5 일차까지 유지되었다. RNA 전사 수준에서도 동일한 저항성이 유도되는지 확인하기 위하여, 같은 시기에 채취한 동일한 양의 접종엽에서 총 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하여 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 VPg를 검출할 수 있는 프라이머로 RT(real time) PCR을 수행하였다.
Pvr4 유전자는 접종 후 4일차에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대한 저항성을 가장 크게 나타냈다. Pvr4의 저항성은 ELISA 와 RT PCR 결과 모두에서, 접종 후 4 일차에 가장 효과적으로 나타났다. 결과적으로, 이 실험결과는 동정된 Pvr4 유전자가 N. benthamiana에서 단독의 발현만으로 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 증식을 억제함으로써 저항성을 유도한다는 증거가 된다(도 1).
실시예 2 : 다양한 종류의 포티바이러스에 대한 Pvr4 유전자의 저항성 테스트
Pvr4 유전자가 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스 이외에 다른 포티바이러스의 증식을 실제로 억제하는지 확인하기 위하여, 이병성인 N. benthamiana 에 단일 우성저항성 유전자 Pvr4, 이병성 대립 유전자 pvr4 및 빈 벡터(Empty vector)를 각각 아그로박테리움을 이용하여 침윤시킴으로써 (OD600 1.0) cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 일시적으로 과발현시킨 후, 1 일이 지난 시점에 같은 잎에 PepSMV, PVY가 각각 감염되어 있는 담배 접종액을 3 ㎖/g의 농도로 루빙(rubbing)시켰다. 접종 후, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 일차에 잎 디스크를 5 개씩 채취하여 아그디아(Agdia)의 ELISA (PepSMV: SRA 27200, PVY : SRA 20600)를 수행하였다.
Pvr4 유전자의 저항성은 ELISA 결과에서, 접종 후 3 일 이후부터 가장 효과적으로 나타났다. PVY의 증식은 PVY의 외피 단백질(coat protein)을 검출할 수 있는 항체를 이용한 ELISA(SRA 20600)를 사용하였으며 Pvr4 유전자가 PVY의 증식을 접종 후 6 일차까지 억제하는 것을 관찰하였다. PepSMV의 증식은 PepSMV를 특이적으로 검출할 수 있는 항체가 상용화되어 있지 않으므로, 포티바이러스 외피 단백질(potyvirus coat protein)을 광범위하게 검출할 수 있는 ELISA(PepSMV: SRA 27200)를 사용하였다.
PepSMV의 증식이 상대적으로 적게 억제되는 것으로 관찰된 이유는 PepSMV를 검출하기 위해 특이성이 떨어지는 항체를 사용했기 때문으로 추정된다. 그럼에도 불구하고 4 일차부터 PepSMV의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로, Pvr4 유전자는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스뿐만 아니라 기존에 Pvr4 유전자를 가지고 있는 고추가 보였던 저항성과 동일하게 PepSMV와 PVY에 대해서 저항성을 유도한다는 증거가 된다. 따라서, Pvr4 유전자를 형질전환한 작물을 개발하는 경우, Pvr4 유전자에 의해 PepMoV, PepSMV와 PVY 의 포티바이러스에 대해 고추뿐만 아니라 감자와 토마토와 같이 분류학적인 종(species)을 넘어선 작물에서도 저항성을 유도할 것으로 추정되었다(도 2).
실시예 3 : Pvr4 유전자가 형질전환된 감자(Solanum tuberosum)의 PVY에 대한 저항성 테스트
상기 실시예 1 및 2의 결과에 근거하여 실제적으로 Pvr4 유전자가 형질전환된 감자(Solanum tuberosum)에 PVY를 감염시켰을 때, 저항성을 나타내는지 확인하기 위하여 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 Pvr4 유전자를 과발현시키는 감자 형질전환체를 개발하였다. PVY에 대해 이병성을 나타내는 S. tuberosum spp. Daeji 감자 품종에 Pvr4 유전자를 형질전환하였으며, 순화 후 4-5 주 지난 시기에 감자의 본엽에 PVY가 감염된 담배조직의 접종액을 3 ㎖/g의 농도로 루빙(rubbing)시킴으로써 접종하였다. 양성 대조군으로서 접종액으로 사용되었던 N. benthamiana가 사용되었으며, 음성대조군으로서 바이러스가 접종되지 않은 S. tuberosum spp. Daeji 가 사용되었다. 형질전환체의 양성 대조군으로서 빈 벡터(Empty vector)가 S. tuberosum spp. Daeji 에 형질전환된 개체와 Pvr4 유전자와 유사성이 높은 시퀀스를 가진 NBARC575 유전자가 S. tuberosum spp. Daeji 에 형질전환된 개체를 사용하였다.
유전자의 형질전환 유무는 감자의 총 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후, Pvr4 유전자와 NBARC575 유전자를 검출할 수 있는 각각의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행함으로써 확인하였다. 정량을 위해 감자의 액틴이 사용되었다. PVY 접종 후 한 달이 지난 시점에 상엽의 잎 디스크를 5 개씩 채취하여 아그디아 (Agdia)의 PVY 검출 ELISA(PVY: SRA 20600)를 사용하였다. Pvr4 유전자가 형질전환된 감자에서만 음성대조군과 비슷한 정도의 바이러스 증식이 확인되었다. PVY의 VPg를 검출할 수 있는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PVY의 증식은 음성대조군으로 사용된 감자와 Pvr4 유전자가 형질전환된 감자에서만 검출이 되지 않았음을 확인하였다(도 3).
이 결과는 Pvr4 유전자의 과발현이 고추나 담배뿐만 아니라 이종식물인 감자에서도 PVY에 대해서 저항성을 유도한다는 증거가 된다. 이것은 Pvr4 유전자가 과발현되는 형질전환체 즉 감자 또는 토마토 등에서도 포티바이러스에 대한 저항성을 가진 개체를 확보할 수 있다는 것을 의미한다. 분자표지를 이용한 육종을 통해서도 저항성 품종을 개발할 수 있지만, 시간이 오래 걸리고 원하지 않는 형질이 함께 도입된다는 단점이 있다. 또한 여러 종류의 포티바이러스에 대한 저항성 유전자로서 분리된 것은 Pvr4 유전자가 유일하며 고추에만 존재하기 때문에 교배가 불가능한 감자나 토마토 같은 작물로의 Pvr4 유전자 도입은 전통육종으로 불가능하다. 따라서, 강하고 지속적인 저항성 유전자인 Pvr4 유전자를 포티바이러스에 의한 피해가 큰 감자나 토마토에 형질전환하여 단기간에 효율적으로 저항성 품종을 개발한다면, 작물의 생산량이 증가함으로써 경제적으로 많은 이익을 얻을 수 있다고 예상할 수 있다.
실시예 4 : Pvr4 유전자의 in planta 기능분석
4개의 Pvr4 후보유전자 가운데 Pvr4 유전자를 동정하기 위하여, 앞선 연구에서 Pvr4의 이펙터(effector)라고 알려진 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 NIb (RNA-dependent RNA polymerase)(OD600 0.5)를 Pvr4 후보유전자(OD6001.0)와 각각 동시에 아그로박테리움 C58C1을 이용하여 N. benthamiana 에서 동시침윤시켰다. 그 결과, 도 3의 구조를 가진 후보 유전자만이 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 NIb 와 동시침윤되었을 때 3 일차에 과민감성 반응 (hypersensitive response: HR)을 나타내는 것을 확인하였다. N. benthamiana 잎 뿐만 아니라 이병성 고추인 Jupiter 잎에 Pvr4 유전자 (OD6001.0)와 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb (OD600 0.5)를 아그로박테리움 C58C1을 이용하여 동시침윤시켜 과민감성 반응이 나타남을 확인하였다.
양성대조군으로서 두 개의 세트가 사용되었다. 첫 번째로 감자역병의 저항성 유전자인 R3a 와 감자역병균이 분비하는 Avr3a 를 동시침윤시켰고, 두 번째로 콩 역병균(Phytophthora sojae)이 분비하는 톡신(toxin)을 침윤시켰다. 음성대조군으로서 이병성 고추에서 분리된 pvr4 유전자를 침윤시켰다. 양성 대조군으로 사용한 예처럼, 식물의 저항성 유전자(e.g. 감자역병균의 저항성 유전자, R3a)와 병원균의 이펙터(e.g. 감자역병균의 이펙터, Avr3a)를 N. benthamiana에서 동시침윤시키면 과민감성반응이 나타난다고 알려져 있다. Nucleotide-binding site leucine rich repeat (NBSLRR) 타입의 저항성 유전자가 이펙터를 인지함으로써 과민감성 반응을 나타내는 것은 Flor의 gene-for-gene 가설(Flor, Annual reviews, 1971)에 의한 것으로 이러한 인지관계가 저항성을 유도한다고 알려져 있다. 결론적으로 Pvr4 유전자가 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NIb를 인지함으로써 과민감성 반응을 나타내며 이로써 저항성을 유도한다고 추측할 수 있었다(도 4).
실시예 5 : Pvr4 유전자와 포티바이러스의 NIb의 in planta 발현 분석
실시예 3의 실험결과에 근거하여, Pvr4 유전자가 보이는 광범위한 저항성이 포티바이러스의 NIb를 인지함으로써 유도되는 것이란 가설을 세웠다. 따라서, Pvr4 유전자가 독성을 나타내지 않는 포티바이러스의 NIb를 인지하여 과민감성반응을 유도하는지 확인하기 위하여, PepSMV 또는 PVY의 NIb와 Pvr4 유전자를 아그로박테리움을 이용하여 N. benthamiana에서 동시침윤시켰다. 실험결과, Pvr4 유전자가 저항성을 나타내는 바이러스의 NIb와 동시침윤된 경우에 대해서만 과민감성 반응이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. Pvr4 유전자는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스 뿐만 아니라 PepSMV와 PVY에 대해서도 저항성을 나타내지만 TEV에 대해서는 저항성을 나타내지 않는다(Janzac et al., Plant Pathol. 2009, vol. 58, 443-449). Pvr4 유전자에 대해 이병성을 나타내는 TEV의 NIb를 Pvr4 유전자와 동시침윤된 경우, 과민감성반응이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 광범위한 포티바이러스의 NIb가 Pvr4 유전자와의 상호작용을 통해 저항성을 매개한다는 가설을 뒷받침한다고 볼 수 있었다 (도 5).
실시예 6 : SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대해 저항성을 보이는 CM334 고추와 이병성을 나타내는 ECW, Jupiter 와 N. tabaccum
PepMoV에 대한 저항성을 확인하기 위하여 CM334(TC06495, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국), ECW(TC06444, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국) 및 Jupiter(TC05533, 농업유전자원정보센터, 농촌진흥청, 대한민국)에 PepMoV의 게놈에 형광단백질인 green fluorescent protein 이 삽입되어 PepMoV의 증식을 UV light 아래에서 형광으로 확인할 수 있는 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 감염되어 있는 담배 접종액의 3 ㎖/g을 루빙(rubbing)시켰다(Lee, Song et al., Virus research, 2011, vol. 155, 487-494). 고추를 발아시켜 약 4-5 주 지난 후에, SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스로 감염된 담배조직의 접종액을 3 ㎖/g의 농도로 고추의 본엽에 접종하였다. 접종 후, 14 일이 지나 이병성 개체의 상엽에서 모틀링(mottling) 병징이 관찰되었다. CM334는 Pvr4 유전자를 가지고 있어 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 증식을 억제시키므로, 상엽에서 ER(extreme resistance)이 나타났다. 이병성 고추인 ECW와 Jupiter는 저항성 유전자 Pvr4 유전자가 없기 때문에 상엽의 색이 불규칙한 모틀링(mottling) 현상을 나타내었다 (도 6의 A).
실험에 사용한 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스는 바이러스의 게놈안에 GFP가 삽입되어 있어 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 증식하면, UV 라이트 아래에서 GFP의 발현을 관찰할 수 있는 장점이 있다. 따라서 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스의 증식을 확인하기 위한 접종액으로 사용하기 위하여 N. tabaccum에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스를 접종하여 UV 라이트 아래에서 관찰한 결과 상엽에서 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스가 증식한 증거로 GFP를 관찰할 수 있었다. 이러한 GFP의 발현은 고추의 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스 저항성을 판별할 때, 실험의 편의성을 제공하였다(도 6의 B).
실시예 7 : 저항성 고추인 CM334와 이병성 고추인 ECW123R와 Jupiter를 각각 교배하여 만들어진 집단의 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대한 유전학적 분석
Pvr4 유전자와 가장 가까이 연관되어 있는 분자표지를 개발하기 위하여 두 개의 집단을 사용하였다. 저항성 개체로서 CM334를 사용하였고, 이병성 개체로서 ECW123R과 Jupiter를 사용하였다. 첫 번째 집단으로, CM334와 ECW123R의 교배체인 F1 개체를 이병성 개체에 여교잡하여 얻어진 BC1F3의 1063 개체의 각 본엽에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스로 감염된 담배조직의 접종액을 3 ㎖/g의 농도로 루빙(rubbing)한 결과 저항성과 이병성의 분리 개체수가 각각 812:251로써 3:1의 분리비가 나타남을 확인하였다(표 1).
또한, Jupiter를 모계로 하고 CM334를 부계로 교배하여 얻어진 F1은 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스에 대해 저항성을 보였으며, 이것은 저항성 유전자가 우성유전자임을 의미하였다. F1 교배체를 자가수분하여 얻어진 405 개체의 F2 집단에 같은 방법으로 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스로 감염된 담배조직의 접종액을 3 ㎖/g 의 농도로 루빙(rubbing)한 결과 저항성과 이병성의 분리개체수가 309:96으로 3:1의 분리비가 나타남을 확인하였다. 이러한 분리비는 SP6PepMoV-Vb1/GFP에 대한 저항성이 멘델의 유전법칙에 의거하여 단일 우성 저항성 유전자에 의해 유도된다는 것을 의미하였다. 이 결과는 Pvr4 유전자를 가지고 있는 CM334와 PVY를 포함한 potyvirus에 이병성을 나타내는 RNaky 또는 ECW를 교배하여 얻어진 F1 교배체가 저항성을 나타내고, F1을 자가수분하여 얻어진 F2 개체에서 단일 우성 저항성 유전자에 의해 저항성을 나타내는 분리비인 3(저항성): 1(이병성)을 나타냈던 기존의 보고와 동일한 결과를 나타냈다(Dogimont et al., Euphytica, 1996, vol.88, 231-239; Boiteux et al., Euphytica, 1996, vol. 87, 53-58). 따라서, 이 실험에 사용된 고추의 교배집단이 분자표지를 개발하거나 Pvr4 유전자를 동정하기 위해 적합한 실험재료라는 것을 알 수 있었다. 또한, 카이스퀘어 검정을 통해 분리비가 3:1 로써 통계적으로 예측치와 실측치가 다르지 않음을 확인할 수 있었다(표 1). BC1F3는 CM334를 모계로하고 ECW123R을 부계로 하여 얻어진 F1 개체를 ECW123R에 다시 여교잡을 한 개체를 세 번 자가수분시킨 개체를 의미한다. 또한 Expected ratio는 단일 우성 저항성 유전자에 의새 바이러스에 의한 저항성이 유도되는 경우 나타나는 분리비의 예상 비율을 의미하며, Observed frequency는 각각의 고추 집단에서 PepMoV 바이러스 접종 후에 ELISA를 통해 나타난 실험적 결과를 의미한다. R은 resistance phenotype을 나타낸 개체를 의미하며 S는 Susceptible phenotype을 나타낸 개체를 의미한다. Expected ratio와 Observed frequency가 통계학적으로 유의성이 있는지에 대한 결과를 나타내기 위해 카이스퀘어 검정을 하였으며 이것이 X2이다. 마지막으로 카이스퀘어 검정이 P value에 의해 유의한 비율로 나타났는지에 대해 검증하였다.
표 1
Plant materials Expected ratio (R:S) Observed frequency X 2 P
R S
CM334 (CM) 1:0 40 - - -
Jupiter (J) 0:1 - 29 - -
ECW123R (E) 0:1 - 41 - -
ER x (ER x CM) BC1F3 3:1 812 251 1.091 0.296
(J x CM) F1 1:0 19 - - -
(J x CM) F2 3:1 309 96 0.362 0.546
실시예 8 : Pvr4 유전자 분리를 위한 BC1F3 32개체의 유전형 분석 결과
고추와 토마토는 가지과에 속하는 작물로 염색체간의 신터니가 잘 보존되어 있다. 염색체 12개 가운데 포티바이러스의 저항성 유전자인 Pvr4는 기존의 많은 논문과 앞선 실험에서 염색체 10번의 텔로미어 영역에서 토마토의 TG420 분자표지 근처에 위치한다고 보고되었다(Wu, Eannetta et al., TAG, 2009, vol. 118, 1279-1293; Kim, Han et al., TAG. 2011, vol. 122, 1051-1058). TG420을 포함한 영역이 토마토와 고추의 시퀀스 레벨에서 잘 보존되어 있는 것에 기반하여 염색체 10 번의 87 Mb의 전체영역에서 50-60 Mb 일부 시퀀스를 분리하였다. TG420 분자표지를 포함한 일정영역의 시퀀스를 CM334의 스캐폴드 시퀀스를 쿼리(query)로 한 블라스트를 통하여 동일성(identity)이 높은 스캐폴드를 분리하였다. 분리한 시퀀스에서 FGENESH 프로그램을 통하여 유전자를 예측하였고, 유전자의 엑손영역에서 프라이머를 작성하여 CM334와 Jupiter의 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물들은 시퀀싱을 통하여 SNP및 Indel을 확인하였으며, 시퀀스의 차이를 이용하여 Pvr4 유전자와 공분리하는 SNP61786 분자표지를 개발하였다(도 7).
SNP61786 분자표지가 실시예 6의 두 개의 집단에 적용되었을 때, 1468개의 고추개체에 대해서 표현형과 유전형이 일치하는 0cM으로 나타났다. 공-우성(Co-dominant) 분자표지로서 PCR 증폭 후 MboI 제한효소를 처리한 경우, 저항성 (R)은 1000 bp 와 550 bp 의 밴드가 나타나고, 이병성 (S)는 500 bp 와 350 bp의 밴드가 나타나며, 헤테로 (H)는 4종류의 밴드 (1000 bp, 550 bp, 500 bp 와 350 bp)가 모두 나타난다. 결과적으로 SNP61786 분자표지가 위치한 CM334의 스캐폴드 영역에 Pvr4 유전자가 위치한다는 것을 확인하였다. SNP61786 분자표지를 포티바이러스 저항성 품종 육성에 사용한다면 Pvr4 유전자를 보다 정확하고 빠르게 확인하여 육종과정을 단축하는데 산업적으로 이용될 수 있다(도 7).
실시예 9 : 고추의 10 번 염색체에서 Pvr4 유전자 영역의 유전학적 또는 물리적 거리를 나타낸 모식도
Pvr4 유전자와 연관되어 있는 31 개의 분자표지 중에 Pvr4 유전자와 가장 가까이 위치한 분자표지들로 SNP20172, SNP575, SNP61786, SNP1072, SNP1983을 선발하였으며 분자표지를 포함하는 스캐폴드의 뉴클레오타이드 시퀀스를 확보한 후, FGENESH를 통해 유전자를 예측하였다. 일반적으로 식물의 저항성 유전자는 NBS(nucleotide-binding site) LRR(leucine-rich repeat)의 구조를 가지고 있다고 보고되었다(Moffett, Advances in virus research, 2009, vol. 75, 1-33, 228-229). 포테이토 바이러스 X(Potato virus X)의 저항성 유전자인 Rx 는 N-말단에 CC (coiled-coil) 도메인을 가진 NBSLRR 구조를 가진 유전자이며, Xanthomonas campestris의 저항성 유전자인 Bs2 또한 CC-NBS-LRR 구조를 가졌으며, 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus)의 저항성 유전자인 N 은 N-말단에 TIR(Toll/interleukin-1 receptor-like) 도메인을 가진 NBSLRR 유전자이다(Kang et al., Annu. Rev. Phytopathol, 2005, vol.43, 581-621; Moffett, Advances in virus research, 2009, vol. 75, 1-33, 228-229).
따라서, Pvr4 유전자 역시 NBS-LRR 구조를 가졌을 것으로 추측하고, 이 영역에 위치한 NBLRR 유전자를 찾아본 결과 8개의 NBLRR 유전자가 존재하는 것으로 분석되었다. 이 영역의 8 개 Pvr4 저항성 후보유전자는 NBARC의 뉴클레오타이드 상동성 비교를 통해 두 개의 그룹으로 나누어지며 NBSLRR 유전자가 중복(duplication) 되어 있는 형태로 존재한다고 추정되었다. 저항성 유전자로서 기능하는데 필요한 구조를 모두 가지고 있는 NBSLRR 유전자는 끝이 네모난 화살표로 나타내었으며 4 개의 유전자가 완전한 구조를 가진 것으로 분석되었다. 또한 이 영역을 포함하고 있는 BAC을 선발하여 유전자들의 정보를 확인하였다. 빨강색으로 표시된 화살표는 Pvr4 유전자를 나타내고 있으며, Pvr4 유전자의 구조가 7 개의 엑손과 6 개의 인트론으로 이루어진 유전자임을 표시하였다(도 8). 이병성 대립유전자인 pvr4 유전자는 6개의 엑손과 5개의 인트론으로 이루어진 유전자임을 표시하였다(도 8).
실시예 10 : Pvr4 유전자의 염기 서열 및 구조적 특이성
상기의 실험을 통해 동정된 CM334에서 분리된 Pvr4 유전자는 coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat (CC-NBS-LRR) 타입이며, 총 5238 개의 뉴클레오타이드 (nucleotide)의 ORF (open reading frame) 서열을 가지고 있으며 1745 개의 아미노산 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 포티바이러스에 대해 이병성을 나타내는 C. annuum cv. ECW 에서 Pvr4 유전자의 이병성 대립유전자로 동정된 pvr4 유전자는 4806 개의 뉴클레오타이드의 ORF 서열을 가지고 있으며 1601 개의 아미노산 서열을 포함한다는 것을 나타낸다(도 9a). Pvr4 유전자와 pvr4 유전자의 폴리뉴클레오타이드 전체서열을 비교분석한 결과 95% 상동성을 나타내며, 이병성 대립유전자 pvr4는 432 개의 뉴클레오타이드가 결실된 것으로 나타났다. 도 9b 에서 Pvr4 유전자와 pvr4 유전자의 아미노산 전체 서열을 비교분석한 결과, N-말단의 CC 도메인과 NBS 도메인은(1-600 아미노산 영역) 98% 이상의 상동성을 보였으나 아미노산 서열의 c-terminal 영역에서(GFKLQDDFFDGMSEL으로 시작되는 아미노산 서열부터 정지코돈의 영역의 1205개의 아미노산) 85% 이상의 서열 유사성을 나타냈다 (도 12). 따라서, PepMoV에 대한 저항성이 Pvr4 유전자의 LRR 도메인에 의해 유도될 것이란 추측을 할 수 있었다. 이것은 저항성 유전자의 LRR 도메인이 병원균의 이펙터(effector)를 인지함으로써 과민감성 반응이나 저항성을 매개한다는 기존의 보고를 재확인해 주는 결과이다(도 9a-9b).
실시예 11 : Pvr4 유전자의 genomic DNA 구조
CM334의 스캐폴드와 BAC 라이브러리 스크리닝을 통해 인트론을 포함한 Pvr4 유전자의 전체 뉴클레오타이드 시퀀스를 확보할 수 있었다. Pvr4 유전자는 7 개의 엑손과 6 개의 인트론으로 이루어져 있으며 전체 13870 bp의 뉴클레오타이드를 가지는 큰 사이즈의 저항성 유전자이다(도 10a). CC-NBS를 포함하고 있는 엑손 1은 2673 bp의 뉴클레오타이드를 가지며, 마지막 엑손 2 개를 제외한 엑손 2부터 엑손 5의 4 개 엑손은 서로간의 상동성이 94%를 나타냈다(도 10b). 또한, 인트론 영역 역시 첫 인트론 1을 제외하고 인트론 2부터 인트론 5의 4 개 인트론은 서로간의 상동성이 99%를 나타냈다(도 10c). 엑손 2와 인트론 2가 하나의 반복단위로써 4번 순차 중복(tandem duplication)된 구조로 예측된다. 이러한 저항성 유전자의 구조는 현재까지 보고된 적이 없으며, 높은 상동성을 나타내는 반복성으로 인해 PCR을 통한 genomic DNA 분리는 기술적으로 불가능한 부분으로 여겨진다. 이러한 구조적 특이성으로 인해 Pvr4 유전자가 포티바이러스의 여러가지 바이러스에 대해서 광범위한 저항성을 유도하는 것으로 추정하고 있다(도 10a-10c).
실시예 12 : 포티바이러스에 대한 Pvr4 유전자의 저항성 테스트
Pvr4 유전자가 포티바이러스의 NIb와 1:1로 동시에 과발현 시키는 경우뿐만 아니라 바이러스를 접종하는 경우에도 과민감성반응을 보이는지 확인하기 위하여, N. benthamiana에 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스, PepSMV와 PVY가 감염된 담배조직의 접종액을 3 ㎖/g 의 농도로 루빙(rubbing)시킨 후, 2 일이 지난 시기에 왼쪽에는 빈 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 침윤시켰고, 오른쪽에는 Pvr4 유전자를 침윤시킴으로써 과발현시켰다. 루빙(rubbing)시키고 3 일이 지난 후에, SP6PepMoV-Vb1/GFP, PepSMV과 PVY이 각각 접종된 모든 잎의 Pvr4 유전자가 과발현된 오른쪽 영역에서 과민감성 반응이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 Pvr4 유전자와 포티바이러스의 NIb를 N. benthamiana에서 동시에 과발현시켰을 때 유도된 과민감성 반응과 유사하였다. 바이러스 접종을 통해 유도된 과민감성 반응은 Pvr4 유전자에 의해 바이러스의 증식이 억제된 것을 의미하며, Pvr4 유전자가 in vivo 에서 SP6PepMoV-Vb1/GFP 바이러스, PepSMV 및 PVY에 대해 저항성을 나타냈음을 확인하였다(도 11).
실시예 13 : 포티바이러스에 대한 저항성을 나타내는 Pvr4와 이병성 대립유전자인 pvr4 의 아미노산 서열의 차이
CM334에서 유래한 포티바이러스 저항성 유전자 Pvr4 가 암호화하는 아미노산 서열의 c-terminal에 위치한 1205개의 아미노산(서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열에 해당함)과 ECW에서 유래한 이병성 대립형질인 pvr4 유전자가 암호화하는 아미노산 서열의 c-terminal에 위치한 1062 개의 아미노산을 비교한 결과이다. NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 블라스트(Blast) 프로그램을 이용하여 Pvr4 아미노산과 pvr4 아미노산의 서열을 비교한 결과, 두 단백질의 유사도가 85%에 해당하는 것으로 분석되었다(도 12). 두 단백질의 아미노산 서열 차이는 포티바이러스에 대한 저항성을 기능하는데 중요한 아미노산 위치 및 서열을 정하는데 중요한 정보를 제공한다.

Claims (17)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 식물체의 포티바이러스(potyvirus)에 대한 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4.
  2. 제1항의 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항의 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. Pvr4 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 형질전환시켜 형질전환 식물세포에서 Pvr4 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 포티바이러스에 대한 저항성을 증가시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Pvr4 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 포티바이러스에 대한 저항성을 증가시키는 방법.
  8. (a) 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계; 및
    (b) 상기 단계(a)에 의하여 제조된 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물을 재분화시키는 단계를 포함하는 포티바이러스에 대한 이병성 식물체 또는 비형질전환 식물체에 비해 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 Pvr4 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 것을 특징으로 하는 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
  10. 제8항의 방법에 의해 제조된 포티바이러스 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식물체는 분류학적으로 포티바이러스에 의해 감염되는 숙주식물체(host)인 솔라나세아(Solanaceae), 케노포디아세아(Chenopodiaceae), 레규미노세-파필리오노이데아(Leguminosae-Papilionoideae), 아마란타세아(Amaranthaceae), 쿠쿠르비타세아(Cucurbitaceae), 컴포지테(Compositae), 크루시퍼레(Cruciferae), 그라미니에(Gramineae)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  12. 제10항에 따른 형질전환 식물체의 형질전환된 종자.
  13. 서열번호 3의 아미노산 서열; 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 541~1745번째 서열과 85% 이상의 서열 유사성을 가지며, 포티바이러스(potyvirus) 저항성을 갖는 아미노산 서열;로 이루어진 포티바이러스 저항성 단백질 Pvr4를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 포티바이러스 저항성 증가용 조성물.
  14. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머(primer).
  15. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열 중 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브(probe).
  16. 제14항의 프라이머 또는 제15항의 프로브를 포함하는 포티바이러스 저항성 Pvr4 유전자 검출용 키트.
  17. 제1항의 포티바이러스 저항성 Pvr4 단백질에 대한 항체.
PCT/KR2015/005133 2015-05-22 2015-05-22 포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도 WO2016190452A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020177029127A KR101996891B1 (ko) 2015-05-22 2015-05-22 포티바이러스 저항성을 가지는 Pvr4 유전자 및 이의 용도
PCT/KR2015/005133 WO2016190452A1 (ko) 2015-05-22 2015-05-22 포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도
CN201580080240.XA CN108350045B (zh) 2015-05-22 2015-05-22 具有马铃薯Y病毒属抗性的Pvr4基因及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2015/005133 WO2016190452A1 (ko) 2015-05-22 2015-05-22 포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016190452A1 true WO2016190452A1 (ko) 2016-12-01

Family

ID=57392892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2015/005133 WO2016190452A1 (ko) 2015-05-22 2015-05-22 포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR101996891B1 (ko)
CN (1) CN108350045B (ko)
WO (1) WO2016190452A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024037548A1 (zh) * 2022-08-17 2024-02-22 江苏省农业科学院 一种植物免疫激活蛋白PmSCR1及其应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022004957A (es) * 2019-12-20 2022-05-16 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel Bv Gen resistente al torradovirus.
CN111171116A (zh) * 2020-02-12 2020-05-19 湖南省植物保护研究所 辣椒斑驳病毒的重组蛋白及其制备方法、多克隆抗体及制备方法、检测试剂盒及应用
CN112760330B (zh) * 2021-03-16 2022-12-27 华中农业大学 ScRy1基因在抗马铃薯Y病毒植物育种中的应用
CN114034862A (zh) * 2021-11-29 2022-02-11 内蒙古中加农业生物科技有限公司 一种马铃薯种薯病毒检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130138000A (ko) * 2012-06-08 2013-12-18 서울대학교산학협력단 ＰｅｐＭｏＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2835698B1 (fr) * 2002-02-08 2004-08-06 Genoplante Valor Procede de selection ou d'obtention de plantes resistantes aux potyvirus et sequences marquant ou codant cette resistance
KR100920369B1 (ko) * 2007-11-21 2009-10-07 재단법인서울대학교산학협력재단 ＣｈｉＶＭＶ저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머세트, 방법 및 키트
CN102180955B (zh) * 2011-03-18 2013-03-06 中国农业大学 与马铃薯y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白及其编码基因与应用
KR101432281B1 (ko) * 2013-12-20 2014-08-22 주식회사 에프앤피 캡시컴 안늄의 종내집단을 이용한 ｓｓｒ 마커 및 유전자 연관지도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130138000A (ko) * 2012-06-08 2013-12-18 서울대학교산학협력단 ＰｅｐＭｏＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenBank [O] NCBI; 23 March 2015 (2015-03-23), "Capsicum annuum cultivar CM334 unplaced genomic scaffoldPGAv.1.5.scaffold1161, whole genome shotgun sequence", XP055337208, Database accession no. KI868371.1 *
DATABASE GenBank [O] NCBI; 25 March 2015 (2015-03-25), XP055337202, Database accession no. AJW77762.1 *
DEVRAN ET AL.: "Development of Molecular Markers Tightly Linked to Pvr4 Gene in Pepper Using Next-Generation Sequencing", MOLECULAR BREEDING, vol. 35, no. 101, 17 March 2015 (2015-03-17), pages 1 - 9, XP035491133 *
KIM ET AL.: "RNA-Dependent RNA Polymerase (NIb) of the Potyviruses is An Avirulence Factor for the Broad-Spectrum Resistance Gene Pvr4 in Capsicum Annuum cv. CM334", PLOS ONE, vol. 10, no. 3, 11 March 2015 (2015-03-11), pages 1 - 11, XP055337196 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024037548A1 (zh) * 2022-08-17 2024-02-22 江苏省农业科学院 一种植物免疫激活蛋白PmSCR1及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170129186A (ko) 2017-11-24
KR101996891B1 (ko) 2019-07-05
CN108350045A (zh) 2018-07-31
CN108350045B (zh) 2021-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016190452A1 (ko) 포티바이러스 저항성을 가지는 Ｐｖｒ4 유전자 및 이의 용도
Fitch et al. Virus resistant papaya plants derived from tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus
Watanabe et al. Genetic and molecular bases of photoperiod responses of flowering in soybean
Ritzenthaler Resistance to plant viruses: old issue, news answers?
Westerink et al. Cladosporium fulvum circumvents the second functional resistance gene homologue at the Cf‐4 locus (Hcr9‐4E) by secretion of a stable avr4E isoform
Pavli et al. The hrpZ gene of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola enhances resistance to rhizomania disease in transgenic Nicotiana benthamiana and sugar beet
Duan et al. Phenotypic variation in transgenic tobacco expressing mutated geminivirus movement/pathogenicity (BC1) proteins
Yoshii et al. Isolation of an Arabidopsis thaliana mutant in which accumulation of cucumber mosaic virus coat protein is delayed
Wang et al. Identification of wheat blue dwarf phytoplasma effectors targeting plant proliferation and defence responses
Chowdhury et al. HCPro suppression of callose deposition contributes to strain-specific resistance against potato virus Y
UA126433C2 (uk) Ген стійкості до іржі стебел пшениці і спосіб його застосування
Méndez‐López et al. Tomato SlGSTU38 interacts with the PepMV coat protein and promotes viral infection
Butler et al. Soybean resistance locus Rhg1 confers resistance to multiple cyst nematodes in diverse plant species
Zafirov et al. When a knockout is an Achilles’ heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana
CN107418957B (zh) 控制水稻耐冷基因cold2及其应用
WO2010008204A2 (en) Genes for enhancing resistance to magnaporthe oryzae and uses thereof
de Ronde et al. Identification and characterization of a new class of Tomato spotted wilt virus isolates that break Tsw‐based resistance in a temperature‐dependent manner
Liu et al. Overexpression of OsCIPK30 enhances plant tolerance to rice stripe virus
KR101465692B1 (ko) AtbHLH113 유전자를 이용한 안토시아닌 생합성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체
Lovato et al. The N protein of Tomato spotted wilt virus (TSWV) is associated with the induction of programmed cell death (PCD) in Capsicum chinense plants, a hypersensitive host to TSWV infection
Wang et al. Appropriate reduction of importin‐α gene expression enhances yellow dwarf disease resistance in common wheat
US20100115668A1 (en) Ocp3 gene of arabidopsis thaliana and the ocp3 recessive mutation thereof, and the use of same as a resistance regulator in plants with disease caused by necrotrophic fungal pathogens
US20100242133A1 (en) MANIPULATION OF THE FUNCTION OF AtDBP1 IN ORDER TO GENERATE POTYVIRUS RESISTANCE
De Turck et al. Transgenic potato plants expressing the nptII-gus marker genes affect survival and development of the Colorado potato beetle
Ohnishi et al. Multigenic system controlling viral systemic infection determined by the interactions between Cucumber mosaic virus genes and quantitative trait loci of soybean cultivars

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15893405

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177029127

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15893405

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1