CN105755011B - 用于芥菜芜菁花叶病毒病抗性鉴定的分子标记及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述；上述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。本发明还同时公开了一种基于抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ开发的用于芥菜芜菁花叶病毒病抗性鉴定的分子标记BjTuR。本发明的抗芜菁花叶病毒病基因具有抗芜菁花叶病毒病功能。上述分子标记BjTuR的用途是：用于鉴定芥菜抗芜菁花叶病毒病株系或其后代的辅助选择育种。

Description

用于芥菜芜菁花叶病毒病抗性鉴定的分子标记及其用途
技术领域
本发明属于蔬菜抗病分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种芥菜抗芜菁花叶病毒病分子标记开发及其应用，为芥菜抗芜菁花叶病毒病的高通量筛选鉴定和回交育种提供一种新型分子标记及辅助选择方法。
背景技术
芜菁花叶病毒病是侵染芥菜的主要病害之一，严重影响芥菜植株的生长和产量，病毒病发生严重年份导致绝产。感染该病毒后的芥菜的外在表型为：感病植株表现出植株矮缩，接种叶片死亡脱落，而未接种叶片则出现黄绿相间的花叶症状，同时叶片皱缩，植株生长受到抑制，严重的甚至整株死亡。
生产上目前一般采用延迟播期，或者育苗期间采用防虫网等设施，以避开苗期蚜虫等病毒病传播媒介，降低病毒病发生几率。然而最有效的解决途径是鉴定抗芜菁花叶病毒病种质、发掘抗芜菁花叶病毒病基因，建立芥菜类蔬菜抗芜菁花叶分子标记辅助选择技术方法，选育抗芜菁花叶病毒病品种，从根本上解决限制芥菜类蔬菜作物产业发展的瓶颈问题。
近年来，随着分子遗传学的快速发展，科学家借助于拟南芥、白菜等十字花科模式植物抗芜菁花叶病毒病分子标记的研究，取得了一系列重要进展，关于芥菜芜菁花叶病毒病的研究刚刚起步。不同十字花科作物对芜菁花叶病毒病抗性表现出不同遗传特性，同一物种不同抗性种质对芜菁花叶病毒病抗性也表现为不同遗传规律，主要有质量性状和数量性状、简单遗传和复杂遗传等抗性。如不同大白菜种质对芜菁花叶病毒病抗性表现为1个或多个显性基因控制的显性抗性(Suh et al.,1995)、不完全显性抗性(曹光亮等,1995)、1个或2个隐性基因控制的隐性抗性(Yoon et al.,1993；Qian et al.,2012)。甘蓝对芜菁花叶病毒病抗性遗传也有显性、不完全显性、多个基因遗传等规律(方智远等,1990；王雪等,2005)，油菜对芜菁花叶病毒病抗性与抗性种质和芜菁花叶病毒病株系密切相关，不同芜菁花叶病毒病株系抗性表现为受单基因显性、1对基因隐性、多个隐性基因调控等遗传规律(王雪等,2005)。
伴随着芜菁花叶病毒病抗性遗传规律的研究，在十字花科植物中开发了系列芜菁花叶病毒病抗性连锁分子标记，如油菜中与抗芜菁花叶病毒病CDN1株系抗病基因TuRB03连锁的1个AFLP和6个SSR标记(Hughes et al.,2003)，大白菜中与抗芜菁花叶病毒病C4株系抗病基因连锁的RAPD、SCAR标记等，与抗芜菁花叶病毒病C5株系抗病基因连锁的SCAR标记等(闫瑾琦等,2000；韩和平等,2003)，以及大白菜抗芜菁花叶病毒病的4个QTLs，Tu1、Tu2、Tu3和Tu4(王美等,2003)。在模式植物拟南芥中，芜菁花叶病毒病抗性分子标记与抗性基因发掘方面研究进展较快，如在拟南芥Ler生态型中定位了一个抗芜菁花叶病毒病的显性基因TuN1，位于拟南芥A1染色体上(Kaneko et al.,2004)，精细定位TuN1发现候选基因中At1g58480编码CC-NBS-LRR类R基因，可能与芜菁花叶病毒病抗性有关。在拟南芥C24的EMS突变体中，鉴定到一个芜菁花叶病毒病隐性突变体，对该隐性抗性基因lsp(At5g35620)定位后发现，编码植物真核翻译起始因子eIF(iso)4E蛋白(Lellis et al.,2002)。目前，定位的十字花科芸薹属中芜菁花叶病毒病抗性基因，大多位于A基因组上，少数位于C基因组上。其中，油菜显性抗性TuRB01基因位于B.napus的A亚基因组上，TuRB01b基因是B.rapa基因组上的抗性基因，TuRB02基因是B.napus的C亚基因组上的数量抗病基因，调控芜菁花叶病毒病的感病成都。TuRB03基因为单显性基因，对芜菁花叶病毒病CDN1表现为高抗，TuRB04基因对许多芜菁花叶病毒病株系均有抗性，TuRB05基因对芜菁花叶病毒病侵染后的坏死应答反应，限制病毒在寄主体内的系统传播(Walsh and Jenner,2002；Rusholme et al.,2007)。近年来，大白菜中隐性基因retr01和显性基因ConTR01分别被定位，主要通过调控植株的过敏反应调控大白菜对芜菁花叶病毒病的广谱抗性。病毒病抗性对大多数作物来说是一个非常重要的农艺性状，病毒病发生直接影响植物的生长发育，关系到蔬菜作物的经济产量。基于芜菁花叶病毒病对十字花科蔬菜作物生产的重要性，科学家一直以来致力于芜菁花叶病毒病的遗传归来及抗性相关基因的挖掘。
上文中涉及的参考文献如下：
1.曹光亮,曹寿椿.不结球白菜抗病育种研究.南京农业大学学报,1995,18(1):106-108。
2.王雪,刘玉梅,李汉霞,张扬勇,方智远.芸薹属作物抗芜菁花叶病毒育种研究进展.园艺学报,2005,32(5):939-946。
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4.韩和平.大白菜抗芜菁花叶病毒病基因的AFLP分子标记的研究.[硕士学位论文].北京:中国农业科学院,2003。
5.王美.大白菜遗传图谱构建及抗TuM的QTL分析.[硕士学位论文].泰安:山东农业大学:2003。
6.方智远,孙培田,刘玉梅,杨丽梅,侯安福.青花菜杂交优势利用研究初报.中国蔬菜,1990,(6):2-5。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是克隆一个芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ，提供一种与芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ有关的分子标记及其开发方法和用途。本发明所获得的分子标记BjTuR为芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ的基因标记，能用于芥菜抗芜菁花叶病毒病的辅助选择育种。
为了解决上述技术问题，本发明克隆了一个与芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ，该基因具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。
本发明还同时提供了上述芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
本发明还同时提供了一种与芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ有关的分子标记，以芥菜为物种，该分子标记引物采用的下列引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’：
BjTuR：正向引物(F)：GTTAATGGGAAAGGGATTGGGTATCCTTG；
反向引物(R)：ATAGCTTGCTCGGCGATCTGCTCAT。
本发明还提供了芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ的克隆方法，包括以下步骤：
1)、以抗病毒病芥菜--大头菜与感病芥菜--榨菜为亲本进行杂交和自交，从而获得作为后代的抗/感病分离的单株；
2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonnium Bromide)法提取芥菜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；
3)、采用BSA(分离群体分析，Bulked Segregant analysis)构建抗/感基因池，基于Illumina高通量测序平台对抗/感基因池进行基因组覆盖度50倍重测序；
4)、采用关联分析鉴定与抗芜菁花叶病毒病相关的基因；
5)、克隆到一个与芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ。
本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
1)、以抗病毒病大头菜作为抗病基因供体亲本与感病芥菜榨菜进行杂交和回交，从而获得作为后代的抗病芥菜单株；
2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonnium Bromide)法提取芥菜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；
3)、采用PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)方法进行抗芜菁花叶病毒病基因标记的筛选；
4)、开发出一个PCR分子标记BjTuR。
本发明还提供了上述分子标记BjTuR的用途：用于芥菜抗芜菁花叶病毒病株系或其后代辅助选择育种。
作为本发明的分子标记BjTuR的用途的改进：当筛选大头菜和榨菜的后代时，选择后代中带型与大头菜带型一致的单株用于育种。
与芥菜抗芜菁花叶病毒病有关的分子标记BjTuR，具体采用下述方法获得：
1)、比较抗病毒病大头菜和感病芥菜榨菜中抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ的基因组序列，鉴定到感病芥菜榨菜中eIF2Bβ基因在基因组水平上有一段90bp长度的Indel变异，即，通过测序检测出两亲本中eIF2Bβ基因序列内部在分子标记限定的片段上存在差异；
2)、基于抗/感芥菜中eIF2Bβ基因的Indel变异，在Indel附近区域设计一对引物；
3)、用CTAB法提取芥菜亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；
4)、采用PCR方法进行抗芜菁花叶病毒病基因标记的筛选；
5)、开发出一个PCR标记BjTuR，经多态性检测，发现其与芥菜抗芜菁花叶病毒病相关性，采用该标记可以用来鉴定芥菜病毒病抗性。
采用BjTuR标记进行芥菜抗芜菁花叶病毒病筛选的方法具体是：
(1)BjTuR标记在芜菁花叶病毒病不同抗性品种大头菜和榨菜见的DNA多态性分析：
根据eIF2Bβ基因的核苷酸序列，设计开发分子标记BjTuR，用于检测大头菜和榨菜之间病毒病抗性的多态性。备注说明：引物(分子标记)可委托上海桑尼生物科技有限公司合成，在ABI Veriti96PCR仪上进行PCR扩增。
PCR反应体系为：20ng/μl芥菜基因组DNA1μl，10×PCR Buffer 2.0μl，25mMMgCl22.0μl，2mM dNTP 2.0μl，10μM正反向引物个1.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O10.8μl，总体积20μl。
反应程序：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃终止反应10分钟；产物检测：在含有0.005％Goldview的1.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。
(2)BjTuR标记的序列区间在不同抗性的大头菜和芥菜间的基因组序列差异：
根据获得的BjTuR标记，用于PCR扩增不同病毒病抗性的大头菜和榨菜间的基因组序列，PCR扩增产物委托上海桑尼生物技术有限公司进行测序分析。PCR扩增参照上述(1)进行，PCR产物回收选用Omega生物技术有限公司开发的PCR产物回收试剂盒。
(3)利用BjTuR分子标记开展抗芜菁花叶病毒病辅助选择育种：
抗病毒病基因供体大头菜与感病芥菜榨菜进行杂交，然后通过回交、自交结合标记辅助选择，将大头菜的抗病基因eIF2Bβ导入到榨菜中，选择分离群体中带型与大头菜带型一致的单株用于育种改良，获得了若干份榨菜背景的含有大头菜eIF2Bβ基因的材料，通过芜菁花叶病毒病病菌源接种，发现其抗病性显著增加。
抗芜菁花叶病毒病是芥菜的重要性状，是高产的重要组成部分。本发明采用分子遗传学方法以含有抗病基因的大头菜为材料，开发了新的、稳定性好的能改良病毒病抗性的分子标记及其方法，用于芥菜抗病毒病辅助选择育种。由于研究所用的材料抗病基因能提高芥菜抗病毒病能力，其对我国芥菜抗病毒病分子设计育种具有普遍性。
本发明创造了芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ的PCR标记BjTuR。采用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需要周期长、抗病鉴定稳定性差等缺点，可以有目标地将大头菜的抗病基因eIF2Bβ在实验室内选择获得，并有目的地进行多个抗病基因的聚合，而从培育出具有抗多种病害的芥菜新品种。在本发明中，当后代植株中检测到具有大头菜的带型时，我们判定其属于抗病毒病芥菜，当后代植株中检测到具有榨菜的带型或者同时出现大头菜和榨菜带型时，我们判定其属于感病芥菜。
本发明可适用于大部分的芥菜抗病毒病的标记选择。
因此，本发明结果在芥菜抗芜菁花叶病毒病育种实践中具有重要意义；其优点具体归纳如下：
(1)本发明克隆到芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ，是通过基于高通量测序和基于BSA的关联分析获得的，是国内外首次报道eIF2Bβ在植物中起到抗芜菁花叶病毒病功能。
(2)本发明的能实现芜菁花叶病毒病抗性功能基因eIF2Bβ分子标记，是通过含有抗性基因的大头菜与感病芥菜榨菜的杂交、回交和自交中筛选获得的，能显著提高病毒病抗性，而且稳定遗传，可用于病毒病抗性的辅助选择育种。
(3)本发明依据的是芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ的核苷酸序列开发而来的PCR标记，极大提高了辅助选的效率和效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是抗病芥菜大头菜和感病芥菜榨菜对芜菁花叶病毒病抗性鉴定；
(a)为芜菁花叶病毒侵染后症状；
(b)为芜菁花叶病毒侵染后病毒外壳蛋白基因(CP)表达；
(c)为芜菁花叶病毒侵染后植株体内病毒含量。
图2是eIF2Bβ抗芜菁花叶病毒病功能验证图；
(a)代表芜菁花叶病毒病侵染后植株生长；
(b)代表芜菁花叶病毒病侵染后叶片情况。
其中：MOCK为假侵染；TuMV为芜菁花叶病毒病侵染；pTY-S为病毒介导基因沉默的载体侵染；pTY-S/TuMV pTY-S为病毒介导基因沉默的载体侵染后在侵染芜菁花叶病毒；pTY-S/eS为通过病毒介导基因沉默技术沉默eIF2Bβ表达；pTY-S/eS为通过病毒介导基因沉默技术沉默eIF2Bβ表达再侵染芜菁花叶病毒病。
图3是eIF2Bβ在抗病芥菜大头菜和感病芥菜榨菜核苷酸序列比较。
图4是PCR标记BjTuR在大头菜、榨菜和F1中的电泳谱带图；
图5是PCR标记BjTuR在大头菜和榨菜F2群体中的遗传分析。
根据该图5，我们能得知：PCR标记BjTuR在F2群体中发生分离，且分离比例符合单基因隐性性状1:3的分离规律，表明PCR标记BjTuR与芜菁花叶病毒病抗性连锁。
图6是PCR标记BjTuR在大头菜和榨菜BC1群体中的遗传分析。
根据该图6，我们能得知：PCR标记BjTuR在BC1群体中发生分离，且分离比例符合单基因隐性性状1:1的分离规律，表明PCR标记BjTuR与芜菁花叶病毒病抗性连锁。
图7是PCR标记BjTuR在大头菜和榨菜杂交、自交和回交后代中标记与抗病表型相关性分析；
(A)为F2群体中标记与抗性相关性分析；
(B)为BC1群体中标记与抗性相关性分析。
具体实施方式
实施例1、大头菜和榨菜对芜菁花叶病毒病抗性鉴定
具体做法是：从中国农科院蔬菜种质资源库中选取芥菜材料---大头菜、榨菜、大头菜和榨菜杂交F1后代，芜菁花叶病毒病原菌接种，采用检测芜菁花叶病毒病原菌外壳蛋白基因(CP)表达、植株体内病毒含量和叶片症状判定抗性。如图1。
一、病毒病原菌接种：
1)、配制病毒接种PBS缓冲液
在ddH2O中按依次加入8g NaCl、0.2g KCl、Na2HPO4 1.42g和NaH2PO4 0.27g，用ddH2O定容至1升，调节pH至7.2，配置成PBS缓冲液(0.02mol/L PBS缓冲液)。
2)、芜菁花叶病毒病毒株
芜菁花叶病毒病毒株取自于田间病毒病发病植株(即，完全满足植株矮缩、叶片现黄绿相间的花叶皱缩症状的外在表型，该植株为TuS1)，将发病叶片按照1g:10ml(重量/体积)的比例加入20ml 0.02mol/L PBS缓冲液研磨成匀浆，用纱布滤出病毒液，采用人工摩擦接种到芥菜叶片(即，分别接种至大头菜叶片、榨菜叶片、F1后代叶片)。假侵染仅使用PBS缓冲液摩擦叶片接种。
二、提取RNA和反转录cDNA
1)RNA提取
RNA提取可选择天根生化科技(北京)有限公司生产的植物总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Plant Mini Kit)。
①、称取0.1g上述芥菜叶片用液氮研磨成粉状，然后参照RNA提取试剂盒提供的操作步骤提取总RNA。
②、采用Nanodrop2000超微量分光光度计检测上述所得的RNA样品浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。完整合格的RNA样品用于反转录cDNA。
2)、反转录cDNA
cDNA反转录可选择东洋纺(上海)生物科技有限公司生产的Rever Tra Ace qPCRRT Master Mix with gDNA Remover反转录试剂盒，参考试剂盒提供的操作步骤反转录cDNA。
三、CP基因表达检测
1)、反应体系
芥菜cDNA2.5μl、SYBR green supermix 10μl、灭菌ddH2O 5.5μl、正反向引物各1.0μl，总体积20μl。芥菜25S基因作为基因相对表达量内参，引物序列如下：
CP正向(F)：CTACGAACTGACGGAGGACA
CP反向(R)：CACATTCCGTTTATGTTCGG
25S正向(F)：CGGTTCCTCTCGTACTAGGTTGA
25S反向(R)：CCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTT；
2)、反应程序
反应混合液在实时荧光定量PCR仪(ABI Step One Plus)上进行，反应程序为：95℃预变性10min，40个循环的95℃变性10s和60℃退火30s。
3)、相对表达量计算
采用内参基因标准化CP基因的临界循环值，采用以下公式计算CP基因相对表达量：
ΔCT＝CT(CP)-CT(25S)
ΔΔCT＝ΔCT(接种植株)-ΔCT(假侵染植株)
目的基因的相对表达量采用STEPONE software(Applied Bio-system)进行计算，其计算公式：RQ(相对表达量)＝2-ΔΔCT。
根据图1(b)，病毒病病原菌接种后大头菜叶片中CP基因表达量与假侵染相当，病原菌没有在大头菜叶片中得到复制，表明大头菜为抗病毒病种；而榨菜叶片中CP基因表达量比假侵染高出3000多倍，表明病原菌在榨菜叶片中得到大量复制，表明榨菜为感病毒病种质；同时在大头菜和榨菜的杂交F1后代中，CP基因表达量比假侵染高出4000多倍，表明F1代为感病，芥菜中抗病毒病表现为隐性遗传。
四、植株体内病毒含量检测
1)、酶联免疫吸附测定(ELISA)检测
植株体内病毒含量测定采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测，可选择美国Agdia公司生产的检测试剂盒检测。
①、抗体制备
参考试剂盒说明书，制备病毒抗体。
②、样品提取
选取芥菜(即，分别为大头菜、榨菜、F1)上部未接种叶片，将样品与提取缓冲液(GEB，试剂盒提供)以1g:10ml(质量/体积)的比例迅速研磨成匀浆，收集匀浆至1.5ml离心管，5000rpm离心5分钟。
③、病毒含量测定
参考试剂盒说明书进行点样、孵育、酶标记物制备、洗板、PNP底物制备等步骤，用酶标记检测405nm波长下的吸光值，表示叶片中病毒病病原菌含量。ELISA鉴定的P/N值用抗病性判定，P/N≥2.1时，植物表现为阳性即感病；P/N＜2.1时，植物表现为阴性即抗病。
根据图1(c)，其中，负对照为假侵染处理，正对照为病毒病原，病毒病病原菌接种后大头菜叶片中病毒含量与假侵染相当，病原菌没有在大头菜叶片中得到复制，表明大头菜为抗病毒病种质；而榨菜叶片中病毒含量比假侵染高出10倍上，表明病原菌在榨菜叶片中得到大量复制，表明榨菜为感病毒病种质；同时在大头菜和榨菜的杂交F1后代中，CP基因表达量比假侵染高出10倍以上，表明F1代为感病，芥菜中抗病毒病表现为隐性遗传。该结果与CP基因表达检测结果相符。
五、叶片症状观察
病原菌接种2周以上观察叶片症状，感病植株表现叶片出现黄绿相间的花叶症状，同时叶片皱缩。抗病植株接种后零星发病或不发病，叶片无明显差异。
根据图1(a)，病毒病病原菌接种后大头菜叶片生长与假侵染相当，表明大头菜为抗病毒病种；而榨菜叶片皱缩，表明榨菜为感病毒病种质；同时在大头菜和榨菜的杂交F1后代中，叶片皱缩，表明F1代为感病，芥菜中抗病毒病表现为隐性遗传。该结果与CP基因表达检测及病毒含量检测结果相符。
实验1、eIF2Bβ在植物中起到抗芜菁花叶病毒病功能：
从中国农科院蔬菜种质资源库中选取芥菜材料榨菜，利用病毒介导基因沉默技术，将SEQID NO：1所述基因表达沉默。
其中：MOCK为假侵染；TuMV为芜菁花叶病毒病侵染；pTY-S为病毒介导基因沉默的载体侵染；pTY-S/TuMV为病毒介导基因沉默的载体侵染后在侵染芜菁花叶病毒；pTY-S/eS为通过病毒介导基因沉默技术沉默eIF2Bβ表达；pTY-S/eS/TuMV为通过病毒介导基因沉默技术沉默eIF2Bβ表达再侵染芜菁花叶病毒病。
如图2所示，我们可得出：MOCK榨菜植株和叶片生长正常；TuMV榨菜植株表现感病，植株和叶片均表现出芜菁花叶病毒病侵染典型症状；pTY-S榨菜植株和叶片只表现出pTY-S载体特有的白色斑点症状；pTY-S/TuMV榨菜植株和叶片均表现出芜菁花叶病毒病侵染典型症状；pTY-S/eS榨菜植株和叶片只表现出载体特有的白色斑点症状；pTY-S/eS/TuMV榨菜植株和叶片只表现出pTY-S载体特有的白色斑点症状。
从上述结果我们能得知：榨菜本身表现为感病，pTY-S/eS/TuMV榨菜表明eIF2Bβ基因表达沉默，结果榨菜表现为抗病毒病，表明eIF2Bβ在植物中起到抗芜菁花叶病毒病功能。
实施例2、抗病毒病芥菜大头菜和感病芥菜榨菜eIF2Bβ基因核苷酸序列比对
具体做法是：从中国农科院蔬菜种质资源库中选取芥菜材料大头菜和榨菜，利用eIF2Bβ基因引物从大头菜和榨菜中扩增其基因组序列，进行序列比对，发现基因组水平上的变异。
一、提取DNA
1)、DNA提取
DNA提取可选择天根生化科技(北京)有限公司生产的植物总DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)。
①、称取0.1g上述芥菜叶片用液氮研磨成粉状，然后参照DNA提取试剂盒提供的操作步骤提取总DNA。
②、采用Nanodrop2000超微量分光光度计检测上述所得的DNA样品浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
二、PCR扩增
1)、反应体系
20ng/μl芥菜基因组DNA1μl，10×PCR Buffer 2.0μl，25mM MgCl2 2.0μl，2mMdNTP 2.0μl，10μM正反向引物各1.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，ddH2O 10.8μl，总体积20μl。引物序列如下：
eIF2Bβ正向(F)：ATGCCGGACGTGCAATCGA；
eIF2Bβ反向(R)：CTACATCACCAAATCATCAGC。
2)、反应程序
反应混合液在PCR仪(ABI Veriti96)上进行，反应程序为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃终止反应10分钟。
三、PCR产物电泳检测及回收
1)、电泳检测
取扩增产物10μl，用1％的琼脂糖凝胶(含有0.0005％EB)电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。
2)、PCR产物回收
PCR产物(大约2300bp目标条带)的回收可选用Omega生物技术有限公司生产的PCR产物回收试剂盒，参照产品说明书要求进行。
四、测序及比对分析
1)、测序
回收的PCR产物可委托上海桑尼生物科技有限公司进行测序，序列结果见图3。
2)、比对分析
采用ClustalW软件对大头菜和榨菜中eIF2Bβ的基因组序列进行比对，比对结果见图3。
根据图3，我们发现在榨菜的eIF2Bβ的基因组序列上有一个90bp插入序列(Indel)变异。具体而言：大头菜中的eIF2Bβ的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
在后续实施例3用PCR标记BjTuR鉴定大头菜和榨菜多态性与遗传分析中，我们根据这一变异设计一对特异PCR引物。
实施例3、用PCR标记BjTuR鉴定大头菜和榨菜多态性与遗传分析
具体做法是：从中国农科院蔬菜种质资源库中选取芥菜材料大头菜和榨菜，用大头菜和芥菜杂交获得其F1，然后F1自交获得F2，同时F1与榨菜回交获得BC1，利用引物PCR标记BjTuR扩增鉴定其多态性和遗传分离规律。
一、提取DNA
同实施例2。
二、PCR扩增
1)、反应体系
引物序列改成如下：
BjTuR：正向引物(F)：GTTAATGGGAAAGGGATTGGGTATCCTTG；
反向引物(R)：ATAGCTTGCTCGGCGATCTGCTCAT。
其余等同于实施例2。
2)、反应程序
同实施例2。
三、电泳检测
同实施例2。
根据图4，我们得出结论利用BjTuR引物对分别从大头菜和榨菜基因组中PCR扩增获得709bp和799bp大小的条带，在大头菜和榨菜杂交F1后代中PCR扩增同时获得709bp和799bp大小的条带。由此表明，PCR分子标记BjTuR能用于大头菜和榨菜之间及其后代的标记辅助选择。
实施例4、用PCR标记BjTuR开展芥菜抗病毒病辅助选择育种
具体做法是：对大头菜与感病种质榨菜进行杂交、自交和回交后代分离群体(即，用大头菜和芥菜杂交获得其F1，然后自交获得F2，同时与榨菜回交获得BC1)，采用PCR标记BjTuR进行辅助选择，如图5、6所示，选择带型与大头菜带型一致的单株进一步用于育种改良。
一、提取DNA
同实施例2。
二、PCR扩增
同实施例3。
三、电泳检测
同实施例2。
四、PCR分子标记BjTuR开展抗病毒病的辅助选择育种
抗芜菁花叶病毒病种质大头菜与感病种质榨菜进行杂交、自交和回交，结合PCR分子标记BjTuR的辅助选择。在杂交和自交获得的F2分离群体中选择带型与大头菜带型一致的单株进一步用于育种改良，淘汰带型与榨菜带型一致的以及同时具有大头菜和榨菜带型的个体(图5)。在杂交和回交获得的BC1分离群体中选择带型与大头菜带型一致的单株进一步用于育种改良，淘汰带型与榨菜带型一致的和同时具有大头菜和榨菜带型的个体(图6)。
实验2、利用PCR分子标记BjTuR判别芥菜芜菁花叶病毒病抗性
将实施例4所得的与大头菜带型一致的单株以及被淘汰的带型，即与榨菜的带型一致和杂合带型(同时具有大头菜和榨菜带型)的个体(包括F2和BC1)继续种植，通过对其进行芜菁花叶病毒病抗性接种鉴定，进一步分析PCR分子标记BjTuR辅助选择的可靠性。
具体为：
随机选择实施例4中与大头菜带型一致的单株、被淘汰的带型与榨菜一直的单株，以及杂合带型的植株(同时具有大头菜和榨菜带型)，通过病毒病病菌源接种；
该病毒病病菌源接种方式如同实施例1所述，选用实施例1所得的已被确认感染病毒的F1(即，外在表型为植株矮缩、叶片现黄绿相间的花叶皱缩症状，条带为榨菜带型)作为“芜菁花叶病毒病毒株”。
结果为：如图7所示，
在F2群体中，3个与大头菜带型一致的单株的外在表型为植株和叶片生长正常；
在BC1群体中，3个与大头菜带型一致的单株的外在表型为植株和叶片生长正常；
F2群体中1个与榨菜带型一致的单株和BC1群体中1个与榨菜带型一致的单株，以及上述2个群体中4个杂合带型的植株的外在表型为植株矮缩、叶片现黄绿相间的花叶皱缩症状；从而表明该6个单株均表现为感病。我们得出结论，PCR分子标记BjTuR可准备判别芥菜芜菁花叶病毒病抗性。
最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变性。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 浙江大学
<120> 用于芥菜芜菁花叶病毒病抗性鉴定的分子标记及其用途
<160> 2
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA CDS
<213> 人工序列
<220>
<223> 芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ
<400> 1
atgccggacg tgcaatcgat ggtgcttgag tttgttaaca agctcaggaa 50
acgtaagatt gagggctcac aagctacagc tagatgcacc gtggagcttc 100
ttaggtcggt gatctctcat catcgggtgc ctcatgcaaa ccaagcttca 150
gctcttattg atgctgtgaa agccgttggt gcgcaactgg tcgctgctaa 200
tcctgttgag cttgcggtgg ggaatgtagt gaggcgggtt ttgcatataa 250
taagggagga ggatctgtct cttgctacag cagctgtggc ggggttggat 300
ttgttggatg cgagtgatga cgatgaggat gttaatggga aagggattgg 350
gtatcctggg atgtctgcgg cggttgttgc tgctgctgct aggagtacgt 400
tgcgtcctcc ttctttgcag acgcttctcg agggaactcc tgagtctgcg 450
acggttccgt acacttcttc gtccggtgct gattccgaaa gcaaaactgc 500
cgacaaaagt tcaataactc ggaagctgaa gcatgatgtt attgaaggag 550
tcaatcaact tatccacgag attgctggtt gtcatgagca gatcgccgag 600
caagctgttg agcacataca tcaaaatgag gtgattctaa ccctgggtag 650
ctcaagaaca gtactcgagt ttctgtgcgc tgcaaaggag aagaaaaggt 700
catttcgtgt atttgtcgct gaaggtgctc caaggtatca gggacatcta 750
ttagcaaaag aattggtagc tagaggtctg cagaccactg tgatcactga 800
ctctgcagtg tttgctatga tatctcgagt gaacatggtt ataattggag 850
ctcatgcagt gatggccaat ggtggagtta taggacctgt tggagtcaac 900
atggctgctt tggcagcaaa aaagcacgca gtcccatttg tggttctagc 950
cggtagtcac aagctatgtc cactctatcc tcacaatccg gaggtgttac 1000
taaacgagct gagatctcct tctgaactgt tggattttgg tgaattctct 1050
gattgcctgg attttggatc cggttccggg tctccccttc ttcaagtagt 1100
caacccaacc ttcgattacg tcccaccaag cctcgtcagt ctctttataa 1150
ccgacacggg aggacacaac ccgtcttaca tgtaccgtct tattgctgac 1200
tactactccg ctgatgattt ggtgatgtag 1230
<210> 2
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芥菜抗芜菁花叶病毒病
<400> 2
Met Pro Asp Val Gly Ser Met Val Leu Glu Phe Val Asn Lys Leu
1 5 10 15
Arg Lys Arg Lys Ile Glu Gly Ser Gly Ala Thr Ala Arg Cys Thr
20 25 30
Val Glu Leu Leu Arg Ser Val Ile Ser His His Arg Val Pro His
35 40 45
Ala Asn Gly Ala Ser Ala Leu Ile Asp Ala Val Lys Ala Val Gly
50 55 60
Ala Gly Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Glu Leu Ala Val Gly Asn
65 70 75
Val Val Arg Arg Val Leu His Ile Ile Arg Glu Glu Asp Leu Ser
80 85 90
Leu Ala Thr Ala Ala Val Ala Gly Leu Asp Leu Leu Asp Ala Ser
95 100 105
Asp Asp Asp Glu Asp Val Asn Gly Lys Gly Ile Gly Tyr Pro Gly
110 115 120
Met Ser Ala Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Arg Ser Thr Leu Arg
125 130 135
Pro Pro Ser Leu Gly Thr Leu Leu Glu Gly Thr Pro Glu Ser Ala
140 145 150
Thr Val Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Gly Ala Asp Ser Glu Ser Lys
155 160 165
Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ile Thr Arg Lys Leu Lys His Asp Val
170 175 180
Ile Glu Gly Val Asn Gly Leu Ile His Glu Ile Ala Gly Cys His
185 190 195
Glu Gly Ile Ala Glu Gly Ala Ile Glu His Ile His Gly Asn Glu
200 205 210
Val Ile Leu Thr Leu Gly Ser Ser Arg Thr Val Leu Glu Phe Leu
215 220 225
Cys Ala Ala Lys Glu Lys Lys Arg Ser Phe Arg Val Phe Val Ala
230 235 240
Glu Gly Ala Pro Arg Tyr Gly Gly His Leu Leu Ala Lys Glu Leu
245 250 255
Val Ala Arg Gly Leu Gly Thr Thr Val Ile Thr Asp Ser Ala Val
260 265 270
Phe Ala Met Ile Ser Arg Val Asn Met Val Ile Ile Gly Ala His
275 280 285
Ala Val Met Ala Asn Gly Gly Val Ile Gly Pro Val Gly Val Asn
290 295 300
Met Ala Ala Leu Ala Ala Lys Lys His Ala Val Pro Phe Val Val
305 310 315
Leu Ala Gly Ser His Lys Leu Cys Pro Leu Tyr Pro His Asn Pro
320 325 330
Glu Val Leu Leu Asn Glu Leu Arg Ser Pro Ser Glu Leu Leu Asp
335 340 345
Phe Gly Glu Phe Ser Asp Cys Leu Asp Phe Gly Thr Gly Ser Gly
350 355 360
Ser Pro Leu Leu Gly Val Val Asn Pro Thr Phe Asp Tyr Val Pro
365 370 375
Pro Ser Leu Val Ser Leu Phe Ile Thr Asp Thr Gly Gly His Asn
380 385 390
Pro Ser Tyr Met Tyr Arg Leu Ile Ala Asp Tyr Tyr Ser Ala Asp
395 400 405
Asp Leu Val Met

Claims (6)

1.芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ，其特征是：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
2.如权利要求 1所述的芥菜抗芜菁花叶病毒病基因eIF2Bβ编码的蛋白质，其特征是：该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。
3.如权利要求1所述的抗芜菁花叶病毒病基因的用途，其特征是：用于抵抗抗芜菁花叶病毒病。
4.如权利要求1所述的抗芜菁花叶病毒病基因的用途，其特征是：用于鉴定芥菜芜菁花叶病毒病抗性基因。
5.分子标记BjTuR的用途，其特征是：用于鉴定芥菜抗芜菁花叶病毒病株系或其后代的辅助选择育种；
所述分子标记BjTuR，以芥菜为物种，分子标记引物采用如下引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’，
BjTuR：正向引物(F)：GTTAATGGGAAAGGGATTGGGTATCCTTG；
反向引物(R)：ATAGCTTGCTCGGCGATCTGCTCAT。
6.分子标记BjTuR的用途，其特征是：当筛选大头菜和榨菜的后代时，选择后代中带型与抗病芥菜带型一致的单株用于育种；
所述分子标记BjTuR，以芥菜为物种，分子标记引物采用如下引物对，其中的核苷酸序列为5’-3’，
BjTuR：正向引物(F)：GTTAATGGGAAAGGGATTGGGTATCCTTG；
反向引物(R)：ATAGCTTGCTCGGCGATCTGCTCAT。
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