CN103290126B - 区分大白菜eIF(iso)4G基因野生型和突变体的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种区分大白菜eIF(iso)4G野生型和突变体的位点特异性显性ASM标记：与野生型位点检测相关的标记命名为ASM-I4E.G，片段大小1526bp，如SEQIDNo.1所示。用于鉴别上述特异性显性分子标记的引物是：正向引物PF1：5'-TTTTTTGGTTGTTGGAGATTTTG-3'；反向引物PR1：5'-GGTACTTCAGCTTTGACGAGGAC-3'；如SEQIDNO.2、3所示。所述标记可以应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育：利用ASM标记的一对引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果能扩出条带，则为纯合野生型或杂合体，扩不出则为突变型。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

Description

区分大白菜eIF(iso)4G基因野生型和突变体的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因的突变体及其相关位点特异性分子标记的开发，尤其涉及一种大白菜真核生物翻译起始因子eIF(iso)4G的突变及其位点特异性分子标记的开发和应用。突变体能够为选育含该突变位点的抗病毒大白菜种质提供变异源，位点特异分子标记能够直接应用于分子标记辅助育种来选择含有该突变位点的大白菜材料，提高eIF(iso)4G突变体的选择效率，属于生物技术领域。

背景技术

大白菜(Brassica rapa L.ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原产于中国，目前在世界各地均有种植。尤其在我国蔬菜的常年供应和淡季蔬菜调剂中已经成为蔬菜产品供给的重要组成部分，因而对人们生活具有重要影响。在大白菜生产过程中，常遭病毒病、霜霉病和软腐病等病害的威胁。就整体而言病毒病的危害最为严重，且没有普遍适用的抗病毒病药剂或其它行之有效的控制技术。培育抗病毒大白菜新品种是应对病毒病危害的首选途径[王雪,刘玉梅,李汉霞,张扬勇,方智远.芸薹属作物抗芜菁花叶病毒育种研究进展.园艺学报.2005,32(5):939-946]。苗立强等[苗立强,张耀伟,崔崇士.我国白菜抗病育种研究进展.东北农业大学学报.2008,37(4):529-533]研究发现，我国大白菜病毒病的病原分离物中70%是芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus,TuMV)、还有少量黄瓜花叶病毒(Cucumber MosaicVirus,CMV)和其它病毒。因此我国大白菜抗病毒病育种的主攻目标是抗TuMV。

培育抗TuMV大白菜新品种的两个关键要素是拥有丰富的抗TuMV种质资源和高效的育种效率。我国是大白菜原产地，种质资源非常丰富，其中不乏抗TuMV的优良资源，同时也有更多品质优良但不抗病毒的资源。在常规育种实践中，常通过回交转育的手段获得更多遗传背景丰富的抗性材料。随着分子标记技术的兴起及研究的深入，标记辅助选择在常规育种操作中已经成为提高选择效率、缩短育种年限的主要手段。一些跨国的育种集团更是不惜重金把创新资源和开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记作为育种攻关的主要内容。

一般而言，要寻找与某农艺性状紧密连锁的分子标记，往往需要先选择在目标性状方面存在显著差异的亲本，并构建分离群体(F2,RI,BC1,DH等)，采用混合分群(BSA)和传统的分子标记（如RAPD,SRAP,AFLP,SSR等）技术进行分析，用相应的软件分析所得标记与性状的连锁距离，最终得到与目标性状连锁的分子标记。目前报道的与大白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)性状连锁的分子标记正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所选择的标记类型不同，所得到的与抗病毒特性连锁的标记距离亦不同，介于3.8-15.36cM。由于这些标记与性状的连锁程度不够紧密，因而其用于大白菜抗TuMV辅助育种尚有一定的距离。

另一方面，由于拟南芥与大白菜同属十字花科，其抗病毒相关功能基因已有较深入的研究；同时大白菜的全基因组序列已经公布(Wang et al.,2011，the genome of themesopolyploid crop species Brassica rapa.Nature Genetics.43(10):1035-1039)。所以可以将拟南芥功能基因研究的结果和大白菜基因组序列信息结合，直接以抗病毒相关功能基因为潜在的候选功能基因，通过对大白菜自然群体在这些候选功能基因的筛查入手，有可能找到抗病毒相关功能基因的突变体；针对突变位点开发位点特异性分子标记(Allelespecific marker，ASM)，则这种标记本身与性状直接相关，这无疑会使标记辅助选择更加精准。

在抗病毒功能基因研究方面近年来发现，由隐性单基因控制的抗病毒性状多与真核生物翻译起始因子4E、4G及其异构体iso4E、iso4G的突变有关。Ryder在生菜[RyderEJ.1970.Inheritance of resistance to common lettuce mosaic.Am Soc Horticult Sci.95:378–379]、Ruffel在辣椒[RuffelS,Dussault MH,Palloix A,Moury B,BendahmaneA,Robaglia C,Caranta C.2002.A natural recessive resistance gene against potatovirus Y in peper corresponds to the eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E).PlantJ.2002Dec;32(6):1067-75]、Nieto在甜瓜[Nieto C,Piron F,Dalmais M,Marco CF,Moriones E,Gomez-Guillamon ML,Truniger V,Gomez P,Garcia-Mas J,Aranda MA,Bendahmane A.2007.EcoTILLING for the identification of allelic variants of melone IF4E,a factor that controls virus susceptibility.BMCPlant Biology.7,34-42]等重要蔬菜作用中已经发现了不少这样的突变体资源，Yeam等[YeamI,KangBC,LindemanW,Frantz JD,Faber N,and Jahn MM.2005.Allele-specific CAPSmarkers based on pointmutations in resistance alleles at the pvr1 locus encoding eIF4E in Capsicum.Theor.Appl.Genet.NNO,178-186]在辣椒中针对突变位点开发了相应的位点特异性CAPs标记并用于抗病毒材料转育时的辅助选择。其中在模式植物拟南芥中，eIF(iso)4E的功能缺失突变并未影响植株的正常生长，却导致植株高抗TuMV[Duprat A,Caranta C,Revers F,MenandB,Browning KS,Robaglia C.2002.The Arabidopsis eukaryotic initiation factor(iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility topotyviruses.The Plant Journal,32:927–934]。而在mRNA翻译过程中，eIF(iso)4E与eIF(iso)4G结合，参与eIF(iso)4F复合体的形成，是植物特有的一类翻译起始因子。

我国大白菜种质资源十分丰富，从其他作物的eIF4E和eIF(iso)4E突变及其在抗病毒中的作用推测，大白菜自然群体中也可能存在eIF4E和eIF(iso)4E的突变体，且这种突变可能与大白菜的抗病毒特性有关。目前，Jenner等[Jenner CE,Nellist CF,BarkerGC,Walsh JA.Turnip mosaic virus(TuMV)is able to use alleles ofboth eIF4E and eIF(iso)4E from multiple loci of the diploid Brassica rapa.MolPlant Microbe Interact.2010，3(11):1498-1505]从病毒敏感材料R-O-18中克隆得到了eIF4E和eIF(iso)4E各三个拷贝，分别命名为BraA.eIF4E.a、BraA.eIF4E.b、BraA.eIF4E.c和BraA.eIF(iso)4E.a、BraA.eIF(iso)4E.b、BraA.eIF(iso)4E.c。除BraA.eIF4E.b和BraA.eIF(iso)4E.b以外，其余4个基因分别转化拟南芥At.eIF(iso)4E功能缺失突变体[Duprat A,Caranta C,Revers F,Menand B,Browning KS,Robaglia C.2002.TheArabidopsis eukaryotic initiation factor(iso)4E is dispensable for plant growthbut required for susceptibility to potyviruses.The Plant Journal,32:927–934]，然后对所有转基因株系接种TuMV加拿大株系CDN1，进行病毒敏感性互补实验。根据病情指数及ELISA结果，发现所转的四个基因均能使突变体完全或部分恢复对TuMV侵染的敏感性。这表明，在TuMV侵染白菜类蔬菜作物时，eIF4E和eIF(iso)4E都可能参与病毒与寄主的相互作用。同时作者指出，要想在大白菜中获得与eIF4E和eIF(iso)4E有关的抗病毒材料，则这几个基因需同时丧失功能。

截止目前，我们已经对大白菜在上述两个基因位点的突变进行了检测及相关标记的开发。综合已有结果发现：除BraA.eIF4E.b为假基因外，其余五个基因在同一份材料中同时发生突变的几率极低。要想寻找在这一层面的大白菜抗病毒材料，只能另辟蹊径。eIF4E和eIF(iso)4E是重要的翻译起始因子，它们与mRNA结合后，必须与eIF4G和eIF(iso)4G及其它翻译起始因子结合，才能形成翻译起始复合物eIF4F和eIF(iso)4F。经检索发现，在大白菜基因组中，这两个基因均以单拷贝存在，如果它们发生突变，则无论上游多个拷贝的eIF4E和eIF(iso)4E是怎样的状态，都不能进行RNA的翻译。

鉴于此，有必要对我国丰富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4G和eIF(iso)4G两个位点的多态性进行广泛筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。有以下几个方面的潜在益处：①可以将该标记用于筛查大白菜种质资源，提供高效的大白菜突变体检测手段；②可以用于回交辅助选择，提高选择效率，创造遗传背景丰富的抗病毒材料；③在培育广谱抗TuMV大白菜新品种时，可以实现标记辅助选择，提高育种效率。

发明内容

针对上述现有技术，针对目前大白菜在eIF4G和eIF(iso)4G基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明首先获得了一个eIF(iso)4G位点的突变体，其次根据突变位点的序列特点，设计引物，开发了鉴定野生型和突变体的ASM显性标记并用于标记辅助选择。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种区分大白菜eIF(iso)4G野生型和突变体的位点特异性显性ASM标记：与野生型(显性遗传)位点检测相关的标记命名为ASM-I4E.G，片段大小1526bp，如SEQIDNo.1所示。

一种用于鉴别上述特异性显性分子标记的引物是：

正向引物PF1：5'-TTTTTTGGTTGTTGGAGATTTTG-3'；

反向引物PR1：5'-GGTACTTCAGCTTTGACGAGGAC-3'；如SEQIDNO.2、3所示。

本发明首先检索大白菜全基因组数据库中的eIF(iso)4G基因组序列，发现其全长3392bp，为了方便操作，将该基因分三段克隆，即设计三对引物：PF1/PR1、PF2/PR2、PF3/PR3。选择了四个大白菜自交系材料即抗病毒材料322和8407、感病毒材料06-247和Guan291。采用分段克隆技术从2份高感TuMV自交系材料中分别克隆到了eIF(iso)4G基因的三个片段，测序后经拼接得到了全序列，将所得序列与大白菜全基因组数据库中检索的同源基因比对后发现彼此之间完全一致。而在2份抗病毒材料中只扩增得到了该基因的第三段，第一、二段均未扩出。由此推测，该基因在抗病毒材料中发生了突变。由此可见，用扩增该基因的第一对引物PF1/PR1就可以区分eIF(iso)4G基因的野生型和突变体。

所述ASM标记的筛选过程如下：

(1)以大白菜抗TuMV自交系322、8407和TuMV敏感自交系06-247、Guan291为材料，采用CTAB法，提取两者的基因组DNA。

(2)依据大白菜全基因组数据库中检索的eIF(iso)4G基因组序列信息，设计三对引物对其进行克隆。

(3)三对引物在感病材料中均扩出了条带，经测序后将序列拼接在了一起，而在感病材料中只有PF3/PR3引物组合扩增出了条带，而PF1/PR1和PF2/PR2两对引物均未扩出条带。这两对引物都可以用来鉴别eIF(iso)4G的野生型和突变体，本发明申请保护的是PF1/PR1。该标记为显性标记，只有基因组中有eIF(iso)4G就能检测出，或者反言之，eIF(iso)4G突变导致的抗病毒性状为隐性遗传，只有纯合状态才表现抗性。

所述标记可以作为分子标记应用于大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育，选择不能扩出条带的基因型，即抗性材料的类型。具体应用方式为：利用ASM标记的一对引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增片段的有无，如果能扩出条带，则为纯合野生型或杂合体，扩不出则为突变型。

本发明的有益效果是：本发明利用同源克隆技术发现了eIF(iso)4G位点的一个突变体并开发了鉴定该位点的分子标记。利用该标记可以对回交转育后代的基因型进行准确选择。同时该标记还可用于对大白菜种质资源进行筛查，以寻找遗传背景更加丰富的突变体材料。其优点具体如下：

1.本发明获得的与eIF(iso)4G位点突变直接相关的标记，结果稳定、准确、操作简便。适用于不同遗传背景大白菜材料的筛选，是一个普遍性标记。它能够准确鉴定大白菜种质资源在该位点的基因型，极大地提高了对大白菜种质资源在eIF(iso)4G位点突变体的筛选效率。

2.在大白菜eIF(iso)4G基因序列及突变型研究方面，国内外未见报道。针对该突变位点的特异标记，可以为种质资源鉴定、通过回交转育等手段筛选和培育不同遗传背景的抗病毒材料提供辅助选择工具。本发明的应用可大大简化筛选手段、缩短转育年限，避免了常规育种方法中选择的盲目性。

附图说明

图1：引物PF1/PR1的扩增结果，其中，M是DNA分子量标准DL2000；1、2是抗病毒材料322和8407；3、4是高感病毒病材料06-247和Guan291。

图2引物PF1/PR1对10份大白菜种质材料的鉴定，其中材料1、2、3、4、6、8、9为抗性突变体材料，5、7、10野生型状态的病毒敏感材料。M为DNA分子量标准DL2000。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、不同大白菜自交系材料中eIF(iso)4G的克隆

1.1大白菜基因组DNA提取

（1）将大白菜幼苗叶片放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

（2）待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入0.6ml预热至65℃的CTAB提取液，融化后，剧烈振荡混匀样品，65℃水浴放置40-60分钟使细胞裂解；

（3）裂解结束后，取出样品使其完全冷却至室温。加入等体积的氯仿(chloroform)，轻轻颠倒使混匀，室温放置10分钟；

（4）室温，12000rpm离心15分钟；

（5）用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，室温沉淀10min；

（6）4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

（7）DNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

（8）重复用75%乙醇洗涤一次DNA沉淀；

（9）去上清，DNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，DNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的10mM的Tris.HCl，pH8.0使沉淀溶解(可放于4℃冰箱溶解过夜)；

（10）紫外分光光度计及1%Agrose凝胶电泳检测DNA浓度及质量。

1.2eIF(iso)4G的检索、克隆及序列分析

(1)检索大白菜全基因组数据库，获得eIF(iso)4G基因全序列，在编码区上游和下游分别设计正反向引物三对，即PF1/PR1、PF2/PR2、PF3/PR3，后两对引物序列如下：

PF2：TTTTTTCACTTTTGGCATGGTT；

PR2：TCGTGTTCATTGAGGTGGACTT；

PF3：GAGGTTCCCAGGACAAGGTC；

PR3：ACAAAGAAGACCAAAACTCCCAC；如SeqIDNo.4-7所示。

(2)PCR扩增：在20μl反应体系中，包含1×TransStartFastPfubuffer；20ng的基因组DNA；0.4μM正反向引物；0.25mMdNTPmix;1个单位的TransStartFastPfuDNA聚合酶(TransGenAP221)。PCR循环条件：95℃预变性5分钟；接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸40秒，35-38个循环，最后72℃延伸10分钟。

(3)PCR产物的电泳检测：

PCR结束后，取10μlPCR扩增产物加入1μl10×loadingbuffer，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后EB染色，自动凝胶成像系统观察拍照。其中引物PF1/PR1的扩增结果见图1。图中M是DNA分子量标准DL2000；1、2是抗病毒材料322和8407；3、4是高感病毒病材料06-247和Guan291。

(4)PCR产物的克隆测序

电泳确认目的条带被扩增后，取1μlPCR扩增产物加1μlpEasy-Blunt(TransGenCB101)载体室温连接10分钟，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(TransGen：CD501)，转化菌在含Kan50μg/ml的LB固体平板上37℃倒置培养16小时左右。菌液PCR检测后挑取阳性克隆委托北京博尚生物技术有限公司进行DNA序列的测定。

(5)所克隆的大白菜eIF(iso)4G序列分析

来自TuMV敏感材料06-247和Guan291中的三个片段经测序后拼接在了一起，该序列(SeqID No.8)与大白菜全基因组数据库中的序列仅相差一个碱基，但预测的编码产物完全一致。而在抗病毒材料322和8407中，除了3’末端的800多碱基外(Seq ID No.9)，其余序列缺失，导致该基因发生了突变。

(3)据此判定来自抗病毒322和8407的eIF(iso)4G为突变体。

实施例2ASM标记的获得及对大白菜不同资源的鉴定

2.1ASM标记的获得

(1)分别利用PF1/PR1引物组合在抗/感材料中扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如实施例1的1.2第(2)所述。

(2)扩增结果的检测如实施例1的1.2第(3)所述。

(3)扩增结果如图1所示，即PF1/PR1能够在野生型感病材料06-247和Guan291中扩增出1526bp的条带，在抗病毒突变体322和8407中扩不出条带，此即为显性标记。

2.1ASM标记的应用

(1)不同大白菜资源的基因组DNA提取：随机选取不同的大白菜材料8份，这些材料基因组DNA提取如1.1所述。

(2)PCR扩增：PCR反应液的配制及扩增条件如实施例1的1.2第(2)所述。

(3)PCR产物的检测如实施例1的1.2第(3)所述。检测结果如图2所示，其中材料1、2、3、4、6、8、9为抗性突变体材料，5、7、10野生型状态的病毒敏感材料，M为DNA分子量标准DL2000。

Claims (6)

1.一种区分大白菜 eIF(iso)4G 野生型和突变体的位点特异性显性分子标记，其特征在于：与野生型位点检测相关的标记命名为 ASM-I4E.G，片段大小 1526bp，如 SEQ ID No.1 所示。

2.用于鉴别权利要求 1 所述的特异性显性分子标记的引物，其特征在于：

正向引物 PF1：5' -TTTTTTGGTTGTTGGAGATTTTG -3'；

反向引物 PR1：5' -GGTACTTCAGCTTTGACGAGGAC -3'；如 SEQ ID NO.2、3 所示。

3.权利要求 1 所述的特异性显性分子标记在大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育中的应用。

4.权利要求 2 所述的引物在大白菜种质资源鉴定和育种辅助选育中的应用。

5.根据权利要求 3 或 4 所述的应用，其特征在于：具体应用方式为：利用 SEQ ID NO.2、3 所示的引物对待测个体的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，检测扩增片段的有无，如果能扩出条带，则为纯合野生型或杂合体，扩不出则为突变型。

6.根据权利要求 5 所述的应用，其特征在于：所述 PCR 扩增的条件为：在 20μl 反应体系中，包含1×TransStart FastPfu buffer；20ng 的基因组 DNA；0.4μM正反向引物；0.25mM dNTPmix；1个单位的TransStart FastPfu DNA聚合酶，PCR循环条件：95℃预变性5 分钟；接着是95℃变性30秒，57.5℃退火30秒，72℃延伸40秒，35-38个循环，最后 72℃延伸10分钟。