CN108366539B

CN108366539B - 与大豆的疫霉根腐病相关联的遗传基因座

Info

Publication number: CN108366539B
Application number: CN201680033730.9A
Authority: CN
Inventors: 马渐新; 平洁青; J·C·菲茨杰拉德; 张春宝; 林峰; Y·白; M·雷曼; O·克拉斯塔; R·阿加沃尔; A·阿查里雅
Original assignee: Dow AgroSciences LLC; Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation; Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2015-06-03
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2036-06-02
Also published as: US20180030550A1; IL255956A; AU2016270918A1; AR104914A1; BR102016012586A2; RU2017143393A3; CN108366539A; BR102016012586B1; RU2748688C2; RU2017143393A; WO2016196787A1; AU2016270918B2; MX2017015148A; CA2987333A1; EP3302031A4; KR20180028410A; CL2017003034A1; UY36707A; JP2018516088A; US10995377B2

Abstract

本发明主题涉及用于鉴定具有增加的疫霉根腐病抗性的大豆植物的方法和组合物。所述方法使用分子标记来鉴定和选择具有增加的疫霉根腐病抗性的植物或来鉴定和取消选择具有降低的疫霉根腐病抗性的植物。通过公开的方法生成的大豆植物也是本发明主题的特征。

Description

与大豆的疫霉根腐病相关联的遗传基因座

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2015年6月3日的美国临时申请号62/170,441的优先权，该临时申请以引用方式整体并入本文。

对以电子方式提交的序列表的引用

序列表的正式拷贝以电子方式经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表提交，其文件名为“77970-WO-PCT_ST25_SEQUENCE_LISTING.txt”，于2016年6月1日创建，大小为15.7千字节，并与本申请同时提交。该ASCII格式文件中所含的序列表是说明书的一部分，并以引用方式整体并入本文。

技术领域

本公开主题涉及可用于增加大豆植物的疫霉根腐病(Phytophthoraroot andstem rot)抗性的方法。

背景技术

自从在1948年在印第安纳州首次被注意并在1951年在俄亥俄州再次被注意(Dorrance等人2007；Erwin和Ribeiro 1996；Kaufmann和Gerdemann 1958；Schmitthenner1985)，由土传病原体大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的疫霉根腐病(PRSR)在全世界大多数大豆生产地区都有报道。从1996年到2009年，在美国PRSR被排名为位居抑制大豆产量的大豆孢囊线虫病(SCN)之后的第二最具破坏性大豆病害，其导致年度产量损失达4470万bu(Koenning和Wrather 2010；Wrather和Koenning 2009)。

生理小种(race)特异抗性大豆栽培品种的部署一直是PRSR管理的主要策略，因为它在降低由疫霉病导致的大豆产量损失方面是高效且经济和环境安全的(Dorrance等人2007；Dorrance和Schmitthenner 2000；Schmitthenner 1999)。迄今为止，已经鉴定了大约25个Rps基因/等位基因，其分布在八个不同染色体上的19个座位处。3号染色体(Chr.3)(MLG N)具有作图(mapped)最多的Rps基因/等位基因，包括Rps1a、Rps1b、Rps1c、Rps1d、Rps1k、Rps7、Rps9、RpsUN1、RpsYu25、RpsYD29和日本栽培品种'Waseshiroge'中报道的未命名Rps基因(Demirbas等人2001；Fan等人2009；Gao等人2005；Lin等人2013；Sugimoto等人2011；Sun等人2011；Weng等人2001；Wu等人2011a；Yao等人2010；Zhang等人2013)。两个Rps基因即Rps2和RpsUN2已作图在Chr.16(MLG J)的末端处，该Chr.16是熟知的抗性基因簇区(Kanazin等人1996；Lin等人2013；Polzin等人1994)。有趣的是，Rps3(含有三个等位基因3-a、3-b、3-c)和Rps 8已被作图到Chr。13(MLG F)上的另一抗性基因富含区(Demirbas等人2001；Gordon等人2006)。最近鉴定出的Rps基因RpsJS与Rps4、Rps5和Rps6连锁并且全部位于Chr.18(MLG F)的短臂上(Demirbas等人2001；Sandhu等人2004；Sun等人2014)。此外RpsYB30、Rps ZS18、RpsSu和Rps10已分别被作图到Chr.19(MLG L)、Chr.2(MLG D1b)、Chr.10(MLG O)和Chr.17(MLG D2)(Wu等人2011b；Yao等人2010；Zhang等人2013；Zhu等人2007)。

这些Rps基因中许多已成功部署在大豆育种程序中来控制PRSR。然而，由于病原体在选择压力下快速而持续地进化，这些基因仅可有效持续8至15年(Schmitthenner 1985)。此外，将已知Rps基因聚合成单一栽培品种可能不是有效的长期育种策略，因为重组病原体群体可像育种者可堆叠抗性基因一样迅速地产生新的毒力等位基因组合(McDonald和Linde 2002)。因此，仍需要鉴定新型Rps基因来有效管理疫霉病。

本公开中鉴定了新型疫霉抗性基因座。此外，还鉴定了与公开的新型疫霉抗性基因座连锁的标记。与新型疫霉抗性基因座连锁的标记包括SSR、InDel和SNP标记。本公开中鉴定的标记可用于疫霉抗性基因分型以支持育种程序。使用目前公开的标记来进行疫霉抗性基因分型以支持育种程序除其他益处之外还提供：节约成本和时间；早期选择期望的子代；以及更准确和快速地商业化抗疫霉大豆品种。也描述了本文公开的新型疫霉抗性基因座的表型的基础候选基因。

发明内容

在一个实施方案中，提供了鉴定显示出增加的PRSR抗性的大豆植物的方法，其包括在大豆植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因。标记基因座在7号染色体上，并位于包含并侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的染色体区间内，并且至少一个等位基因与增加的PRSR抗性相关联。在一些具体的实施方案中，标记基因座可以选自以下标记基因座中的任一者：BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C以及与这些标记连锁的任何其他标记。在一些实施方案中，标记基因座在7号染色体上，并位于包含并侧接BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的区间内，并且包含与增加的PRSR抗性相关联的至少一个等位基因。在一些具体的实施方案中，标记基因座可以选自以下标记基因座中的任一者：BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel2和InDel_1以及与这些标记连锁的任何其他标记。在一些实施方案中，标记基因座包含选自由以下各项组成的组的基因：Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800和Glyma.07G62900。通过该方法鉴定的大豆植物也是感兴趣的。

在另一个实施方案中，提供了用于通过检测大豆植物的种质中的单倍型来鉴定具有增加的PRSR抗性的大豆植物的方法。单倍型包含一个或多个标记基因座处的等位基因，其中一个或多个标记基因座发现于7号染色体上、在包含并侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的区间内。在一些具体的实施方案中，标记基因座可以选自以下标记基因座中的任一者：BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C以及与这些标记连锁的任何其他标记。在一些实施方案中，单倍型包含一个或多个标记基因座处的等位基因，其中一个或多个标记基因座发现于7号染色体上、在包含并侧接BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的区间内。在一些具体的实施方案中，标记基因座可以选自以下标记基因座中的任一者：BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_1和InDel_1以及与这些标记连锁的任何其他标记。单倍型与增加的PRSR抗性相关联。在一些实施方案中，标记基因座包含选自由以下各项组成的组的基因：Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800和Glyma.07G62900。通过该方法鉴定的大豆植物也是感兴趣的。

在另一个实施方案中，提供了选择具有增加的PRSR抗性的植物的方法。在一方面，获得了具有标记基因座的至少一个等位基因的第一大豆植物，其中等位基因与增加的PRSR抗性相关联。标记基因座可发现于7号染色体上、在包含并侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的区间内，并且在一些具体的实施方案中标记基因座可发现在包含并侧接BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的区间内。第一大豆植物可与第二大豆植物杂交(cross)，并且可针对第一大豆植物的等位基因来评价得自该杂交的子代。具有来自第一大豆植物的等位基因的子代植物可被选择为具有增加的PRSR抗性。在一些实施方案中，标记基因座包含选自由以下各项组成的组的基因：Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800和Glyma.07G62900。通过该方法选择的大豆植物也是感兴趣的。

附图和序列表简述

根据以下详细描述以及构成本申请一部分的附图和序列表可以更加全面地理解本发明主题。该序列表包含表示核苷酸序列特征的单字母密码和表示氨基酸的三字母密码，其定义与描述于以下文献中的IUPAC-IUBMB标准一致：Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2):345-373(1984)，所述文献以引用的方式整体并入本文。用于核苷酸序列和氨基酸序列的符号和格式符合37C.F.R.§1.822中提出的规则。

图1基于抗性池(bulk)与易感池之间的相异SNP分布示出Rps11的位置。y-轴指示Chr.07上的三种类型的SNP。T1表示在Williams中易感等位基因的情况下SNP是纯合的。T3表示在PI 594527中抗性等位基因的情况下SNP是纯合的。T2表示在来自两个亲本的等位基因的情况下SNP是杂合的。x-轴示出SNP的物理位置。a与b之间的区间指示Rps11的潜在区。

图2示出Rps11在Chr.7上的遗传图谱和物理图谱。图2(a)是Rps11的遗传连锁图谱。标记名称列出在左侧并且遗传距离(cM)在右侧。*‘BARCSOYSSR_07_0241’的缩略语。图2(b)示出SSR标记的物理位置，其通过对SoyBase网站上的大豆参考基因组(Glyma1.1)BLAST搜索其引物序列来确定。括号中的数字表示标记的以碱基对(bp)计的起始位置。TRps11的区间用黑色突显。图2(c)示出Williams 82参考基因组中的Rps11区间的物理位置。棒指示Chr.07的两个臂，并且圆形指示着丝粒区的近似位置。

图3示出7号染色体上的含有Rps11基因座的61kb区，和在该区中预测的相关标记和五种基因模型。示出了10个F3重组体的图谱。

SEQ ID NOs:1-33和54是侧接且包含用于设计SoySNP8K BeadChip上的测定和/或用于KASP^TM基因分型的SNP的序列。

SEQ ID NOs:34-53和55-60是针对作图在7号染色体上的SSR标记的正向引物和反向引物。

具体实施方式

本发明主题提供了用于鉴定和选择具有增加的PRSR抗性的大豆植物的方法。提供以下定义作为帮助理解本文公开的主题。

定义

术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸序列中的一个。当等位基因与其连锁并且等位基因的存在是指示期望性状或性状将在包含该等位基因的植物中发生的指示物时，等位基因“与”该形状相关联。

“回交”是指用于将核酸序列引入植物中的过程。回交技术已经被广泛使用了数十年来将新的性状引入到植物中。Jensen,N.编Plant Breeding Methodology,John Wiley &Sons,Inc.,1988。在一个典型的回交方案中，感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带待转移的感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后将从该杂交得到的子代再次与轮回亲本杂交，并且重复该过程直至获得下述植物，其中除了自轮回亲本转移的基因之外，基本上所有期望的形态学和生理学特性在经转化的植物中重新获得。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。一个cM等于由于单代交叉在一个遗传基因座处的标记将与在第二基因座处的标记分离的1％概率。

“染色体区间”表示植物体内存在于单个染色体上的基因组DNA的连续线性跨度。位于单个染色体区间上的遗传元件或基因是物理连锁的。染色体区间的大小没有特别的限制。在一些方面，位于单个染色体区间内的遗传元件是遗传连锁的，通常具有例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM的遗传重组距离。也就是说，单个染色体区间内的两个遗传元件以小于或等于20％或10％的频率进行重组。

术语“染色体区间”表示由本公开主题中提出的任何标记限定的任何和全部区间。提供了与PRSR抗性增加相关的染色体区间。位于7号染色体上的该区间包含并且侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C。染色体区间BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的子区间是BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1。

术语“互补序列”是指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即通过碱基配对规则而相关的序列。

术语“连续的DNA”是指重叠的连续遗传片段。

术语“杂交的”意指通过授粉使配子融合以产生子代(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一种植物由另一种植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植物时)。术语“杂交”是指通过授粉将配子融合以产生子代的行为。

“有利等位基因”是特定基因座处的等位基因，其赋予或有助于所需表型，例如增加的PRSR抗性，或者是允许鉴定具有减小的PRSR抗性的植物的等位基因，这些植物可以从育种程序或播种(“反选择”)中去除。标记的有利等位基因是与有利表型分离，或者与不利植物表型分离，因此提供了鉴定植物的益处的标记等位基因。

“遗传图谱”是描述给定物种内的一个或多个染色体(或染色体)上的基因座之间的遗传连锁关系，通常以图表或表格形式描述。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离通过它们之间的重组频率来测量，并且可以使用多种分子遗传标记(也称为“分子标记”、“遗传标记”或简称“标记”)来检测基因座之间的重组。遗传图谱是作图群体、所用标记的类型以及不同群体之间每个标记的多态性潜力的产物。基因座之间的顺序和遗传距离可以在遗传图谱之间是不同的。然而，诸如标记位置和顺序的信息可以通过使用在SoyBase网站上公众可得的大豆参考基因组(例如像Glyma1.1)确定感兴趣的染色体上的标记的物理位置而在图谱之间相关联。本领域的普通技术人员可以使用公众可得的基因组浏览器来确定染色体上标记的物理位置。

术语“遗传标记”应是指任何类型的基于核酸的标记，包括但不限于：限制性片断长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey,1993,Trends in Genetics 9:275-280)、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人,1995,Nucleic Acids Res.23:4407-4414)、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes,1999,Gene 234:177-186)、序列特异性扩增区(SCAR)(Pecan和Michelmore,1993,Theor.Appl.Genet,85:985-993)、序列标签位点(STS)(Onozaki等人2004,Euphytica138:255-262)、单链构象多态性(Orita等人,1989,Proc Natl Aced Sci USA 86:2766-2770)。简单序列重复区间(ISR)(Blair等人1999,Theor.Appl.Genet.98:780-792)、反转录转座子位点间扩增多态性(IRAP)、反转录转座子微卫星扩增多态性(REMAP)(Kalendar等人,1999,Theor.Appl.Genet 98:704-711)、RNA裂解产物(诸如Lynx标签)等等。

“基因重组频率”是两个遗传基因座之间的交叉事件(重组)的频率。重组频率可以通过追踪减数分裂后的标记和/或性状的分离来观察。

“基因组”是指由染色体或染色体组携带的总DNA或整套基因。

术语“基因型”是个体(或个体组)的一个或多个遗传基因座处的遗传组成，与可观察的性状(表型)相对照。基因型由个体从其父母遗传的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因限定。术语基因型可以用来指个体的单个基因座处的遗传组成，多个基因处的基因组成，或者更一般地，术语基因型可以用来指个体基因组中所有基因的遗传构成。

“种质”是指以下各项的或来自以下各项的遗传物质：个体(例如植物)、个体组(例如植物系、品种或家族)或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆。种质可以是生物体或细胞的一部分，或可以与生物体或细胞分开。一般而言，种质为具有特定分子构成的遗传物质，该分子构成为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传性质提供物理基础。如本文所用，种质包括可以由其生长出新植物的细胞、种子或组织，或植物部分，诸如可以培养成完整植物的叶、茎、花粉或细胞。

“单倍型”是个体的多个遗传基因座处的基因型，即等位基因的组合。典型地，由单倍型描述的遗传基因座在物理和遗传上是连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定基因座诸如单个标记基因座处的序列多态性，或在给定基因组中沿着染色体区段的多个基因座处的序列多态性。前者也可以被称为“标记单倍型”或“标记等位基因”，而后者可以被称为“长距离单倍型”。

术语“杂合的”是指其中不同等位基因位于同源染色体上对应基因座的遗传条件。

术语“纯合的”是指其中相同等位基因位于同源染色体上对应基因座的遗传条件。

“杂交”或“核酸杂交”是指互补RNA和DNA链的配对以及互补DNA单链的配对。

术语“杂交”意指在核酸链的互补区之间形成碱基对。

术语“渐渗”是指将遗传基因座的期望等位基因从一个遗传背景传递到另一个遗传背景。例如，渐渗的指定基因座处期望等位基因可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中期望等位基因。另选地，例如，等位基因的传递可以通过两个供体基因组之间的重组发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有期望等位基因。期望等位基因可以是例如标记所选择的等位基因、数量性状基因座(QTL)、转基因等。在任何情况下，包含期望等位基因的后代可重复与具有期望遗传背景的品系的回交并针对期望等位基因进行选择，以使等位基因在选择的遗传背景中固定。例如，本文所述的7号染色体基因座可以基因渗入到易感PRSR的轮回亲本中。具有渐渗基因或基因座的轮回亲本系具有增加的PRSR抗性。

如本文所用，术语“连锁”或“连锁的”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或一些其他基因座(例如PRSR基因座)相关联的程度。分子标记与表型之间的连锁关系以“概率”或“可变概率”给出。连锁可以表示为期望的界限或范围。例如，在一些实施方案中，当标记相隔少于50、40、30、25、20或15个图单位(cM)时，任何标记(在遗传上和物理上)与任何其他标记物连锁。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如，在10与20cM之间，在10与30cM之间，或在10与40cM之间。标记与第二基因座连锁越紧密，则标记对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”诸如标记基因座和第二基因座显示出10％或更小，优选约9％或更小、还更优选约8％或更小、又更优选约7％或更小、还更优选约6％或更小、又更优选约5％或更小、还更优选约4％或更小、又更优选约3％或更小并且还更优选约2％或更小的基因座内重组频率。在非常优选的实施方案中，相关基因座显示出约1％或更小，例如约0.75％或更小，更优选约0.5％或更小，或又更优选约0.25％或更小的重组频率。定位于同一染色体并且处于使得两个基因座之间的重组以小于10(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5、0.25％或更小)的频率发生的距离下的两个基因座也被认为是彼此“接近”的。因为一个cM是显示1％重组频率的两个标记之间的距离，所以任何标记与例如以10cM或小于10cM的距离紧密接近的任何其他标记是紧密连锁的(在遗传上和物理上)。在同一染色体上的两个紧密连锁的标记可以彼此定位于9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更小。

术语“连锁不平衡”是指两者的遗传基因座或性状的非随机分离)。在任一种情况下，连锁不平衡意味着相关基因座在沿着染色体长度的足够物理接近度内，以便它们以大于随机(即非随机)频率的方式一起分离(在共分离性状的情况下，为性状基础的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50％的情况下，例如在约51％至约100％的情况下共分离。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％的重组频率(并且根据定义，在同一染色体上相隔小于50cM)。如本文所用，连锁可以在两个标记之间，或者在标记与表型之间。标记基因座可与性状例如增加的PRSR抗性“相关联”(连锁)。例如以分子标记与表型共分离的统计学概率的形式测量分子标记与表型性状的连锁程度。

连锁不平衡最常见地用量度²评估，它使用由Hill,W.G.and Robertson,A,TheorAppl.Genet 38:226-231(1988)所述的公式来计算。当r²＝1时，两个标记基因座之间存在完整的LD，这意味着标记并未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r²高于1/3的值表明足够强的LD可用于作图(Ardlie等人,Nature Reviews Genetics 3:299-309(2002))。因此，当成对标记基因座之间的r²值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。

如本文所用，“连锁平衡”描述两个标记独立分离，即随机分在子代中的情况。认为显示连锁平衡的标记是不连锁的(无论它们是否位于同一染色体上)。

“优势对数(LOD)值”或“LOD评分”(Risch,Science 255:803-804(1992))用于区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记之间的LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。

“基因座”和“标记基因座”在本文中可互换使用，并且意指基因和/或标记所在的染色体上的位置。

如本文所用，术语“作图群体”可以是指用于基因作图的植物群体。作图群体通常从亲本基因型的受控杂交获得。对用于发展作图群体的亲本和交配设计的选择决策以及所用标记的类型取决于待作图的基因、标记的可用性和分子图谱。作图群体内的植物亲本在核酸序列和表型水平上都必须具有足够的一个或多个感兴趣性状的变异。使用亲本核酸序列的变异来追踪作图群体植物中的重组事件。信息性多态标记的可用性取决于核酸序列变异的量。

“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码的产物(例如蛋白质)。为了使标记在检测重组中有用，它们需要检测被监测的群体内的差异或多态性。对于分子标记，这意指由于多核苷酸序列差异而在DNA水平上的差异(例如SSR、RFLP、FLP、SNP)。基因组变异性可以是任何来源的，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座元件的存在和序列。分子标记可以来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可以是指用作探针或能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段的引物对的核酸。大量的大豆分子标记是本领域已知的，并且是公开的或可从各种来源诸如SoyBase互联网资源获得。

对应于群体成员之间的遗传多态性的标记可以通过本领域中已充分建立的方法检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性(RFLP)检测、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。也已知已充分建立的方法用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以是指群体中位于标记基因座处的多个多态性核苷酸序列中一个，它对于标记基因座而言是多态性的。

“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择表型的方法。

“标记辅助反选”是将标记基因型用于鉴定将不被选择的植物，使得它们被从育种程序或种植中去除的方法。

“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位置，其中可存在特定标记。标记基因座可用于追踪第二连锁基因座，例如编码或有助于表型性状表达的连锁基因座的存在。例如，标记基因座可用于监测等位基因在某一基因座，诸如QTL或单基因处的分离，这些等位基因与标记基因座在遗传或物理上连锁。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交来鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。包含标记基因座的30个或更多个连续核苷酸(标记基因座序列的“全部或一部分”)的标记探针可用于核酸杂交。另选地，在一些方面，标记探针是指能够区别(即基因分型)存在于标记基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所定义，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或用作参考点的其编码产物(例如，蛋白质)。标记可来源于基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也是指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，诸如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。另选地，在一些方面，标记探针是指能够区别(即基因分型)存在于标记基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中例如根据Watson-Crick碱基配对原则特异性“杂交”时，核酸是“互补的”。本文所述的一些标记当位于插入缺失区诸如本文所述的非共线区时也称为杂交标记。这是因为插入区根据定义是相对无插入序列的植物的多态性。因此，所述标记仅需要指示插入缺失区是否存在。任何合适的标记检测技术可用于鉴定这种杂交标记，例如在本文提供的实例中使用SNP技术。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并且是指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，并且由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基组成。核苷酸(通常以其5'-单磷酸形式存在)通过它们下述的单字母命名法来引用：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸。“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸。“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，并且“N”指任何核苷酸。

术语“表型”或“表型性状”或“性状”是指生物体的一个或多个性状。表型可用肉眼或通过本领域已知的任何其他评价手段，例如显微镜法、生物化学分析、或机电测定法观察到。在一些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可鉴定的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而，与遗传图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的或重叠的连续遗传片段)并且不基于遗传重组。

“植物”可以为整棵植物、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可是指以下各项中的任何一种：整棵植物、植物部分或器官(例如叶片、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或子代的相同材料。植物细胞是植物的细胞，其或者直接取自植物，或者来源于取自植物的细胞的培养物。

“多态性”是DNA中的变型，其过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在群体中必须具有至少1％的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性，所述插入/缺失多态性本文也称为“插入缺失”。

“概率值”或“p-值”是表型和特定标记等位基因存在或不存在的特定组合是否随机的统计学可能性。因此，概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在一些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是共分离的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。

术语“子代”是指从杂交生成的后代。

“子代植物”是从两棵植物间的杂交生成的。

“参考序列”是用作序列比较的基础的定义序列。参考序列通过以下方式获得：在基因座处基因分型多个品系、在序列比对程序(例如Sequencher)中比对核苷酸序列，然后获得比对的共有序列。

“单核苷酸多态性(SNP)”是在基因组(或其他共用序列)中的单个核苷酸—A、T、C或G—在生物物种成员个体中配对的染色体之间不同时出现的DNA序列变化。例如，来自不同个体的两个测序的DNA片段AAGCCTA至AAGCTTA含有单个核苷酸的差异。

术语“大豆植物”包括：整个大豆(soybean)(大豆属(Glycine max))植物、大豆植物细胞、大豆植物原生质体、可再生大豆植物的大豆植物细胞或大豆组织培养物、大豆植物愈伤组织、以及大豆植物中完整的大豆植物细胞或大豆植物部分诸如大豆种子、大豆外壳、大豆花、大豆子叶、大豆叶片、大豆茎、大豆芽、大豆根、大豆根尖等。

短语“在严格条件下”是指下述条件，在该条件下通常在核酸复杂混合物中探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交但基本上不与其他序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。

较长的序列在较高温度下特异性杂交。通常，将严格条件选择为比限定离子强度pH下的特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列过量存在，所以在Tm下，平衡时50％探针被占据)，严格条件将是其中如下所述的那些：在pH 7.0至8.3时的盐浓度低于约1.0M钠离子、通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)而言是至少约30℃，而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)而言是至少约60℃。还可以通过加入去稳定剂诸如甲酰胺来实现严格条件。针对选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少两倍，优选地为背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件通常是：50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS，在42℃下孵育，或者5xSSC、1％SOS，在65℃下孵育，并在0.2xSSC以及0.1％SDS中在65℃下洗涤。针对PCR，低严格性扩增的温度通常为约36℃，但是退火温度可根据引物长度在约32℃与48℃之间变化。用于确定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。

序列比对和百分比同一性计算可使用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于

生物信息计算包的

程序(

Inc.,Madison,Wis.)。除非另行指出，否则本文提供的序列的多重比对使用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp,CABIOS.5:151-153(1989))采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行。用于成对序列比对和使用Clustal V方法计算蛋白序列百分比同一性的默认参数是KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗＝5并且对角线保存(DIAGONALSSAVED)＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗＝4，对角线保存＝4。在使用Clustal V程序进行序列比对后，通过观看相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性“和“趋异度”值；除非另行指出，否则本文提供的和权利要求保护的百分比同一性和趋异度是以该方式计算。

在详述本发明主题之前，应当理解本发明不受特定实施方案的限制。也应当理解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。除非上下文另外清楚地规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式的术语“一个/种”和“该/所述”也包括复数指代物。因此，例如对“植物”、“该植物”或“一棵植物”的引用也包括多棵植物。取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的子代。使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的许多拷贝。

基因作图

在相当一段时间内已经认识到可以对生物体基因组中与特定表型诸如增加的PRSR抗性相关的特定遗传基因座进行作图。有利的是，植物育种人员可使用分子标记通过鉴定标记等位基因来鉴定期望的个体，这些标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与感兴趣性状共分离的分子标记或分子标记簇，育种人员能够通过选择合适的分子标记等位基因迅速选择期望的表型(一种称为标记辅助选择或“MAS”的方法)。

本领域熟知的多种方法可用于检测与感兴趣性状诸如增加的PRSR抗性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测针对具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，在标记基因座之间比较供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，该一个或多个标记与基因型差异具有最大的关联性。

用于检测感兴趣基因座的两种此类方法是：1)基于群体的关联性分析和2)传统的连锁分析。在基于群体的关联性分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有群体中获取品系。基于群体的关联性分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和以下观点：在非结构化的群体中，在如此多代随机交配之后，仅有控制感兴趣性状的基因与与那些基因紧密连锁的标记之间的相关性得以保留。实际上，大多数已有群体具有群体亚结构。因此，通过把个体分配到群体中、利用得自随机分布于基因组的标记的数据，使用结构关联方法有助于控制群体结构，从而最小化由于单个群体(也称为亚群体)内的群体结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座处的基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联性指示标记基因座与涉及该性状表达的一个或多个遗传基因座之间极为接近。

传统的连锁分析基于相同原理；然而，LD通过从少量创始者产生群体生成。选择创始者以最大化结构化群体内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联性。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein,Genetics 121:185-199(1989)，其中测试沿遗传图谱(例如以1cM为区间隔)的许多位置中的每一个位置的控制感兴趣性状的基因位于该位置的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位置的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分超过阈值时，存在控制感兴趣性状的基因在遗传图谱上的该位置的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。

与PRSR抗性相关联的标记

本文鉴定了与PRSR抗性相关联的标记。该方法涉及检测与大豆植物种质中的抗性增强相关联的至少一个标记等位基因的存在。标记基因座可选自表6中提供的任一种标记基因座，包括BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A和InDel_1，以及与这些标记连锁的任何其他标记(连锁的标记可从公众可得的SoyBase资源确定)。标记基因座可选自表6中提供的任一种标记基因座，包括BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C，以及与该标记连锁的任何其他标记(连锁的标记可从SoyBase资源确定)。

位于单个染色体上的基因组DNA的连续线性跨度上的遗传元件或基因是物理上连锁的。均与PRSR抗性高度相关联的BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C划定了PRSR抗性基因座。装配成介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA的任何多核苷酸可容纳与PRSR抗性相关联的标记基因座：SEQ ID NO:6(针对BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T的SNP源序列)和SEQ ID NO:24(针对BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的SNP源序列)。

位于单个染色体上的基因组DNA的连续线性跨度上的遗传元件或基因在BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的子区间上是物理上连锁的。均与PRSR抗性高度相关联的BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1划定了PRSR抗性基因座。装配成介于以下序列之间并包括以下序列的连续DNA的任何多核苷酸可容纳与PRSR抗性相关联的标记基因座：SEQ ID NO:43(针对BARCSOYSSR_07_0295的正向引物序列)和SEQ ID NO:58(针对InDel_1的反向引物序列)。

连锁的常见量度是性状共分离的频率。其可以表示为共分离百分比(重组频率)，或以厘摩(cM)表示。cM是遗传重组频率的量度单位。一个cM等于由于单代交叉在一个遗传基因座处的性状将与在另一个基因座处的性状分离的1％概率(意味着性状99％的情况下一起分离)。因为染色体距离与性状间交叉事件的频率大约成比例，所以存在与重组频率相关的近似物理距离。

标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过追踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，一个cM等于由于单代交叉标记基因座将与另一个基因座分离的1％概率。

与表4中列出的标记连锁的其他标记可用于预测大豆植物的PRSR抗性。该标记包括在BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的小于50cM(例如约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更小)内的任何标记，这些标记与PRSR抗性相关联。标记与控制感兴趣性状的基因越靠近，该标记就越更有效和更有利地成为期望性状的指示物。紧密连锁的基因座显示出约10％或更小，优选约9％或更小、还更优选约8％或更小、又更优选约7％或更小、还更优选约6％或更小、又更优选约5％或更小、还更优选约4％或更小、又更优选约3％或更小并且还更优选约2％或更小的基因座内交叉频率。在非常优选的实施方案中，相关基因座(例如，标记基因座和靶基因座)显示出约1％或更小，例如约0.75％或更小，更优选约0.5％或更小，或又更优选约0.25％或更小的重组频率。因此，基因座相隔约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更小。换句话说，定位于同一染色体并且处于使得两个基因座之间的重组以小于10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5、0.25％或更小)的频率发生的距离下的两个基因座被认为是彼此“接近”的。

尽管特定标记等位基因可显示与增加的PRSR抗性共分离，但是重要的是注意标记基因座不一定负责表达PRSR抗性表型。例如，不需要标记多核苷酸序列是赋予增加的PRSR抗性的基因部分(例如，基因开放阅读框部分)。特定标记等位基因与增加的PRSR抗性表型之间的关联性归因于标记等位基因与等位基因所来源的祖先大豆品系中的等位基因之间的初始“相引”连锁相。最后，通过反复重组，标记与遗传基因座之间的交叉事件可改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于用于制备分离种群的耐受性亲本中的连锁相发生改变。这不改变可使用标记监测表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。

术语“染色体区间”表示由本公开中提出的任何标记限定的任何和全部区间。提供了与PRSR抗性相关的染色体区间。位于7号染色体上的该区间包含并且侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C。染色体区间BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的子区间是BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1。

本领域中熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。划定此类染色体区间的边界以包含将与控制感兴趣性状的基因连锁的标记。换句话说，划定染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作PRSR抗性标记。上文所述的区间包含与PRSR抗性共分离的标记簇。标记的簇集发生在染色体的相对较小结构域中，这表明控制感兴趣性状的基因在这些染色体区中的存在。划定该区间以包含与PRSR抗性共分离的标记。该区间包含作图在该区间的标记以及限定末端的标记。例如，基于Glyma2.0参考基因组相隔368,797bp的区间BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C，其限定了包含与PRSR抗性共分离的标记簇的染色体区间。第二实例包括基于Glyma2.0参考基因组相隔61,874bp的子区间BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1，其限定了包含与PRSR抗性共分离的标记簇的染色体区间。通过限定区间端点的末端标记所述的区间包括末端标记和定位于该染色体结构域内的任何标记，无论这些标记是否是当前已知或未知的。

染色体区间还可以通过与感兴趣标记连锁(显示与感兴趣标记的连锁不平衡)的标记限定，并且是关联性研究背景下的连锁不平衡(LD)的常见量度。如果位于BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的区间、BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的子区间或BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的任何其他子区间内的任何7号染色体标记基因座与具有与增加的PRSR抗性相关联的等位基因的那个区间内的所鉴定标记之间的LD的r²值大于1/3(Ardlie等人Nature Reviews Genetics 3:299-309(2002))，则基因座是连锁的。

本文公开的主题的标记也可以是标记基因座处的等位基因的组合，或者称为单倍型。技术人员将期望可能存在附加的多态性位点，这些位点位于本文鉴定的7号染色体标记中的及其周围的标记基因座上处，其中一个或多个多态性位点与与增加的PRSR抗性相关联的等位基因连锁不平衡(LD)。如果在一个位点处存在等位基因易于预测同一染色体上的其他位点处存在等位基因，则在不同多态性位点处的两个特定等位基因据称是LD((Stevens,Mol.Diag.4:309-17(1999))。

标记辅助选择

分子标记可用于多种植物育种应用中(例如参见Staub等人(1996)Hortscience729-741；Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1:3-8)。感兴趣的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和渐渗基因的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了选择植物群体中的性状的有用工具。在表型难以测定的情况下(例如许多抗病害性状)或者在植物发育晚期阶段发生的情况下(例如种子特性)尤其如此。因为DNA标记测定更省力并且占用的物理空间比田间表型更少，所以可测定大得多的群体，增加了找到靶区段从供体品系转移到受体品系的重组的概率。连锁越紧密，标记越有用，因为重组在标记与引起性状的基因之间发生的可能性较小，这可导致假阳性。具有侧接标记降低了假阳性选择将发生的概率，因为这将需要双重组事件。理想的情况是基因自身具有一个标记以便在标记与基因之间不能发生重组。此类标记称为‘完美标记’。

当基因通过MAS渐渗时，不仅引入基因而且引入侧接区(Gepts.(2002).Crop Sci；42:1780-1790)。这将称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物高度不相关的情况下，这些侧接区携带可能编码农学上不可取性状的附加基因。这种“连锁累赘”甚至在多轮回交到优良大豆品系后也可能导致产量降低或其他不良农学特性。有时这也称为“产量累赘”。侧接区的大小可通过附加的回交减小，但是这不总是成功的，因为育种人员无法控制该区或重组断点的大小(Young等人,(1998)Genetics 120:579-585)。在经典的育种中，这通常仅仅是偶然现象：选择的重组有助于减小供体区段的大小(Tanksley等人(1989).Biotechnology 7:257-264)。甚至在20轮这种类型的回交后，技术人员可期望找到仍与选择基因连锁的供体染色体的相当大的片段。然而关于标记，选择那些在感兴趣基因附近经历过重组的罕见个体是可能的。在150个回交植物中，基于单一减数分裂图谱距离，至少一棵植物将已经历过基因1cM内的交叉的概率为95％。标记将允许这些个体的明确鉴定。在一次附加回交的300棵植物中，在该基因另一侧的1cM单一减数分裂图谱距离内发生交叉的概率将为95％，生成了围绕基于单一减数分裂图谱距离小于2cM的靶基因的区段。使用标记这可在两代中完成，而不使用标记它将需要平均100代来完成(参见Tanksley等人，同上)。当已知基因的确切位置时，可利用围绕该基因的侧接标记选择不同群体大小的重组。例如，在较小的群体大小中，可预料重组离该基因更远，这样将需要较多的远端侧接标记来检测重组。

大豆参考基因组和含增加密度的公开大豆标记的大豆基因组的整合连锁图谱的可用性促进了大豆基因作图和MAS。参见，例如，组装Glyma1.1和Glyma2.0和比较性大豆属Consensus 4.0，它们可在SoyBase网站上在线获取。

MAS具体实施的关键部分为：⑴限定群体，在该群体内将确定标记-性状关联性，该群体可以是分离群体、或随机或结构化群体；(ii)监测多态性标记相对于性状的分离或关联，并且使用统计方法确定连锁或关联；(iii)基于统计分析的结果限定一组所期望的标记，以及(iv)将该信息用于和/或外推至当前育种种质组，以使基于标记的选择决策得以作出。在本公开中描述的标记以及其他标记类型诸如FLP可用于标记辅助选择方案。

可将SSR定义为长度为6bp或更小的串联重复DNA的相对短的片段(Tautz(1989)Nucleic Acid Research 17:6463-6471；Wang等人(1994)Theoretical and AppliedGenetics,88:1-6)多态性由多个重复单位的变异引起，可能由DNA复制期间的滑移引起(Levinson和Gutman(1987)Mol Biol Evol 4:203-221)。重复长度中的变异可通过设计保守非重复侧接区的PCR引物进行检测(Weber和May(1989)Am J Hum Genet.44:388-396)，SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的并适于高通量自动化(Rafalski等人(1996)Generating and using DNA markers in plants.In Non-mammalian genomic analysis:a practical guide.Academic Press,第75-135页)。

可生成多种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征图可通过扩增产物的凝胶电泳获得。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由位于Saint-Jean-sur-Richelieu,Quebec,Canada依据合同规定向公众提供大豆的SSR服务。

也可生成多种类型的FLP标记。最常见的是，使用扩增引物来生成片段长度多态性。此类FLP标记在许多方面类似于SSR标记，不同的是通过引物扩增的区通常不是高度重复的区。此外，扩增区或扩增子在种质中将具有足够的可变性，这通常是由于插入或缺失，使得由扩增引物生成的片段可在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失在大豆中频繁发生(Bhattramakki等人(2002).Plant Mol Biol 48,539-547；Rafalski(2002b)，同上文)。

SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在全部分子标记类型中，SNP是最丰富的，因此具有提供最高的遗传图谱分辨率的潜力(Bhattramakki等人2002 Plant MolecularBiology 48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平下以所谓的“超高通量”方式进行测定，因为它们不需要大量DNA并且测定的自动化可为直接的。SNP也具有成为相对低成本系统的前景。这三个因素一起使得SNP在MAS中的应用具有高度吸引力。若干种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶酶解、微测序和编码球。此类方法已在以下文献中综述：Gut(2001)Hum Mutat 17第475-492页:Shi(2001)ClinChem 47,第164-172页；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1,第95-100页:Bhattramakki和Rafalski(2001)Discovery and application of single nucleotide polymorphismmarkers in plants.In:R,J Henry编,Plant Genotyping:The DNAFingerprinting ofPlants,CABI Publishing,VVallingford。宽范围的可商购获得的技术利用这些方法和其他方法询问SNP，包括Masscode^TM.(Qiagen)、

(Third Wave Technologies)、

(Applied Biosystems)、

(Applied Biosystems)和Beadarrays^TM(Illumina)。

许多一起在单条序列内、或跨越连锁序列的SNP可用于描述任何特定基因型的单倍型(Ching等人(2002),BMC Genet.3:19；Gupta等人2001；Rafalski(2002b),PlantScience 162:329-333)。单倍型可提供比单个SNP更多的信息并且可更多地描述任何特定的基因型。例如单个SNP可为特定品系的等位基因“T”或具有增加的PRSR抗性的品种，但是等位基因“T”也可发生在轮回亲本利用的大豆育种群体中。在这种情况下，单倍型例如位于连锁SNP标记处的等位基因组合可提供更多的信息。一旦已经将独特的单倍型分配给供体染色体区，该单倍型可在那个群体或其任何亚群中使用以测定个体是否具有特定基因。参见例如WO2003054229。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标记检测平台使得这种方法高效并有效。

表6中列出的标记的序列可容易地用于获得本公开中所述的染色体区间内的另外的多态性SNP(和其他标记)。在所述图谱区内的标记可杂交到细菌人工染色体(BAC)或其他基因组文库上或与基因组序列进行电子比对以找到在与所述标记相同的近似位置上的新序列。

除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其他类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA(RAPD)和其他基于核酸的标记。

在一些情况下，同功酶特征图和连锁的形态学特征也可间接用作标记物。尽管它们不直接检测DNA差异，但是它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测DNA变异的标记远远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性(Tanksley(1983)Plant MolecularBiology Reporter 1:3-8)。

序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新序列接近本文所述的标记，然后被用于发现并开发功能上等同的标记。例如，将不同的物理和/或遗传图谱进行比对以定位未在所述公开中描述但位于相似区内的等同标记。这些图谱可在大豆物种内，或者甚至在已经与大豆在遗传或物理上进行比对的其他物种内，诸如绿豆、豇豆或普通菜豆。

一般来讲，MAS使用已被鉴定为具有与PRSR抗性共分离的显著概率的多态性标记。推测此类标记在图谱上接近产生植物PRSR抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示物或标记。测试植物是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座处包含期望基因型的植物将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。用于鉴定具有增加的抗性的大豆植物的手段是通过鉴定在本文所述的任何一个标记基因座处具有特定等位基因的植物，这些标记基因座包括BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C。

本文呈现的区间可用于MAS中，以选择展示出增加的PRSR抗性的植物。在由BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C限定并包含它们的7号染色体区间内作图的任何标记可用于此目的。此外，包含由BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C限定并包含它们的7号染色体区间内的一个或多个标记基因座处的等位基因的单倍型可用于向大豆品系或品种引入增加的PRSR抗性。与和增加的PRSR抗性相关联的等位基因连锁不平衡的任何等位基因或单倍型可用于MAS中，以选择具有增加的PRSR抗性的植物。

Rps11的基础候选基因

开发分子标记来进行疫霉抗性基因分型以支持育种程序除其他益处之外还提供：节约成本和时间；早期选择期望的子代；以及更准确和快速地商业化抗疫霉大豆品种。对于商业植物育种者，可在不同群体中筛选的高质量遗传标记的可用性是足够的。然而，鉴定疫霉抗性表型性状的基础的一个或多个负责基因及其等位基因变型和作用方式提供另外的益处。鉴定为表型性状基础或与表型性状相关联的一个或多个负责基因可克服使用与主要基因或QTL相关联的分子标记的标记辅助育种的限制。例如，在一个群体中鉴定的与QTL或感兴趣基因连锁的分子标记可能不是多态性的或在来自不同的遗传来源的育种材料中不是紧密连锁的。本文呈现了可能描述的新型Rps11抗性表型的基础候选基因。

实施例

提供以下实施例来说明，但并非限制所附权利要求。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实施例1：大豆疫霉的植物材料和分离物

从USDA-ARS大豆库选择据称赋予PRSR的总共204个大豆品系以用于初始评价。在第一轮筛选之后，鉴定出携带对17号生理小种和25号生理小种的抗性的总共72个品系。迄今对17号生理小种和25号生理小种的抗性在报道的单一Rps基因中是稀有的，并且因此这些品系被选择为对多生理小种抗性是有前景的。将72个品系进一步缩窄至23个品系，这23个品系在与另外的大豆疫霉分离物一起孵育之后显示出广谱PRSR。在进一步分析之后，植物引种(PI)594527被鉴定为有前景的抗性品系，这是由于其对大豆疫霉的强且广谱的抗性。

作图群体由来源于易感栽培品种“Williams”与由发明人鉴定的抗性品系PI594527之间的杂交的58个F2个体和209个F2:3家系组成。PI 594527是由USDA大豆种质库保持且由中国福建捐献的大豆品系。PI 594527由USDA报道为赋予对包括1号生理小种、3号生理小种、7号生理小种和25号生理小种的多种大豆疫霉分离物的强劲抗性，但是该抗性的遗传来源先前是未知的。使F1植物自授粉以在温室中生成F2群体。将少量的F2种子保存用于初始分析，而使剩余部分在田间自授粉以培育F2:3作图家系用于表型和基因型评价。

在所有接种实验中使用一组大豆鉴别品作为标准对照以确保分离物完成适当的感染(Lin等人2013)。这些鉴别检查是Union(Rps1-a)、Harosoy 13xx(Rps1-b)、Williams79(Rps1-c)、PI 103091(Rps1-d)、Williams82(Rps1-k)、L76-1988(Rps2)、L83-570(Rps3-a)、PRx146-36(Rps3-b)、PRx145-48(Rps3-c)、L85-2352(Rps4)、L85-3059(Rps5)、Harosoy62xx(Rps6)、Harosoy(Rps7)、PI 399073(Rps8)和易感栽培品种(rps)。

首先使用具有不同毒力的总共八个大豆疫霉分离物来评价大豆品系PI 594527的抗性。这些分离物是ISA19A-1、ISA71D-1、ISA33O-8、124C-1(1号生理小种)、pmg(10)-1(10号生理小种)、pmg(13)-1(13号生理小种)、pmg(17)-1(17号生理小种)、pmg(25)-1(25号生理小种)以及96-13S-106A(28号生理小种)。对于集群分离分析(bulk segregationanalysis)和基因作图，使用大豆疫霉的分离物124C-1(1号生理小种)来获得F2个体和F2:3家系的表型数据。将分离物保持在利马豆琼脂(LBA)培养基(150g/L利马豆，2％琼脂)上。

因为PI 594527对大豆疫霉具有强且广谱的抗性，所以PI 594527被鉴定为有前景的抗性品系，所述大豆疫霉包括1号生理小种、10号生理小种、13号生理小种、17号生理小种、25号生理小种、28号生理小种以及致病型不符合任何已知生理小种命名的其他三个分离物(表1)。

表1.针对于大豆疫霉的不同分离物的相互作用对大豆品系PI 594527的评价。

*获自USDA-ARS大豆库数据库的信息

实施例2：疾病接种和评价

在所有实验中都采用改良的下胚轴接种技术用于疾病接种(Dorrance等人2008)。简而言之，将种子在平均温度为25℃的温室中播种和生长。在播种的第7天，将来自在1/2LBA上生长的14日龄培养物的菌丝体浆液注射到幼苗的下胚轴中(子叶下约1cm)。接种后，用塑料盖盖住幼苗超过12小时，以在感染期间确保的高相对湿度(不受直射的阳光)。将盖子移除，并且在评价之前使疾病发展5-7天(最多10天)。

如果幼苗存活而没有扩大病变，则将反应记录为抗性的，或者如果幼苗死亡并伴有棕色下胚轴则将反应记录为具有易感的。对于每个F2:3家系，对12-36个子代进行评分。从数据分析中去除少于12株幼苗的任何家系。如果超过80％的子代存活，则将该家系归类为纯合抗性(R)的；如果少于20％的幼苗存活则将该家系归类为纯合易感(S)的；或者如果21％-79％没有死亡则将该家系归类为分离(Rs)的(Gordon等人2006；Zhang等人2013)。

使用分离物1号生理小种测试来自PI 594527杂交的个体F2子代以及易感栽培品种“Williams”，所述1号生理小种对于大多数Rps基因是无毒的。在58个F2后代中，45个具有抗性，并且13个具有易感性。分离比例45:13与孟德尔比率3:1吻合(χ2＝0.21，p＝0.65)(表2)。为了获得F2子代的更精确表型结果和杂合抗性信息，由此我们将其余的F2群体行进至F2:3代，随后对来自每个F2植物的～12-36株F3幼苗进行评分。在F2:3作图群体中进一步研究了分离比率。观察到的R(纯合抗性):Rs(分离):S(纯合易感)之比为59:102:48，这也与预期比率1:2:1吻合(χ2＝1.28，p＝0.53)。所有这些结果表明PI 594527中对1号生理小种的抗性由单一显性新型抗性基因控制，本发明人将所述抗性基因命名为Rps11。

实施例3：样品收集和DNA分离

将幼叶组织收集在温室中并保持在冰上，直到在使用前保存在液氮中或储存在-80℃冷冻机中。对于F2:3家系，从大约12-20株F3幼苗收集等量叶组织的混合物。这些混合物在一定程度上代表了每个F2祖代植物。使用进行稍作修改的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法提取基因组DNA(Allen等人2006)。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(ThermoFisher Scientific Inc.,Wilmington,DE)测定DNA浓度。将最终的DNA浓度调整到50ng/ul。

实施例4：与SNP基因分型相结合的集群分离分析

为了快速鉴定与Rps表型相关联的基因座的位置，将集群分离分析(BSA)方法应用于F2分离群体(Michelmore等人1991)。基于接种结果，通过汇集10个抗性或10个易感F2个体的等量DNA样品形成抗性池和易感池。对于SNP基因分型也包括抗性亲本品系和易感亲本品系。使用SoySNP8K BeadChip通过Illumina iScan平台(Illumina,Inc.San Diego,CA)在密歇根州立大学(Michigan State University)进行SNP基因分型。Song描述了详细的Infinium II测定方案(Song等2013)。使用GenomeStudio基因分型模块v1.8.4(Illumina,Inc.San Diego,CA)调用SNP等位基因。

实施例5：SSR标记和PCR分析

SSR引物获自Song(Song等人2010)，并且然后由Integrated DNA Technologies,Inc(Coralville,IA)合成。将两个亲本品系之间的多态性SSR标记用于实验中。根据进行稍作修改的Ping等人2014年进行PCR扩增。简而言之，每个PCR反应包含100ng模板DNA、10×PCR缓冲液(2.5mM Mg2+)、0.2mM dNTP、0.2μM正向引物和反向引物以及1.0U Taq DNA聚合酶，总体积为20μl。将反应在MyCycler热循环仪(Bio-Rad Lab,Hercules,CA)上进行，包括在95℃下初始变性3分钟，然后是35个循环，95℃30秒，55～60℃30秒和72℃30秒，最后在72℃下延伸10min。将PCR产物与6×上样缓冲液混合，并通过用溴化乙锭染色的4％琼脂糖凝胶(DOT Scientific Inc.,Burton,MI)分离，然后在Molecular Imager Gel Doc XR系统(Bio-Rad Lab,Hercules,CA)上可视化。然后根据凝胶图像对SSR条带进行人工评分。

实施例6：数据分析和连锁图谱构建

使用SPSS 22.0软件(SPSS,Chicago,USA)进行卡方(χ2)分析以测试表型数据和基因型数据与预期的孟德尔比率的拟合优度，其中显著性阈值P＝0.05。将显示出与预期的孟德尔比率的显著偏分离的标记排除在作图构建之外。使用Joinmap 4.1软件(Van Ooijen2011)构建遗传连锁图谱。连锁群是使用3.0的优势对数(LOD)阈值确定的。

在两个亲本品系之间鉴定出总共2588个SNP，随机分布在20个染色体中。基于单基因遗传假设，对于从易感性“Williams”遗传的易感性等位基因来说，预期在易感F2池中检测到的基因及其侧接区的SNP是纯合的，而其他区应该是杂合的，因为两个等位基因均可以接收自亲本。然而，由于纯合抗性和杂合抗性F2子代存在于DNA汇聚物中，所以抗性F2池的SNP应该总是杂合的。因此，这两个池在靶区中在遗传上是不相似的，同时在所有其他区处是杂合的。使用这种方法，将染色体7上的从3Mb开始至8Mb的～5Mb总基因组区被鉴定为致病基因座的潜在位置(图1)。该区中鉴定的SNP示出在表2中。

为了更好地作图新型Rps11基因座，用来自杂交的209个F2:3家系进行连锁分析和基因作图。基于BSA结果，从初步作图区选择了14个随机分布的SSR引物(Song等人2010)。在作图群体的两个亲本之间鉴定出四个多态性SSR标记BARCSOYSSR_07_0223、BARCSOYSSR_07_0266、BARCSOYSSR_07_0278和BARCSOYSSR_07_0459。然后将这四个标记用于F2:3家系的基因型50。分别鉴定出9、2、0和14个重组体，这表明Rps11基因座在BARCSOYSSR_07_0223与BARCSOYSSR_07_0459之间并且与BARCSOYSSR_07_0266和BARCSOYSSR_07_0278连锁更紧密。初步分析也进一步证实了SNP-Chip分析的作图结果。

随后，选择在SSR_07_0223与SSR_07_0459之间的9个多态性SSR标记以对全部群体进行基因分型。来自209个F2:3家系的基因型数据的卡方分析揭示所有九个多态性标记符合预期的1:2:1分离比(表3)。因此，使用Joinmap 4.1软件(Van Ooijen 2011)构建由9个SSR标记和Rps11组成的遗传图谱。在这种方法中，将Rps基因座作图到根据Glyma1.1参考基因组的0.5cM区，跨越226kb，并且侧接SSR标记BARCSOYSSR_07_0286和BARCSOYSSR_07_0300(图2)。发现SSR标记BARCSOYSSR_07_0295与基因座共分离。

表2.在7号染色体上的PRSR抗性染色体间隔中鉴定的SNP标记。列出了亲本基因型以及易感池和抗性池。标记的物理位置基于Glyma1.1大豆参考图谱。

表3.在来源于PI 594527×Williams的F_2:3作图群体中对九种SSR标记的卡方(χ²)拟合优度测试。

^a“a”对于来自抗性PI 594527的标记等位基因是纯合的；“b”对于来自易感Williams的标记等位基因是纯合的；“h”对于来自两个亲本的标记等位基因是杂合的。

实施例7：精细作图Rps11QTL区和候选基因预测

精细作图群体由来源于Williams与PI594527之间的初始杂交的2640个F3个体组成。从田间的每个个体收集叶样品以使用标准十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法进行DNA分离。将大豆疫霉1号生理小种用于重组体的抗性评价。所有的接种工作使用由Lin等人(2013年)所述的标准下胚轴接种方法进行。如果超过80％的子代存活，则将F3:4家系认为是纯合抗性的；如果21％-79％存活，则是杂合抗性的；如果少于20％存活，则是易感的。

SSR标记BARCSOYSSR_07_0286和BARCSOYSSR_07_0300侧接7号染色体上的Rps11QTL，并且基于Glyma1.1参考基因组相隔225kb的物理距离(Ping等人,2015)。使用这些侧接标记扫描整个F3群体以鉴定重组体，从而鉴定出10个新的重组体。除了SSR标记之外，还开发了KASP^TM标记和插入/缺失(InDel)标记以对重组体进行基因分型。将Rps11作图到由SSR标记BARCSOYSSR_07_0295和InDel标记InDel_1限定的61kb区中(图3；表4)。在61kb区内，根据新的Glyma2.0参考基因组预测了五种基因模型(表5)。基于基因注释，Glyma.07G062900是唯一可编码含有NB-ARC结构域的抗病蛋白的基因。

表4.作图到7号染色体上348kb PRSR抗性区间的标记。列出了亲本的基因型。精细作图到61kb区间的标记用粗体和灰色阴影显示。标记的物理位置基于Glyma2.0大豆参考基因组。

表5.根据大豆参考基因组(Glyma2.0)的61kb作图区中的基因注释。

标记框架和用于标记辅助选择的用途

可以使用一组通用标记来建立用于鉴定染色体区间中的标记的框架。表4示出在7号染色体来源的遗传连锁图谱上相对于彼此位置一致的标记。SSR标记的物理位置通过对可在SoyBase网站上公众可得的大豆参考基因组Glyma1.1或Glyma2.0进行BLAST搜索来确定。

侧接感兴趣基因座、具有与该基因座上的有利等位基因连锁不平衡的等位基因的紧密连锁的标记可以有效地用于选择具有增加的PRSR抗性的子代植物。因此，本文所述的标记(诸如表6中列出的那些)以及在遗传或物理上作图到同一染色体区段的其他标记可用于选择具有增加的PRSR抗性的大豆植物。典型地，在侧接感兴趣基因座的区中将使用一组这些标记(例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个)。任选地，可以使用实际基因和/或基因座内的标记。

表6.7号染色体上PRSR抗性区间中的分子标记及其供体等位基因。染色体区间内的标记对于标记辅助选择是所需的。

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序列表

<110> Dow AgroSciences, LLC

Ma, Jianxin

Acharya, Ananta

Ping, Jieqing

Fitzgerald, Joshua

Zhang, Chunbao

Lin, Feng

Bai, Yonghe

Rehman, Maqsood

Crasta, Oswald

Aggarwal, Rajat

Acharya, Ananta

<120> 与大豆的疫霉根腐病相关联的遗传基因座

<130> 77970-US-NP

<160> 60

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 121

<212> DNA

<213>大豆

<400> 1

aatgggcgtg cacagttatc agttatcagt tatcattccc tattttgtag tcttaattgt 60

rgggtcagtt tcgtacctct ctagttacat gttaaaatca atcctctcta ctgtgttaca 120

c 121

<210> 2

<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 2

atatgtgaag gtgaatggaa tggtattggt tgttgtactt atgaggcacc agcagccaac 60

rtattcataa taacgtggag gatcagtgat aatatgaaac tcgagcctaa ggtgaatggt 120

t 121

<210> 3

<211> 121

<212> DNA

<213> x大豆

<400> 3

tggatgaacc aaacccattg aagcttctat catgcagtaa tatttccact aatcatcagt 60

rgaaggacaa gttttctcac tacaggcaca aactatgatt tttttccttc tgatttgatt 120

a 121

<210> 4

<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 4

attctcgaat ctttcctggg ccagcccatt gaggtttttc tttttggacc ggcccatatc 60

ycactatcac tccactcttc ctttctcttg ccctacctca gaaacccaca ctccaaaacc 120

a 121

<210> 5

<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 5

tagatttgaa ttgatataga tatatgggtg attattaatt aatatgccag ctcttaccca 60

yaaatagtct taattaaact aaaagaaaag gaaattaaga tctcattgta aaaataaaag 120

g 121

<210> 6

<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 6

tggggggtgg gaggttcttg gaaagataag tggttgctta ttcattatgc catctcgcat 60

ycctttttgg aggttttgat tggttgttgt acagacagga ctgacagccg aagaggttta 120

t 121

<210> 7

<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 7

tttatcattt gttttatatt tacatacttc gcctaactaa acgtatttaa aagaaatatg 60

ytaataattt aaaattataa tttgtaaatt aaaatctatt aattatttaa aagtgtgatt 120

a 121

<210> 8

<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 8

caagtggtgg caaagagtgg agatggggca acctgatgat tctttttagg acgtacgttt 60

ycccactcta gagtgtgtat gtgtttgctc gtgttgggag ttcaatagct gcaatcacta 120

c 121

<210> 9

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 9

tgtcaccatc taccggcatg ggaggcaaag aatccgcatc accttttacc ccatacattc 60

ycctcatggc ttctgagaaa gcaaaccttc actcaaacac aaatgaagag aaaatcaagc 120

t 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 10

gtagttttga acttttgata actacaattt cgctatcaat aaaagtgtat gccctttaat 60

yatagagcag tacttccctt tcttggttat caaaatggat ggtgataaat tgtcttattt 120

t 121

<210> 11

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 11

gcggcggcgg caaccctaaa attcgataca agcaagtaca cagtcgcagc tccttttata 60

rtgagcgttt tggttcaaat gctagtgcag aaacccaaaa cattcccaaa tttatttaat 120

t 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 12

catgccatgt tttttaaaaa catttaaaga aaaaataaat attaagcaga tggtatacga 60

kaaattattg tataatccca gatcaccatg gtattggtca atctaacaaa tgccaagttt 120

a 121

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<212> DNA

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aatcttacca ttttgcaatg tcataggctg ggatatatag tttttggtta tctaactaat 60

rcatatatta tgttattgct ttgaaggcat caaaggagat gaacaaaata catactgaat 120

t 121

<210> 14

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<212> DNA

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gatcggaggt gctcaacaag gttcgggtaa aggtgttgtt cgtggagttc ttgggctgcc 60

kggccgcctg gttggaggca tcttgggagg aagttcgact gatgctgctg caaatgcggg 120

a 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 15

acatttgttt cttatgtaca acagtgttac agtggcaaca agtatagaat ttaagatatt 60

ktgtaaaata cttaaacttt acttctctag gcctgtccgt agtgattttg cttaaaactt 120

t 121

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<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 16

aattctagat ttggaatgaa agggggcttg gaattttggt tgggcgtgtg gcacagatga 60

raaggatgtg tgcgacaaat catatagaac tgtgggacct aactggagtt gtacatgtgc 120

a 121

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<211> 121

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 17

cttctaacag cttgtctgtt ttgactgtac ctgcacacaa actttccatc ctctcgcaaa 60

rgaatactgt gaattcctcc aaggacggga aacttaaact ccctttgtag aaccttctca 120

g 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 18

tctcaaataa ccttatgcta aggaatccaa ccaccactaa ccgctaaata taattagaat 60

kattattcaa atagataata tttcttacat atatatcatt gctttagtga aatagtaagt 120

g 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 19

ctgttccagt atttcttgct gatatctgtg gatggggttg gatggttata taggtttccg 60

yggcgacaac aatatcatcg cagatatccc gaattttctt gacaaatctg atgcaaaggt 120

a 121

<210> 20

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 20

cagaatttat tttagagact agctatagca aggcttgtgg ctaagccagt taccttcctg 60

mgagtgaact tgagaaagta cagaggctag ctaaggtagg tattagtcta cctaaacctg 120

a 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 21

gaagacatta tcgggtccac tgtaaaatta attgtttgtt ctactattgt ggacaacaca 60

ractccattc tttcagcttg attttcttgt acagtgacta catctcttct cgaaataaaa 120

a 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 22

gcggtttgaa ggtggcggtg gtgaggtcct gtcttggtgt tctaggtatt ttgaaggaga 60

rgagaatggg gatggtgtag ctcttgccat gtggttgggg tttggcacga ggtcatgatg 120

g 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 23

caaaaaaact tcatctggac tagtggctcc atatcttatg caagttaatt ggagataaat 60

ycacgctctc taaaatttcg catttttaac ttacaagcac gtgcacattt gaattactct 120

g 121

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<213> 大豆

<400> 24

gttttgaagc ttgccgcttt gggtaagggg ccaacagtaa agacacagta gatatattga 60

maagatctct ggtggtcatg cggaacaggt ttatccacca aatctttttt tttttttttt 120

t 121

<210> 25

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<212> DNA

<213>大豆

<400> 25

tccttaacac ccttaccgca gttacttgcc gcctcaatcc attgctgaaa tgaatgctca 60

yaaataaata tatttgcagg ctacgaatct ctgctcctag atttttgttt cttaattatt 120

t 121

<210> 26

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<213> 大豆

<400> 26

aacaaacgaa ttcttggact tgttgctatg tacagtctag caactttaag aaacacgggt 60

ygtagtaagc atgacactat tacaaaagtc cttttaaaga tacttttcac aatagttcgc 120

c 121

<210> 27

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 27

taaaatattt aaaagaaaaa gaaaaagaaa tgagggttta aaatagaagt acaaattaaa 60

mattatcgaa aaatgaaatt agtatgcaat ataataaatg gaaccatttt cactttcacc 120

a 121

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<212> DNA

<213>大豆

<400> 28

acaacttgaa gagtttattt aatcaatgtc aatcatggca aagggtgagg aatggcttgg 60

rttaaatggg atttggttgc ttcacccatt gacatggggg gttggggatt aaaaatttag 120

a 121

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<213>大豆

<400> 29

ttgccgtgag attcactgga aatggtttac attagtatgt gtcgagaaac aattagttcc 60

rattatcctt gcttttttaa actgttgtcc atgctatcat cttctttgaa ccatattgta 120

a 121

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<212> DNA

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<400> 30

gcatgcatac actggtatac atgtcaatgc ttgaattgtt ttgatcacag tggtttttgt 60

rtatcttttc agattggctt atcttcatga aggtcttgaa ccaaaagttg tccaccgaga 120

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<213> 大豆

<400> 31

atagaaggtg gtagaatctg gctgaaggca tggcagcagg cagctgtggc agtgggttcc 60

rcggtggggg cgttgttgga ccctcgaaga gcagatttga tagcagctct tggtgagacc 120

a 121

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<400> 32

aatcagttaa gatttctgga cacgtacaaa gaaggttaca agaaatgctt atgaggaatg 60

yagattagaa gatttctagt catataaaag gatagaagga ggagaccaag aagaatgtta 120

a 121

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<212> DNA

<213> 大豆

<400> 33

cttgcctatc ggcagtccat catagttctc gcctatattg gcacctcgcc tatatcagcg 60

rcatctatga aggggaatgt tagaaagtct cacacgcctg attcgttctt tggatgcaac 120

t 121

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 'BARCSOYSSR_07_0241正向引物

<400> 34

caaacaaggc cgcttaaatc 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> e人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0241反向引物

<400> 35

tccttaaaac atgctcatgg aa 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0266 正向引物

<400> 36

ctgtcaagtg aggcaccaaa 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0266反向引物

<400> 37

cccccatgct tgttctctta 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0275正向引物

<400> 38

actactcacc ggccaaaatg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0275反向引物

<400> 39

cacactcgat cgatatccca 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0278正向引物

<400> 40

ggggatcgaa aatgtcttcc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0278反向引物

<400> 41

gacaaccgtc catcatgaca 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0286正向引物

<400> 42

aaaaatcagc acccatcgac 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0286反向引物

<400> 43

agccctggcc ttattttgtt 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0295正向引物

<400> 44

ctctcctttc attccccaca 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0295反向引物

<400> 45

ttcttggagc ttcggaggta 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0300正向引物

<400> 46

tcgcaatatt ggctacgatg 20

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0300反向引物

<400> 47

ctgaaaacaa aataaaagag aacaaa 26

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0320正向引物

<400> 48

tttaactgaa aatactccgg ca 22

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0320反向引物

<400> 49

tcataattta agagaccaaa ccga 24

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0339正向引物

<400> 50

cgcaaggtct aatattcact cg 22

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0339反向引物

<400> 51

aaaactgatt gcaggagatt agc 23

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0289正向引物

<400> 52

ggcaaaaggt aaaaagggtt t 21

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0289反向引物

<400> 53

tccccaaact ttcatcatgt 20

<210> 54

<211> 121

<212> DNA

<213>大豆

<400> 54

gtagttttga acttttgata actacaattt cgctatcaat aaaagtgtat gccctttaat 60

yatagagcag tacttccctt tcttggttat caaaatggat ggtgataaat tgtcttattt 120

t 121

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> InDel_2正向引物

<400> 55

ctccattctt ttgagtcgag t 21

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> InDel_2反向引物

<400> 56

actcagggcg gatcccaaag tg 22

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> InDel_1正向引物

<400> 57

aataaattta ttttggaatg tatc 24

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> InDel_1反向引物

<400> 58

tttatgttga tcccaacatg ta 22

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0297正向引物

<400> 59

ttgtctatca aaatttaacc acgaa 25

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BARCSOYSSR_07_0297反向引物

<400> 60

tccacatgtg cactgttagt gt 22

Claims

1.一种鉴定显示出增加的疫霉根腐病抗性的大豆植物的方法，所述方法包括在所述大豆植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因，其中：

a.所述标记基因座位于包含并侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的染色体区间内；并且

b.所述至少一个等位基因与增加的疫霉根腐病抗性相关联，

其中所述标记基因座选自由以下各项组成的组：BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记基因座位于包含并侧接BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的染色体区间内。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记基因座包含选自由以下各项组成的组的基因：Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800和Glyma.07G62900。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是Glyma.07G62900。

5.一种鉴定显示出增加的疫霉根腐病抗性的大豆植物的方法，所述方法包括在所述大豆植物的种质中检测包含一个或多个标记基因座处的等位基因的单倍型，其中：

a.所述一个或多个标记基因座位于包含并侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的染色体区间内；并且

b.所述单倍型与增加的疫霉根腐病抗性相关联，

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于包含并侧接BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的染色体区间内。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述标记基因座包含选自由以下各项组成的组的基因：Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800和Glyma.07G62900。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基因是Glyma.07G62900。

9.一种标记辅助选择方法，所述方法包括：

a.获得具有标记基因座的至少一个等位基因的第一大豆植物，其中所述标记基因座位于包含并侧接BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C的染色体区间内，并且所述标记基因座的所述等位基因与增加的疫霉根腐病抗性相关联；

b.使所述第一大豆植物与第二大豆植物杂交；

c.针对所述至少一个等位基因评价子代；以及

d.选择具有所述至少一个等位基因的子代植物，

其中所述标记基因座选自由以下各项组成的组：BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T、BARCSOYSSR_07_0286、BARCSOYSSR_07_0289、BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C、BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T、Gm07_5480878_G_A、BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C、BARCSOYSSR_07_0295、BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G、BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T、BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A、BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G、BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T、BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A、InDel_2、InDel_1、BARCSOYSSR_07_0297、BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G、BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C、BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T、BARC_101_Gm07_5599140_A_C、BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A、BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C、BARCSOYSSR_07_0300和BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记基因座位于包含并侧接BARCSOYSSR_07_0295和InDel_1的染色体区间内。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记基因座包含选自由以下各项组成的组的基因：Glyma.07G62500、Glyma.07G62600、Glyma.07G62700、Glyma.07G62800和Glyma.07G62900。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因是Glyma.07G62900。