KR20090052754A - ＣｈｉＶＭＶ저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머세트, 방법 및 키트 - Google Patents

ＣｈｉＶＭＶ저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머세트, 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 ChiVMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하는 방법, 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다. 분자 표지가 없다면, ChiVMV에 대한 저항성 육종을 하기 위하여 매 세대마다 후대 검정을 해야 하므로, 많은 노력과 시간, 자본 등이 소요되는데, 본 발명의 프라이머 세트로 이루어진 분자 표지의 개발은 이러한 비용을 줄여 보다 빠르고 정확한 육종에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
프라이머 세트, ChiVMV, 고추, 키트, 마커

Description

ＣｈｉＶＭＶ저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트{Primer set, method and kit for selecting ChiVMV-resistant pepper cultivar}
본 발명은 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 DNA 마커에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 ChiVMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하는 방법, 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다.
Potyvirus는 작물에 병을 일으키는 것으로 알려진 바이러스 중 30%를 차지할 정도로 매우 위험한 병원체군이다. 고추에서도 potyvirus는 큰 문제가 되는데, Potato virus Y(PVY), pepper mottle virus(PepMoV), Tobacco etch virus(TEV), Pepper veinal mottle virus (PVMV), Chilli veinal mottle virus(ChiVMV)의 5개 종이 고추에 병을 일으키는 것으로 알려져 있다.
상기 5가지의 potyvirus 중에서 특히 ChiVMV가 고추에 큰 피해를 준다. AVRDC가 아시아 16개국에서 ChiVMV에 의한 병의 피해를 조사했을 때, 재배되는 고추의 30%가 ChiVMV에 감염되었다는 것이 보고되었다. 또한 AVRDC의 조사에 의하면 매운 고추에서는 9-74%, sweet pepper에서는 55-95%의 수확량이 ChiVMV에 의해 감소하는 것으로 나타나 그 피해가 크다는 것을 알 수 있다.
바이러스가 식물체에 감염되기 위해서는 기주 인자와 바이러스의 단백질, RNA 사이의 상호작용이 필요하다. 그렇기 때문에 기주 인자의 중요 부분에 돌연변이가 발생하면 바이러스의 단백질과 RNA가 상호작용을 하지 못해 식물은 바이러스에 대한 열성 저항성을 갖게 된다.
자연계에서 기주 인자에 의한 열성 저항성은 eIF4E, eIF(iso)4E 단백질군의 돌연변이체에서만 발견되었고, 몇 몇 작물에서는 이들 단백질군을 암호화하여 열성 저항성에 관여하는 유전자도 발견되었다. 고추에서는 TEV, PVY에 저항성을 갖는 pvr1, 상추에서는 LMV에 저항성을 가지는 mo1, 완두에서 PSbMV에 저항성을 가지는 sbm1, 보리에서 bymovirus에 저항성인 rym4 /5, 멜론에서 MNSV에 저항성인 ncv 유전자 등이 발견되었다 (Kang et al, 2005, Plant J. 42(3): 392-405).
근대 작물 육종에서 분자 표지는 매우 유용한 도구이다. 분자 표지를 사용하면 원하는 대립유전자를 갖는 계통을 조기에 선별할 수 있다. 후대 검정을 하지 않기 때문에 비용, 노력, 시간을 절감할 수 있다.
특히 열성으로 유전되는 형질에는 그 가치가 더욱 커진다. 표현형에 의해 선발할 경우 그 형질을 구별하기가 어렵고, 불가능한 경우도 있다. co-dominant 분자 표지를 이용한다면 열성 대립 유전자를 가지고 있는 계통을 확실하게 구별할 수 있 다.
고추에 큰 피해를 주는 ChiVMV에 대한 저항성은 pvr1 2 , pvr6 이 두 유전자가 관여하며 열성으로 유전된다. 분자 표지가 없다면, ChiVMV에 대한 저항성 육종을 하기 위하여 매 세대마다 후대 검정을 해야 한다. 이에 따라 많은 노력과 시간, 자본 등이 소요된다. 이번 분자 표지의 개발은 이러한 비용을 줄여 보다 빠르고 정확한 육종에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명에서는 고추에 큰 피해를 주는 ChiVMV에 대한 저항성 고추 품종을 육종하기 위해, ChiVMV에 대한 저항성에 관여하며 열성으로 유전되는 2개의 유전자 pvr1 2 , pvr6 에 대한 DNA 마커를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 ChiVMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 분자 표지가 없다면, ChiVMV에 대한 저항성 육종을 하기 위하여 매 세대마다 후대 검정을 해야 함으로 인해 많은 노력과 시간, 자본 등이 소요되는데, 본 발명의 프라이머 세트로 이루어진 분자 표지의 개발은 이러한 비용을 줄여 보다 빠르고 정확한 육종에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr1 2 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr6 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레 오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr1 2 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr6 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr1 2 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr6 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다. 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 ChiVMV에 대한 저항성을 가진 계통을 비교적 쉽고 정확하게 분별할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 마커로 이용되며, eIF4E의 엑손과 인트론의 염기서열 정보를 이용하여 제작하였다. 상기 마커의 염기 서열은 도 1에 서열번호 1 내지 4로 표시하였다.
pvr1 2 는 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 분자 표지를 이용하였다. dCAPS 분자 표지는 CAPS 분자 표지의 하나로 제한효소 자리는 없지만 돌연변이가 발생한 부분에, 제한 효소에 의해 잘릴 수 있도록 처리하여 아가로스 겔에서 그 야생형과의 다형성을 보는 방법이다. 우선 일반 PCR에서 사용하는 것보다 더 길면서 그 안에 돌연변이가 발생한 염기와 만나 제한효소 자리가 되도록 프라이머를 제작하여 PCR을 한다. 그 다음 PCR 산물을 제한효소로 자르면 아가로스 겔에서 밴드의 길이의 차이를 확인할 수 있다. pvr1 2 의 경우 야생형(도 4a에서 S(감수성)로 표시된 레인)은 412bp의 길이의 밴드로 나타나는 반면 돌연변이체 pvr1 2 (도 4a에서 R(저항성)로 표시된 레인)은 제한효소 HindIII 절단에 의해 380bp와 32bp의 길이를 가진 2개의 밴드로 나타나 야생형과 구별할 수 있다 (도 4a 참조).
pvr6 는 SCAR (sequence characterized amplified region) 분자 표지를 이용하였다. SCAR 분자 표지는 PCR을 하여 겔 상에서 밴드의 유무나 그 길이의 차이로 다형성을 찾는 방법이다. pvr6는 야생형과 비교했을 때, 80bp의 염기서열이 삭제되어 있다. 이 삭제되어 있는 부분을 포함하도록 프라이머를 제작하여 PCR을 하면, 야생형에서는 600bp의 밴드를 겔 상에서 확인할 수 있고(도 4b에서 S(감수성)로 표시된 레인), pvr6에서는 80bp가 적은 520bp의 밴드를 확인할 수 있다 (도 4b에서 R(저항성)로 표시된 레인)(도 4b 참조).
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 고추 시료는 진핵생물의 번역 조절 인자인 eIF4E의 돌연변이인 pvr1 2 를 가지고 있는 고추 종 (Capsicum annuum 'Dempsey' (DEMP))과 pvr6 를 가지고 있는 고추 종 (Capsicum annuum 'Perennial' (PER)) 을 교배하여 식물 재료로 사용하였다. DEMP는 ChiVMV에 대해 감수성을 가지며, PER은 ChiVMV에 대해 저항성을 나타낸다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효 소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 프라이머 세트가 SCAR 마커인 경우에는 제한효소는 필요 없게 된다. 그러나, 프라이머 세트가 CAPS 마커를 포함하는 경우에는 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에 제한효소를 필요로 한다. 즉, CAPS 마커는 증폭 반응을 수행한 후에, 해당하는 제한효소로 절단해야 증폭 산물을 구별할 수 있기 때문이다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험재료 및 방법
식물시료
Chili veinal mottle virus (ChiVMV)에 대한 저항성과 관련된 유전자를 선별하기 위해 진핵생물의 번역 조절 인자인 eIF4E의 돌연변이인 pvr1 2 를 가지고 있는 고추 종 (Capsicum annuum 'Dempsey' (DEMP))과 pvr6 를 가지고 있는 고추 종 (Capsicum annuum 'Perennial' (PER)) 을 교배하여 식물 재료로 사용하였다. DEMP는 ChiVMV에 대해 감수성을 가지며, PER은 ChiVMV에 대해 저항성을 나타낸다. DEMP와 PER을 종간 교배하여 F1, F2, F3 집단을 만들었으며, 이를 이용하여 ChiVMV에 대한 저항성과 pvr1 2 , pvr6의 저항성 분리가 일치하는지 확인하였다.
바이러스 분리와 접종
ChiVMV는 인도네시아에서 ChiVMV가 감염된 고추로부터 바이러스를 분리하여 사용하였다. 모든 바이러스 접종 실험은 인도네시아의 농우바이오에서 진행하였다. 바이러스 접종은 고추가 5~6 잎이 있는 생육 시기에 carborandum을 이용하여 제일 큰 두 잎에 가볍게 물리적 상처를 주고 바이러스에 전반적으로 감염된 조직 1g당 50mM의 potassium phosphate 버퍼(pH 7.5) 20ml를 넣고 갈아서 바이러스 접종원으로 사용하였다. 육안으로 관찰하여 병의 저항성을 판단하였다.
DNA 추출
DNA의 추출은 잎을 채취하여 실시하였다. 잎 조직 (2-3g)을 액체질소를 넣고 분쇄한 후, DNA 추출 버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.5, 1.4M NaCl, 20mM EDTA pH8.0, 0.5% SDS, 1% 폴리비닐피롤리돈 (불용성), 1% β-머캅토에탄올)를 넣고 부드럽게 교반시킨 후 60℃에서 45분간 반응시킨다. 클로로포름 25ml을 더 넣어주고 균질화하도록 30분 동안 더 반응시킨다. 그 후 7,000 g에서 30 분간 원심분리하여 상등액만을 취하고 에탄올을 이용하여 핵산을 침전시킨다. DNA를 멸균된 증류수와 RNase A를 넣어 녹여준다.
pvr1 2 과 pvr6 의 유전자형 분석
pvr1 2 와 pvr6는 유전자 특이적인 돌연변이를 가지고 있으며, CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)와 SCAR (sequence characterized amplified region) 분자 표지는 그 돌연변이를 바탕으로 만들어졌다. 대립 유전자 특이적인 CAPS, SCAR 분자 표지를 위한 PCR 프라이머 제작은 eIF4E의 엑손과 인트론의 염기서열 정보를 이용하여 제작하였다.
CAPS는 대립유전자간의 단백질을 암호화하는 구역의 SNP (single nulceotide polymorphism)에 의해 제한효소에 의해 잘리는 단편의 길이가 달라지는 것을 이용한 것이다. PCR을 이용한 DNA 증폭은 50ng의 genomic DNA와 50mM KCl, 10mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 그리고 0.4uM의 5'과 3' 방향의 프라이머 Pvr1-R2 F(서열번호 1) 및 Pvr1-R2 R(서열번호 2)를 각각 넣고 1unit의 Taq 중합효소를 넣어주어 총 25ul의 부피를 맞춰주어 실시한다. PCR은 95℃에서 5분간 반응한 후, 95℃ 1분, 59℃ 1분, 72℃ 1분의 일련의 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 더 반응하고 4℃로 냉각시켜주어 DNA 증폭 반응을 종료하였다. PCR을 마친 후, PCR 산물 10ul을 취하여 HindⅢ 2.5 unit을 넣고 10X 제한효소 버퍼를 2.5ul를 넣어준 후 제한효소가 작용할 수 있는 온도조건에서 2시간 동안 반응시킨다. 제한효소 처리 후, 2.2% 아가로스 겔 (1X TAE 버퍼)에 전기 영동하여 밴드를 확인한다.
SCAR 분자 표지는 PCR을 하여 그 밴드의 유무를 확인하거나, gel에서 밴드의 위치가 다르게 나오는 것을 이용한다. PCR을 이용한 DNA 증폭은 50ng의 genomic DNA와 50mM KCl, 10mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 그리고 0.4uM의 5'과 3'방향의 프라이머 iso-exon-F1(서열번호 3) 및 ixo-exon-R1(서열번호 4)를 각각 넣고 1unit의 Taq 중합효소를 넣어주어 총 25ul의 부피를 맞춰주어 실시한다. PCR은 95℃에서 5분간 반응한 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 일련의 반응을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 더 반응하고 4℃로 냉각시켜주어 DNA 증폭 반응을 종료하였다. PCR 산물은 2.2% 아가로스 겔 (1X TAE 버퍼)에 전기 영동하여 밴드를 확인한다 (도 1 참조).
실시예 1: 유전분석( genetic analysis )
PER와 DEMP를 부모친으로 하는 F2 집단에서 ChiVMV의 저항성에 대한 유전 분석을 한 결과, 그 유전 양상이 매우 복잡했다 (도 2 참조). pvr1 2 와 pvr6이라는 2개의 열성 유전자들과 우성으로 유전되는 ChiVMV에 관여하는 QTL이 복합적으로 작용했기 때문인 것으로 생각된다. pvr1 2 (eIF4E)와 pvr6(eIFiso4E)가 ChiVMV의 저항성에 관여하는지를 알아보기 위하여, 75개의 F2 집단과 350개의 F3 집단의 ChiVMV 저항성과 특이 분자 표지를 사용하여 pvr1 2 와 pvr6의 유전자형을 조사하였다 (도 3 참조). 그 결과는 eIF4E와 eIFiso4E의 연속적인 돌연변이가 고추에서 ChiVMV에 대한 저항성을 나타내는 것으로 해석되며, pvr1 2 와 pvr6의 분자표지는 ChiVMV 저항성 육종에 사용될 수 있을 것이다.
실시예 2: 마커 개발
pvr1 2 와 pvr6에 특이적인 분자표지를 개발하였다. pvr1 2 는 CAPS 분자 표지를 이용하였다. dCAPS 분자 표지는 CAPS 분자 표지의 하나로 제한효소 자리는 없지만 돌연변이가 발생한 부분에, 제한 효소에 의해 잘릴 수 있도록 처리하여 아가로스 겔에서 그 야생형과의 다형성을 보는 방법이다. 우선 일반 PCR에서 사용하는 것보다 더 길면서 그 안에 돌연변이가 발생한 염기와 만나 제한효소 자리가 되도록 프라이머를 제작하여 PCR을 한다. 그 다음 PCR 산물을 제한효소로 자르면 아가로스 겔에서 밴드의 길이의 차이를 확인할 수 있다. pvr1 2 의 경우 야생형은 412bp의 길이의 밴드로 나타나는 반면 돌연변이체 pvr1 2 은 제한효소 HindIII 절단에 의해 380bp와 32bp의 길이를 가진 2개의 밴드로 나타나 야생형과 구별할 수 있다 (도 4a 참조).
pvr6 는 SCAR (sequence characterized amplified region) 분자 표지를 이용하였다. SCAR 분자 표지는 PCR을 하여 겔 상에서 밴드의 유무나 그 길이의 차이로 다형성을 찾는 방법이다. pvr6는 야생형과 비교했을 때, 80bp의 염기서열이 삭제되어 있다. 이 삭제되어 있는 부분을 포함하도록 프라이머를 제작하여 PCR을 하면, 야생형에서는 600bp의 밴드를 겔 상에서 확인할 수 있고, pvr6에서는 80bp가 적은 520bp의 밴드를 확인할 수 있다 (도 4b 참조).
실시예 3: 유전분석과 병저항성의 상관관계조사
F2와 F3에 대한 cosegregation 분석 결과 pvr1 2 와 pvr6에서 모두 homogeneous한 유전자형이 나올 때 그 개체가 ChiVMV에 대해 저항성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 2개의 분자표지를 이용하면 ChiVMV에 대한 저항성을 가진 계통을 비교적 쉽고 정확하게 분별할 수 있다. 이를 통해 ChiVMV에 대한 저항성을 목표로 하는 고추의 육종에 많은 도움이 될 수 있을 것이다.
도 1은 CAPS 분자 표지와 SCAR 분자 표지의 프라이머 서열을 나타내는 그림이다.
도 2는 F2 집단에서 ChiVMV의 저항성 형질이 분리되는 양상을 조사한 그림이다.
도 3a는 F2 집단에서 ChiVMV의 저항성의 표현형과, pvr1 2 , pvr6 특이적인 분자 마커를 이용한 유전자형을 나타내는 그림이다.
도 3b는 F3 집단에서 ChiVMV의 저항성의 표현형과, pvr1 2 , pvr6 특이적인 분자 마커를 이용한 유전자형을 나타내는 그림이다.
도 4a는 pvr1 2 에 특이적인 CAPS 마커를 겔에서 확인했을 때의 예시를 나타내는 그림이다.
도 4b는 pvr6에 특이적인 SCAR 마커를 겔에서 확인했을 때의 예시를 나타내는 그림이다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Primer set, method and kit for selecting ChiVMV-resistant pepper cultivar <130> PN07044 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pvr1-R2 F primer <400> 1 gggctaaaat acgctcatct cccttc 26 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pvr1-R2 R primer <400> 2 ggctcaattt tatgcttgaa acaatgtaag c 31 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iso-exon-F1 primer <400> 3 ggtgaaacag ccacataagc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iso-exon-R1 primer <400> 4 gccaccatta gcgcactcag g 21

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr1 2 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
    서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr6 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr1 2 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
    서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr6 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr1 2 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
    서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는 고추 pvr6 유전자를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  4. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, ChiVMV (Chilli veinal mottle viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
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