KR101531950B1 - 고추 병 저항성 품종 선발용 프라이머 세트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오이모자이크 바이러스(CMV), 담배 etch 바이러스(TEV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 토바토바이러스(TMV), Chilli venial mottle virus(ChiVMV)에 의한 병, 세균성점무늬병(BS), 및 고추 역병의 고추에서의 병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머세트, 이를 포함하는 키트 및 이 프라이머세트를 이용하여 상기 고추 병 저항성 또는 이병성 품종을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 고추 병 저항성 품종을 정확하게 판별할 수 있다.

Description

고추 병 저항성 품종 선발용 프라이머 세트{Primer Set Useful for Selecting Pathogen Resistance Pepper}

본 발명은 고추 병 저항성 품종을 선발하는데 유용하게 사용될 수 있는 단일염기다형성(SNP)마커 검출용 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 이 프라이머 세트를 사용하여 고추 병 저항성 품종을 선발하는 방법에 관한 것이다.

야생 고추는 대략 26개의 품종이 중남미에 자생한다고 알려져 있다. 아시아에는 1942년 콜럼부스가 남아메리카 대륙에서 인도로 전파했으며, 우리나라에는 임진왜란 전후에 전파된 것으로 추정되며, 1600년 후반에 전국적으로 재배되기 시작되었다.

고추는 1700년대부터 김치 등의 음식에 넣어 먹었으며, 재배면적은 04년도에 61.9만 ha를 재배하던 것이 07년도에는 54.8만 ha로 12% 감소하였지만, 생산량은 10a당 91년도에 199kg을 생산하던 것이 07년도에는 292kg을 생산해 46%의 생산량이 증가하였다. 하지만 07년도를 기준으로 생산량은 감소하는 추세이다.

고추는 다양한 병이 발생하며, 이 병들의 발생은 생산량으로 연결되어 많은 종묘회사에서 다양한 병에 저항성을 갖는 품종을 육성하기 위해 노력을 기울이고 있다. 그중 전 세계적으로 고추 생산량 감소에 가장 큰 피해를 주는 병중 하나인 역병은 화학적 방제법이 주로 사용되지만, 최근에는 환경오염과 건강한 먹거리로 소비자의 소비 패턴이 바뀌며 저항성 품종 육성이 활발히 진행되고 있다.

전세계적으로 다양한 연구 그룹이 역병 저항성 유전자원 선발, 역병 저항성 유전자 연구를 수행했다. CM334, PI201234, AC2258, Perrenial 등 다양한 역병 저항성 유전자원이 발견되었고, 유전자 분석을 통해 다양한 QTL이 발견되었다(Bonnet et al., 2007, Theor Appl Genet 115:253-264). 그러나 QTL의 정확한 위치가 분석되지 않았고, 또한 환경에 의한 영향 및 QTL에 의한 영향을 구별하거나 QTL 간의 상호작용을 규명하기 어렵기 때문에 QTL 연구 결과를 실제 품종 육성에 적용하기는 쉽지 않다. 하지만, 양적 형질 유전자좌 수 및 위치는 다르지만 염색체 5번에 한 개의 주동 유전자좌가 공통적으로 존재한다는 연구 결과가 보고되었다. 따라서 실제 육종에 활용할 수 있는 저항성 연관 분자표지를 개발하기 위하여 복잡한 QTL에 의한 유전을 단순화시켜 염색체 5번에 위치하는 주동 유전자좌의 효과를 극대화시키고자 했다.

본 발명자들은 이렇듯 다양한 고추 병 저항성 유전자 중 주동 유전자좌의 SNP 부위를 활용하여 오이모자이크 바이러스(CMV), 담배 etch 바이러스 (TEV), 토마토반점위조바이러스 (TSWV), 토바토바이러스(TMV), 세균성점무늬병(BS), Chilli venial mottle virus(ChiVMV), 고추 역병을 동시에 진단할 수 있는 다중진단 제품을 개발하고자 하였다. 고추 병 저항성 품종 선발을 위해 사용되는 다중진단용 단일염기다형성 특이 프라이머 및 이의 용도에 대해서 밝혀진 바가 없다.

본 발명자들은 고추 병 저항성 단일염기다형성(Single Polynucleotide Polymorphism, SNP) 마커를 특이적으로 검출하여 고추 병 저항성 품종을 판별할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 오이모자이크 바이러스(CMV), 담배 etch 바이러스 (TEV), 토마토반점위조바이러스 (TSWV), 토바토바이러스(TMV), 세균성점무늬병(BS), Chilli venial mottle virus(ChiVMV), 고추 역병에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 7개의 SNP 마커를 확인하여 선별하였고, 이를 검출할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머를 개발하였으며, 이를 사용하여 SNP 마커의 염기타입을 분석하면 7개 병에 대한 고추 저항성 품종을 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고추병 저항성 또는 고추 병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 고추병 저항성 또는 이병성 품종을 판별하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 저항성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 이병성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트는 고추 병 저항성 또는 이병성 유전자좌에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 마커의 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다.

본 발명에서 용어 "고추(Hot pepper, Capsicum annuum)" 는 쌍떡잎식물 통화식물목 가지과의 한해살이풀을 의미하며, 남아메리카가 원산지이며, 온대와 열대지방에 분포하며, 통상적으로 밭에서 재배하는 식물이다. 열매는 수분이 적은 원뿔 모양 장과로 8-10월에 익는다. 붉게 익은 열매는 말려서 향신료로 쓰고 관상용 및 약용(중풍·신경통·동상 등)으로도 쓰며, 잎은 나물로 먹고 풋고추는 조려서 반찬으로 하거나 부각으로 만들어 먹는다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드" 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 7개의 각 SNP 마커들이 고추 병 저항성 품종 육성에 사용할 수 있는 것은 병 저항성 유전자좌의 각 SNP 변이 위치에서 저항성 및 이병성 품종에 따라 특정 염기가 존재하는 확률이 높은 것에 근거한 것이다.

구체적으로, 상기 SNP들은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 각각 개시된 폴리뉴클레오티드에서, 각각 오이모자이크 바이러스(CMV)병, 담배 etch 바이러스 (TEV)병, 토마토반점위조바이러스(TSWV)병, 토바토바이러스(TMV)병, 세균성점무늬병(BS), Chilli venial mottle virus(ChiVMV)병, 및 고추 역병 저항성에 관련된 SNP 마커가 나타난다.

상기 SNP들의 SNP 위치에서 특정 염기 타입이 고추 병 저항성에 특이적으로 연관되어 있음이 확인되었다. 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드에서 나타나는 SNP 좌위에서 병 저항성 품종은 저항성 염기타입을 갖고 있으며, 이병성 품종은 이병성 염기타입을 갖고 있다.

서열번호 1에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 오이모자이크 바이러스(CMV)에 의한 병 저항성 판별 SNP 염기는 (T/C)로 나타나며, 병 저항성에서는 T 염기타입이 이병성에는 C 염기타입이 나타난다.

서열번호 2에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 담배 etch 바이러스(TEV)에 의한 병 저항성 판별 SNP 염기는 (G/A)로 나타나며, 병 저항성에서는 G 염기타입이 이병성에는 A 염기타입이 나타난다.

서열번호 3에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 토마토반점위조바이러스(TSWV)에 의한 병 저항성 판별 SNP 염기는 (T/C)로 나타나며, 병 저항성에서는 T 염기타입이 이병성에는 C 염기타입이 나타난다.

서열번호 4에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 토바토바이러스(TMV)에 의한 병 저항성 판별 SNP 염기는 (G/C)로 나타나며, 병 저항성에서는 G 염기타입이 이병성에는 C 염기타입이 나타난다.

서열번호 5에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 세균성점무늬병(BS3)에 의한 병 저항성 판별 SNP 염기는 (C/T)로 나타나며, 병 저항성에서는 C 염기타입이 이병성에는 T 염기타입이 나타난다.

서열번호 6에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 Chilli venial mottle virus(ChiVMV)에 의한 병 저항성 판별 SNP 염기는 (T/G)로 나타나며, 병 저항성에서는 T 염기타입이 이병성에는 G 염기타입이 나타난다.

서열번호 7에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 고추 역병 저항성 판별 SNP 염기는 (T/A)로 나타나며, 병 저항성에서는 T 염기타입이 이병성에는 A 염기타입이 나타난다.

본 발명에서 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1에 나타나는 SNP (T/C) 염기에서 각 염기 타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드는 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드는 C 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 전방향 프라이머로서, 역방향 프라이머인 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드와 각각 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T/C 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머쌍에 의해 500bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 1 참조).

본 발명에서 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2에 나타나는 SNP (G/A) 염기에서 각 염기 타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드는 G 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드는 A 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 14의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로서, 역방향 프라이머인 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드와 각각 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 12 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 G/A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머 쌍에 의해 435bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 2 참조).

본 발명에서 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3에 나타나는 SNP (T/C) 염기에서 각 염기 타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드는 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드는 C 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 17의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로서, 전방향 프라이머인 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드와 각각 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T/C 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머쌍에 의해 370bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 3 참조).

본 발명에서 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4에 나타나는 SNP (G/C) 염기에서 각 염기 타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드는 G 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드는 C 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 20의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로서, 역방향 프라이머인 서열번호 18 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드와 각각 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 18 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 G/C 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머 쌍에 의해 300bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 4 참조).

본 발명에서 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5에 나타나는 SNP (C/T) 염기에서 각 염기 타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드는 C 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드는 T 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 23의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로서, 역방향 프라이머인 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드와 각각 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 21 및 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 C/T 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머쌍에 의해 250bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 5 참조).

본 발명에서 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6에 나타나는 SNP (T/G) 염기에서 각 염기 타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드는 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드는 G 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 26의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로서, 역방향 프라이머인 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드와 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 24 및 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T/G 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머 쌍에 의해 200bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 6 참조).

본 발명에서 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7에 나타나는 SNP (T/A) 염기에서 각 염기타입을 검출하기 위한 프라이머이다. 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드는 T 염기를 특이적으로 검출할 수 있도록 설계한 프라이머이고, 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드는 A 염기를 특이적으로 검출하도록 설계한 프라이머이다.

서열번호 29의 올리고뉴클레오티드는 전방향 프라이머로서 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드와 쌍을 이루어 PCR 증폭한다. 서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로써, 각각 야생형의 염기를 치환한 미스매치(mismatch) 염기를 포함하고 있어, 상기 SNP 염기인 T/A 염기에 대한 검출 특이도가 향상되어 있다. 상기 프라이머쌍에 의해 150bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물이 생성된다(도 7 참조).

본 발명에서 올리고뉴클레오타이드인 프라이머는 핵산 증폭을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 프라이머이다.

본 명세서에서 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 세트는 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 내부대조군(internal control) 프라이머쌍을 더욱 포함한다.

본 발명에서 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 쌍은 액틴(actin) 유전자 서열의 일부 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 프라이머 쌍이다. 이 프라이머 쌍은 100bp의 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 생성하고, PCR 반응의 내부대조군으로 사용된다. 이 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭산물 생성은 중합효소연쇄반응(PCR)이 정상적으로 수행되었음을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 고추 병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응((polymerase chain reaction, PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 고추 병 저항성 품종을 판별하는 방법을 제공한다: (a) 고추의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 고추병 저항성 품종 판별에 유용한 PCR 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및 (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 고추 병 저항성 품종 여부를 판별하는 단계.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 고추 병 이병성 품종을 판별하는 방법을 제공한다: (a) 고추의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계; (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 고추병 이병성 품종 판별에 유용한 PCR 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및 (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 고추 병 이병성 품종 여부를 판별하는 단계.

본 발명의 방법을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.

단계 (a): 고추의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계

고추의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는다. 고추의 생물학적 샘플은 예를 들어 고추의 다양한 세포 또는 조직으로부터 얻을 수 있으며, 이러한 세포 또는 조직의 원천의 예로는 열매, 잎, 뿌리, 줄기 등이 있다. 본 발명의 방법에서 지놈 DNA의 분리는 당 업계에 공지된 통상의 방법, 예컨대, 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215. 1998).

단계 (b) : 상기 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 상기 고추병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 PCR 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계

상기 단계 (a)에서 준비한 지놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 설명된 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행한다.

상기 중합효소연쇄반응은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

중합효소연쇄반응에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다. 한편, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다. 본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성 (pre-denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행한다.

단계 (c) : 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 고추 병 저항성 또는 이병성 품종 여부를 판별하는 단계

상술된 본 발명의 프라이머 세트에 의해 PCR 증폭되는 산물은 모두 다른 크기의 DNA 증폭산물 밴드를 형성한다. PCR 증폭된 DNA 증폭산물은 당업계의 공지된 방법, 예를 들어 아가로스 젤에서의 전기영동 및 EtBr 염색 및 자외선 조사에 의한 시각화에 의해 관찰할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 프라이머쌍에 의해 증폭되는 증폭산물생성 확인은 고추 병 저항성 또는 이병성의 가능성을 나타낸다. 즉, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 생성되는 증폭산물이 저항성 품종 검출용 프라이머쌍에 의해 증폭산물이 생성되면 고추 병 저항성 품종일 가능성이 높고, 이병성 품종 검출용 프라이머쌍에 의해 증폭산물이 생성되면 고추 병 이병성 품종일 가능성이 높아진다.

본 발명은 오이모자이크 바이러스(CMV), 담배 etch 바이러스(TEV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 토바토바이러스(TMV), Chilli venial mottle virus(ChiVMV)에 의한 병, 세균성점무늬병(BS), 및 고추 역병의 고추에서의 병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머세트, 이를 포함하는 키트 및 이 프라이머세트를 이용하여 상기 고추 병 저항성 또는 이병성 품종을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 고추 병 저항성 품종을 정확하게 판별할 수 있다.

도 1은 서열번호 1의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 9, 10 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 2는 서열번호 2의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 12, 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 3은 서열번호 3의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 15, 16 및 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 4는 서열번호 4의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 18, 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 5는 서열번호 5의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 21, 22 및 23의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 6은 서열번호 6의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 24, 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 7은 서열번호 7의 염기서열, SNP 위치, 이 SNP 변이 염기를 검출할 수 있는 서열번호 27, 28 및 29의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 8은 고추 액틴(actin) 유전자의 염기서열을 나타내고 있으며, 이 부위를 증폭하여 검출할 수 있는 서열번호 30 및 31의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 보여준다.
도 9는 7개의 고추 병 저항성 유전자 SNP 정보를 확인하기 위해 15개 고추 품종을 대상으로 염기서열 분석을 통해 확인한 결과이다. 실험결과 SNP 정보가 일치하는 것을 확인하였다.
도 10는 본 발명의 SNP 대립유전자 특이적 프라이머의 작용 메카니즘 모식도이다.
도 11은 본 발명의 SNP 대립유전자의 인위적인 mismatch 및 프라이머 길이를 다르게 적용했을 때 PCR 증폭산물의 증폭 효율의 변화 결과를 보여준다.
도 12은 본 발명의 SNP 대립유전자 특이적 프라이머를 이용한 다중 PCR 및 아가로스 젤 상의 PCR 증폭산물 결과와 염기서열 분석을 통해 일치함을 보여주는 결과이다.
도 13은 본 발명의 프라이머 세트 중 고추 병 저항성 품종 판별 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 다중 대립유전자 특이 PCR (multiple allele specific PCR)을 수행한 결과를 보여준다. 1: 부강 A, 2: 부강 C, 3: Tean, 4: ECW30R, 5: PI159234, 6: PI59236, 7: ECW, 8: PI52225, 9: Special, 10: Perennial, 11: Dempsey, 12: YCM334, 13: Tabasco, 14: PI260429, 15: ECW20R, NTC (non template control).
도 14는 본 발명의 프라이머 세트 중 고추 병 이병성 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 다중 대립유전자 특이 PCR (multiple allele specific PCR)을 수행한 결과를 보여준다. 1: 부강 A, 2: 부강 C, 3: Tean, 4: ECW30R, 5: PI159234, 6: PI59236, 7: ECW, 8: PI52225, 9: Special, 10: Perennial, 11: Dempsey, 12: YCM334, 13: Tabasco, 14: PI260429, 15: ECW20R, NTC (non template control).
도 15는 본 발명의 PCR 프라이머의 재현성 테스트로서 다중 대립유전자 특이적 PCR 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험의 재료 및 방법

1. 공시 재료

본 발명 실험에 사용한 공시재료는 서울대학교로부터 49개, 농협으로부터 96개의 고추 지놈(genomic) DNA를 제공 받아 사용하였다.

2. DNA 농도 측정

지놈 DNA의 정량 분석은 Spectrophotometer ND-1000(Nanodrop, USA)을 이용하였으며, 260 - 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다. 멸균증류수를 이용하여 모두 25 ng/㎕로 보정한 후 실험 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

3. SNP 마커 정보

고추에서 CMV, ChiVMV 병 저항성 및 이병성 판별에 관한 SNP 정보와, 담배 etch 바이러스(TEV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 토마토바이러스(TMV), 세균성점무늬병(BS), 고추역병 저항성 및 이병성 품종 판별에 관련된 7개의 SNP 정보는 서울대학교로부터 받았다.

4. SNP 마커의 분석

서울대학교에서 제공한 DNA를 사용하여 서울대학교로부터 받은 병 저항성 및 병 이병성 판별에 관련된 SNP 정보를 확인하기 위해 염기서열분석을 수행했으며, 제공한 정보와 일치하는 것을 확인했다.

5. SNP 마커 검출용 대립유전자 특이 PCR 프라이머 디자인

염기서열 분석을 통해 확인된 7개의 SNP 마커에 대해 다중 대립유전자 특이 PCR을 수행하기 위해 전방향 및 역방향 프라이머를 디자인하였다. 7개의 각각의 SNP 마커에 대해 500 bp 이하 100 bp 이상의 각기 다른 크기의 PCR 증폭산물이 생성될 수 있도록 대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였고, PCR 내부대조군으로 사용할 액틴(actin) 유전자 서열에 대해서는 100 bp의 PCR 증폭산물이 생성되도록 디자인하였다(하기 표 2 참조).

6. 최종 SNP 마커의 다중 대립유전자 특이 PCR 반응 조건

다중 대립유전자 특이 PCR 반응은 주형 DNA (25 ng/㎕) 4 ㎕, 프라이머 믹스 3 ㎕, 2X multiplex-pre mix (SolGent, Korea) 12.5 ㎕, 증류수 5.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕의 반응액을 사용하였다. PCR 반응에는 Variti (ABI, USA)을 사용하였고, PCR 반응조건은 95℃에서 15분간 전-변성(pre-denaturation)을 실시한 후 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 1 분간 연장(extention)을 35 사이클 수행한 후 마지막으로 72℃에서 3분간 최종 연장 과정을 수행하였다. 주형(template)은 고추 지놈 DNA를 이용하였으며, 음성 대조군(negative control)로는 증류수를 사용하여 교차오염을 확인하였다. PCR 증폭 산물은 증폭된 단편의 크기가 예상된 대립유전자 크기 범위 내에 존재하는지, PCR 조건의 적정성 여부를 확인하기 위하여 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 3％ 아가로스 젤에 전기영동하고 UV상에서 관찰하였다.

8. SNP 마커의 다중 대립유전자 특이 PCR - 재현성 테스트

재현성 테스트에 사용한 96개 지놈 DNA는 농협 연구소에서 받아 사용하였다.

실험결과

1. SNP 마커 선별

고추 병 저항성 품종 판별에 사용된 SNP로서, CMV, ChiVMV 병 저항성 및 이병성 판별에 관한 SNP 정보와, 담배 etch 바이러스(TEV), 토마토반점위조바이러스(TSWV), 토마토바이러스(TMV), 세균성점무늬병(BS), 고추역병 저항성 및 이병성 판별에 관련된 7개의 SNP 정보는 서울대학교로부터 받았다. 하기 표 1에는 고추에서 병을 일으키는 병명과 병에 관련된 유전자 그리고 유전자에 관련된 정보를 정리하였다.

2. SNP 마커의 분석

7개의 고추 병 저항성 유전자 SNP 정보를 확인하기 위해 15개 고추 품종을 대상으로 염기서열 분석을 통해 확인했다. 그 결과 SNP 정보가 일치하는 것을 확인하였다(도 9 참조).

3. SNP 마커에 대한 다중 대립유전자 특이적 PCR 프라이머 디자인

염기서열 분석을 통해 확인된 SNP 마커를 이용하여 고추 병 저항성 품종을 판별하기 위하여, 병 저항성에서만 증폭되는 특이적 프라이머와 병 이병성에서만 증폭되는 특이적 프라이머를 디자인하였다. 예를 들어 ‘역병(Phyto)’ SNP 마커(서열번호 7에 개시된 염기서열)에서 병 저항성 특이적인 T대립유전자 특이적 프라이머와 병 이병성 특이적인 ‘A' 대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다(도 11). 나머지 6개의 SNP 마커에 대해서도, 병 저항성 특이 대립유전자 특이적 프라이머와 병 이병성 특이 대립유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다(표 2 참조). 또한 고추 병에 특이적으로 증폭되는 산물은 염기서열분석을 통해 유전자형이 일치하는지를 염기서열 분석을 통해 확인했다(도 12).

상기 표 2에서 Res : 저항성 프라이머, Sus : 이병성 프라이머, Com : 공통 프라이머, F : 정방향 프라이머, R : 역방향 프라이머

상기 표 2에서 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 26 및 서열번호 29의 프라이머는 각각의 유전자에 대한 고정된 대립유전자 특이적 PCR 프라이머이다. 상기 프라이머들은 SNP 변이염기에 대한 결합 특이도를 향상시키기 위해 야생형(wild type)의 염기 위치에 미스매치(mismatch) 염기가 삽입되어 있다. 각 프라이머에서 인위적인 미스매치 염기는 대문자로 표기되어 있다. 한편, 디자인한 대립유전자 특이적 PCR 프라이머들의 경우 PCR 증폭산물의 강도를 고려하여 반응당 프라이머의 농도를 조절하였다.

4. SNP 마커에 대한 다중 대립유전자 특이적 PCR의 수행

서울대학교에서 제공한 17개 품종의 DNA를 대상으로 상술한 바에 따라 디자인한 프라이머 세트를 사용하여 다중 대립유전자 특이적 PCR을 진행한 후, 3％ 아가로스 젤 상에서 증폭산물을 확인하였다. 도 13 및 도 14에 나타낸 결과를 보면, 고추의 경우 100bp의 내부대조군인 액틴(actin) 유전자 증폭산물은 항상 증폭되었으며, 각 품종의 특성에 따라 병 저항성 및 병 이병성에 따라 PCR 증폭산물이 확인되었다.

6. SNP 마커의 다중 대립유전자 특이적 PCR의 재현성 테스트

재현성 테스트에 사용된 고추 DNA는 농협에서 96개 지놈 DNA 상태로 받아 사용하였다. 각 개체는 고추 병 저항성 프라이머와 고추 병 이병성 프라이머를 사용해 실험을 진행했다. PCR 증폭산물은 3% 아가로스 젤 상에서 증폭 산물을 확인하였으며(도 15), 이 결과는 아래 표 3에 정리하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Solgent Co., Ltd. <120> Primer Set Useful for Selecting Pathogen Resistance Pepper <130> PN130581 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1682 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 tcacagtttg acaattatgt ggtcgtgaaa cagaatagtg tgattgatgt catcttgcac 60 aacttagaac aagtaaagat agctagctat tcgaaaaact tctcaggaca tcatgctttt 120 gttgtcatta ggagatattc tgccatacgt tcgaaaaatt attgtagtgt gttgtgactg 180 cacaattaag cgtgtggctt tcaatttgat aagctatcaa ataagtattg tggcgtgcct 240 tttcagttat aatggaatgc tatgtttcag gtttccctaa tgcgtactac agtaggtgaa 300 aataggaaat ttgctgcatt tatagcagaa aagttgaaca aggcatcatc aagtgtacgt 360 gtttgcttgc ccgagaaagg tgtctctgca ttggatgcac cagggaaagc cttttatgat 420 cctgaggcaa ctagttgtct tacacatgag ctacagatgc ttcttggaaa aagtgaatgc 480 tgtcaggtac cacaattatt tgtaagatgg cagcctatga tgttacattc cactgcaaaa 540 ctcaacttag ataattgaaa tgtttgtcca ctgataggct aaggtcttcc cttaccatat 600 aaatgatgtg gagtttgcaa atgctttagt tgattcgttc ttggaaatct ctccgaaatc 660 tagacatgtt gaatgtcagc cagctgagtc caaatctatc caagacattc agaatgataa 720 tgctgttctt cagaaatatt cctcatgcaa tggaaaaaac ttttctagcc tgaatgactt 780 tccaaatgca aaaccaggtg ataattcttc cttaatatca aggctaataa tttccttcct 840 aatggatatt tccaataagc tgctagggaa ttactgaaca gttccgacta tatgattact 900 gcaagtgaat ccaggtttcg tctaatttat ttacctgtcc ctgcagtagt gttggggtgt 960 tcacattatt ttctaggtct aacacgaagt tttcttctta ttttgccaat ttcatgcact 1020 tctatctttg acgcccatgt tgattttaga tgataagtgg aataaactgg tgtttttatc 1080 agccttagct gccataggag ccagcagagt gaaatatgac aagagagcga cttatgattg 1140 atcttatctc aggaattatt tycttaccga taggttgctg gttatgggat agcttgaaat 1200 gccatatcat gaattcttgt ccttcattgt tatcataata atctctacta ttgttatgtg 1260 aatgtctttg aaatggaata tactggctca tctacaggga aaggaatctt tcagcttcta 1320 gttaatgatc tttcatttct ccttttaatt catatgagga cttgatgaga ggcctaatct 1380 tccttgagta gaaactttgc agaaaagaat tgtcatactg cagaaattga aagaccaaat 1440 aagtaagggc aagcccatta ttggggctgg tgctggtaca ggtatttctg ccaagtttga 1500 ggaagctggt ggtgtagatt taattgtctt gtacaactcg ggccgcttta ggatggcagg 1560 aaggggatcc ttgtctggtc tattgccctt tgctgatgca aatgccatcg tacttgagat 1620 ggccaacgaa gtattgcctg taagtcctac ttgttgtgtg cttatttagt tcttccaaag 1680 ac 1682 <210> 2 <211> 1210 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 2 tgtaggaatg gcgtcaattg ggttatgtcg ttggatagtt tcctttgctt caaatttaag 60 aacctctttc atgtttgtca aatgcattta caaccacgga tatgttacta atgccagttt 120 gagctaataa ggtagtggat aatgctctgg gttcagtttt ctctcctaag caaaatgata 180 cagttacttt tttcaagtac caactacttt ttcttatata tacgtatacg agctggtcct 240 gtacaggggc ggagccagcc ctttggcaag ggggttccga acccccttgg aaaaatatac 300 catttctaca tgattaaaat tatttttatg tatctatcgt aggtgttgaa ccccctttgg 360 ctaggttttc ttcaaatatt gaaccccctg agttgaaata ccgactccgc ctctggtcat 420 gtacttcatt gctgtgatgt ctctatgagc tttagtctta atagtccaag ctgatgaata 480 ctcattttaa aaataaagat agatgctttt ctatttctta attgggctaa aatacgccca 540 tctcccttct agatgatgaa actaaactta gctgcaggcc agtattttca gtttcatgca 600 tggacctttt tattaagtcc tatgatttga gtaacgcagg cggtactgat gtgaatttgg 660 tgtctgcctt ggaggcatgc accttgtttg gtgagttctt tatagatcta atttctaaag 720 gcgctttgag ttatcgtaca acttggactg tgacatgcct gtttgatatt ctgtatcatg 780 gattacatct tttaaatgtt attatcctgt tggcttttga tgaaatcctt gaaccatgtt 840 gcttattctg caaacagtgc ttacaataat atccaccacc caagcaagtt agttgtgrga 900 gcagacttac attgtttcaa gcataaaatt gagccaaagt gggaagatcc tgtatgtgcc 960 aatggaggga catggaaaat gagtttttca aagggtaaat ctgataccag ctggctatat 1020 acggtatgcc gaggatactg ccatccagct cgtagtgatt ggtcactcta gtaatattat 1080 tttctgttac gctataatct caactcttgt tttctcatat gggattattg tagctgcttg 1140 caatgattgg acatcaattc gatcatgaag atgaaatttg tggagcagta gttagtgtca 1200 gaggtaaggg 1210 <210> 3 <211> 1209 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 3 ttgaaatggg tttgcatcgg attgaacgta gaaaacttgt atagctaagt cgaggtttat 60 taggtagaag gttagtaggg aggagtgtgt caatgctagt agtaggagtg ttttgtcttg 120 ttgttcgtac tagtagtcgt agtgctagat gtgtagtttc aagtcgtgaa agcagcctct 180 tacagaaatg aaaggtaaac ctgcatacaa taaacaataa acccttgttg ttcggccttt 240 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ttctagactg tttttgtctt gatcgggggg gtctatcgga aaccacctct 1140 ctacctcacc tctaagacag agggactgtg tacactctgc cctcccagac ccgctttgtg 1200 ggaatacac 1209 <210> 4 <211> 431 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 4 gccagaaggt atgcaggaac tccttccctc tcttaaggaa ctgcgactgt gggattgtcc 60 agaaatagag tcatttcctg atgaaggatt gcccttcaat ttacaagacc tttggatcga 120 caattgcgag aaactggtga acagccgaaa ggagtggcgt ctacagagac tcccctctct 180 cagagagttg ttcatctacc acaatggcag tgacgaagag attgttggtg gtgcgaattg 240 ggatttgcct tgctctattc aaaggcttca catacgcaat ctaaaaacat taagcagcca 300 acttctcaaa agcctcacct ctcttgaata tctagggact tctatgcttc aaattcrgtc 360 actgctggga actagggctt ccctcctctc tttctgagct atatttatac agccaaaggg 420 gagcttccaa a 431 <210> 5 <211> 1229 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 5 ttttgttaat ctttcaggta cagggtcgta atttccctga ggaaataaac atagttccag 60 caatcaagaa atttactcaa ggaaaagtag aatttgttaa tggacaaatt ctagagatcg 120 actctgttat cttggcaact ggttatacca gcaatgtaac ttcttggtta atggtaagga 180 aatacacaag ttttatttct atgcctaatt aaattggtgt ttaatcataa attatatata 240 gtactaagta tgataaaagc tccttcaact ataaaggatg atttagtcaa atgaactctt 300 aatgaatgta gtaattattt atggattctt gttacattca tgtaagttgg tatctcatta 360 tcctgtggat tctttccttt gagttattaa ttagttagaa ttcactataa ccgtcttttt 420 tcttttaccc tttcctcata cctttttgtt cttttgataa ctcgaactca caatcttaag 480 attgggaata aggggctctt taccatctga gcaactttct ctcgttctat aatagccccc 540 ttcgaaattt ggtctaatga gaattttact gatacaggag agtgaattkt tttcaaggga 600 gggatgtcca aaaagcccat tcccaaatgg ttggaagggg gaggatggtc tctatgcagt 660 tggatttaca ggaataggac tgtttggtgc ttctatagat gccactaatg ttgcacaaga 720 tattgccaaa atttggaaag aacaaatgta gcacaagaat cataatcaat ctgttggatg 780 catgccatgg agaagaagca agttactttt ctcatgtcaa gaaaataaga tttttttttt 840 tcttcctgta atattactgg gattggatat tctcccagtt gccttttgtt tgatttgtgt 900 catgtgtgaa aataataatt taatggtttg taagttattc ttctatttga tgttttaagt 960 cacttgtttt atatttttcc tgtgatggat ttatattatg aatttttata taaattattt 1020 ttttttcctt tttcaaggtt gcatttcaat accagtcata ttaaccattt tcgaactcta 1080 cttcttttta tgacatagat tttgaagcat ttttctgtga ccccactcac aattaggatt 1140 catttggtac aaacaactag cccgtggcga gtcaactatg agggcatata tatatatatt 1200 tttttttcca tttagacttg aactatcct 1229 <210> 6 <211> 1220 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 6 aattgacatg ttaaactcac gttccagtga agcagtgtta tattaatcat atgtagcact 60 tcttatctta aaattttcat aatttcctag taattgattt tttggtacga tatgtatggc 120 ttgattcttg attatgattg attaatgatg tgctatgatt tagaaagaat aataggttgg 180 tagatgctac ttttaagtgt ggattgaagt gttggatcga cttctttgca gtttatatga 240 tcagatattc aagcccagca agttgactgt taatgcggat tttcatttgt tcaaaactgg 300 gattgagccc aaatgggaag atcctgagtg cgctaatggt ggcaagtgga ctgttacgag 360 cagcagaaaa gctaatcttg agactatgtg gcttgagact gtaataagtt cattcctttt 420 tgtttgattt tttttcagta gttagtgtgt catggaaagc ttagtattct tgctaaagat 480 gctcatatac tgtttgctgc atgggcttct tttggacagc tgatggcatt ggttggtgag 540 caatttgatg attcagaaga tatatgtgga gtggttgcta gcgtgcgtag gagtcaggat 600 aaactttcct tgtggactaa gactgctaca aatgaagcag ctcagagctc aaaaactgca 660 atatgtatta ttgtttcact gtttccgaaa tatgatatga aatatcattt aaaaaggata 720 taccagaata cttgaaacgg atgcatttgc agcaatgtga tgaccctcct ccttcatttt 780 caattgatat atgctcttgt actgtgttta tatttttcct taatgctgat atgacaacct 840 ttctctgtgg catttgctct aggtctgtct ckggtttcca tttttgcatt agggattctg 900 atcaaagcat gtgggcctgt atcttatcct tttcactgtt ccatggacca tatgcatcta 960 gatctccttc attaacttct gctttgaact cttctgaaga ccccttaaaa tttgtcttga 1020 aatcttaact tgttgtgcgg tgatgttcta tagtgcgtaa ggtggtctga aggttgtgga 1080 ggttgcaaaa gtggttcctt gaagttccat acttatcagt tgctcatcat ctataacata 1140 tgaatgtgct tattttatgg ttttattgtg tcagcaagtg gactcatcaa acccctagtc 1200 tccaccctta ctttcaattt 1220 <210> 7 <211> 2188 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 7 atttcgtgca ttgtgcaggt atctatacta gttttcttaa agggagtgcc tagtcaaagg 60 gccaactagt ttgaaatgga gggagtacat atgacaatta aaggggaaaa aaattatttt 120 tttgaaaact ttaggagtaa aagtgactaa aatgagtaat aacaaggata tgataatcaa 180 aagacacaga agtgatccgg agaaagtagw aatcttcgat attcatgttt aaataaaatc 240 ttttatatgt atattacatg aagttgttat tattttatat taagtcgact tattcatgag 300 aaaattaaca tcctgaacac ccacttgtag ttatataaat tttattcaaa ttaaatttaa 360 aattagtcca tataaatgtg ctggattaat atgattggat tattatttaa attcaaataa 420 atatggattt gactaaagtc caatttctgt agggctagtc aactgatttg gaccacaaat 480 gatgagcccg atttgctaag ctcaagatgt catcatattc tagaggacta attgagcgcc 540 acgtgttgaa taatgtggca taccaagtta gcgaaggatc caataatacc atgccacttg 600 tcaaaataat gcagcaagcc tagtgaaatc aaaggcccaa tcaaatatcg ccatgtcact 660 taaatctgat tggccaaaag aagtccatct tcatcatgac tttttccttt ccacaactat 720 aaatagggat ttcataattc aaaaaagaca ctaagaatta aaacaaaaaa gcaagagaga 780 gctcgcggat caaacaccac aaatttttct ataaattcaa gaattcaaaa tccaatttat 840 caaaattcaa gatcaagttt gcaagattca agaacaagcc caaaatatct tgaaatcaag 900 tataggtcga gatcaaatcc atcaaattaa caaatcaagt tcaaattcaa gatcaagctc 960 gaatcccttg aatttgtatt tgaaaatgca aattagagga ttcataggga ttgtaaactc 1020 acatattaaa atcaataaaa tgattgttgc agtattattc ttattccgat tattatcttt 1080 ttattcaaaa ttttctgttc aacaaattct ggcacgccta gtgggacact ctttatctct 1140 catctcaact ttttcaacat caaagttcaa aaattgcatg cactgtattg agtcctataa 1200 ataggggaga aatgcatgcc ttttctcatc agccaaaaaa aaaaaaaact caaagtttca 1260 aatagtttaa tttgttaatc aaaatggttt ccaaaagtag tatttttatt tgcctttctt 1320 tgattattct agtgataatg tccacacaga ttgttgccag ggagatgact tctgaggcat 1380 ctgcttcgct gacccaagtt tatttacttc cagctccatc tactaattat ttcaaatttt 1440 aagttattta aagaaaatta agatttttct ttctttttcc cctactctga aaaatatcta 1500 catataaatt tcctccttta ttctaggtta atctacgttt aatattaaca gtgatagagc 1560 taaaatttta actaatccag ttaaaatata aagaaaagaa tccctgaaaa actcaagact 1620 attcaacaaa tatagcggta tatatattgc atacattcaa aaatatacat gtcggtacaa 1680 tttaattttc ggcgaaggat gtcaactgac actttagaca agtgtgggcc caaacacttg 1740 atattagtgg tagaaatacg caccggagga atcctctaca ctagataatt atattgtgga 1800 tataaaagat attataattt ttatgtatta gtgattaaat tctcgagaca aagtacatga 1860 ttttagtata taatagtaac ggtatttcaa aaattgtttt ctgacatgtt caaatagtat 1920 ttacttatat ttattaaagg aaaggggcag aaagattaca atgtcaatag aagatgtcta 1980 ttattgtttc aaatagaaat aggcaggaca ctctaattaa ttttttgatc ttgtaaataa 2040 tttttcttgc ttcgcccgct gactgctaca attttctgca ttaatttttt gatgcaggcg 2100 atgaatggaa ataacattag tgagactaag aaagttggac gccatttagt gaaaggtctt 2160 gataaaatct tcaaagctgg caaagtta 2188 <210> 8 <211> 758 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 8 atatggcatc atactttcta caatgagctt cgtgttgccc cggaagagca ccctgtcctg 60 ctcactgaag cacctctcaa ccctaaggcc aacagagaga aaatgaccca gattatgttt 120 gagaccttca atgttccggc catgtatgtt gctattcagg ctgttctttc cttgtatgct 180 agtggtcgta caactggtat tgtgttggac tctggtgatg gtgtgagtca cactgtccct 240 atctatgagg gttatgcttt gccgcatgcc attcttcgtt tggatcttgc tggacgtgac 300 ctaactgata acctgatgaa gatcctcact gagagaggtt acatgttcac caccactgct 360 gaacgggaaa ttgtccgtga catgaaggaa aagcttgcct atgtggctct tgactatgag 420 caggagcttg aaactgccag gagcagctcc tccattgaaa agaactatga attgcctgat 480 ggacaagtta ttaccattgg tgctgagaga ttccgttgcc cagaggtcct cttccaacca 540 tccatgattg gtatggaagc tgcaggtatc catgagacca catacaactc cattatgaag 600 tgtgatgttg atatcaggaa ggacctctac ggtaacattg tgctcagtgg tggctcaacc 660 atgttccctg gtattgctga tcgtatgagc aaggaaatta ctgctttggc tcccagcagc 720 atgaagatta aggttgttgc accaccagag agaaagta 758 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 accagcaacc tatcggtacg a 21 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 ccataaccag caacctatcg gtctgg 26 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 agtccaaatc tatccaagac at 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 attttatgct tgaaacaatg gaaatc 26 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 ctcaatttta tgcttgaaac aatggaaatt 30 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 tagatgcttt tctatttctt aattgggc 28 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 actaaggcta gcatacaaat ctt 23 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 ccactaaggc tagcgtacaa atgtc 25 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 tactagcata tacgcactct t 21 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 gaagcccttg ttctagcagt ctcc 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ccctagttcc agcagtctcg 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 gaggattgcc cttcaattta ca 22 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 tttggacatc cctcccttga gtac 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ggacatccct cccttgacaa a 21 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 cgaactcaca atcttaagat tggg 24 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 aatccctaat gcaaaaatgg aagtca 26 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 aatccctaat gcaaaaatgg aaatcc 26 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 26 tgaaatatca tttaaaaagg atata 25 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 taactttgcc agctttgaag agta 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 taactttgcc agctttgaat actt 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 29 tcaaatagaa ataggcagga cact 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 ttgtgttgga ctctggtgat ggtg 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 gcaagatcca aacgaagaat ggca 24

Claims (6)

1. 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 21의 올리고뉴클레오드 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및
   서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 저항성 품종 판별에 유용한중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머 세트.
   
2. 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍;
   서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및
   서열번호 28의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 이병성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열번호 30의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 31의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 내부대조군(internal control) 프라이머쌍을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항의 프라이머 세트를 포함하는 고추 병 저항성 또는 이병성 품종 판별에 유용한 중합효소연쇄반응((polymerase chain reaction, PCR)용 키트.
   
5. 다음의 단계를 포함하는 고추 병 저항성 품종을 판별하는 방법:
   (a) 고추의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
   (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 제 1 항의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및
   (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 고추 병 저항성 품종 여부를 판별하는 단계.
   
6. 다음의 단계를 포함하는 고추 병 이병성 품종을 판별하는 방법:
   (a) 고추의 생물학적 샘플로부터 지놈(genomic) DNA를 얻는 단계;
   (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 사용하고, 제 2 항의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및
   (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR)의 증폭산물을 분석하여 고추 병 이병성 품종 여부를 판별하는 단계.
   

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