CN102325900A - Cysdv抗性黄瓜植物的育种方法 - Google Patents

Cysdv抗性黄瓜植物的育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测试核酸样品中存在选自SEQ ID NO：1、2和3中的至少一种核酸序列的方法，包括确定所述样品中存在包含选自SEQ ID NO：1、2和3中的核酸序列的核酸的步骤。

Description

CYSDV抗性黄瓜植物的育种方法
技术领域
本发明涉及植物标记，特别是用于植物育种的标记。本发明提供了利用标记辅助选择进行抗CYSDV的黄瓜植物育种的方法。本发明进一步提供了用于检测与黄瓜植物基因组中CYSDV抗性连锁的标记的存在的核酸检测方法、基于所述标记的存在与否来选择黄瓜植物的方法，以及利用所述方法生产黄瓜植物的方法。本发明进一步提供了检测黄瓜植物中CYSDV抗性的新标记。
背景技术
标记辅助育种是对传统育种的技术改进，其可以监测特定基因材料通过回交从供体亲本渐渗到优良变种的基因背景或基因组中的过程。这可以显著地加速育种过程。该技术利用与待渐渗的特定性状连锁的基因标记(genetic markers)。基因标记是与精确界线(preciseboundary)未知的感兴趣遗传间隔(genetic interval)或与身份未知的基因连锁的、可遗传且容易检测的多态性遗传特性。该标记可用于识别与它们连锁的特定染色体上的位点处的等位基因。该等位基因通常具有表型效应，其比该标记的检测更复杂。
传统的植物育种方法基于纯粹的杂交(cross-fertilization)以及从后代中选择具有期望性状组合的植物。在杂交过程中，数千基因混合，需要与优良种系的多次回交来除去不想要的性状。这需要花费数年的时间。标记辅助育种方法更精确、更可预测而且更快速。通过控制清楚界定(well-defined)的基因位点在植物中的渐渗或插入，可以使现有植物系(plant line)具有特定的新特征，而不期望的性状则基本上未转移。
已成功应用于植物育种的分子标记类型包括RFLP(限制性片段长度多态性)(WO89/07647、WO90/04651)、RAPD(随机扩增多态性DNA分析)(WO95/19697；WO99/05903)、AFLP(扩增片段长度多态性)(EP0 534 858、WO00/15852)、也称为小卫星序列(minisatellite)的VNTR(可变数目串联重复序列)(WO98/42867)、也称为SSR(简单序列重复)或微卫星序列(microsatellite)的STR(短串联重复序列)(WO99/67421)、SNP(单核苷酸多态性)(US2007/039065)、SFP(单特征多态性(single featurepolymorphism))(Borevitz等人，2003.Genome Res.13：513-523)、EST(表达序列标签)(WO05/17158)、RDA(代表性差异分析)(WO99/53100)、GMS(基因组错配扫描)(美国专利5,376,526)、SCAR(序列特征化扩增区域，WO98/56948)、同工酶(Tanksley&Rick，1980.Theor.Appl.Genet.57：161-170；Ammati等人1985Plant Disease69(2)：112-115)、ASH(等位基因特异性杂交)(Coryell等人，(1999)Theor.Appl.Genet.98：690-696)、3SR(自主序列复制)，和RAD(限制位点关联的DNA)标记(Miller等人，Genome Res 17：240-248(2007))。
挑选特定类型的标记，要考虑多种因素。RFLP和AFLP标记一般不是首选方案，因为它们需要大量DNA的繁琐的限制酶消化，并且需要利用凝胶电泳分离来自并行的不同个体中的多种消化液(digest)。甚至在遗传的、多等位基因和共显性的物种和栽培种中，微卫星(也称为简单重复序列(SSR))标记也具有高度多态性的优点。然而，筛选多重微卫星所需的时间、努力(effort)和巨大花费是对微卫星在植物遗传学中扩大应用的严重限制。据认为，RAPD的开发更快、成本更低，但它们通常表现出较低的多态性。ASH标记用作显性标记，其中通过仅一个探针由杂交或缺少杂交只能确定一个等位基因存在与否。从缺少杂交可以推断出交互等位基因。
任何性状的最终标记都是因果(causal)DNA多态性(或多种因果DNA多态性)或者直接引起期望表型的等位基因变体。原因是等位基因中的基因型和相关表型是直接联系的。然而，关于特定性状遗传基础的认识并不是育种计划所必需的，只要该标记的预测值允许以足够的确定性选择携带该性状的后代植物即可。为此，该性状位点和该标记位点在该染色体上必须足够靠近，以便它们例如，优选在多于95％的减数分裂(meioses)中一起遗传。
因为遗传基础狭窄的植物物种如黄瓜(Dijkhuizen等人，1996)的基因标记数目有限，所以发现与性状关联的其它基因标记将有利于基因分型应用，包括标记-性状相关性研究、基因作图、基因发掘、标记辅助选择，和标记辅助育种。
假定轮回亲本与包含待渐渗的一种或多种基因的供体亲本杂交。使所得F1与轮回亲本交配，从而形成第一回交(BC1)；使这一代与轮回亲本杂交产生第二回交(BC2)，等等。在每个回交世代中，待与轮回亲本杂交的植物以这样的方式选择，以便它们都具有存在于轮回亲本中的整套标记等位基因，以及与待渐渗基因(或多种基因)关联的标记等位基因。这就对待使用的标记进行了限制：它们必须是共显性的，或者如果是显性的，如在RAPD的情况中，则该供体亲本必须携带显性等位基因。(Reyes-Valdés，Crop Science 40：91-98(2000))。
黄化病毒(yellowing viruses)可能会给黄瓜产量造成重大的经济损失，其中物种CYSDV(长线形病毒科(黄化丝状病毒科，closterovirus family))的威胁最大。该病毒通过粉虱(whitefly)传播，虽然需要应用杀虫剂来加以控制，但优选通过利用抗病毒的栽培种加以控制。据信某些抗性黄瓜变种基因组中的至少两个数量性状位点或QTL与有价值的长线形病毒抗性性状关联(参见WO 02/22836)。一个实例是源自黄瓜地方品种(landrace)Khira PI250147的QTL。可以通过选择具有与这些QTL关联的标记的植物，将与此种长线形病毒抗性关联的基因物质适当地渐渗到后代植物中。
发明内容
本发明人已发现检测源自黄瓜地方品种Khira PI250147的黄瓜植物中CYSDV抗性的新标记。这些标记位于与来自黄瓜登录号PI250147的CYSDV-QTL-1抗性位点很接近的位置。
本发明涉及利用基因标记表征与CYSDV抗性有关的黄瓜种质的组合物和方法。被识别为具有高度遗传性的CYSDV抗性性状的植物和种系对开发具有有价值的农艺和/或种子质量性状的黄瓜农作物商业栽培种有用。
在第一方面，本发明提供了测试核酸样品中存在选自SEQ IDNO：1、2和3中的至少一个(多态性)核酸序列的方法。
在优选的实施方式中，所述方法包括检测SEQ ID NO：1相对于SEQ ID NO：2的多态性中的至少一个的存在。
在另一个优选实施方式中，所述核酸样品是来自植物、植物种质或植物系的样品。
在又一个优选实施方式中，所述植物是葫芦科植物，最优选黄瓜。
在另一个优选实施方式中，本发明的测试方法是在标记的基因标记位点处对植物或种质进行基因分型的方法的一部分，其中该标记具有选自与CYSDV抗性关联的SEQ ID NO：1、2和3的核酸序列，所述方法包括
a)通过将扩增引物或扩增引物对与核酸样品混合而扩增该核酸序列或其部分的标记位点，其中该引物或引物对与该标记位点或所述核酸序列的至少一部分互补或部分互补，并且其中该引物或引物对能够利用所述核酸作为模板，通过DNA聚合酶启动DNA聚合，和
b)在包含DNA聚合酶和所述模板核酸的DNA聚合反应中延长引物或引物对，从而产生至少一个扩增子，以及可选地检测所得的扩增标记扩增子中的所述核酸序列。
在本发明测试方法的另一个优选实施方式中，该引物或引物对选自SEQ ID NO：4和5构成的组中。
在另一个方面，本发明提供了选择植物或种质的方法，包括对来自植物、植物种质(plant germplasm)或植物系(plant line)的核酸样品执行本发明测试方法，和选择具有选自SEQ ID NO：1和3的至少一个核酸序列的植物或种质，以及选择所述植物或种质用于进一步育种目的。
在另一方面，本发明提供了植物育种方法，包括：通过执行根据本发明的选择植物或种质的方法来选择植物或种质，和使所选植物或种质与优选来自优良植物系(elite plant line)的第二植物或种质杂交从而产生后代植物或种质。
在植物育种方法的优选实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤：分析从一种或多种所述后代植物或种质中分离的DNA样品中存在选自SEQ ID NO：1、2和3的至少一个(多态性)核酸序列，其中所述分析识别出包含与CYSDV抗性连锁的至少一种标记的植物。
在植物育种方法的另一个优选实施方式中，所述后代植物或种质来自与所述至少一个核酸序列的存在有关和/或与CYSDV抗性有关的分离群体(segregating population)。
在植物育种方法的另一个优选实施方式中，所述方法进一步包括回交、自交(selfing)、异交(outcrossing)和植物选择中的一个或多个步骤。
在植物育种方法的又一个优选实施方式中，所述方法进一步包括从利用该方法产生的一种或多种植物中分离的DNA样品的分子标记分析步骤，其中所述分析识别出至少包含与CYSDV抗性连锁的SEQ ID NO：1或3的标记的植物。
本发明植物可以可选地包含与长线形病毒抗性关联的第二QTL(如WO 02/22836中描述的QTL-2，这篇文献的说明书明确地提到了这种QTL的定位和特征的详细信息)。其表明，这种QTL位于独立染色体上。因此，除从利用该方法产生的一种或多种植物中分离的DNA样品的分子标记分析步骤之外，本发明植物育种的方法还包括识别至少包含与CYSDV抗性连锁的SEQ ID NO：1或3的标记的植物的分析(步骤)，该标记可选地与在WO 02/22836中识别为QTL-2的数量性状位点连锁的标记相结合。适合于检测QTL-2的标记包括WO02/22836中描述的那些。
在植物育种方法的又一个优选实施方式中，当与第二黄瓜植物或种质相比，所述已识别的植物表现出对CYSDV的抗性增强。
在又一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其选自以下构成的组：
a)具有SEQ ID NO：1、2和3中任何一个的序列的核酸分子；
b)具有10～50个核苷酸长度并且与SEQ ID NO：1、2和3中任何一个具有至少80％的序列同一性的核酸分子；
c)能够在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1、2和3中任何一个序列的核酸分子杂交的核酸分子；
d)与a)至c)中任何一个核酸分子互补的核酸分子。
在又一个方面，本发明提供了本发明分离的核酸分子作为杂交探针或扩增引物的用途。
附图说明
图1示出从实施例2描述的抗性和易感的近交育种系扩增的不同的DNA片段。通过电泳和溴化乙锭染色使片段可视化。(R)表示抗性表型，(S)表示易感性。
图2示出在本文称为CYSDV-QTL-1的CYSDV抗性位点的位置。示出本文识别的标记，以及先前在WO 02/22836和WO2007/053015中描述的一些其它标记的各个标记位点。QTL的不同表示法(“CYSDV-QTL-1”和“QTL-1”)并不是要指出该两个QTL之间存在任何差异，这两种标识在本文可以交互地使用。然而，出于作图的目的，称为“QTL-1”的区域表示侧面有本发明识别的紧密连锁的标记的区域。
图3示出本文所述标记的分值，并表明新识别的标记可以准确地预测近交系的表型。
具体实施方式
定义
本文使用的术语“葫芦科植物”是指葫芦(Cucurbitaceae)科植物，通常称为甜瓜(melon)、南瓜(瓜类，gourds)或葫芦(cucurbits)的植物家族，并包括此类农作物，如黄瓜、南瓜属植物(squashes)(包括南瓜(pumpkins))、丝瓜(luffas)、甜瓜和西瓜。特别地，葫芦科植物是指黄瓜。
本文使用的术语“黄瓜”是指黄瓜(Cucumis sativus)物种的植物或其部分，包括但不局限于通常称为黄瓜(Cucumber)、美国醋渍黄瓜(American gherkin)、香蕉瓜(Cassabanana)、黄瓜(Cuke)、醋渍黄瓜(Gherkin)、温室黄瓜(Hothouse cucumber)、柠檬黄瓜(Lemoncucumber)、Mandera黄瓜、腌制黄瓜(Pickling cucumber)、蛇黄瓜(Serpent cucumber)、切片黄瓜(Slicing cucumber)、蛇黄瓜(Snakecucumber)和西印度黄瓜(West Indian gherkin)的植物。
本文使用的术语“植物系”是指共享有共同的遗传衍化关系(遗传来源，genetic derivation)的遗传异质性(genetically heterogeneous)植物集合。
本文使用的术语“植物部分”表示植物的部分，包括单个细胞和细胞组织例如植物中的完整的植物细胞、从中可以再生植物的细胞团和组织培养物。植物部分的实例包括但不限于，来自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽(苗，shoots)和种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、接穗(幼枝，scions)、根茎、种子、原生质体、愈伤组织(calli)等。
本文使用的术语“葫芦科植物黄色矮化失调病毒(Cucurbit yellowstunting disorder virus)”及其缩写“CYSDV”是指通常称为长线形病毒的长线形病毒科(Closteriviridae)的特定物种。该病毒首先于1982年在阿联酋检测到，此后在整个地中海地区以及德州南部和墨西哥北部里奥格兰德山谷的北美蔓延。CYSDV通过粉虱以半持续的、非循环方式传播。该病毒具有二分基因组(bipartite genome)，其由两个单独包装(encapsulated)的单链加有义RNA节段组成。
本文使用的术语“核酸”包括提及的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，即，单链或双链形式的多核苷酸，并且除非另有限定，否则都包括具有天然核苷酸本质特征的已知类似物，因为它们以类似于天然存在的核苷酸(例如，肽核酸)方式与单链核酸杂交。多核苷酸可以是全长，或者天然或异种的结构或调控基因的子序列。除非另有限定，否则该术语包括提及的具体指定的序列及其互补序列。因而，带有因稳定性或其它原因而修饰的骨架的DNA或RNA是“多核苷酸”，如同本文预期的该术语。而且，包含稀有碱基(unusual bases)如肌苷，或者修饰碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是多核苷酸，如同本文使用的该术语，其中该稀有碱基或修饰碱基仅是两个实例。应当理解，为了本领域技术人员已知的许多有用目的，可以对DNA和RNA作出各种修饰。本文采用的术语多核苷酸包括此种化学修饰形式、酶修饰形式或代谢修饰形式的多核苷酸，以及化学形式的DNA和RNA特性的病毒和细胞。如果是双链，则DNA分子一般具有编码或有义链，以及非编码或反义链。
如本文使用的术语“连锁群”是指位于同一染色体上的所有基因或基因性状。在连锁群内，足够靠近在一起的那些位点将表现出遗传杂交(genetic crosses)的连锁。因为交换的可能性随着染色体上基因之间的物理距离而增大，所以在直接的基因测试中，连锁群内位置彼此远离的基因没有表现出任何可检测的连锁。该术语“连锁群”主要用于指在还未进行染色体定位(chromosomal assignments)的遗传系统中表现出连锁行为的遗传位点。因而，在本发明上下文中，术语“连锁群”与染色体(的物理实体)同义。
本文使用的术语“基因”是指核酸序列，特别是由转录区域以及可选的一个或多个调控序列组成的DNA节段，该调控序列使得转录能够实现并且包含核酸聚合酶(在真核细胞中，RNA聚合酶II)的模板。当被表达时，基因转录为mRNA，mRNA然后翻译为蛋白质。“基因”在本文也被定义为由DNA序列组成的遗传单位，其在染色体上占据特定位置并包含有机体的特殊特征或性状的遗传指令。术语“性状”是指特征或表型。
本文使用的术语“等位基因(或多个等位基因)”是指基因的一种或多种可替换形式中的任一种，所有等位基因涉及至少一种性状或特征。在二倍体细胞中，所给基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应位点。等位基因长度可以像1个核苷酸碱基一样小，但通常比它大。等位基因序列可以是氨基酸序列或核酸序列。因为本发明涉及可以包含一个或多个基因的基因组区域，或者调控序列，所以，在某些实例中更准确地称之为“单体型(haplotype)”(即染色体节段的等位基因)而不是“等位基因”，然而，在那些实例中，术语“等位基因”应被理解为包括术语“单体型”。
本文使用的术语“单体型”是指单倍体配子中多个位点或基因标记的基因型。一般地，该单体型是作为单位被遗传的一套等位基因或一组紧密连锁的基因，因而，它们的位点或与其连锁的标记存在于相对较小的限定的染色体区域中。而且，该术语是指一系列具有特定表型的个体之间的共同标记分值。优选的单体型包含与抗性显著关联的信息(informative)标记周围的10cM区域或5cM区域或2cM区域。
“位点”在本文定义为所给基因或调控序列占据给定物种染色体的位置。
本文使用的术语“渐渗”、“被渐渗的”和“渐渗的”表示天然的和人为的过程，其中通过杂交这些物种将一种物种、变种或栽培种的基因组区域转移到另一种物种、变种或栽培种的基因组中。可选地通过与轮回亲本回交完成该过程。
本文使用的术语“抗”和“抗性”包括对感染的部分和完全抗性。易感植物可以对感染无抗性或者对感染有低水平的抗性。该术语用于包括可单独识别的抗性形式，如“完全抗性”、“免疫性”、“中等抗性”、“部分抗性”、“超敏性”和“耐受性”。
本文使用的术语“完全抗性”是指在感染之后疾病完全无法进展，这可能是由于疾病未能进入细胞(无初始感染)引起的，或者是由于该药剂(agent)未能在细胞内繁殖并感染后继细胞(无潜在感染，未蔓延)引起的。
本文使用的术语“易感”是指植物对疾病无抗性，导致该植物受到疾病影响，产生疾病症状。术语“易感”因而与“无抗性”等同。
本文使用的术语“位于……的侧面”是指位于(并包括)基因组标记之间。
“基因型”是指在个体有机体内一个或多个位点处等位基因组合的具体化。在二倍体有机体的情况下，每个位点处都有两个等位基因；当该等位基因相同时，该二倍体基因型被称为是纯合的，而当该等位基因不同时，该二倍体基因型被称为是杂合的。
“表型”是指细胞或有机体的可检测特征，其是基因表达的表现。
“连锁”是指在杂交中产生多种类型的配子的相对频率。例如，如果位点A具有等位基因“A”或“a”，位点B具有等位基因“B”或“b”，则带有AABB的亲本I与带有aabb的亲本II杂交将产生四个可能的配子，其中单倍体基因型分离为(segregated into)AB、Ab、aB和ab。空期望(null expectation)是独立而等同地分离为四个可能的基因型中的每个，即没有连锁，1/4配子将是每种基因型。配子分离为不同于1/4的基因型则归因于连锁。当两个位点显示与预期的1/4相同频率相偏离时，该两个位点被称为是“基因连锁的”。
“连锁不平衡”定义在单一代中的许多个体群中的配子类型相对频率的情境中。如果等位基因A的频率是p，a是p’，B是q，b是q’，则基因型AB的预期频率(在无连锁不平衡的情况下)是pq，Ab是pq’，aB是p’q，ab是p’q’。与预期频率的任何偏离都称为连锁不平衡。
本文使用的术语“连锁”是指标记位点和第二位点在染色体上足够靠近，以至于它们在多于50％的减数分裂中一起遗传，即，不是随机的。这个定义包括其中标记位点和第二位点形成相同基因的一部分的情况。此外，这个定义包括其中该标记位点包含负责感兴趣性状的多态性(换言之，该标记位点与该表型直接“连锁”)的情况。当两个位点在多于50％的减数分裂中一起遗传时，在每代位点之间观察到的重组百分比(厘摩(cM))将小于50。在本发明特定实施方式中，基因连锁位点可以在染色体上相距45、35、25、15、10、5、4、3、2或1或更小cM。优选地，该标记相距小于5cM，最优选相距约0cM。
本文使用的术语“cM”是指厘摩，并表示染色体或其基因连锁图谱上两个位点或标记之间的距离。位点之间的距离通常通过同一染色体上位点之间的交换频率测量。两个位点离得越远，则它们之间发生交换的可能性就越大。相反地，如果两个位点非常接近，则(它们之间)发生交换的可能性就会较小。通常，1厘摩(Kosambi作图函数(cM))大约等于位点(标记)之间的1％重组。
本文使用的术语“标记”或与其等效的“基因组标记”，是指连锁到感兴趣基因或QTL上的可遗传且容易检测的多态性DNA序列。“多态性”是序列，特别是DNA序列中个体之间的变化。有用的多态性包括单核苷酸多态性(SNP)和DNA序列的插入或缺失(INDEL)。标记可以是基因，并可以是无已知功能的DNA部分，其在视觉上区分核酸序列特征的方法中用作指征(indicator)。此种指征的实例是限制性片段长度多态性(RFLP)标记、扩增片段长度多态性(AFLP)标记、单核苷酸多态性(SNP)、插入突变、微卫星标记(SSR)、序列特征性扩增区(SCAR)、裂解型扩增多态性序列(CAPS)标记或同工酶标记或本文所述的限定特异遗传和染色体位置的标记的组合。当标记和与供体和接受渐渗的受体植物二者中感兴趣性状连锁的等位基因物理关联时，该标记被表示为“顺式”-连锁的。显性性状容易利用顺式标记评估，因为该等位基因的存在与该表型呈正相关。因此，对于显性性状的标记辅助育种而言，顺式标记是最重要的标记。当标记与相反等位基因物理关联，即该等位基因没有赋予供体植物的感兴趣性状时，该标记被表示为“反式”基因连锁。技术人员应理解，具有渐渗的植物中不存在的反式标记对于检测后代植物中成功渐渗的测定法也是有用的，但测试标记的不存在从而检测特异性渐渗的存在是间接的。然而，反式标记与隐性性状的标记辅助育种有关，因为当该标记不再存在于群体中时，纯合(表达的表型)形式的感兴趣等位基因的存在最佳地被显示。标记可以是显性或共显性的。
“标记测定法”是指利用特定方法，例如表型(如，种子颜色、花色或其它可视觉检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性杂交(ASH)、RAPID等，检测特定位点处的多态性的方法。优选的标记测定法包括US6,013,431中公开的单碱基延伸，和US 5,538,848中公开的，其中核酸内切酶活性使报告基因染料从杂交探针中释放出来的等位基因鉴别，该两篇专利的公开内容都通过引用合并在此。
“数量性状位点(QTL)”是指在一定程度上控制通常连续分布的可用数字表示的性状的位点。
在核酸上下文中的术语“杂种”是指由互补核苷酸碱基之间的氢键形成的双链核酸分子，或双链体(二重体，duplex)。术语“杂交”或“退火”是指通过互补碱基之间的氢键使单链核酸序列形成双螺旋节段的过程。“杂交”是指两个核酸分子或其片段形成反平行的双链核苷酸结构的能力。本发明核酸分子在某些情况下能够与其它核酸分子杂交。如果核酸分子表现出“完全互补性(completecomplementarity)”，即，一个序列中的每个核苷酸与另一个序列中的其碱基配对的伴侣核苷酸(partner nucleotide)互补，则该核酸分子被称为是另一种核酸分子的“互补体”。如果两个分子可以足够的稳定性彼此杂交从而使得它们仍然可以在至少传统“低严格(lowstringency)”条件下被彼此退火，则该两个分子被称为是“最低限度的互补的”。类似地，如果该分子可以足够的稳定性彼此杂交从而使得它们仍然可以在传统“高严格”条件下被彼此退火，则该两个分子被称为是“互补的”。例如至少在低严格条件下与其它核酸分子杂交的核酸分子被称为是其它核酸分子的“可杂交同源物(cognate)”。传统的严格条件描述在以下文献中：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)以及Haymes等人，Nucleic Acid Hybridization，APractical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)，其中的每篇文献通过引用合并在此。因此，允许偏离完全互补性，只要此种偏离没有完全阻止该分子形成双链结构的能力即可。因而，为了使核酸分子用作引物或探针，只需要它在序列上足够互补从而可以在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构即可。促进DNA杂交的适当的严格条件，例如，在约45℃下的6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃下的2.0x SSC洗涤是本领域技术人员已知的，或可以在Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中的现行规程(Current Protocols)中找到，该文献通过引用合并在此。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自50℃下约2.0x SSC的低严格条件至50℃下约2.0x SSC的高严格条件。另外，洗涤步骤的温度可以从室温，约22℃下的低严格条件提高到约65℃下的高严格条件。温度和盐二者都可以变化，或者该温度或盐浓度可以保持恒定，而其它变量是变化的。
“序列同一性(sequence identity)”是指在成分如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中，两个最佳比对的多核苷酸或肽序列的不变程度。测试序列和参考序列比对节段的“同一性分数”是这两个比对序列共享的相同成分的数目除以参考序列节段，即，整个参考序列或该参考序列的较小限定部分中成分的总数目。“同一性百分比”等于同一性分数乘以100。比对比较窗口的序列最佳比对是本领域技术人员已知的，并可以通过这些工具进行，如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似法搜寻，优选通过计算机执行这些算法，如GAP、BESTFIT、FASTA，以及作为
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Wisconsin的部分获得的TFASTA(Accelrys Inc.Burlington，Mass)。作为本文提供的多核苷酸变体的本发明多核苷酸一般与本文提供的多核苷酸具有显著的同一性。特别感兴趣的是这样的多核苷酸同系物(同源物，homologs)，其与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70％的序列同一性、至少约80％的序列同一性、至少约90％的序列同一性，更优选甚至更大，如98％或99％的序列同一性。
术语“探针”是指将与靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列形成氢键键合双链体的单链寡核苷酸序列。
本文使用的术语“引物”是指能够退火至扩增靶标以允许DNA聚合酶附着的寡核苷酸，由此当其被置于引物延伸产物的合成被诱导的条件下，即，存在核苷酸和诸如DNA聚合酶的聚合试剂以及合适的温度和pH条件下时，起到DNA合成初始点的作用。(扩增)引物优选为单链化的以便扩增具有最大效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长才能在聚合试剂存在下启动延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度和引物的组成(A/T和G/C含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，如通常在DNA扩增技术领域如PCR扩增中所使用的那些。应该理解，本文中使用的“引物”可以是指多于一种引物，特别是在有关被扩增靶区域的末端序列(或多个序列)的信息中存在一些错读(ambiguity)的情况下更是如此。因此，“引物”包括含有表示在序列中可能变化的序列的引物寡核苷酸的集合(collection)或包括容许典型碱基配对的核苷酸。寡核苷酸引物可以通过任何合适的方法制备。制备具有特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，包括例如合适序列的克隆和限制(限制性酶切)，以及直接化学合成。化学合成法可以包括，例如，磷酸二酯法或磷酸三酯法、二乙基氨基磷酸酯(diethylphosphoramidate)法和公开于例如美国专利第4,458,066中的固相载体(solid support)法。需要时，引物可以通过引入以例如光谱、荧光、光化学、生物化学、免疫化学或化学方式可检测的装置(means)来进行标记。寡核苷酸引物(或多个寡核苷酸引物)的模板依赖性延伸是在足量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸酯(dATP、dGTP、dCTP和dTTP，即dNTP)或类似物的存在下，在由合适的盐、金属阳离子和pH缓冲系统组成的反应介质中由聚合试剂催化的。合适的聚合试剂是已知催化引物-和模板-依赖性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。用这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件是本领域中已知的。合成产物是由模板链和引物延伸链组成的双链体分子，其包括靶序列。这些产物又作为另一轮复制的模板。在第二轮复制中，使第一次循环的引物延伸链与其互补引物退火；合成产生“短”产物，其通过引物序列或它们的互补体结合于5′-端和3′-端。变性、引物退火和延伸的重复循环导致由引物限定的靶区域呈指数累积。执行足够次数的循环而达到所需数量的含有核酸靶区域的多核苷酸。所需数量可以是不同的，这由产物多核苷酸将要起到的功能决定。在手册中已经详细地描述了PCR方法，这是技术人员已知的。通过PCR扩增后，可以通过用探针多核苷酸杂交来检测该靶多核苷酸，该探针多核苷酸在严格到中等严格的杂交和洗涤条件下与靶序列的多核苷酸形成稳定杂交体。如果预期探针将基本上与靶序列完全互补(即约99％或更大)，则采用严格条件。如果预期会发生一些错配，例如，如果变种株(variant strains)预期具有探针将不会完全互补的结果，则杂交的严格性就会降低。然而，条件的选择会排除非特异性/偶然性结合。影响杂交的条件，以及排除非特异性结合的条件的选择在本领域中是已知的，并描述在例如Sambrook和Russell(2001)中。一般而言，较低的盐浓度和较高的温度会使杂交条件的严格性提高。
术语“严格的杂交条件”是指使多核苷酸与典型地在核酸复杂混合物中的其靶序列杂交，而基本上不与其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。较长序列的特异性地杂交要在较高的温度下进行。在Tijssen，1993中发现核酸杂交的广泛指南(extensive guide)。一般而言，严格条件选择为比特异性序列的热熔点(Tm)低约5～10℃的温度、确定的离子强度和pH。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下的)这样的温度，在该温度下50％的靶互补探针杂交到处于平衡(因为在Tm下存在的靶序列过量，50％的探针处于平衡)的靶序列上。严格条件为这样的条件，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，典型地为约0.01～1.0M钠离子浓度(或其它盐)，而对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，对于长探针(例如，超过50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以采用加入去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号至少是背景的2倍，优选为背景杂交的10倍。示例的严格杂交条件通常是：50％甲酰胺、5xSSC，和1％SDS，在42℃下孵化，或者5xSSC、1％SDS，在65℃下孵化，在65℃下用0.2xSSC和0.1％SDS洗涤。对于PCR，约36℃的温度典型地用于低严格扩增，但退火温度可以在约32℃和48℃之间变化，这取决于引物长度。确定杂交参数的其它指导原则在许多参考文献中提供(例如，Ausubel等人，1999)中。
本文使用的术语“繁殖材料”是指植物的任何部分，包括来自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体和愈伤组织，该部分能够再生成新植物。
本文使用的术语“选择”是指评估标记或性状在植物或植物部分中的存在，以及给所述植物或植物部分指定所选的迄今为止具有期望性状或标记的状态，从而提供植物或植物部分用于将来育种目的。
“纯化的”和“分离的”是指从与其天然状态正常关联的基本上所有的其它分子中分离出的核酸分子或多肽。更优选地，基本纯化的分子是在配制品(preparation)中占优势的物质。基本纯化的分子可以有多于60％或75％或90％或95％不含天然混合物中存在的其它分子(溶剂除外)。术语“分离和纯化的”和“基本纯化的”并不是要包括以其天然状态存在的分子。
本文使用的术语“标记辅助选择”是指现代植物育种过程，其中通过检测那些植物中存在性状关联的标记，例如，限定QTL或与期望性状关联的基因组区域的标记，而选择具有有利等位基因的后代植物用于将来的育种目的。
本文使用的术语“后代植物”是指由一种或多种亲本植物或其后代通过无性生殖或有性生殖获得的子代的任何植物。例如，后代植物可以通过亲本植物的克隆或自交，或通过两种亲本植物杂交获得，并且包括自交体(selfings)以及F1或F2或更进一步的世代。F1是由其中至少一个第一次作为性状供体使用的亲本产生的第一代后代，而第二代后代(F2)或后续世代(F3、F4等)都是从F1、F2等的自交产生的样本。因此，F1可以是(通常是)来自两个纯育(true-breeding)亲本(实际育种是性状纯合子)之间的杂交产生的杂种，而F2可以是(通常是)由所述F1杂种自体受精产生的后代。
本文使用的术语“超亲分离子(transgressive segregant)”是指具有显著地不同于其亲本的性状/表型的后代(例如，在育种计划中产生的)。此种后代是等位基因对在减数分裂期间(彼此)分离，以及随后分配到不同生殖细胞中的结果。
本文使用的术语“近交”是指基本纯合的个体或种系。
本文使用的术语“纯合子”是指相同等位基因位于同源染色体上的相应位点上时存在的遗传情况，其与术语“杂合子”相反，杂合子是指不同等位基因位于同源染色体上的相应位点上时存在的遗传情况。
本文使用的植物育种上下文中的术语“杂种”是指这样的植物，其是通过不同种系或品种或物种植物杂交产生的遗传学上不同的亲本的后代，包括但不局限于两个近交系之间的杂交。
优选实施方式的描述
在第一方面，本发明提供了测试核酸样品中存在选自SEQ IDNO：1、2和3的至少一个(多态性)核酸序列的方法。所述方法适宜地包括通过执行核酸分析方法，特别是识别DNA分子中独特核苷酸(通常是多态性)序列的分析方法，检测核酸样品(优选分离的核酸样品)中存在选自SEQ ID NO：1、2和3的至少一个核酸序列的步骤。
本发明测试方法可能涉及本领域中已知的任何形式的核酸分析。适宜地，该方法包括扩增怀疑包含感兴趣的核酸序列的DNA区域的步骤，该区域或位置可以适宜地称为具有所述核酸序列的标记的标记位点，该方法还包括检测所得扩增的标记扩增子中的多态性核酸序列的步骤。而且，可以扩增标记位点部分，并且可以在此后检测所得扩增的标记扩增子中的多态性核酸序列。
可替换地，该(多态性)序列可以通过利用与多态性标记序列特异性杂交的扩增引物由该核酸样品直接扩增。然后，扩增子的产生指示存在感兴趣的核酸序列。
一般地，扩增步骤包括使扩增引物或扩增引物对与核酸，适宜地与从黄瓜植物或种质中分离的核酸混合，其中该引物或引物对与标记位点或所述核酸序列的至少一部分互补或部分互补，并且其中该引物或引物对能够利用所述核酸作为模板通过DNA聚合酶启动DNA聚合。扩增步骤然后进一步包括在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸引物或引物对，从而产生至少一个扩增子。
在根据本发明的测试方法中有用的核酸扩增方法在本领域中是熟知的。原则上，本发明方法可以采用任何核酸扩增方法，如聚合酶链反应(PCR；Mullis 1987、美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159)，或者使用扩增反应如连接酶链反应(LCR；Barany 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193、欧洲专利申请320,308)、自主序列复制(3SR；Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878)、链置换扩增(SDA；美国专利5,270,184和5,455,166)、转录扩增系统(TAS；Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人，1988，Bio/Technology6：1197)、滚环扩增(RCA；美国专利5,871,921)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、裂解酶片段长度多态性(美国专利5,719,028)、等温和嵌合引物起始的核酸扩增(Isothermal and Chimeric Primer-initiatedAmplification of Nucleic Acid)(ICAN)、分枝-延伸扩增法(Ramification-extension Amplification Method)(RAM；美国专利5,719,028和5,942,391)，或者任何其它适合用于扩增DNA的方法。
为了将带有少量错配的DNA扩增到一种或多种扩增引物上，可在降低的严格条件下进行扩增反应(例如，利用38℃的退火温度，或在3.5mM MgCl2的存在下进行PCR扩增)。本领域技术人员将能够选择适宜的严格条件。
本文引物选择为与存在于每个待扩增特异性序列不同链上的它们的靶区域“基本”互补(即，至少65％、更优选至少80％的完全互补)的引物。可以使用含有例如肌醇残基或多义碱基(ambiguous base)的引物序列，或甚至当与靶序列相比时含有一个或多个错配的引物。一般地，认为表现出与靶DNA寡核苷酸序列至少65％，更优选至少80％同源性的序列适宜用在本发明方法中。当使用低严格的杂交条件时，序列错配也不是关键的。
扩增产物的检测原则上可以通过本领域中已知的任何适宜的方法完成。该扩增子可以用放射性标签、抗体、发光染料、荧光染料、酶试剂直接或间接地染色或标记，或者利用作为报告分子而被标记的寡核苷酸可视化。直接的DNA染色包括，例如，嵌入染料如吖啶橙、溴化乙锭、叠氮溴乙锭(ethidium monoazide)、Hoechst染料。适宜的荧光标签包括，但不局限于荧光素、罗丹明(FAM、R6G、TAMRA和ROX)、德克萨斯红(Texas red)、BODIPY、香豆素(coumarins)、花青染料(噻唑橙[TO]、噁唑黄[YO]、TOTO、YOYO；Cy3、Cy5)和Alexa染料(Alexa dyes)。报告分子包括，但不局限于用荧光染料(Fluorochromes)如FAM、ROX、德克萨斯红、TET、TAMRA、JOE、HEX、CAL红和VIC标记的寡核苷酸。
可替换地，可以通过将标记的dNTP碱基并入到所合成的DNA片段中来检测该DNA片段。可与并入到扩增子中的核苷酸碱基关联的检测标签包括，例如，荧光素、花青染料或BrdUrd。
测试核酸样品中存在选自SEQ ID NO：1、2和3的至少一个(多态性)核酸序列的方法也可以通过利用基于探针的检测系统进行，可选地与核酸扩增相结合。适合于本发明使用的检测方法可以包含例如，酶免疫测定(EIA)法(Jacobs等人，1997，J.Clin.Microbiol.35，791-795)。在EIA方法中，用在扩增反应中的正向或反向引物包含捕获基团，如生物素基团(biotin group)，其用于将扩增子固定在例如链霉亲和素(streptavidin)涂覆的微量滴定板上以便随后对扩增子进行EIA检测。
对检测本文公开的标记序列有用的探针优选只结合到通过DNA扩增方法扩增的标记序列区域的至少一部分上。本领域技术人员可以制备适合于基于标记序列的核苷酸序列进行检测而无需进行本文列出的不适当的实验的探针。该标记序列的互补序列也同样地适合用作本发明方法中的检测探针，条件是此种互补链在所采用的扩增反应中被扩增。
在又一些其它可替换的实施方式中，核酸样品可通过Southern印迹法测试，其中使该核酸样品和与标记核酸序列的至少一部分互补或部分互补的探针接触，其中当结合到过滤材料(filter material)上时，该探针能够在严格杂交条件下与该标记核酸序列的至少一部分杂交。适宜的方法因而可以包含固定扩增子和用探针探测其DNA序列。为了方便对结合的检测，该特异性扩增子检测探针可以包含标签部分如荧光团、发色团、酶或放射性标签，以便使该探针与该扩增反应的反应产物的结合容易被监测。此种标签是本领域技术人员熟知的并包括，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉亲和素(streptavidin)、生物素、地高辛(digoxigenin)、35S或125I、3H，以及上文所述的那些。其它实例对本领域技术人员是明显的。
检测也可以通过例如Van den Brule等人(2002，J.Clin.Microbiol.40，779-787)描述的所谓的反向线点(RLB，reverse line blot)测定法执行。为了这个目的，优选合成带有用于随后固定在例如羧基涂覆的尼龙膜上的5’氨基的RLB探针。
可替换地，该方法可以包括原位杂交试验，其中使靶核酸和与所述核酸序列的至少一部分互补或部分互补并能够在严格条件下杂交到其上的探针原位接触。此种检测探针可以用可检测标签适当地标记。
核酸探针在检测DNA片段中的用途是本领域熟知的。这些方法主要包括使靶DNA与探针杂交，接着进行杂交后洗涤。特异性典型地为杂交后洗涤的功能(function)，关键因素是离子强度和最后洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交，该Tm可以由Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284(1984)的等式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L估算；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是该DNA中鸟嘌呤核苷和胞嘧啶的百分比，％form是该杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是碱基对中杂种(hybrid)的长度。该Tm是(在限定的离子强度和pH下的)温度，在该温度下50％的互补靶序列杂交到最优匹配的探针上。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因而，该杂交和/或洗涤条件可被调节从而与期望同一性的序列杂交。例如，如果搜寻同一性＞90％的序列，则可以使Tm降低10℃。一般而言，严格条件选择为在限定的离子强度和pH下比特异序列及其互补体热熔点低5℃的温度。然而，严重严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃的温度下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10℃的温度下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的温度下的杂交和/或洗涤。利用该等式，杂交和洗涤组合物，以及期望的Tm，技术人员将理解，杂交严格度和/或洗涤溶液的变化是固有的描述(inherently described)。如果期望的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增大SSC浓度以便可以采用较高的温度。
SEQ ID NO：1、2和3的核酸序列代表与QTL连锁的标记，该QTL与连锁群4上葫芦科植物中的CYSDV抗性关联。这些标记与抗性位点紧密连锁，因而对于葫芦科植物和种质中存在CYSDV抗性表现出非常高的预测值。
根据本发明的测试方法因而可以适宜地用作对植物、种质，以及葫芦科植物系如黄瓜植物、黄瓜植物群体和/或黄瓜系进行基因分型以便确定存在与CYSDV关联的目标(subject)基因标记的方法。实质上，本发明提供了对从一种或多种植物分离的DNA样品进行分子标记分析的方法。
本文提及的分子标记指示存在至少一个具有与CYSDV抗性连锁的多态性序列的等位基因。
SEQ ID NO：1是与抗性关联的INDEL标记，其表示相对于易感植物或种质相应位点中的序列，基因组DNA序列中插入了18个核苷酸。SEQ ID NO：1和2对应于本文所指CYSDV-QTL-1的标记位点E16/M55-F-112/130。这个位点是双等位基因。该抗性位点(由SEQ IDNO：1表示)包含相对于易感位点(SEQ ID NO：2表示的)的多核苷酸插入5’-CTGTGTTTATAATCCCAT-3’。因而，本文所述的本发明方法可以包含检测存在SEQ ID NO：1相对于SEQ ID NO：2的多态性中的至少一个。
对于减小包含源于黄瓜登录号Khira PI250147的连锁群IV上的CYSDV抗性等位基因的渐渗尺寸(the size of the introgression)的目的，有利地采用根据本发明的测试方法。利用紧密连锁的标记的渐渗的减少使得这个位点周围的重组体容易被识别。示出这种应用的实例是早期专利申请WO2007/053015中描述的，CYSDV和PM抗性位点之间的重组。小基因组区域的精确渐渗是插入一种性状而不丧失另一种性状所必需的。另一个实例是除去与CYSDV关联的连锁累赘(linkage drag)，其可以包括诸如坏疽和/或大果顶(large blossom end)的阴性性状(negative trait)。
连锁群IV由RFLP标记(括号中为以cM计的图位(图谱位置，map position))CsC477H3(16.3)、CsC032a/E1(30.2)、CsP357/H3(36.9)、CsC588/H3(39.7)、CsP046/E1(43.1)、CsC694/E5(44.6)、CsP347/H3(44.6)、CsC365/E1(53.3)、CsC386/E1(53.3)和CsC230/E1(54.8)表示。本发明方法中使用的核酸样品因而可以适宜地为来自植物或植物种质(例如，种子)的核酸样品。这里无需详细描述从植物或种质中分离核酸的方法，因为它们是本领域熟知的(参见，例如，Kang等人，1998.Plant Molecular Biology Reporter 16：1-9；WO/2004/056984)。
本发明方面中使用的植物优选为葫芦科植物，还更优选为黄瓜。考虑在内的是，该标记不仅可以在PI250147Khira抗性渐渗到黄瓜中的情况中有实用性，而且在基于Khira-地方品种的CYSDV抗性越过物种界线，即，渐渗到其它葫芦科植物中后，该方法可以有更广的适用性。
据认为，可通过本发明方法检测的CYSDV-QTL-1可以提供对黄瓜植物中的CYSDV的至少部分抗性。当需要植物中的完全抗性时，除了确定存在CYSDV-QTL-1之外，还确定存在WO02/22836中识别的CYSDV-QTL-2作为本发明方法中另外步骤的一部分。WO02/22836说明书明确提及了与QTL-2连锁的标记和可用作本发明检测方法中靶和引物序列的序列。
植物育种的目的是将各种期望的性状结合到单个变种或杂种中。对于商业农作物，这些期望的性状可以包括抗病和虫害；耐热和干旱；缩短农作物成熟时间；植物特征的一致性如出芽和起身期(standestablishment)、生长速率、成熟期和植物高度；以及改进的农艺学品质如更大产率、开花、植物生长和/或植物结构。
通常，期望性状的育种以育种系或优良系的建立而告终，该育种系和优良系通常为生产商业杂交种子的母体。因而，本发明的优选方面涉及将在本文后面详细描述的优良系。
当前育种计划涉及广泛的基因分型工作。实际上，当对植物执行本发明方法时，该方法有利地作为在具有选自SEQ ID NO：1、2和3的核酸序列的标记的基因标记位点处对植物或种质进行基因分型的方法的一部分，因为已发现这些标记位点与CYSDV抗性相结合，特别是基于源自与此种抗性关联的黄瓜登录号Khira PI250147的基因组渐渗。
根据本发明的基因分型方法包括第一步骤：将扩增引物或扩增引物对与核酸样品混合而扩增该核酸序列或其部分的标记位点，其中该引物或引物对与标记位点或所述核酸序列的至少一部分互补或部分互补，并且其中该引物或引物对能够利用所述核酸作为模板通过DNA聚合酶启动DNA聚合。
根据本发明的基因分型方法包括第二步骤：在包含DNA聚合酶和所述模板核酸的NDA聚合反应中延伸该引物或引物对从而产生至少一个扩增子，以及可选地检测所得所扩增的标记扩增子中的所述核酸序列。
当使用非特异性引物扩增标记(的部分)时，检测标记扩增子中的核酸序列是特别有益的。当使用仅退火至SEQ ID NO 1、2或3的多态性序列或SEQ ID NO 1相对于SEQ ID NO 2的多态性核苷酸的特异性引物时，标记扩增子的产生指示存在SEQ ID NO 1、2和/或3的核酸序列。
仅扩增特异性标记序列的引物的实例是SEQ ID NO：4和5的引物。使用这些引物可以产生这样的扩增子，其具有的尺寸为抗性等位基因的109个碱基对和易感等位基因的91个碱基对，如以下更详细描述的。
在另一方面，本发明提供了选择植物或种质的方法。该选择方法涉及执行以下方法：测试核苷酸样品中存在选自本文所述SEQ IDNO 1、2和3的至少一个(多态性)核酸序列，接着选择具有选自SEQ ID NO 1和3的至少一个核酸序列的植物或种质用于进一步育种目的。SEQ ID NO 1和3指示包含抗性等位基因的植物。
如此选择的植物在与CYSDV抗性关联的至少一个所选基因标记位点处具有期望的基因型。此种植物可以用作创建育种群体的亲本。例如，选择植物的方法可以提供黄瓜植物或黄瓜系，基于它们的基因型，预测它们可以产生具有CYSDV抗性的超亲分离子(transgressive segregants)。
在另一方面，本发明提供了植物育种方法。本发明中考虑的育种方法实质上是标记辅助方法。该方法包括利用上述选择方法选择植物或种质，以及使如此选择的植物或种质与优选来自优良植物系的第二植物或种质杂交从而生产后代植物或种质。对于生产包含所述核酸序列和/或表现出CYSDV抗性的黄瓜植物，这种植物育种方法是有利的。特别地，此种方法利用至少一种基因标记从通过标记辅助选择的黄瓜育种群体中选择黄瓜植物，并使所选黄瓜植物与第二黄瓜植物杂交，其中该杂交的后代黄瓜植物产生关于CYSDV抗性的超亲分离子，该超亲分离子表现出对CYSDV的抗性。
可以再次测试该后代植物中存在以SEQ ID NO：1、2和3为特征的标记，或与期望性状关联的任何其它标记。特别地，该测试可以识别包含与CYSDV抗性连锁的至少一种标记的植物。
在又一些其它可替换的实施方式中，可以利用生物测定法测试该后代植物是否表现出期望性状，包括CYSDV抗性。
虽然本发明方法并没有局限于此，但其有利地对来自与本文限定的CYSDA标记相关和/或与CYSDV抗性相关的分离群体的后代种子或后代植物执行该方法。
在本发明育种方法中识别并选择了合适的后代植物或种质后，可将它用于进一步的育种目的。本文限定的进一步育种目的可以包含回交、自交、异交和植物选择中的一个或多个步骤。优选地，回交和选择进行约4～约9代或循环，合适地约7代或循环，以便提供基本纯合的育种亲本。
可以再次分析由上述方法产生的植物或种质中存在与CYSDV抗性连锁的SEQ ID NO：1或3标记。优选地，当与在第一杂交中用作原始亲本的第二黄瓜植物或种质相比时，如此识别的植物表现出增强的CYSDV抗性。
本发明也涉及新颖性和创造性的分离的核酸分子。此种分子包含例如具有SEQ ID NO：1、2和3中任何一个序列的核酸分子；10～50个核苷酸长度并与SEQ ID NO：1、2或3具有至少80％，优选至少85、88、91、93、95、96、97、98或99％序列同一性的核酸分子；能够在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1、2或3序列的核酸分子杂交的核酸分子；以及与前面核酸分子中任何一种互补的核酸分子。
这里描述的核酸分子可以适宜地用作本发明方法中的杂交探针或扩增引物。
在另一方面，本发明提供了检测与本文所述CYSDV抗性连锁的标记的寡核苷酸探针或引物。本文的检测探针和引物选择为与通过本发明扩增反应产生的双链DNA扩增子的其中一个链“基本”互补。允许本发明检测探针和引物包含与它们靶序列的一个或多个错配。一般而言，表现出与靶DNA寡核苷酸序列至少65％，更优选至少80％同源性的序列被认为适合用在本发明方法中。
现通过下列非限制性实施例描述本发明。
实施例
实施例1.发现与对黄瓜中CYSDV有抗性的QTL1紧密连锁的标记
标记
对黄瓜中CYSDV有抗性的QTL1的位置先前已通过AFLP连锁作图研究，如WO02/22836中描述的。通过对带有相反表型(抗性和易感性)的多重F2池执行分群分析法(分组分析法，bulked segregantanalysis(BSA))，从而精细地定位(Fine-mapping)对黄瓜中CYSDV有抗性的QTL1。这导致另外的AFLP标记。通过BSA识别的标记定位在F2个体和QTL异基因重组体(QIR)上。
解释了CYSDV抗性水平的表型值，如此识别出比WO02/22836中描述的那些更紧密连锁的三个标记QTL1：E23/M60-F-187-P1、E16/M55-F-130-P1和E16/M55-F-112-P2。定位在QTL-1内的标记位点和CYSDV抗性似乎如此紧密地连锁在染色体上，以至于它们在多于95％，优选多于97％的减数分裂中一起遗传(标记E23/M60-F-187-P1和E16/M55-F-112/130-P1之间的距离为1.5cM)。本文考虑了，标记E23/M60-F-187-P1和E16/M55-F-130-P1之一甚至更紧密地连锁到在多于99％的减数分裂中与其一起遗传的抗性位点上。因而，在每代的标记位点和抗性之间观察到的重组率(厘摩，cM)将小于5。在本发明的特定实施方式中，基因连锁的位点在染色体上可以相距2，或1，或更小的cM。
标记序列
确定了最紧密排列(lined)的AFLP标记的碱基对序列。标记E16/M55-F-130-P1似乎是E16/M55-F-112-P2的等位基因，因为这两个片段是相同的，除了18个碱基对序列的插入/缺失(INDEL)差异之外。确定AFLP标记E16/M55-F-130-P1和E16/M55-F-112-P2的序列如下：
抗性等位基因：E16/M55-F-130(5’到3’)：
GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCA
TCTGTGTTTA TAATCCCATC TGTGTTTATA ATCCCATTTT GAATAAGGTC
GTTAA
易感等位基因：E16/M55-F112(5’到3’)：
GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCA
TCTGTGTTTA TAATCCCATT TTGAATAAGG TCGTTAA
未识别到标记E23/M60-F-187-P1的多态性。确定的AFLP标记E23/M60-F-187-P1序列如下：
抗性等位基因：E23/M60-187(5’到3’)：
GAATTCTAAA ATTTAGAATA TAATTCGATA TTTCTCTAAA AAAGACAAAA
TAAAAAGAAT GAGTAGAAAA CTATAGAAAG AGGCAGAATC GTGTGAATGA
AAGATAAAAG AGAATAGTAA CGAAGAATTT TCCAGACGTG TTCAAATGGT
TGATATGAGT TAA
预测值
性状和标记之间的遗传连锁确定了间接选择的预测值标记。所有AFLP标记的预测值都通过筛选源自不同育种计划的一系列38个近交系确定(图3)。然后，将该基因型与相应的表型进行比较。标记E23/M60-F-187-P1和双等位基因标记E16/M55-F-112/130的基因型总是与所测试近交系表型相对应。这与以下结论一致：标记E23/M60-F-187-P1和双等位基因标记E16/M55-F-112/130与CYSDVQTL1紧密连锁。此外，标记E23/M60-F-187-P1和双等位基因标记E16/M55-F-112/130具有100％的预测值。因而，标记E23/M60-F-187-P1和E16/M55-F-112/130对标记辅助育种计划中的间接选择特别有用。
实施例2.SCAR标记开发
将标记E16/M55-F-130/112转化成SCAR(序列特征的扩增区域)标记，其可以通过聚合酶链反应测定法检测。设计引物，并开发热循环条件。
PCR引物
针对AFLP标记E16/M55-F-130/112设计以下PCR引物：
正向引物：
5’-AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGACACACT GGTACGAACCCAATTCAATT CCCTTTTC-3’
反向引物：
5’-AACGACCTTATTCAAAATGGGAT-3’
PCR热循环
该PCR反应混合物由1.5μl 5.0μM正向引物、1.5μl 5.0μM反向引物、0.20μl 20.0mM(每种)dNTP混合物、2.0μl 10x Taq PCR缓冲液、1.2μl 25.0mM MgCl2、0.1μl 5.0单位/μl Taq DNA聚合酶(例如，New England Biolabs，MA，USA)10pg-1μg模板DNA以及无菌去离子水组成从而使该混合物体积为20μl。该PCR反应由94℃的变性(3.0分钟)，此后是94℃变性(0.5分钟)、54℃退火(1.0分钟)和72℃延伸(1.0分钟)的35次循环，以及72℃最后延伸(5分钟)组成，接着储存在4℃下。
结果
测试了25个近交系的SCAR标记(图1)。结果与AFLP基因分型一致。AFLP分值(A)证实抗性等位基因的存在，通过109个碱基对的扩增DNA片段证明。AFLP分值(B)与有18个碱基对缺失的91个碱基对的易感等位基因的存在关联。因而，利用SCAR和AFLPE16/M55-F-112/130标记的基因分型总是给出相同的结果。因此，SCAR标记可以与AFLP E16/M55-F-112/130类似的方式应用于标记辅助育种。
序列表
<110>De Ruiter Seeds R&D B.V.
<120>CYSDV抗性黄瓜植物的育种方法
<130>P86308EP00
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>105
<212>DNA
<213>AFLP标记E16/M55-F-130
<400>1
GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCA TCTGTGTTTA    60
TAATCCCATC TGTGTTTATA ATCCCATTTT GAATAAGGTC GTTAA
<210>2
<211>87
<212>DNA
<213>AFLP标记E16/M55-F-112
<400>2
GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCA TCTGTGTTTA    60
TAATCCCATT TTGAATAAGG TCGTTAA
<210>3
<211>105
<212>DNA
<213>AFLP标记E23/M60-F-187
<400>3
GAATTCTAAA ATTTAGAATA TAATTCGATA TTTCTCTAAA AAAGACAAAA TAAAAAGAAT    60
GAGTAGAAAA CTATAGAAAG AGGCAGAATC GTGTGAATGA AAGATAAAAG AGAATAGTAA    120
CGAAGAATTT TCCAGACGTG TTCAAATGGT TGATATGAGT TAA
<210>4
<211>58
<212>DNA
<213>设计用于双等位基因AFLP标记E16/M55-F-130/112的SCAR标记的正向引物
<400>4
AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGACACACT GGTACGAACC CAATTCAATT CCCTTTTC
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>设计用于双等位基因AFLP标记E16/M55-F-130/112的SCAR标记的反向引物
<400>5
AACGACCTTA TTCAAAATGG GAT
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>多态性多核苷酸双等位基因AFLP标记E16/M55-F-130/112
<400>6
CTGTGTTTAT AATCCCAT
Figure IDA0000097844120000011

Claims (18)

1.一种测试核酸样品中存在选自SEQ ID NO：1、2和3中的至少一种核酸序列的方法，包括确定所述核酸样品中存在包含选自SEQ IDNO：1、2和3中的核酸序列的核酸的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括检测SEQ ID NO：1相对于SEQ ID NO：2的多态性中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸样品是来自植物、植物种质或植物系的样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述植物是葫芦科植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述葫芦科植物是黄瓜。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述方法是在与CYSDV抗性关联的至少一个基因标记位点处对植物或种质进行基因分型的方法的一部分，所述CYSDV抗性具有含有选自SEQ IDNO：1、2和3中的核酸序列的标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括：
a)通过将扩增引物或扩增引物对与所述核酸样品混合，扩增所述核酸序列或其部分的标记位点，其中，所述引物或引物对与所述标记位点或所述标记核酸序列的至少一部分互补或部分互补，并且其中，所述引物或引物对能够利用所述样品核酸作为模板核酸、通过DNA聚合酶启动DNA聚合，以及
b)在包含DNA聚合酶和所述模板核酸的DNA聚合反应中延伸所述引物或引物对，以产生至少一个扩增子，以及可选地检测所得的经扩增的标记扩增子中的所述核酸序列。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
a)可选地，通过将扩增引物或扩增引物对与所述核酸样品混合，扩增所述核酸序列或其部分的标记位点，其中，所述引物或引物对与所述标记位点或所述标记核酸序列的至少一部分互补或部分互补，并且其中，所述引物或引物对能够利用所述样品核酸作为模板核酸、通过DNA聚合酶启动DNA聚合，以及
b)通过确定所述植物或种质的基因组核酸、或可选地经扩增的标记位点的熔融曲线，以及在所述熔融曲线指示存在所述多态性的情况下确立所述标记位点中所述标记核酸序列的存在，从而确定在所述植物或种质的基因组中、或可选地在经扩增的标记位点中存在所述标记核酸序列。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，所述引物或引物对选自SEQ ID NO：4和5构成的组。
10.一种选择植物或种质的方法，包括执行根据权利要求3-9中任一项所述的方法和选择具有选自SEQ ID NO：1和3中的至少一种核酸序列的植物或种质用于进一步育种目的。
11.一种植物育种方法，包括通过根据权利要求10所述的方法选择植物或种质，和使所述选择的植物或种质与第二植物或种质杂交从而产生后代植物或种质，所述第二植物优选来自优良植物系。
12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括以下步骤：分析从一种或多种所述后代植物或种质中分离的DNA样品中存在选自SEQ IDNO：1、2和3中的至少一种核酸序列，其中，所述分析识别出包含与CYSDV抗性连锁的至少一种标记的植物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述后代植物或种质来自与所述至少一种核酸序列的存在有关、和/或与CYSDV抗性有关的分离群体。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，进一步包括回交、自交、异交和植物选择中的一个或多个步骤。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，进一步包括对从利用所述方法产生的一种或多种植物中分离的DNA样品进行分子标记分析的步骤，其中，所述分析识别出包含与CYSDV抗性连锁的SEQ IDNO：1或3中的至少一种标记的植物，所述标记可选地与连锁至WO02/22836中被识别为QTL-2的数量性状位点的标记相结合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，当与所述第二黄瓜植物或种质相比时，所述被识别出的植物表现为对CYSDV的抗性增强。
17.一种分离的核酸分子，选自以下构成的组：
a)具有SEQ ID NO：1、2和3中任何一个的序列的核酸分子；
b)具有10至50个核苷酸长度并且与SEQ ID NO：1、2和3中任何一个具有至少80％的序列同一性的核酸分子；
c)能够在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1、2和3中任何一个的序列的核酸分子杂交的核酸分子；
d)与a)至c)中任何一个的核酸分子互补的核酸分子。
18.根据权利要求17所述的核酸分子作为杂交探针或扩增引物的用途。
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