BRPI0712514B1 - Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem asiática da soja - Google Patents

Abstract

processo para identificar loci de caracteristicas quantitativas de resistência a doenças na soja e composições dos mesmos. a presente invenção refere-se ao campo de cruzamento e genética de plantas, partícularmente uma vez que pertence ao gênero, glycine. mais especificamente, a invenção refere-se ao processo para a seleção de plantas de soja contendo um ou mais loci de características quantitativas para resistência a doenças, a espécies de gfycine que possuem tais loci e a processos para o cruzamento e para a seleção de glycine com tais loci. a invenção refere-se ainda ao uso de germoplasma exótico em um programa de cruzamento.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA SELEÇÃO DE UMA PLANTA DE SOJA RESISTENTE À FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA (51) Int.CI.: C12Q 1/68; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 25/05/2006 US 60/808,430 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): GEORGE JAMES BALEY; DAVID VINCENT BUTRUILLE; SAMUEL R.

EATHINGTON; MICHAEL D.HAVERDINK; WARREN M. KRUGER; JOHN ROBERT LEDEAUX; JAMES NARVEL; JOHN W. PITKIN; JOHN TAMULONIS; CHONGQING ΧΙΕ; VERGEL C. CONCIBIDO

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA SELEÇÃO DE UMA PLANTA DE SOJA RESISTENTE À FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA.

Referência Cruzada Aos Pedidos de Patentes Relacionados

Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade ao Pedido de Patente U.S. Provisório N² de Série 60/808.430 depositado em 25 de maio de 2006.

Incorporação da Listagem de Sequências

Uma listagem de sequências está contida no arquivo nomeado pa_53517.txt que tem 65.000 bytes (medidos no MS-Windows) e foi criado em 22 de maio de 2007 e está alocado em uma forma que pode ser lida pelo computador em um disquete depositado com a presente invenção e é incorporado aqui como referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de cruzamento de plantas e resistência a doenças. Mais especificamente, a invenção refere-se a um método para a seleção de plantas do gênero Glycine contendo loci de características quantitativas que estão associadas com resistência a doenças e métodos para o cultivo de plantas de Glycine resistentes a doenças. A doença pode ser causada por um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado. A invenção refere-se ainda ao uso do número de acesso de germoplasma contendo loci de características quantitativas (QTL) que conferem resistência a doenças para introgressão no germoplasma de elite em um programa de cruzamento para resistência ao agente patogênico fúngico, Phakopsora pachyrhizi.

Antecedentes da Invenção

A soja, Glycine max (L.) Merril, é uma das plantas de cultivo econômicas principais cultivadas em todo o mundo como uma fonte primária de óleo e proteína vegetal (Sinclair e Backman, Compendium of Soybean Diseases, 3^a Ed. APS Press, St. Paul, MN, p. 106. (1989)). A demanda de cultivo para dietas com baixo teor de colesterol e alto teor de fibras também aumentou a importância da soja como um alimento saudável.

Os rendimentos de soja nos Estados Unidos da América são reduzidos a cada ano por doenças. Os altos rendimentos por hectare são críticos para uma margem de lucro do cultivador, especialmente durante pe5 ríodos de preços baixos para a soja. A perda financeira causada por doenças da soja é importante para as economias rurais e para as economias de indústrias aliadas em áreas urbanas. Os efeitos destas perdas são eventualmente sentidos em todo o mercado da soja por todo o mundo. As estimativas de perdas devido à doença nos Estados Unidos da América e em Ontá10 rio variam de ano para ano e por doença. De 1999 até 2002 as estimativas de perda no rendimento da soja estavam na faixa de 8 milhões de toneladas métricas até 10 milhões de toneladas métricas nos Estados Unidos da América e de 90.000 até 166.000 de toneladas métricas em Ontário (Wrather e outros, Online. Plant Health Progress do/. W:1094/PHP-2003-0325-01-RV).

A Ferrugem Asiática da Soja (referida aqui como ASR) foi relatada nos hemisférios oriental e ocidental. No hemisfério oriental, a ASR foi relatada na Austrália, na China, na índia, no Japão, em Taiwan e na Tailândia. No hemisfério ocidental, a ASR foi observada no Brasil, na Colômbia, na Costa Rica e em Porto Rico. A ASR pode ser uma doença devastadora, que causa perdas no rendimento de até 70 até 80% como é relatado em alguns campos em Taiwan. As plantas que são fortemente infectadas possuem menos vagens e sementes menores que possuem baixa qualidade (Frederick e outros, Mycology 92: 217-227 (2002)). A ASR foi primeiramente observada nos Estados Unidos da América no Havaí em 1994. A ASR foi introduzida depois no continente dos Estados Unidos da América no outono de 2004, presumidamente como uma consequência da atividade de tempestades tropicais. Previsões de modelo indicaram que a ASR foi amplamente dispersa ao longo de todo o sudeste dos Estados Unidos da América e observações subsequentes no campo e no laboratório confirmaram esta distribuição.

Duas espécies de fungos, Phakopsora pachyrhizi Sydow e Phakopsora meibomiae (Arthur) Arthur, causam ASR. Ao contrário de outras ferrugens, P. pachyrhizi e P. meibomiae infectam uma faixa extraordinariamente ampla de espécies de plantas. P. pachyrhizi é conhecido por infectar naturalmente 31 espécies em 17 gêneros de legumes e 60 espécies em 26 outros gêneros foram infectadas sob condições controladas. P. meibomiae infecta naturalmente 42 espécies em 19 gêneros de legumes e 18 espécies adicionais em 12 outros gêneros foram infectadas artificialmente. Vinte e quatro espécies de plantas em 19 gêneros são hospedeiras para ambas as espécies (Frederick e outros, Mycology 92: 217-227 (2002)).

Foram identificadas plantas de soja resistentes à ASR. Quatro QTL específicos à raça herdados independentemente dominantes para resistência a P. pachyrhizi, representados aqui como lócus 1 de resistência à ASR, lócus 2 de resistência à ASR, lócus 3 de resistência à ASR e lócus 4 de resistência à ASR, foram identificados em Pl 200492, Pl 230970, Pl 462312 (Ankur) e Pl 459025B, respectivamente. Estas linhagens, assim como outras sete, são suspeitas de conterem QTL para resistência à ASR. Pl 239871A e Pl 239871B (G. soja), Pl 230971 e Pl 459024B e os cultivares Taita Kaohsiung-5, Tainung-4 e Wayne têm sido utilizados como diferenciais para a identificação de nove raças no Asian Vegetable Research and Development Center, em Taiwan. A raça predominante era compatível com três ou mais dos diferenciais, indicando que algumas raças já possuem vários fatores de virulência para genes conhecidos e suspeitos para resistência. A resistência também ocorre entre a Glycine spp. do tipo selvagem da Austrália. A resistência redutora da taxa também foi demonstrada. Entretanto, é difícil avaliar este tipo de resistência porque a taxa de desenvolvimento de ferrugem é dependente do desenvolvimento e da maturidade da soja (Sinclair e outros, eds., Soybean rust workshop. College of Agricultural, Consumer e Environmental Sciences. Natl. Soybean Res. Lab. Publ. 1 (1996)).

A avaliação de plantas que poderíam potencialmente conter QTL conferindo resistência à ASR pode ser demorada e requerer grandes quantidades de espaço de contenção biológica. O cultivo de P. pachyrhizi requer o uso de uma câmara de contenção biológica aprovada. Em adição, estufas e câmaras de crescimento utilizadas para crescer plantas para o teste de resistência à ASR deverão ser construídas de uma maneira que previna a liberação acidental do organismo, especiaimente em localizações em que o organismo ainda não foi observado. Culturas diferentes de P. pachyrhizi podem possuir fatores de virulência diferentes. Ao longo do tempo, novas cepas de P. pachyrhizi podem ser introduzidas nos Estados Unidos da Améri5 ca. Portanto, qualquer programa de cruzamento planejado para criar resistência na soja contra a ASR precisará ser capaz de responder rapidamente às alterações na população de P. pachyrhizi. Ainda, o cruzamento de plantas de cultivo de soja utilizadas em outras localizações geográficas precisará selecionar a resistência às cepas específicas que afetam tais regiões, em adição ao fornecimento das características agronômicas que são preferidas por estes cultivadores em tal região. Há, portanto, uma grande necessidade de um método de alto rendimento rápido, eficiente em relação ao tempo e em relação ao custo para a seleção de germoplasma resistente à ASR. Este método não pode fornecer apenas rapidez e eficiência, mas também tem que ser capaz de ser realizado com uma quantidade mínima de espaço, permitindo a seleção de muitas amostras de uma vez.

A presente invenção fornece um método para a seleção de uma planta de soja que compreende QTL para resistência a doenças.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece um método para analisar plantas de soja em relação à resistência, à imunidade ou a susceptibilidade a doenças que compreende: (a) a separação de um tecido vegetal da planta de soja; (b) o cultivo do dito tecido em um meio; (c) a exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta; e (d) a avaliação do dito tecido em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade à doença causada pelo agente patogênico. Adicionalmente, a resposta da planta ao agente patogênico pode ser avaliada através das etapas a seguir (e) isolamento dos ácidos nucléicos (DNA e/ou RNA) da dita planta; (f) análise dos ditos ácidos nucléicos (DNA, RNA e/ou cDNA) em relação à presença de um ou mais marcado30 res moleculares para um lócus de característica quantitativa associado com a dita resistência, imunidade ou susceptibilidade; e (g) seleção da dita planta para uso em um programa de cruzamento. A determinação da resistência, da imunidade ou da susceptibilidade de uma planta a um agente patogênico particular é óbvia para qualquer versado na técnica. O tecido vegetal pode ser folha, tecido vascular, flor, vagem, raiz, caule, semente ou uma parte da mesma ou uma célula isolada do tecido. A exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta é realizada através de um meio selecionado do grupo que consiste em (a) aplicação direta do agente patogênico ao tecido; (b) inclusão do agente patogênico no meio de cultura; e (c) inclusão de um agente que é eficientemente contaminado com o agente patogênico e serve para inocular o tecido. O agente patogênico de planta pode ser um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado. A exposição ao agente patogênico de planta pode ser na forma de macromoléculas, células, tecidos do agente patogênico, do organismo inteiro ou de combinações dos mesmos, em que o agente patogênico ou partes do mesmo, está vivo ou morto contanto que o material medeie uma resposta imunológica no tecido hospedeiro. As macromoléculas de agente patogênico relevantes para a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a toxinas, paredes celulares ou membranas, antígenos e polissacarídeos.

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico fúngico selecionado do grupo que consiste em Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae (Ferrugem Asiática da Soja), Colletotríchum truncatum, Colletotríchum dematium var. truncatum, Glomerella glycines (Antracnose da Soja), Phytophthora sojae (podridão da raiz ou do caule causada por Phytophthora), Sclerotinia sclerotiorum (podridão do caule causada por Sclerotinia), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomina phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (Mancha Parda), Pythium aphanidermatum, Pythium debaryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myriotylum, Pythium torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (Podridão da vagem), Phomopsis longicola (Podridão de caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Peronospora manshurica (Míldio Felpudo), Rhizoctonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (Podridão Parda do Caule), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (Cancro do Caule), Cercospora kikuchii (Mancha Púrpura da Semente), Alternaria sp. (Mancha Alvo), Cercospora sojina (Mancha foliar olho de rã), Sclerotium rolfsii (Podridão das estacas), Arkoola nigra (Deterioração foliar negra), Thielaviopsis basicola, (Podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Mycoleptodiscus terrestris (podridão da raiz causada por Mycoleptodiscus), Neocosmospora vasinfecta (podridão do caule causada por Neocosmospora), Phyllosticta sojicola (mancha foliar causada por Phyllosticta), Pyrenochaeta glycines (mancha foliar causada por Pyrenochaeta), Cylindrocladium crotalariae (Mancha foliar), Dactuliochaeta glycines (Mancha foliar vermelha), Spaceloma glycines (Sarna), Stemphylium botryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora cassiicola (Mancha Alvo), Nematospora coryli (Mancha causada por levedura) e Phymatotrichum omnivorum (Podridão da raiz de algodão).

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico viral selecionado do grupo que consiste em Alfamovirus (Vírus mosaico da alfafa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado clorótico do feijão-fradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-daChina, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV) e Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV).

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico bacteriano selecionado do grupo que consiste em Bacillus subtilis (decomposição de sementes causada por Bacillus), Pseudomonas savastonoi pv. glycinea (Deterioração bacteriana), Pseudomonas syríngae subsp. syringae (Folha enrugada causada por bactérias), Xanthomonas axonovagemis pv. glycines, (Pústula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, (Mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (Murchamento causado por bactérias) e Pseudomonas syringae pv. tabaci (Mancha aureolada wildfire).

A presente invenção compreende ainda um QTL que confere resistência a doenças causadas por um agente patogênico invertebrado selecionado do grupo que consiste em Aphis glycines (Afídeo da soja), Heterodera glycines (Nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica (Nematóide das galhas radiculares), Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus (Nematóide em arpão), Pratylenchus spp. (Nematóide das lesões), Paratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus (Nematóide em forma de pino), Rotylenchulus reniformis (Nematóide reniforme), Criconemella ornata (Nematóide em anel), Hemicycliophora spp. (Nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (Nematóide espiralado), Belonolainus gracilis, Belonolainus longicaudatus (Nematóide de ferrão), Quinisulcius acutus, Tylenchorhynchus spp. (Nematóide atrofiador) e Paratrichodorus minor (Nematóide das raízes em coto).

A presente invenção fornece ainda tecido e plantas de soja selecionados que são resistentes a Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae (Ferrugem Asiática da Soja), Colletotríchum truncatum, Colletotrichum dematium var. truncatum, Glomerella glycines (Antracnose da Soja), Phytophthora sojae (Podridão da raiz ou do caule causada por Phytophthora), Sclerotinia sclerotiorum (Podridão do caule causada por Sclerotinia), Fusarium solanif. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomina phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (Mancha Parda), Pythium aphanidermatum, Pythium debaryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myríotylum, Pythium torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (Podridão da vagem), Phomopsis longicola (Podridão de caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis'), Peronospora manshurica (Míldio Felpudo), Rhizoctonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (Podridão Parda do Caule), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (Cancro do Caule), Cercospora kikuchii (Mancha Púrpura da Semente), Alternaria sp. (Mancha Alvo), Cercospora sojina (Mancha foliar olho de rã), Sclerotium rolfsii (Podridão das estacas), Arkoola nigra (Deterioração foliar negra), Thielaviopsis basicola, (Podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Mycoleptodiscus terrestris (podridão da raiz causada por Mycoleptodiscus), Neocosmospora vasinfecta (podridão do caule causada por Neocosmospora), Phyllosticta sojicola (mancha foliar causada por Phyllosticta), Pyrenochaeta glycines (Mancha foliar causada por Pyrenochaeta), Cylindrocladium crotalariae (Mancha foliar (Red crown rot)), Dactuliochaeta glycines (Mancha foliar vermelha (Red leaf blotch)), Spaceloma glycines (Sarna), Stemphylium botryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora cassiicola (Mancha Alvo), Nematospora coryli (Mancha causada por levedura), Phymatotrichum omnivorum (Podridão da raiz de algodão), Alfamovirus (Vírus mosaico da alfafa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado clorótico do feijãofradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-da-China, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV), Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV), Bacillus subtilis (decomposição de sementes causada por Bacillus), Pseudomonas savastonoi pv. glycinea (Deterioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syringae (Folha enrugada causada por bactérias), Xanthomonas axonovagemis pv. glycines, (Pústula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, (Mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (Murchamento causado por bactérias), Pseudomonas syringae pv. tabaci (Mancha aureolada), Aphis glycines (Afídeo da soja), Heterodera glycines (Nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica (Nematóide das galhas radiculares), Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus (Nematóide em arpão), Pratylenchus spp. (Nematóide das lesões), Paratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus (Nematóide em forma de pino), Rotylenchulus reniformis (Nematóide reniforme), Criconemella ornata (Nematóide em anel), Hemicycliophora spp. (Nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (Nematóide espiralado), Belonolainus gracilis, Belonolainus longicaudatus (Nematóide de ferrão), Quinisulcius acutus, Tylenchorhynchus spp. (Nematóide atrofiador) ou Paratrichodorus minor (Nematóide das raízes em coto).

A presente invenção fornece ainda que a planta selecionada é do grupo que consiste nos membros do gênero Glycine, mais especificamente do grupo que consiste em Glycine arenaria, Glycine argyrea, Glycine canescens, Glycine dandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine falcate, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine max, Glycine microphylla, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Glycine rubiginosa, Glycine soja, Glycine sp., Glycine stenophita, Glycine tabacina e Glycine tomentella.

A presente invenção fornece ainda que o meio utilizado no método para seleção é compreendido de água que não é tratada, destilada ou deionizada. O meio pode conter quaisquer ingredientes necessários para manter o agente patogênico ou o tecido vegetal, contanto que os ingredientes não interfiram na expressão de resistência que é conferida pelo QTL.

A presente invenção fornece ainda uma planta de soja selecionada utilizando o dito método.

A presente invenção fornece ainda um QTL que é selecionado do grupo que consiste no lócus de tolerância à infecção por Phytophthora (podridão da raiz, do lócus de resistência a Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), do lócus de resistência a Cercospora sojina (Mancha foliar olho de rã), do lócus de resistência a Phialophora gegata (Podridão Parda do Caule), do lócus de resistência a Sclerotinia (podridão do caule), do lócus 1 de resistência à ASR, do lócus 2 de resistência à ASR, do lócus 3 de resistência à ASR, do lócus 4 de resistência à ASR, do lócus 5 de resistência à ASR, do lócus 6 de resistência à ASR, do lócus 7 de resistência à ASR, do lócus 8 de resistência à ASR, do lócus 9 de resistência à ASR, do lócus 10 de resistência à ASR, do lócus 11 de resistência à ASR, do lócus 12 de resistência à ASR e do lócus 13 de resistência à ASR.

A presente invenção fornece ainda que a planta selecionada contém um ou mais QTLs de resistência a doenças fúngicas, incluindo o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR.

A presente invenção fornece ainda um ou mais loci marcadores de polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) para o lócus 1 de resistência à ASR, em que o dito marcador de SNP é selecionado do grupo que consiste em NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454,

NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943,

NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343 e NS0101121. Um ou mais loci marcadores de SNP para o lócus 3 de resistência à ASR também são fornecidos, em que o dito marcador de SNP é selecionado do grupo que consiste em NS0099746, NS0123747, NS0126598, NS0128378,

NS0096829, NS0125408, NS0098902, NS0099529, NS0097798,

NS0137477, NS0095322, NS0136101 e NS0098982. Um exemplo de lócus marcador de SNP, NS0103033, é fornecido para o lócus 5 de resistência à

ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR e o lócus 9 de resistência à ASR. Um outro exemplo de lócus marcador de SNP, NS0124935, é fornecido para o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. Ainda, um ou mais marcadores mapeados dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras podem ser utilizados para a seleção e para a introgressão dos loci de resistência à ASR.

A presente invenção fornece ainda um método para a seleção e para a introgressão de resistência à ASR na soja que compreende: (a) o isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; (b) a detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com os loci 1-13 de resistência à ASR, em que a dita molécula marcadora é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67 até 99 e qualquer molécula marcadora mapeada dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras; e (c) a seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resistente à ASR.

A presente invenção fornece ainda uma planta de soja selecionada utilizando o dito método.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção fornece um método para a seleção de plantas de soja em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença fúngica. Em uma modalidade preferida a planta é selecionada do gênero Glycine. As sojas perenes selvagens pertencem ao subgênero Glycine e possuem um amplo arranjo de diversidade genética. A soja cultivada (Glycine max (L.) Merr.) e sua progenitora anual selvagem (Glycine soja (Sieb. e Zucc.)) pertencem ao subgênero Soja, contêm 2n = 40 cromossomos, são compatíveis para cruzamento, produzem geralmente híbridos F1 férteis vigorosos e carregam genomas similares. São possíveis os cruzamentos entre espécies cultivadas de Glycine e espécies perenes selvagens de Glycine, cujo sucesso é variável entre os números de acesso. Investiga12 ções mostraram que vários números de acesso de Glycine perenes selvagens carregam resistência à Mancha Parda, à ferrugem da soja, à podridão da raiz, ao vírus mosaico amarelo e ao míldio pulverulento. Há mais de 100.000 números de acesso de Glycine max, provavelmente menos de 10.000 números de acesso de Glycine soja e aproximadamente, 3500 números de acesso de espécies perenes de Glycine em coleções de germoplasma ao longo de todo o mundo. Os números exatos não são conhecidos. As coleções principais de Glycine existem na Austrália, no Brasil, na China, na Alemanha, na índia, na Indonésia, no Japão, na Rússia, na Coréia do Sul e nos Estados Unidos da América. Muitas outras coleções menores, mas importantes, existem ao longo da Ásia e da Europa. Não é sabido quantos são os números de acesso duplicados entre as coleções. A USDA Soybean Germplasm Collection é uma das maiores coleções e a maior fora da Ásia (Verma e outros, eds., Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology (1996)). Contém atualmente 20.765 números de acesso, compreendidos de 19 coleções de espécies, incluindo 18.680 números de acesso de Glycine max e 1.166 números de acesso de Glycine soja assim como espécies perenes de Glycine.

Em uma modalidade preferida, uma planta de soja é analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a doenças compreendendo: (a) a separação de um tecido vegetal da planta de soja; (b) o cultivo do dito tecido em um meio; (c) a exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta; e (d) a avaliação do dito tecido em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade à doença causada pelo agente patogênico. Adicionalmente, a resposta da planta ao agente patogênico pode ser avaliada através das etapas a seguir (e) de isolamento de ácidos nucléicos da dita planta; (f) de análise dos ditos ácidos nucléicos em relação à presença de um ou mais marcadores moleculares para um lócus de característica quantitativa associado com a dita resistência, imunidade ou susceptibilidade; e (g) de seleção da dita planta para uso em um programa de cruzamento. A determinação de resistência, imunidade ou susceptibilidade de uma planta a um agente patogênico particular é óbvia a qualquer versado na técnica. O tecido vegetal pode ser folha, tecido vascular, flor, vagem, raiz, caule, semente ou uma parte dos mesmos ou uma célula isolada do tecido. A exposição do dito tecido a um agente patogênico de planta é realizada através de um meio selecionado do grupo que consiste em (a) aplicação direta do agente patogênico ao tecido; (b) inclusão do agente patogênico no meio de cultura; e (c) inclusão de um agente que é eficientemente contaminado com o agente patogênico e serve para inocular o tecido. O agente patogênico de planta pode ser um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado. A exposição ao agente patogênico de planta pode ocorrer na forma de macromoléculas, células, tecidos, organismo inteiro do agente patogênico ou combinações dos mesmos, em que o agente patogênico e partes do mesmo, são vivos ou mortos contanto que o material medeie uma resposta imunológica no tecido hospedeiro. As macromoléculas do agente patogênico relevantes para a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a toxinas, paredes ou membranas celulares, antígenos e polissacarídeos.

Em uma modalidade preferida, o tecido de folha pode compreender uma folha de cotilédone, uma folha unifoliada, uma folha trifoliada e prófilos. Há quatro tipos de folhas de soja: 1) o primeiro par de cotilédones simples ou folhas de semente, 2) o segundo par de folhas primárias simples, também conhecidas como folhas unifoliadas, 3) as folhas de folhagem trifoliadas e 4) os prófilos, que são partes da planta que se assemelham a folhas. As folhas unifoliadas ocorrem no primeiro nó acima dos cotilédones. Todas as outras folhas seriam trifoliadas, em que o primeiro par a emergir após as unifoliadas é o das primeiras folhas trifoliadas, que são seguidas pela emergência das segundas folhas trifoliadas e então das terceiras folhas trifoliadas (H.R. Boerma e J.E. Specht (ed.) Soybean Monograph, 3^â Edição, Am. Soc. Agron., Madison, Wl (2004)).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença fúngica. As doenças da soja causadas pelos fungos incluem, mas não estão limitadas a Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae (Ferrugem Asiática da Soja), Colletotrichum truncatum,

Colletotrichum dematium var. truncatum, Glomerella glycines (Antracnose da Soja), Phytophthora sojae (Podridão da raiz ou do caule causada por Phytophthora), Sclerotinia sclerotiorum (Podridão do caule causada por Sclerotinia), Fusarium solani f. sp. glycines (síndrome de morte súbita), Fusarium spp. (podridão da raiz causada por Fusarium), Macrophomina phaseolina (podridão cinzenta), Septoria glycines, (Mancha Parda), Pythium aphanidermatum, Pythium debaryanum, Pythium irregulare, Pythium ultimum, Pythium myriotylum, Pythium torulosum (decomposição de sementes causada por Pythium), Diaporthe phaseolorum var. sojae (Podridão da vagem), Phomopsis longicola (Podridão de caule), Phomopsis spp. (decomposição de sementes causada por Phomopsis), Peronospora manshurica (Míldio Felpudo), Rhizoctonia solani (podridão da raiz e caule causada por Rhizoctonia, podridão aérea causada por Rhizoctonia), Phialophora gregata (Podridão Parda do Caule), Diaporthe phaseolorum var. caulivora (Cancro do Caule), Cercospora kikuchii (Mancha Púrpura da Semente), Alternaria sp. (Mancha Alvo), Cercospora sojina (Mancha foliar olho de rã), Sclerotium rolfsii (Podridão das estacas), Arkoola nigra (Deterioração foliar negra), Thielaviopsis basicola, (Podridão negra da raiz), Choanephora infundibulifera, Choanephora trispora (deterioração foliar causada por Choanephora), Leptosphaerulina trifolii (mancha foliar causada por Leptosphaerulina), Mycoleptodiscus terrestris (podridão da raiz causada por Mycoleptodiscus), Neocosmospora vasinfecta (podridão do caule causada por Neocosmospora), Phyllosticta sojicola (mancha foliar causada por Phyllosticta), Pyrenochaeta glycines (Mancha foliar causada por Pyrenochaeta), Cylindrocladium crotalariae (Mancha foliar), Dactuliochaeta glycines (Mancha foliar vermelha), Spaceloma glycines (Sarna), Stemphylium botryosum (deterioração foliar causada por Stemphylium), Corynespora cassiicola (Mancha Alvo), Nematospora coryli (Mancha causada por levedura) e Phymatotrichum omnivorum (Podridão da raiz de algodão).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença viral. As doenças da soja causadas por vírus incluem, mas não estão limitadas a Alfamovirus (Vírus mosaico da alfafa, AMV), Comovirus (vírus do mosqueado do feijoeiro, BPMV), Potyvirus (vírus mosaico amarelo do feijoeiro, BYMV), Bromovirus (vírus do mosqueado clorótico do feijão-fradinho, CCMV), Begomovirus (vírus mosaico amarelo do feijão-da-China, MYMV), Potyvirus (vírus do mosqueado do amendoim, PeMoV), Potyvirus (vírus de estrias do amendoim, PStV), Cucumovirus (vírus do atrofiamento do amendoim, PSV), Caulimovirus (vírus do mosqueado clorótico da soja, SbCMV), Begomovirus (vírus de enrugamento foliar da soja, SCLV), Luteovirus (vírus de nanismo da soja, SbDV), Potyvirus (vírus mosaico da soja, SMV), Nepovirus (vírus do atrofiamento grave da soja, SSSV) e Nepovirus (vírus das manchas circulares do tabaco, TRSV).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença bacteriana. As doenças da soja causadas por bactérias incluem, mas não estão limitadas a Bacillus subtilis (decomposição de sementes causada por Bacillus), Pseudomonas savastonoi pv. glycinea (Deterioração bacteriana), Pseudomonas syringae subsp. syringae (Folha enrugada causada por bactérias), Xanthomonas axonovagemis pv. glycines, (Pústula bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, (Mancha castanha bacteriana), Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, Ralstonia solanacearum, (Murchamento causado por bactérias) e Pseudomonas syringae pv. tabaci (Mancha aureolada).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção possibilita que uma planta de soja seja analisada em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a uma doença causada por pragas de animais. As doenças da soja causadas por pragas de animais incluem, mas não estão limitadas a Aphis glycines (Afídeo da soja), Heterodera glycines (Nematóide do cisto da soja), Meloidogyne arenaría, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica (Nematóide das galhas radiculares), Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus (Nematóide em arpão), Pratylenchus spp. (Nematóide das lesões), Paratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus (Nematóide em forma de pino), Rot16 ylenchulus reniformis (Nematóide reniforme), Criconemella ornata (Nematóide em anel), Hemicycliophora spp. (Nematóide em bainha), Heliocotylenchus spp. (Nematóide espiralado), Belonolainus gracilis, Belonolainus longicaudatus (Nematóide de ferrão), Quinisulcius acutus, Tylenchorhynchus spp. (Nematóide atrofiador) e Paratrichodorus minor (Nematóide das raízes em coto).

A invenção fornece ainda um método para a seleção e para a introgressão de QTL para resistência a doenças na soja que compreende: (a) o isolamento de ácidos nucléicos de um grande número de plantas de soja; (b) a detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o QTL de resistência a doenças; e (c) a seleção de uma planta de soja que compreende a dita uma ou mais moléculas marcadoras, selecionando assim uma planta de soja resistente a doenças.

O QTL de resistência a doenças da presente invenção pode ser introduzido em uma linhagem de Glycine max de elite. Uma linhagem de elite é qualquer linhagem que resultou do cruzamento e da seleção para desempenho agronômico superior. Os exemplos de linhagens de elite são linhagens que estão disponíveis comercialmente para plantadores ou para cultivadores de soja tais como HARTZ® variedade H4994, HARTZ® variedade H5218, HARTZ® variedade H5350, HARTZ® variedade H5545, HARTZ® variedade H5050, HARTZ® variedade H5454, HARTZ® variedade H5233, HARTZ® variedade H5488, HARTZ® variedade HLA572, HARTZ® variedade H6200, HARTZ® variedade H6104, HARTZ® variedade H6255, HARTZ® variedade H6586, HARTZ® variedade H6191, HARTZ® variedade H7440, HARTZ® variedade H4452 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H4994 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H4988 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5000 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5147 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5247 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5350 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5545 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5855 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5088 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5164 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5361 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5566 Roundup

Ready®, HARTZ® variedade H5181 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5889 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H5999 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6013 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6255 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6454 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H6686 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H7152 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H7550 Roundup Ready®, HARTZ® variedade H8001 Roundup Ready® (HARTZ SEED, Stuttgart, Arkansas, USA); A0868, AG0202, AG0401, AG0803, AG0901, A1553, A1900, AG1502, AG1702, AG1901, A1923, A2069, AG2101, AG2201, AG2205, A2247, AG2301, A2304, A2396, AG2401, AG2501, A2506, A2553, AG2701, AG2702, AG2703, A2704, A2833, A2869, AG2901, AG2902, AG2905, AG3001, AG3002, AG3101, A3204, A3237, A3244, AG3301, AG3302, AG3006, AG3203, A3404, A3469, AG3502, AG3503, AG3505, AG3305, AG3602, AG3802, AG3905, AG3906, AG4102, AG4201, AG4403, AG4502, AG4603, AG4801, AG4902, AG4903, AG5301, AG5501, AG5605, AG5903, AG5905, A3559, AG3601, AG3701, AG3704, AG3750, A3834, AG3901, A3904, A4045 AG4301, A4341, AG4401, AG4404, AG4501, AG4503, AG4601, AG4602, A4604, AG4702, AG4703, AG4901, A4922, AG5401, A5547, AG5602, AG5702, A5704, AG5801, AG5901, A5944, A5959, AG6101, AJW2600C0R, FPG26932, QR4459 e QP4544 (Asgrow Seeds, Des Moines, lowa, USA); DKB26-52, DKB28-51, DKB32-52, DKB08-51, DKB09-53, DKB10-52, DKB18-51, DKB26-53, DKB29-51, DKB42-51, DKB35-51 DKB3451, DKB36-52, DKB37-51, DKB38-52, DKB46-51, DKB54-52 e DeKalb variedade CX445 (DeKalb, Illinois, USA); 91B91, 92B24, 92B37, 92B63, 92B71, 92B74, 92B75, 92B91, 93B01, 93B11, 93B26, 93B34, 93B35, 93B41, 93B45, 93B51, 93B53, 93B66, 93B81, 93B82, 93B84, 94B01, 94B32, 94B53, 94M80 RR, 94M50 RR, 95B71, 95B95, 95M81 RR, 95M50 RR, 95M30 RR, 9306, 9294, 93M50, 93M93, 94B73, 94B74, 94M41, 94M70, 94M90, 95B32, 95B42, 95B43 e 9344 (Pioneer Hi-bred International, Johnston, lowa, USA); SSC-251RR, SSC-273CNRR, AGRA 5429RR, SSC-314RR, SSC-315RR, SSC-311STS, SSC-320RR, AGRA5432RR, SSC-345RR, SSC-356RR, SSC366, SSC-373RR e AGRA5537CNRR (Schlessman Seed Company, Milan,

Ohio, USA); 39-E9, 44-R4, 44-R5, 47-G7, 49-P9, 52-Q2, 53-K3, 56-J6, 58V8, ARX A48104, ARX B48104, ARX B55104 e GP530 (Armor Beans, Fisher, Arkansas, USA); HT322STS, HT3596STS, L0332, L0717, L1309CN, L1817, L1913CN, L1984, L2303CN, L2495, L2509CN, L2719CN, L3997CN, L4317CN, RC1303, RC1620, RC1799, RC1802, RC1900, RC1919, RC2020, RC2300, RC2389, RC2424, RC2462, RC2500, RC2504, RC2525, RC2702,

RC2964, RC3212, RC3335, RC3354, RC3422, RC3624, RC3636, RC3732,

RC3838, RC3864, RC3939, RC3942, RC3964, RC4013, RC4104, RC4233,

RC4432, RC4444, RC4464, RC4842, RC4848, RC4992, RC5003, RC5222,

RC5332, RC5454, RC5555, RC5892, RC5972, RC6767, RC7402, RT0032,

RT0041, RT0065, RT0073, RT0079, RT0255, RT0269, RT0273, RT0312,

RT0374, RT0396, RT0476, RT0574, RT0583, RT0662, RT0669, RT0676,

RT0684, RT0755, RT0874, RT0907, RT0929, RT0994, RT0995, RT1004,

RT1183, RT1199, RT1234, RT1399, RT1413, RT1535, RT1606, RT1741,

RT1789, RT1992, RT2000, RT2041, RT2089, RT2092, RT2112, RT2127,

RT2200, RT2292, RT2341, RT2430, RT2440, RT2512, RT2544, RT2629,

RT2678, RT2732, RT2800, RT2802, RT2822, RT2898, RT2963, RT3176,

RT3200, RT3253, RT3432, RT3595, RT3836, RT4098, RX2540, RX2944,

RX3444 e TS466RR (Croplan Genetics, Clinton, Kentucky, USA); 4340RR, 4630RR, 4840RR, 4860RR, 4960RR, 4970RR, 5260RR, 5460RR, 5555RR, 5630RR e 5702RR (Delta Grow, Inglaterra, Arkansas, USA); DK3964RR, DK3968RR, DK4461RR, DK4763RR, DK4868RR, DK4967RR, DK5161RR, DK5366RR, DK5465RR, DK55T6, DK5668RR, DK5767RR, DK5967RR, DKXTJ446, DKXTJ448, DKXTJ541, DKXTJ542, DKXTJ543, DKXTJ546, DKXTJ548, DKXTJ549, DKXTJ54J9, DKXTJ54X9, DKXTJ554, DKXTJ555, DKXTJ55J5 e DKXTJ5K57 (Delta King Seed Company, McCrory, Arkansas, USA); DP 3861 RR, DP 4331 RR, DP 4546RR, DP 4724 RR, DP 4933 RR, DP 5414RR, DP 5634 RR, DP 5915 RR, DPX 3950RR, DPX 4891 RR, DPX 5808RR (Delta & Pine Land Company, Lubbock, Texas, USA); DG31T31, DG32C38, DG3362NRR, DG3390NRR, DG33A37, DG33B52, DG3443NRR, DG3463NRR, DG3481NRR, DG3484NRR, DG3535NRR, DG3562NRR, DG3583NRR, DG35B40, DG35D33, DG36M49, DG37N43, DG38K57,

DG38T47, SX04334, SX04453 (Dyna-gro line, UAP-MidSouth, Cordova, Tennessee, USA); 8374RR CYSTX, 8390 NNRR, 8416RR, 8492NRR e 8499NRR (Excel Brand, Camp Point, Illinois, USA); 4922RR, 5033RR, 5225RR e 5663RR (FFR Semente, Southhaven, Mississippi, USA); 3624RR/N, 3824RR/N, 4212RR/N, 4612RR/N, 5012RR/N, 5212RR/N e 5412RR/STS/N (Garst Seed Company, Slater, lowa, USA); 471, 4R451, 4R485, 4R495, 4RS421 e 5R531 (Gateway Seed Company, Nashville, Illinois, USA); H-3606RR, H-3945RR, H-4368RR, H-4749RR, H-5053RR e H5492RR (Golden Harvest Seeds, Inc., Pekin, Illinois, USA); HBK 5324, HBK 5524, HBK R4023, HBK R4623, HBK R4724, HBK R4820, HBK R4924, HBK R4945CX, HBK R5620 e HBK R5624 (Hornbeck Seed Co. Inc., DeWitt, Arkansas, USA); 341 RR/SCN, 343 RR/SCN, 346 RR/SCN, 349 RR, 355 RR/SCN, 363 RR/SCN, 373 RR, 375 RR, 379 RR/SCN, 379+ RR/SCN, 380 RR/SCN, 380+ RR/SCN, 381 RR/SCN, 389 RR/SCN, 389+ RR/SCN, 393 RR/SCN, 393+ RR/SCN, 398 RR, 402 RR/SCN, 404 RR, 424 RR, 434 RR/SCN e 442 RR/SCN (Kruger Seed Company, Dike, lowa, USA); 3566, 3715, 3875, 3944, 4010 e 4106 (Lewis Hybrids, Inc., Ursa, Illinois, USA); C3999NRR (LG Seeds, Elmwood, Illinois, USA); Atlanta 543, Austin RR, Cleveland VIIRR, Dallas RR, Denver RRSTS, Everest RR, Grant 3RR, Olympus RR, Phoenix IIIRR, Rocky RR, Rushmore 553RR e Washington IXRR (Merschman Seed inc., West Point, lowa, USA); RT 3304N, RT 3603N, RT 3644N, RT 3712N, RT 3804N, RT 3883N, RT 3991N, RT 4044N, RT 4114N, RT4124N, RT4201N, RT4334N, RT4402N, RT 4480N, RT 4503N, RT 4683N, RT 4993N, RT 5043N, RT 5204, RT 5553N, RT 5773, RT4731N e RTS 4824N (MFA Inc., Columbia, Missouri, USA); 9A373NRR, 9A375XRR, 9A385NRS, 9A402NRR, 9A455NRR, 9A485XRR e 9B445NRS (Midland Genetics Group L.L.C., Ottawa, Kansas, USA); 3605nRR, 3805nRR, 3903nRR, 3905nRR, 4305nRR, 4404nRR, 4705nRR, 4805nRR, 4904nRR, 4905nRR, 5504nRR e 5505nRR (Midwest Premium Genetics, Concordia, Missouri, USA); S37-N4, S39-K6, S40-R9, S42-P7, S43-B1, S49-Q9, S50-N3, S52-U3 e S56-D7 (Syngenta Seeds, Henderson, Kentucky, USA); NT-3707 RR, NT3737 RR/SCN, NT-3737+RR/SCN, NT-3737sc RR/SCN, NT-3777+ RR, NT20

3787 RR/SCN, NT-3828 RR, NT-3839 RR, NT-3909 RR/SCN/STS, NT3909+ RR/SCN/ST, NT-3909sc RR/SCN/S, NT-3919 RR, NT-3922 RR/SCN, NT-3929 RR/SCN, NT-3999 RR/SCN, NT-3999+ RR/SCN, NT-3999sc RR/SCN, NT-4040 RR/SCN, NT-4040+ RR/SCN, NT-4044 RR/SCN, NT4122 RR/SCN, NT-4414 RR/SCN/STS, NT-4646 RR/SCN e NT-4747 RR/SCN (NuTech Seed Co., Ames, lowa, USA); PB-3494NRR, PB-3732RR, PB-3894NRR, PB-3921NRR, PB-4023NRR, PB-4394NRR, PB-4483NRR e PB-5083NRR (Prairie Brand Seed Co., Story City, lowa, USA); 3900RR, 4401 RR, 4703RR, 4860RR, 4910, 4949RR, 5250RR, 5404RR, 5503RR, 5660RR, 5703RR, 5770, 5822RR, PGY 4304RR, PGY 4604RR, PGY 4804RR, PGY 5622RR e PGY 5714RR (Progeny Ag Products, Wynne, Arkansas, USA); R3595RCX, R3684Rcn, R3814RR, R4095Rcn, R4385Rcn e R4695Rcn (Renze Hybrids Inc., Carroll, lowa, USA); S3532-4, S3600-4, S3832-4, S3932-4, S3942-4, S4102-4, S4542-4 e S4842-4 (Stine Seed Co., Adel, lowa, USA); 374RR, 398RRS (Taylor Seed Farms Inc., White Cloud, Kansas, USA); USG 5002T, USG 510nRR, USG 5601T, USG 7440nRR, USG 7443nRR, USG 7473nRR, USG 7482nRR, USG 7484nRR, USG 7499nRR, USG 7504nRR, USG 7514nRR, USG 7523nRR, USG 7553nRS e USG 7563nRR (UniSouth Genetics Inc., Nashville, Tennessee, USA); V38N5RS, V39N4RR, V42N3RR, V48N5RR, V284RR, V28N5RR, V315RR, V35N4RR, V36N5RR, V37N3RR, V40N3RR, V47N3RR e V562NRR (Royster-Clark Inc., Washington C.H., Ohio, USA); RR2383N, 2525NA, RR2335N, RR2354N, RR2355N, RR2362, RR2385N, RR2392N, RR2392NA,

RR2393N, RR2432N, RR2432NA, RR2445N, RR2474N, RR2484N,

RR2495N e RR2525N (Willcross Seed, King City Semente, King City, Missouri, USA); 1493RR, 1991NRR, 2217RR, 2301NRR, 2319RR, 2321NRR, 2341NRR, 2531 NRR, 2541 NRR, 2574RR, 2659RR, 2663RR, 2665NRR, 2671 NRR, 2678RR, 2685RR, 2765NRR, 2782NRR, 2788NRR, 2791 NRR, 3410RR, 3411NRR, 3419NRR, 3421NRR, 3425NRR, 3453NRR, 3461NRR, 3470CRR, 3471 NRR, 3473NRR, 3475RR, 3479NRR, 3491 NRR, 3499NRR, WX134, WX137, WX177 e WX300 (Wilken Seeds, Pontiac, Illinois, USA). Uma planta de elite é uma planta representativa de uma linhagem de elite.

O QTL de resistência a doenças da presente invenção também pode ser introduzido em uma planta transgênica de Glycine max de elite que contém um ou mais genes para tolerância a herbicidas, maior rendimento, controle de insetos, resistência a doenças fúngicas, resistência a virus, resistência a nematoides, resistência a doenças bacterianas, resistência a doenças causadas por micoplasma, produção de óleos modificados, alta produção de óleos, alta produção de proteínas, controle de germinação e de crescimento de mudas, maior nutrição para animais e seres humanos, menor teor de rafinose, resistência ao estresse ambiental, maior capacidade de digestão, enzimas industriais, proteínas, peptídeos e pequenas moléculas farmacêuticas, melhores características de processamento, melhor sabor, fixação de nitrogênio, produção de sementes híbridas, alergenicidade reduzida, biopolímeros e biocombustíveis entre outros. Estas características agronômicas podem ser fornecidas através dos métodos de biotecnologia vegetal na forma de transgenes em Glycine max.

É entendido ainda que uma planta de soja da presente invenção pode exibir as características de qualquer grupo de maturidade. O pólen da planta de soja selecionada pode ser criopreservado e utilizado em cruzamentos com linhagens de elite de outros grupos de maturidade para a introgressão do lócus de resistência à doença fúngica em uma linhagem que não estaria normalmente disponível para cruzamento na natureza. As técnicas de criopreservação de pólen são bem-conhecidas na técnica (Tyagi e outros, Cryo Letters, 24: 119-124 (2003), Liang e outros, Acta Botanica Sinica, 35: 733-738 (1993) e Honda e outros, Euphytica 126: 315-320 (2002)).

O efeito de resistência a doenças do QTL pode variar com base no genótipo parental e nas condições ambientais em que o efeito de resistência a doenças é medido. Está dentro da perícia dos técnicos na técnica do cruzamento de plantas e sem experimentos desnecessários o uso dos métodos descritos aqui para a seleção de uma população de plantas ou de uma coleção de genótipos parentais daqueles que quando contêm um lócus de doença resultam em uma maior resistência a doenças em relação ao genótipo parental. Aqui, uma doença de plantas pode ser causada por um fun22 go, um virus, uma bactéria ou um animal invertebrado.

Um número de mapas genéticos moleculares de Glycine foi relatado (Mansur e outros, Crop Sei. 36:1327-1336 (1996), Shoemaker e outros, Genetics 144: 329-338 (1996), Shoemaker e outros, Crop Science 32: 10911098 (1992), Shoemaker e outros, Crop Science 35: 436-446 (1995), Tinley e outros, J. Cell Biochem. Suppl. 14E: 291 (1990), Cregan e outros, Crop Science 39:1464-1490 (1999)). Glycine max, Glycine soja e Glycine max x. Glycine soja compartilham grupos de ligação (Shoemaker e outros, Genetics 144: 329-338 (1996)). Como utilizado aqui, a referência aos grupos de ligação, G; C2; J; e N de Glycine max se refere ao grupo de ligação que corresponde aos grupos de ligação, G; C2; J; e N do mapa genético de Glycine max (Mansur e outros, Crop Science. 36: 1327-1336 (1996), Cregan e outros, Crop Science 39:1464-1490 (1999) e Soybase, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture).

Um alelo de um QTL pode, evidentemente, compreender vários genes ou outros fatores genéticos mesmo dentro de uma região genômica contígua ou grupo de ligação, tal como um haplotipo. Como utilizado aqui, um alelo de um QTL pode, portanto, abranger mais de um gene ou outro fator genético em que cada gene individual ou componente genético é também capaz de exibir variação alélica e em que cada gene ou fator genético é também capaz de produzir um efeito fenotípico sobre a característica quantitativa em questão. Em uma modalidade da presente invenção o alelo de um QTL compreende um ou mais genes ou outros fatores genéticos que também são capazes de exibir variação alélica. Não é pretendido assim que o uso do termo um alelo de um QTL exclua um QTL que compreende mais de um gene ou outro fator genético. Especificamente, um alelo de um QTL na presente invenção pode significar um haplotipo dentro de uma janela de haplotipos em que um fenótipo pode ser resistência a doenças. Uma janela de haplotipos é uma região genômica contígua que pode ser definida e rastreada, com um conjunto de um ou mais marcadores polimórficos em que dos ditos polimorfismos indicam identidade por descendência. Um haplotipo dentro de tal janela pode ser definido pelo o fingerprint exclusivo de alelos em cada marcador. Como utilizado aqui, um alelo é um de várias formas alternativas de um gene que ocupam um certo lócus em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um certo lócus em um cromossomo são os mesmos, tal planta é homozigota em tal lócus. Se os alelos presentes em um certo lócus em um cromossomo diferirem, tal planta é heterozigota em tal lócus.

As plantas da presente invenção podem fazer parte de ou ser geradas partindo de um programa de cruzamento. A escolha do método de cruzamento depende do modo de reprodução da planta, da condição de herança da(s) característica(s) que será(ão) melhorada(s) e do tipo de cultivar utilizado comercialmente (por exemplo, cultivar híbrido F1, cultivar de linhagem pura etc.). Um cultivar é uma raça ou uma variedade de uma planta que foi criada ou selecionada intencionalmente e mantida através do cultivo.

As abordagens não-limitantes selecionadas para o cruzamento das plantas da presente invenção são apresentadas a seguir. Um programa de cruzamento pode ser melhorado utilizando a seleção auxiliada por marcador (MAS) da progênie de qualquer cruzamento. É entendido ainda que quaisquer cultivares comerciais e não comerciais podem ser utilizados em um programa de cruzamento. Fatores tais como, por exemplo, vigor na emergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência a doenças, formação de ramos, florescência, produção de sementes, tamanho de sementes, densidade de sementes, capacidade de ficar ereta e capacidade de ser debulhada etc. geralmente determinarão a escolha.

Para as características que podem ser altamente herdadas, uma escolha de plantas individuais superiores avaliadas em uma localização isolada será eficiente, enquanto que para características com baixa capacidade de herança, a seleção deve ser baseada em valores médios obtidos de avaliações replicadas de famílias de plantas relacionadas. Os métodos de seleção populares incluem comumente a seleção de pedigrees, a seleção de pedigrees modificados, a seleção de massa e a seleção recorrente. Em uma modalidade preferida um programa de retrocruzamento ou de cruzamento recorrente é realizado.

A complexidade da herança influencia a escolha do método de cruzamento. A criação por retrocruzamento pode ser utilizada para transferir um ou alguns genes favoráveis para uma característica que pode ser altamente herdada em um cultivar desejável. Esta abordagem foi utilizada extensivamente para a criação de cultivares resistentes a doenças. Várias técnicas de seleção recorrentes são utilizadas para melhorar características herdadas quantitativamente controladas por vários genes. O uso da seleção recorrente em plantas de cultivo de autopolinização depende da facilidade de polinização, da frequência de híbridos bem-sucedidos de cada evento de polinização e do número de prole híbrida proveniente de cada cruzamento bem-sucedido.

As linhagens de cruzamento podem ser testadas e comparadas com padrões apropriados em ambientes representativos da(s) área(s) alvo(s) comercial(is) em relação a duas ou mais gerações. As melhores linhagens são candidatas para novos cultivares comerciais; estas ainda deficientes nas características podem ser utilizadas como parentais para a produção de novas populações para seleção adicional.

Um método de identificação de uma planta superior é observar seu desempenho em relação a outras plantas experimentais e a um cultivar padronizado amplamente cultivado. Se uma única observação não for conclusiva, observações replicadas podem fornecer uma melhor estimativa de seu valor genético. Um cultivador pode selecionar e cruzar duas ou mais linhagens parentais, seguido pelo autocruzamento e pela seleção repetidos, produzindo muitas combinações genéticas novas.

O desenvolvimento de novos cultivares de soja requer o desenvolvimento e a seleção de variedades de soja, o cruzamento destas variedades e a seleção de cruzamentos híbridos superiores. A semente híbrida pode ser produzida através de cruzamentos manuais entre parentais férteis do sexo masculino selecionados ou através da utilização de sistemas de esterilidade do sexo masculino. Os híbridos são selecionados para certas características gênicas isoladas tais como coloração da vagem, coloração da flor, rendimento de semente, coloração na puberdade ou resistência a herbicidas que indicam que a semente é realmente um híbrido. Dados adicionais das linhagens parentais, assim como o fenótipo do híbrido, influenciam na decisão do cultivador se deve continuar com o cruzamento híbrido específico.

Os métodos de cruzamento de pedigrees e de cruzamento com seleção recorrente podem ser utilizados para desenvolver cultivares partindo de populações de cruzamento. Os programas de cruzamento combinam características desejáveis de dois ou mais cultivares ou várias fontes de base ampla em conjuntos de cruzamento partindo dos quais os cultivares são desenvolvidos através do autocruzamento e da seleção dos fenótipos desejados. Novos cultivares podem ser avaliados para determinar quais possuem potencial comercial.

O cruzamento de pedigrees é comumente utilizado para melhorar as plantas de cultivo de autopolinização. Dois parentais que possuem características complementares favoráveis são cruzados para produzir uma F^ Uma população F₂ é produzida através do autocruzamento de uma ou de várias F/s. É realizada a seleção dos melhores indivíduos nas melhores famílias. O teste replicado das famílias pode ser iniciado na geração F₄ para aumentar a eficiência de seleção em relação a características com baixa capacidade de herança. Em um estágio avançado de intracruzamento (isto é, F₆ e F₇), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente similares são testadas em relação à liberação potencial como novos cultivares.

A criação por retrocruzamento tem sido utilizada para transferir genes para uma característica que pode ser altamente herdada, simplesmente herdada para um cultivar homozigoto desejável ou linhagem intracruzada, que é o parental recorrente. A fonte da característica que será transferida é chamada de parental doador. É esperado que a planta resultante tenha os atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida do parental doador. Após o cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do parental doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzados) com o parental recorrente. É esperado que o parental resultante possua os atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida do parental doador.

O procedimento de descendência de semente isolada no sentido restrito se refere ao plantio de uma população segregante, à colheita de uma amostra de uma semente por planta e à utilização da amostra de uma semente em planta na geração seguinte. Quando a população foi levada adiante da F₂ até o nível desejado de intracruzamento, as plantas de cujas linhagens são derivadas irão cada uma seguir o curso de indivíduos F₂ diferentes. O número de plantas em uma população diminui a cada geração devido à falha de algumas sementes de germinar ou de algumas plantas de produzir pelo menos uma semente. Como um resultado, nem todas as plantas F₂ originalmente amostradas na população serão representadas por uma progênie quando o avanço da geração é completado.

Em um procedimento de várias sementes, os plantadores de soja comumente colhem uma ou mais vagens de cada planta em uma população e as debulham juntas para formar uma massa. Parte da massa é utilizada para plantar a geração seguinte e parte é colocada em reserva. O procedimento foi referido como técnica de descendência de uma única semente modificada ou de formação de massa de vagens.

O procedimento de várias sementes foi utilizado para diminuir o trabalho na colheita. É consideravelmente mais rápido debulhar as vagens com uma máquina que remover uma semente de cada manualmente para o procedimento com uma única semente. O procedimento de várias sementes torna possível plantar o mesmo número de sementes de uma população a cada geração de intracruzamento.

As descrições de outros métodos de cruzamento que são comumente utilizados para características e plantas de cultivo diferentes podem ser encontradas em um de vários livros de referência (por exemplo, Fehr, Principies of Cultivar Development Vol. 1, pp. 2-3 (1987)).

A presente invenção fornece ainda partes das plantas da presente invenção. As partes das plantas, sem limitação, incluem semente, endosperma, óvulo e pólen. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente.

As plantas ou partes das mesmas da presente invenção podem ser crescidas em cultura e regeneradas. Os métodos para a regeneração de plantas de Glycine max partindo de vários tipos de tecidos e os métodos para a cultura de tecido de Glycine max são conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Widholm e outros, In Vitro Selection and Culture-induced Variation in Soybean, In Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, eds. Verma e Shoemaker, CAB International, Wallingford, Oxon, Inglaterra (1996)). As técnicas de regeneração para plantas tal como Glycine max podem utilizar como material de partida uma variedade de tipos de tecidos ou de células. Com Glycine max, em particular, foram desenvolvidos processos de regeneração que começam com certos tipos de tecidos diferenciados tais como meristemas (Cartha e outros, Can. J. Bot. 59:1671-1679 (1981)), seções de hipocotilédone (Cameya e outros, Plant Science Letters 21: 289-294 (1981)) e segmentos de nós de caule (Saka e outros, Plant Science Letters, 19: 193-201 (1980), Cheng e outros, Plant Science Letters, 19: 91-99 (1980)). Foi relatada a regeneração de plantas de Glycine max sexualmente maduras inteiras partindo de embriões somáticos gerados partindo de explantes de embriões imaturos de Glycine max (Ranch e outros, In Vitro Cellular & Developmental Biology 21: 653-658 (1985)). Também foi relatada a regeneração de plantas maduras de Glycine max partindo da cultura de tecido através da organogênese e da embriogênese (Barwale e outros, Planta 167: 473-481 (1986), Wright e outros, Plant Cell Reports 5: 150-154 (1986)).

A presente invenção fornece ainda uma planta de soja resistente a doenças selecionada através da verificação em relação à resistência, à imunidade ou à susceptibilidade a doenças na planta de soja, a seleção compreendendo a apuração dos ácidos nucléicos genômicos em relação à presença de uma molécula marcadora que está ligada geneticamente a um alelo de um QTL associado com resistência a doenças na planta de soja, em que o alelo de um QTL também fica localizado em um grupo de ligação associado com a soja resistente a doenças. A doença pode ser causada por um fungo, um vírus, uma bactéria ou um animal invertebrado.

A presente invenção fornece ainda QTL que confere resistência à Ferrugem Asiática da Soja, incluindo o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à

ASR. Quatro loci dominantes e independentemente herdados para resistência a P. pachyrhizi, denominados aqui como lócus 1 até 4 de resistência à ASR, foram identificados em PI 200492, PI 230970, PI 462312 (Ankur) e PI 459025B, respectivamente. Na presente invenção, o lócus 1 de resistência à

ASR foi localizado no grupo de ligação G da soja. Os marcadores de SNP utilizados para monitorar a introgressão do lócus 1 de resistência à ASR são selecionados do grupo que consiste em NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454, NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943, NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343 e NS0101121. As sequências de DNA do marcador de SNP do lócus 1 de resistência à ASR (apresentadas como as SEQ ID NOs: 67 até 80) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ

ID NOs: 1 até 28 e detectadas com sondas indicadas como as SEQ ID NOs:

100 até 127. Na presente invenção, o lócus 2 de resistência à ASR fica mais provavelmente localizado no grupo de ligação J, próximo ou dentro do agrupamento de resistência a doenças contendo resistência à Podridão Parda do Caule, ao Nematóide do cisto da soja e resistência à Mancha Foliar olho de rã; ou do grupo de ligação N. Na presente invenção, o lócus 3 de resistência à ASR fica localizado no grupo de ligação C2. Os marcadores de SNP utilizados para monitorar a introgressão do lócus 3 de resistência à ASR são selecionados

NS0126598,

NS0099529,

NS0098982, do grupo que consiste em NS0099746, NS0123747,

NS0128378,

NS0097798,

NS0096829, NS0137477,

NS0125408,

NS0095322,

NS0098902,

NS0136101,

NS0103749, NS0118897, NS0119715 e NS0130920. Estas sequências de DNA dos marcadores (apresentadas como as SEQ ID NOs:

até 97) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 29 até 62 e detectadas com sondas indicadas como as

SEQ ID NOs: 128 até 161. Na presente invenção, o lócus 4 de resistência à

ASR fica provavelmente localizado no grupo de ligação N.

A presente invenção fornece ainda haplotipos que conferem resistência à ASR que foram identificados em estudos de associação. Estas análises de genoma completo revelaram dois marcadores de SNP associados com a resistência à ASR localizados em duas janelas diferentes no cromossomo 13. Na primeira janela de haplotipo, o marcador de SNP utilizado para monitorar a introgressão do lócus 5 de resistência à ASR, do lócus 6 de resistência à ASR, do lócus 7 de resistência à ASR, do lócus 8 de resistência à ASR e do lócus 9 de resistência à ASR é o NS0103033. Estas sequências de DNA do marcador de SNP (apresentadas como a SEQ ID NO: 98) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 63 e 64 e detectadas com sondas indicadas como as SEQ ID NOs: 162 e 163. Na segunda janela de haplotipo, o marcador de SNP utilizado para monitorar a introgressão do lócus 10 de resistência à ASR, do lócus 11 de resistência à ASR, do lócus 12 de resistência à ASR e do lócus 13 de resistência à ASR é o NS0124935. Estas sequências de DNA do marcador de SNP (apresentadas como a SEQ ID NO: 99) podem ser amplificadas utilizando os iniciadores indicados como as SEQ ID NOs: 65 e 66 e detectadas com sondas indicadas como as SEQ ID NOs: 164 e 165.

É ainda entendido, que um ou mais marcadores mapeados dentro de 10 centimorgans ou menos das ditas moléculas marcadoras podem ser utilizados para a seleção e para a introgressão de loci de resistência à ASR.

É ainda entendido, que a presente invenção fornece células bacterianas, vírus, microbianas, de insetos, de mamíferos e de plantas que compreendem os agentes da presente invenção.

As moléculas de ácidos nucléicos ou fragmentos das mesmas são capazes de se hibridizar especificamente com outras moléculas de ácidos nucléicos sob certas circunstâncias. Como utilizado aqui, duas molécu30

Ias de ácidos nucléicos são capazes de se hibridizar especificamente com uma outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duplo antiparalela. Uma molécula de ácido nucléico é o complemento de uma outra molécula de ácido nucléico se exibirem complementaridade completa. Como utilizado aqui, as moléculas exibem complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são minimamente complementares se puderem se hibridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que permanecem aneladas com a outra sob pelo menos condições de baixa estringência convencionais. Similarmente, as moléculas são complementares se puderem se hibridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam aneladas uma com a outra sob condições de alta estrigência convencionais. As condições de estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, Em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2- Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova York (1989) e por Haymes e outros, Em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Desvios da complementaridade são, portanto, permitidos, contanto que tais desvios não impossibilitem completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de filamento duplo. Para uma molécula de ácido nucléico servir como um iniciador ou uma sonda esta precisa apenas ser suficientemente complementar em relação à sequência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações de solventes e de sais particulares empregadas.

Como utilizado aqui, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucléico que irá se hibridizar especificamente ao complemento da sequência de ácido nucléico à qual está sendo comparada sob condições de alta estringência. As sondas e os iniciadores de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser hibridizar sob condições estringentes com uma sequência de DNA alvo. O termo condições de hibridização estringentes é definido como as condições sob as quais uma sonda ou um iniciador se hibridiza especificamente com uma ou mais sequências al31 vos e não com sequências que não são alvos, que pode ser determinado de forma empírica. O termo condições estringentes é definido de forma funcional em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucléico com um ácido nucléico alvo (isto é, com uma sequência de ácido nucléico particular de interesse) através do procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook e outros, 1989, em 9.52-9.55. Vide também, Sambrook e outros, (1989) em 9.47-9.52, 9.56-9.58, Kanehisa Nucl. Acids Res. 12:203-213, (1984) e Wetmur e outros, J. Mol. Biol. 31:349-370 (1968). As condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização do DNA são, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45° C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50°C e são conhecidas pelos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma estringência baixa de aproximadamente 2,0 x SSC a 50°C até uma estringência alta de aproximadamente 0,2 x SSC a 50°C. Em adição, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada desde condições de baixa estringência à temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, até condições de alta estringência a aproximadamente 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é alterada.

Por exemplo, a hibridização utilizando sondas ou iniciadores de DNA ou de RNA pode ser realizada a 65°C em 6x SSC, 0,5% de SDS, 5x Denhardfs, 100 pg/mL de DNA não específico (por exemplo, DNA de esperma de salmão submetido a ultrassom) com lavagem em 0,5x SSC, 0,5% de SDS a 65°C, para alta estringência.

É considerado que as condições de hibridização de estringência inferior tais como temperaturas de hibridização e/ou de lavagem menores podem ser utilizadas para identificar sequências relacionadas que possuem um grau menor de similaridade de sequência se a especificidade de ligação da sonda ou do iniciador com a(s) sequência(s) alvo(s) for preservada. Consequentemente, as sequências de nucleotídeos da presente invenção po32 dem ser utilizadas por sua capacidade de formar seletivamente moléculas em duplex com filamentos complementares de DNA, RNA ou fragmentos de cDNA. A detecção de segmentos de DNA através de hibridização é bemconhecida pelos versados na técnica e dependendo assim da aplicação i5 maginada, pode ser desejado empregar condições de hibridização variáveis para atingir graus variáveis de seletividade de sonda em direção à sequência alvo e o método de escolha dependerá dos resultados desejados.

Como utilizado aqui, um agente, seja este uma molécula que ocorre naturalmente ou de outra maneira podendo ser uma substancialmen10 te purificada, se desejado, se referindo a uma molécula separada substancialmente de todas as outras moléculas normalmente associadas com a mesma em seu estado nativo. Mais preferencialmente uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais que 60% livre, preferencialmente 75% livre, mais preferencialmente 90% livre e mais preferencialmente 95% livre das outras moléculas (sem incluir o solvente) presentes na mistura natural. Não é pretendido que o termo substancialmente purificadas abranja moléculas presentes em seu estado nativo.

Os agentes da presente invenção serão preferencialmente bio20 logicamente ativos em relação a um atributo estrutural, tal como a capacidade de um ácido nucléico de se hibridizar com uma outra molécula de ácido nucléico ou a capacidade de uma proteína de se ligar através de um anticorpo (ou de competir com uma outra molécula por tal ligação). Alternativamente, tal atributo pode ser catalítico e envolver assim a capacidade do a25 gente de mediar uma reação ou uma resposta química.

Os agentes da presente invenção podem também ser recombinantes. Como utilizado aqui, o termo recombinante significa qualquer agente (por exemplo, DNA, peptídeo etc.), que é ou resulta, entretanto, indiretamente, da manipulação humana de uma molécula de ácido nucléico.

Os agentes da presente invenção podem ser marcados com reagentes que facilitam a detecção do agente (por exemplo, marcações fluorescentes (Prober e outros, Science 238:336-340 (1987), Patente Européia

144914), marcações químicas (Patente U.S. N² 4.582.789, Patente U.S. N²

4.563.417), bases modificadas (Patente Européia 119448), das quais todas são incorporadas aqui como referência em sua totalidade).

Em uma modalidade preferida, um ácido nucléico da presente invenção irá especificamente se hibridizar com uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos apresentadas nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complementos das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas sob condições moderadamente estringentes, por exemplo, em aproximadamente 2,0 x SSC e aproximadamente 65°C. Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléico da presente invenção irá especificamente se hibridizar com uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos apresentadas nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complementos ou fragmentos de qualquer uma destas sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção possui a sequência de ácido nucléico apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complementos das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas. Em um aspecto mais preferido da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 98% e 100% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucléico apresentada nas SEQ ID NO: 67 até SEQ ID NO: 99 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma destas.

Marcadores genéticos adicionais podem ser utilizados para sele34 cionar plantas com um alelo de um QTL associado com resistência a doenças fúngicas da soja da presente invenção. Os exemplos de bancos de dados de marcadores públicos incluem, por exemplo: Soybase, um Agricultural

Research Service, United States Department of Agriculture.

Os marcadores genéticos da presente invenção incluem marcadores dominantes ou co-dominantes. Os marcadores co-dominantes revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo haplóide). Os marcadores dominantes revelam a presença de apenas um único alelo. A presença do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, uma banda de DNA) é uma indicação de que um alelo está presente na condição homozigota ou heterozigota. A ausência do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, ausência de uma banda de DNA) é meramente uma evidência de que algum outro alelo indefinido está presente. No caso de populações em que os indivíduos são predominantemente homozigotos e os loci são predominantemente dimórficos, os marcadores dominantes e co-dominantes podem ser igualmente valiosos. À medida que as populações se tornam mais heterozigotas e multialélicas, os marcadores co-dominantes se tornam frequentemente mais informativos do genótipo que os marcadores dominantes.

Os marcadores, tais como marcadores de repetições de sequências simples (SSR), marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, marcadores fenotípicos, SNPs, marcadores de isozimas, perfis de transcrição em microarranjo que estão ligados ou relacionados geneticamente aos alelos de um QTL da presente invenção podem ser utilizados (Walton, Seed World 22-29 (Julho, 1993), Burow e outros, Molecular Dissection of Complex Traits, 13-29, ed. Paterson, CRC Press, Nova York (1988)). Os métodos para isolar tais marcadores são conhecidos na técnica. Por exemplo, os marcadores de SSR específicos ao lócus podem ser obtidos através da verificação de uma biblioteca genômica em relação a repetições de microssatélites, seqüenciando os clones positivos, planejando os iniciadores que flanqueiam as repetições e amplificando o DNA genômico com estes iniciadores. O tamanho dos produtos da amplificação resultantes pode variar em números inteiros das unidades de repetição de bases. Para detectar um polimorfismo, os produtos da PCR podem ser marcados radioativamente, separados em géis de poliacrilamida desnaturantes e detectados através de autorradiografia. Os fragmentos com diferenças de tamanho >4 pb podem também ser resolvidos em géis de agarose, evitando assim a radioatividade.

A detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA, RNA ou cDNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácidos nucléicos. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de polinucleotídeos que possuem o sítio polimórfico ou que incluem tal sítio e sequências localizadas de forma distal ou proximal ao mesmo. Tais moléculas amplificadas podem ser facilmente detectadas por eletroforese em gel ou através de outros meios.

O método mais preferido de conseguir tal amplificação emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986), Pedido de Patente Européia 50.424, Patente Européia 84.796, Patente Européia 258.017, Patente Européia 237.362, Patente Européia 201.184, Patente U.S. N² 4.683.202, Patente U.S. N² 4.582.788, Patente U.S. N² 4.683.194), utilizando pares de iniciadores que são capazes de se hibridizar com as sequências proximais que definem um polimorfismo em sua forma de filamento duplo.

No lugar da PCR, métodos alternativos, tal como a Reação em Cadeia da Ligase (LCR) pode ser utilizada (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:189-193 (1991), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). A LCR utiliza dois pares de sondas de oligonucleotídeo para amplificar de forma exponencial um alvo específico. A sequência de cada par de oligonucleotídeos é selecionada para permitir que o par se hibridize com as sequências adjacentes do mesmo filamento do alvo. Tal hibridização forma um substrato para uma ligase dependente do molde. Como com a PCR, os produtos resultantes servem assim como um molde nos ciclos subsequentes e uma amplificação exponencial da sequência desejada é obtida.

O Ensaio de Ligação de Oligonucleotídeos (OLA) pode ser al36 ternativamente empregado (Landegren e outros, Science 247:1077-1080 (1988), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). O protocolo de OLA utiliza dois oligonucleotídeos que são planejados para serem capazes de se hibridizar com sequências adjacentes de um filamento simples de um alvo. O OLA, como a LCR, é particularmente adequado para a detecção de mutações pontuais. Ao contrário da LCR, entretanto, o OLA resulta na amplificação linear ao invés de exponencial da sequência alvo.

Os esquemas baseados na ligação de dois (ou mais) oligonucleotídeos na presença de um ácido nucléico que possui a sequência do dioligonucleotídeo resultante, amplificando assim o dioligonucleotídeo, são também conhecidos (Wu e outros, Genomics 4:560-569 (1989), cuja totalidade é incorporada aqui como referência) e podem ser facilmente adaptados às finalidades da presente invenção.

Outros procedimentos de amplificação de ácidos nucléicos conhecidos, tais como oligômeros específicos a alelos, tecnologia de DNA ramificado, sistemas de amplificação baseados na transcrição ou métodos de amplificação isotérmicos também podem ser utilizados para amplificar e analisar tais polimorfismos (Patente U.S. N² 5.130.238, Patente Européia 329.822, Patente U.S. N² 5.169.766, Patente Européia 359.789, Kwoh e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 86:1173-1177 (1989) Patente Européia 368.906, Walker e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 89:392-396 (1992), dos quais todos são incorporados aqui como referência em sua totalidade).

Os polimorfismos também podem ser identificados através da análise de Polimorfismo de Conformação de Filamento Simples (SSCP). O SSCP é um método capaz de identificar a maior parte das variações de sequências em um filamento simples de DNA, tipicamente entre 150 e 250 nucleotídeos de comprimento (Elles, Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press (1996); Orita e outros, Genomics 5: 874-879 (1989)). Sob condições de desnaturação um filamento simples de DNA adotará uma conformação que é exclusivamente dependente de sua conformação de sequência. Esta conformação será geralmente diferente, mesmo se apenas uma única base for alterada. Foi relatado que a maior parte das conformações altera a configuração física ou o tamanho suficientemente para ser detectável através de eletroforese.

Um atributo central dos SNPs é que o sítio do polimorfismo ocorre em um único nucleotídeo. Os SNPs são mais estáveis que outras classes de polimorfismos. Sua taxa de mutação espontânea é de aproximadamente 10'⁹ (Kornberg, DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco (1980)). Uma vez que os SNPs resultam de variação de sequências, novos polimorfismos podem ser identificados através do sequenciamento de moléculas genômicas aleatórias ou de cDNA. Os SNPs também podem resultar de deleções, mutações pontuais e inserções. Dito isso, os SNPs também são vantajosos como marcadores uma vez que são frequentemente diagnósticos de identidade por descendência porque raramente surgem de origens independentes. Qualquer alteração de bases isoladas, seja qual for a causa, pode ser um SNP. Os SNPs ocorrem em uma freqüência maior que outras classes de polimorfismos e podem ser mais facilmente identificados. Na presente invenção, um SNP pode representar um evento indel isolado, que pode consistir em um ou mais pares de bases ou de um polimorfismo de um único nucleotídeo.

Os SNPs podem ser caracterizados utilizando qualquer um de uma variedade de métodos. Tais métodos incluem o sequenciamento direto ou indireto do sítio, o uso de enzimas de restrição em que os respectivos alelos do sítio criam ou destroem um sítio de restrição, o uso de sondas de hibridização específicas ao alelo, o uso de anticorpos que são específicos para as proteínas codificadas pelos alelos diferentes do polimorfismo ou a25 través de outra interpretação bioquímica. Os SNPs podem ser sequenciados utilizando uma variação do método de término de cadeia (Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74: 5463-5467 (1977)) em que o uso de radioisótopos é substituído por nucleotídeos didesóxi marcados de forma fluorescente e submetidos ao sequenciamento automatizado baseado em capilari30 dade (Patente U.S. N² 5.332.666, cuja totalidade é incorporada aqui como referência; Patente U.S. N² 5.821.058, cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Os seqüenciadores automáticos estão disponíveis, por exemplo, na Applied Biosystems, Foster City, CA (3730x1 DNA Analyzer),

Beckman Coulter, Fullerton, CA (CEQ™ 8000 Genetic Analysis System) e

LI-COR, Inc., Lincoln, NE (4300 DNA Analysis System).

As abordagens para a análise dos SNPs podem ser categorizadas em dois grupos. O primeiro grupo se baseia nos ensaios de extensão de iniciadores, tal como o minissequenciamento em fase sólida ou o pirossequenciamento. No método de minissequenciamento em fase sólida, uma DNA polimerase é utilizada especificamente para estender um iniciador que se anela imediatamente adjacente ao nucleotídeo variante. Um trifosfato de nucleosídeo marcado isolado complementar ao nucleotídeo no sítio variante é utilizado na reação de extensão. Apenas as sequências que contêm o nucleotídeo no sítio variante serão estendidas pela polimerase. Um arranjo de iniciadores pode ser fixado em um suporte sólido em que cada iniciador é contido em quatro poços pequenos, cada poço sendo utilizado para um dos quatro trifosfatos de nucleosídeo presentes no DNA. O DNA ou o RNA molde de cada organismo de teste é colocado dentro de cada poço e é permitido que se anele com o iniciador. O iniciador é então estendido um nucleotídeo utilizando uma polimerase e um trifosfato de nucleotídeo didesóxi marcado. A reação completada pode ter a imagem formada utilizando dispositivos que são capazes de detectar a marcação que pode ser radioativa ou fluorescente. Através da utilização deste método vários SNPs diferentes podem ser visualizados e detectados (Syvãnen e outros, Hum. Mutat. 13'. 1-10 (1999)). A técnica de pirossequenciamento se baseia em um ensaio bioluminométrico indireto do pirofosfato (PPi) que é liberado de cada dNTP após o alongamento da cadeia de DNA. Após a incorporação de bases mediada pela polimerase de Klenow, o PPi é liberado e utilizado como um substrato, junto com 5-fosfossulfato de adenosina (APS), para ATP sulfurilase, que resulta na formação de ATP. Subsequentemente, o ATP realiza a conversão da luciferina em seu derivado óxi através da reação da luciferase. A produção de luz subsequente se torna proporcional ao número de bases adicionadas, até aproximadamente quatro bases. Para permitir a processividade do método o excesso de dNTP é degradado pela apirase, que também está presente na mistura de reação de partida, de forma que apenas os dNTPs são adicionados ao molde durante o procedimento de sequenciamento (Alderborn e outros, Genome Res. 10: 1249-1258 (2000)). Um exemplo de um instrumento projetado para detectar e interpretar a reação de pirossequenciamento está disponível na Biotage, Charlottesville, VA (PyroMark MD).

Um método de detecção de SNPs mais recente, baseado em ensaios de extensão de iniciadores é o ensaio GOOD. O ensaio GOOD (Sauer e outros, Nucleic Acids Res. 28: e100 (2000)) é um protocolo de extensão de iniciadores específicos ao alelo que emprega espectrometria de massa de MALDI-TOF (tempo de vôo de dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz). A região de DNA que contém um SNP é amplificada primeiro através da amplificação pela PCR. Os dNTPs residuais são destruídos utilizando uma fosfatase alcalina. Os produtos específicos ao alelo são então gerados utilizando um iniciador específico, um conjunto condicionado de aS-dNTPs e a-S-ddNTPs e uma DNA polimerase fresca em uma reação de extensão de iniciadores. O DNA não modificado é removido através da digestão com 5'fosfodiesterase e os produtos modificados são alquilados para aumentar a sensibilidade de detecção na análise espectrométrica de massa. Todas as etapas são realizadas em um único frasco no menor volume de amostra praticável e não requerem purificação. A reação estendida pode receber uma carga positiva ou negativa e é detectada utilizando espectrometria de massa (Sauer e outros, Nucleic Acids Res. 28: e13 (2000)). Um instrumento em que o ensaio GOOD é analisado é, por exemplo, o sistema autoflex® MALDI-TOF da Bruker Daltonics (Billerica, MA).

O segundo grupo, que se baseia no reconhecimento de moléculas de DNA em heteroduplex, inclui a hibridização de oligonucleotídeos, ensaios com Taq-Man, beacons moleculares, ensaios de dot blot eletrônicos e cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante. As hibridizações de oligonucleotídeos podem ser realizadas em massa utilizando microarranjos (Southern, Trends Genet. 12: 110-115 (1996)). Os ensaios com Taq-Man ® ou Real Time PCR (PCR em Tempo Real), detecta o acúmulo de um produto da PCR específico através da hibridização e da divagem de uma sonda fluo40 rogênica marcada duplamente durante a reação de amplificação. Um ensaio com Taq-Man inclui quatro oligonucleotídeos, dos quais dois servem como iniciadores da PCR e geram um produto da PCR que abrange o polimorfismo que será detectado. Os outros dois são sondas de transferência de energia de ressonância de fluorescência específicas ao aleio (FRET). As sondas de FRET incorporam um fluoróforo e uma molécula de extinção em proximidade íntima de forma que a fluorescência do fluoróforo é extinguida. O sinal das sondas de FRET é gerado através da degradação do oligonucleotídeo de FRET, de forma que o fluoróforo é liberado da proximidade para o agente de extinção e é assim capaz de emitir luz quando excitado em um comprimento de onda apropriado. No ensaio, são utilizadas duas sondas de FRET que carregam corantes repórteres fluorescentes diferentes, em que um corante exclusivo é incorporado em um oligonucleotídeo que pode se anelar com alta especificidade a apenas um dos dois alelos. Os corantes repórteres úteis incluem 6-carbóxi-4,7,2',7'-tetraclorofluoresceína (TET), 2'c!oro-7'-fenil-1,4-dicloro-6-carboxif!uoresceína (VIC) e 6-carboxifluoresceína fosforamidita (FAM). Um agente de extinção útil é 6-carbóxi-N,N,N',N'tetrametilrodamína (TAMRA). As sondas de FRET aneladas (mas não as não aneladas) são degradadas pela TAQ DNA polimerase uma vez que a enzima encontra a extremidade a 5' da sonda anelada, liberando assim o fluoróforo da proximidade de seu agente de extinção. Após a reação da PCR, a fluorescência de cada um dos dois agentes de fluorescência, assim como a da referência passiva, é determinada de forma fluorométrica. A intensidade normalizada da fluorescência para cada um dos dois corantes será proporcional às quantidades de cada aleio inicialmente presente na amostra e assim o genótipo da amostra pode ser inferido. Um exemplo de um instrumento utilizado para detectar o sinal de fluorescência nos ensaios com Taq-Man® ou na Real Time PCR são o 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Os sinalizadores moleculares (molecular beacons) são sondas de oligonucleotídeo que formam uma estrutura de haste-e-alça e possuem um fluoróforo que é extinto internamente. Quando se ligam aos alvos com41 plementares, sofrem uma transição conformacional que ativa sua fluorescência. Estas sondas reconhecem seus alvos com maior especificidade que as sondas lineares e podem discriminar facilmente alvos que diferem um do ’ outro em um único nucleotídeo. A porção de alça da molécula serve como 5 uma sequência de sonda que é complementar a um ácido nucléico alvo. A haste é formada através do anelamento das duas sequências do braço complementares que estão em ambos os lados da sequência da sonda. Um grupamento fluorescente fica ligado na extremidade de um braço e um grupamento de extinção não-fluorescente fica ligado na extremidade do outro bra10 ço. O híbrido da haste mantém o fluoróforo e o agente de extinção tão próximos um do outro de forma que a fluorescência não ocorre. Quando o beacon molecular encontra uma sequência alvo, forma um híbrido sonda-alvo que é mais forte e mais estável que o híbrido da haste. A sonda sofre reorganização conformacional espontânea que força a separação das sequên15 cias dos braços, separando o fluoróforo do agente de extinção e permitindo que o fluoróforo sofra fluorescência (Bonnet e outros, 1999). O poder dos beacons moleculares se baseia em sua capacidade de se hibridizar apenas com sequências alvo que são perfeitamente complementares com a sequência da sonda, permitindo assim a detecção de diferenças de uma única base (Kota e outros, Plant Mol. Biol. Rep. 17: 363-370 (1999)). A detecção com beacons moleculares pode ser realizada, por exemplo, no Mx4000® Multiplex Quantitative PCR System da Stratagene (La Jolla, CA).

O ensaio de dot blot eletrônico utiliza um microchip semicondutor compreendido de um arranjo de microeletrodos coberto por uma camada de permeação de agarose contendo estreptavidina. Os amplicons biotinilados são aplicados no chip e submetidos à eletroforese em blocos selecionados através de corrente direta com polarização positiva, em que permanecem fixados através da interação com a estreptavidina na camada de permeação. O DNA em cada bloco é então hibridizado com misturas de oligonucleotí30 deos específicos ao alelo marcados de forma fluorescente. Sondas com pareamento errado de um único par de bases podem então ser preferencialmente desnaturadas através da inversão da polaridade da carga nos blocos individuais com amperagem crescente. É obtida uma imagem do arranjo utilizando uma câmera digital e a fluorescência é quantificada à medida que a amperagem é aumentada até o final. A intensidade de fluorescência é então ' determinada através da média dos valores da contagem de pixels sobre uma região de interesse (Gilles e outros, Nature Biotech. 17\ 365-370 (1999)).

Uma aplicação mais recente baseada no reconhecimento de moléculas de DNA em heteroduplex utiliza cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante (DHPLC). Esta técnica representa um ensaio altamente sensível e completamente automatizado que incorpora um autoamos10 trador de 96 poços resfriado Peltier para a análise de SNP de alto rendimento. Se baseia em um método de cromatografia líquida de alto desempenho em fase inversa com par iônico. A parte central do ensaio é um co-polímero de poliestireno-divinilbenzeno, que funciona como uma fase estacionária. A fase móvel é composta de um agente de pareamento iônico, tampão de ace15 tato de trietilamônio (TEAA), que medeia a ligação do DNA com a fase estacionária e um agente orgânico, acetonitrila (ACN), para atingir a separação subsequente do DNA da coluna. Um gradiente linear de CAN permite a separação de fragmentos com base na presença de heteroduplexes. A DHPLC identifica assim mutações e polimorfismos que causam a formação de hete20 roduplexes entre nucleotídeos com pareamento errado no DNA amplificado pela PCR de filamento duplo. Em um ensaio típico, a variação de sequência cria uma população mista de heteroduplexes e homoduplexes durante o reanelamento de DNA do tipo selvagem e mutante. Quando esta população mista é analisada por DHPLC sob temperaturas parcialmente desnaturantes, as moléculas de heteroduplex são eluídas da coluna antes das moléculas de homoduplex, devido às suas temperaturas de fusão reduzidas (Kota e outros, Genome 44: 523-528 (2001)). Um exemplo de um instrumento utilizado para analisar os SNPs através da DHPLC é o WAVE® HS System da Transgenomic, Inc. (Omaha, NE).

Um método baseado em microarranjo para o monitoramento de alto rendimento da expressão gênica de plantas pode ser utilizado como um sistema de marcador genético. Esta abordagem baseada em 'chip' envolve a utilização de microarranjos de moléculas de ácidos nucléicos como alvos de hibridização específica ao gene para medir quantitativamente ou qualitativamente a expressão de genes de plantas (Schena e outros, Science 270AQ7470 (1995), cuja totalidade é incorporada aqui como referência; Shalon, Tese de Ph.D. Stanford University (1996), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Cada nucleotídeo em uma sequência grande pode ser pesquisado ao mesmo tempo. A hibridização pode ser utilizada para analisar eficientemente as sequências de nucleotídeos. Tais microarranjos podem ser submetidos a sondas com qualquer combinação de moléculas de ácidos nucléicos. As combinações particularmente preferidas de moléculas de ácidos nucléicos que serão utilizadas como sondas incluem uma população de moléculas de mRNA de um tipo de tecido conhecido ou de um estágio do desenvolvimento conhecido ou de uma planta submetida a um estresse conhecido (ambiental ou produzido pelo ser humano) ou qualquer combinação das mesmas (por exemplo, mRNA produzido por folhas estressadas com água no estágio de 2 folhas). Os perfis de expressão gerados através deste método podem ser utilizados como marcadores.

Para a finalidade de mapeamento do QTL, os marcadores incluídos têm que ter origem de diagnóstico para que sejam feitas inferências em relação às populações subsequentes. Os marcadores de SNP são ideais para o mapeamento porque a probabilidade de que um alelo de SNP particular é derivado de origens diferentes nas populações existentes de uma espécie particular é muito baixa. Como tal, os marcadores de SNP são úteis para rastrear e auxiliar a introgressão dos QTLs, particularmente no caso de haplotipos.

A ligação genética de moléculas marcadoras adicionais pode ser estabelecida através de um modelo de mapeamento gênico tal como, sem limitação, o modelo de marcador flanqueador relatado por Lander e Botstein, Genetics, 727:185-199 (1989) e o mapeamento de intervalos, baseado nos métodos de probabilidade máxima descritos por Lander e Botstein, Genetics, 727:185-199 (1989) e implementados no pacote de software MAPMAKER/QTL (Lincoln e Lander, Mapping Genes Controlling Quantitative Traits

Using MAPMAKER/QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990). Um software adicional inclui Qgene, Versão 2.23 (1996), Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY, cujo manual é incorporado aqui como referência em sua totalidade). O uso do software Qgene é uma abordagem particularmente preferida.

Uma estimativa de probabilidade máxima (MLE) em relação à presença de um marcador é calculada, junto com uma MLE assumindo nenhum efeito do QTL, para evitar falsos positivos. Um logio de uma razão de chances (LOD) é então calculado como: LOD = log₁₀ (MLE em relação à presença de um QTL/MLE não fornecido qualquer QTL ligado). O escore de LOD indica essencialmente o quanto é mais provável que os dados tenham aumentado assumindo a presença de um QTL versus em sua ausência. O valor limite de LOD para evitar um falso positivo com uma certa confiança, digamos 95%, depende do número de marcadores e do comprimento do genoma. Os gráficos indicando os limites de LOD são apresentados em Lander e Botstein, Genetics, 727:185-199 (1989) e são descritos adicionalmente por Arús e Moreno-González , Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa (eds.) Chapman & Hall, Londres, pp. 314-331 (1993).

Podem ser utilizados modelos adicionais. Muitas modificações e abordagens alternativas para o mapeamento de intervalos foram relatadas, incluindo o uso de métodos não-paramétricos (Kruglyak e Lander, Genetics, 739:1421-1428 (1995), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Podem também ser utilizados vários métodos ou modelos de regressão, em que a característica sofre regressão em um grande número de marcadores (Jansen, Biometrics in Plant Breed, van Oijen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pp. 116-124 (1994); Weber e Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlim, 16 (1994)). Os procedimentos que combinam o mapeamento de intervalos com a análise de regressão, através dos quais o fenótipo sofre regressão em um único suposto QTL em um certo intervalo de marcadores e ao mesmo tempo em um número de marcadores que servem como 'co-fatores', foram relatados por Jansen e Stam, Genetics, 136:14471455 (1994) e Zeng, Genetics, 736:1457-1468 (1994). Geralmente, o uso de co-fatores reduz a tendência e o erro de amostragem das posições estimadas dos QTLs (Utz e Melchinger, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pp. 195-204 (1994), aumentando assim a precisão e a eficiência do mapeamento dos QTLs (Zeng, Genetics, 736:1457-1468 (1994)). Estes modelos podem ser estendidos para experimentos de vários ambientes para analisar as interações genótipoambiente (Jansen e outros, Theo. Appl. Genet. 91:33-37 (1995);

A seleção de populações de mapeamento apropriadas é importante para a construção de mapas. A escolha de uma população de mapeamento apropriada depende do tipo de sistemas de marcadores empregados (Tanksley e outros, Molecular mapping of plant chromosomes. chromosome structure and function: Impact of new concepts J.P. Gustafson e R. Appels (eds.). Plenum Press, Nova York, pp. 157-173 (1988), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Deve-se considerar a fonte dos parentais (adaptados vs. exóticos) utilizados na população de mapeamento. O pareamento de cromossomos e as taxas de recombinação podem ser gravemente perturbados (suprimidos) em cruzamentos amplos (adaptados x exóticos) e geralmente produzem distâncias de ligação enormemente reduzidas. Cruzamentos amplos fornecerão geralmente populações segregantes com um arranjo relativamente grande de polimorfismos quando comparados com a progênie em um cruzamento estreito (adaptados x adaptados).

Uma população F₂ é a primeira geração de autocruzamento após a semente híbrida ser produzida. Geralmente uma planta F! isolada é autocruzada para gerar uma população que segrega todos os genes de forma Mendeliana (1:2:1). A informação genética máxima é obtida partindo de uma população F₂ completamente classificada utilizando um sistema de marcadores co-dominantes (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen e Co., (1938), cuja totalidade é incorporada aqui como referência). No caso de marcadores dominantes, são necessários testes de progênie (por exemplo, F₃, BCF₂) para identificar os heterozigotos, tornando assim equivalentes a uma população F₂ completamente classificada. Entretanto, este procedimento é frequentemente proibitivo devido ao custo e ao tempo envolvidos no teste de progênie. O teste de progênie de indivíduos da F₂ é frequentemente utilizado na construção de mapas em que os fenótipos não refletem de forma coerente o genótipo (por exemplo, resistência a doenças) ou em que a expressão de características é controlada por um QTL. Os dados de segregação provenientes das populações de testes de progênie (por exemplo, F₃ ou BCF₂) podem ser utilizados na construção de mapas. A seleção auxiliada por marcadores pode ser então aplicada à progênie cruzada com base nas associações de mapas de marcador-característica (F₂, F₃), em que os grupos de ligação não foram completamente desassociados pelos eventos de recombinação (isto é, desequilíbrio máximo).

As linhagens intracruzadas recombinantes (RIL) (linhagens relacionadas geneticamente; geralmente >F₅, desenvolvidas partindo de linhagens F₂ autocruzadas continuamente em direção a homozigosidade) podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. A informação obtida dos marcadores dominantes pode ser maximizada através da utilização de RIL porque todos os loci são homozigotos ou quase. Sob condições de ligação forte (isto é, aproximadamente <10% de recombinação), marcadores dominantes e co-dominantes avaliados nas populações de RIL fornecem mais informação por indivíduo que qualquer tipo de marcador em populações de retrocruzamento (Reiter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 89:1477-1481 (1992)). Entretanto, à medida que a distância entre os marcadores fica maior (isto é, os loci ficam mais independentes), a informação nas populações de RIL diminui drasticamente quando comparadas com a de marcadores co-dominantes.

As populações de retrocruzamento (por exemplo, geradas de um cruzamento entre uma variedade bem-sucedida (parental recorrente) e uma outra variedade (parental doador) carregando uma característica ausente no primeiro) podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. Uma série de retrocruzamentos com o parental recorrente pode ser feita para re47 cuperar a maior parte de suas características desejáveis. Assim, é criada uma população que consiste em indivíduos quase similares ao parental recorrente, mas cada indivíduo carrega quantidades variáveis ou um mosaico de regiões genômicas do parental doador. As populações de retrocruzamento podem ser úteis para mapear marcadores dominantes se todos os loci no parental recorrente forem homozigotos e os parentais doadores e recorrentes tiverem alelos marcadores polimórficos contrastantes (Reiter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 89:1477-1481 (1992)). A informação obtida partindo das populações de retrocruzamento utilizando marcadores codominantes ou dominantes é menor que a obtida partindo de populações F2 porque um, ao invés de dois, gametas recombinantes é amostrado por planta. As populações de retrocruzamento, entretanto, são mais informativas (em uma saturação de marcador baixa) quando comparadas com as RILs uma vez que a distância entre os loci ligados aumenta nas populações de RIL (isto é, aproximadamente 0,15% de recombinação). A maior recombinação pode ser benéfica para a resolução de ligações fortes, mas pode ser indesejável na construção de mapas com saturação de marcador baixa.

Linhagens quase isogênicas (NIL) criadas através de muitos retrocruzamentos para produzir um arranjo de indivíduos que são quase idênticos em relação à composição genética exceto pela característica ou pela região genômica em questão podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. No mapeamento com as NILs, apenas uma parte dos loci polimórficos é esperada que seja mapeada em uma região selecionada.

A análise de segregantes em massa (BSA) é um método desenvolvido para a identificação rápida de ligação entre marcadores e características de interesse (Michelmore e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 88:9828-9832 (1991)). Na BSA, duas amostras de DNA agrupadas são extraídas de uma população segregante que se origina de um único cruzamento. Estes agrupamentos contêm indivíduos que são idênticos em relação a uma característica particular (resistentes ou susceptíveis a uma doença particular) ou uma região genômica, mas são arbitrários em regiões não ligadas (isto é, heterozigotos). As regiões não ligadas com a região alvo não diferi48 rão entre as amostras agrupadas de muitos indivíduos na BSA.

Uma alternativa para o mapeamento de QTLs tradicional envolve realizar uma maior resolução através do mapeamento de haplotipos, versus marcadores individuais (Fan e outros 2006 Genetics). Esta abordagem rastreia blocos de DNA conhecidos como haplotipos, que são definidos por marcadores polimórficos, que são assumidos como sendo idênticos por descendência na população de mapeamento. Esta suposição resulta em um tamanho de amostra eficiente maior, oferecendo maior resolução de QTL. Os métodos para a determinação da significância estatística de uma correlação entre um fenótipo e um genótipo, neste caso um haplotipo, podem ser determinados através de qualquer teste estatístico conhecido na técnica e com qualquer limite aceito de significância estatística sendo requerido. A aplicação de métodos particulares e de limites de significância é bemconhecida na perícia do versado na técnica.

Os marcadores de SNP da presente invenção podem ser utilizados para isolar ou para purificar substancialmente um alelo de um QTL que também está localizado no grupo de ligação associado com o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. A construção de uma série sobreposta de clones (um contig de clones) ao longo da região pode fornecer a base para um mapa físico que abrange um alelo de um QTL de resistência a doenças fúngicas que fica localizado em um grupo de ligação associado com o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. O sistema de clonagem com o cro49 mossomo artificial de levedura (YAC) facilitou a caminhada (walking) cromossômica e as estratégias de clonagem de tamanho grande. Uma abordagem contendo um sítio de marcação (tag) de sequência (STS) utilizando os marcadores da presente invenção pode ser utilizada para a construção de clones de YAC ao longo das regiões do cromossomo. Tal abordagem contendo STS para a construção de mapas de YAC pode fornecer um mapa baseado em STS detalhado e ordenado de qualquer região cromossômica, incluindo a região que abrange o alelo de um QTL que fica também localizado em um grupo de ligação associado com o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR, o lócus 4 de resistência à ASR, o lócus 5 de resistência à ASR, o lócus 6 de resistência à ASR, o lócus 7 de resistência à ASR, o lócus 8 de resistência à ASR, o lócus 9 de resistência à ASR, o lócus 10 de resistência à ASR, o lócus 11 de resistência à ASR, o lócus 12 de resistência à ASR e o lócus 13 de resistência à ASR. Os mapas de YAC podem ser suplementados por mapas físicos detalhados que são construídos ao longo da região utilizando clones de BAC, PAC ou bacteriófago P1 que contêm insertos variando em tamanho de 70 kb até várias centenas de kilobases (Cregan, Theor. AppI.Gen. 78:919-928 (1999), Sternberg, Proc. Natl. Acad. Sei. 87.Ί 03-107 (1990), Sternberg, Trends Genet. 8.Ί1-16 (1992); Sternberg e outros, New Biol. 2.Ί51-162 (1990); loannou e outros, Nat. Genet. 6;84-89 (1994); Shizuya e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 89;8794-8797 (1992), dos quais todos são incorporados aqui como referência em suas totalidades).

Os conjuntos sobrepostos de clones são derivados da utilização dos marcadores disponíveis da presente invenção para verificar bibliotecas de BAC, PAC, bacteriófago P1 ou cosmídeo. Em adição, as abordagens de hibridização podem ser utilizadas para converter os mapas de YAC em mapas de contig de BAC, PAC, bacteriófago P1 ou cosmídeo. YACs inteiros e produtos de inter-A/u-PCR assim como sequências de iniciadores de STSs apropriadas podem ser utilizados para verificar bibliotecas de BAC, PAC, bacteriófago P1 ou cosmídeo. Os clones isolados para qualquer região podem ser montados em contigs utilizando a informação contendo STS e a50 bordagens de fingerprinting (Sulston e outros, Comput. Appl. Biosci. 4.Ί25132 (1988)).

A degeneração do código genético, que permite que sequências de ácidos nucléicos diferentes codifiquem a mesma proteína ou peptídeo, é conhecida na literatura. Como utilizado aqui, uma molécula de ácido nucléico é degenerada de uma molécula de ácido nucléico quando as moléculas de ácidos nucléicos codificam as mesmas sequências de ácidos nucléicos, mas compreendem sequências de nucleotídeos diferentes. Um aspecto da presente invenção é que as moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucléicos que são degeneradas da molécula de ácido nucléico que codifica a(s) proteína(s) dos alelos de características quantitativas.

Um outro aspecto da presente invenção é que as moléculas de ácidos nucléicos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucléicos que são homólogas da molécula de ácido nucléico que codifica uma ou mais das proteínas associadas com o QTL.

O material genético exógeno pode ser transferido para uma planta através do uso de um vetor ou de uma construção de transformação de DNA vegetal planejada para tal finalidade. Um subgrupo particularmente preferido de material exógeno compreende uma molécula de ácido nucléico da presente invenção. O planejamento de tal vetor está geralmente dentro da perícia do estado da técnica (Vide, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nova York (1997). Os exemplos de tais plantas, incluem, sem limitação, alfalfa, Arabidopsis, cevada, Brassica, brócolis, repolho, frutas cítricas, algodão, alho, aveia, semente oleosa de colza, cebola, canola, linho, milho, uma planta ornamental, ervilha, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, soja, morango, cana-de-açúcar, beterraba de açúcar, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilha, uva, banana, chá, turfa, girassol, dendezeiro, Phaseolus etc.

Uma construção ou um vetor pode incluir o promotor endógeno do QTL de resistência a doenças fúngicas da presente invenção. A característica de resistência a doenças fúngicas poderia ser atingida da melhor ma51 neira através da expressão da proteína de QTL identificada com o promotor endógeno. Alternativamente, um promotor heterólogo pode ser selecionado para expressar a proteína ou o fragmento de proteína de escolha. Estes promotores podem estar ligados de forma operacional a uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína que corresponde ao QTL de resistência fúngica. O promotor heterólogo pode ser um que é selecionado com base na maturação ou no tempo de florescência, em que a sincronia de expressão da proteína desejada pode ser crítica para os parâmetros que afetam a característica de resistência a doenças fúngicas. A expressão eficiente do QTL de resistência a doenças fúngicas pode requerer também promotores que são expressos em tipos de tecidos específicos.

Alternativamente, os promotores podem estar ligados de forma operacional com outras sequências de ácidos nucléicos, tais como as que codificam peptídeos de trânsito, proteínas marcadoras que podem ser sele15 cionadas ou sequências anti-senso. Os promotores podem ser selecionados com base no tipo celular em que o vetor será inserido ou com base em suas características reguladoras. Os exemplos de tais características incluem o aumento da atividade de transcrição, a capacidade de indução, a especificidade ao tecido e a especificidade ao estágio de desenvolvimento. Nas plan20 tas, foram descritos os promotores que podem ser induzidos, de origem viral ou sintética, ativos de forma constitutiva, regulados de forma temporal e regulados de forma espacial (Poszkowski e outros, EMBO J., 3: 2719, 1989; Odell e outros, Nature, 313:810, 1985; Chau e outros, Science, 244:174-181. 1989). Os promotores constitutivos utilizados frequentemente incluem o promotor 35S do CaMV (Odell e outros, Nature, 313: 810, 1985), o promotor 35S do CaMV intensificado, o promotor do Vírus Mosaico da Escrofulária (FMV) (Richins e outros, Nucleic Acids Res. 20: 8451, 1987), o promotor da nopalina sintase (nos) (Shaw e outros, Nucleic Acids Res. 12: 7831-7846 (1984)) e o promotor da octopina sintase (ocs).

Os promotores que podem ser induzidos úteis incluem promotores induzidos por ácido salicílico ou ácidos poliacrílicos (PR-1; Williams e outros, Biotechnology 10:540-543, 1992), induzidos pela aplicação de agen52 tes de segurança (herbicidas de benzenossulfonamida substituídos; Hershey e Stoner, Plant Mol. Biol. 17: 679-690, 1991), promotores de choque térmico (Ou-Lee e outros, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 83: 6815, 1986; Ainley e outros, Plant Mol. Biol. 14: 949, 1990), um promotor que pode ser induzido por nitrato derivado da sequência de polinucleotídeos que pode ser transcrita da nitrito redutase do espinafre (Back e outros, Plant Mol. Biol. 17: 9, 1991), promotores que podem ser induzidos por hormônios (Yamaguchi-Shinozaki e outros, Plant Mol. Biol. 15: 905, 1990) e promotores que podem ser induzidos pela luz associados com a subunidade pequena da RuBP carboxilase e as famílias de LHCP (Kuhlemeier e outros, Plant Cell 1: 471, 1989; Feinbaum e outros, Mol. Gen. Genet. 226: 449-456, 1991; Weisshaar e outros, EMBO J. 10: 1777-1786, 1991; Lam e Chua, J. Biol. Chem. 266: 1713117135, 1990; Castresana e outros, EMBO J. 7: 1929-1936, 1988; SchulzeLeferte outros, EMBOJ. 8: 651, 1989).

Os promotores particularmente preferidos no vetor recombinante incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros, 1987), o promotor da octopina sintase (OCS) (que é carregado em plasmídeos indutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovirus tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e outros, 1987), o promotor 35S do CaMV (Odell e outros, 1985), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (Walker e outros, 1987); o promotor que pode ser induzido pela luz da subunidade pequena da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO); o promotor EIF-4A do tabaco (Mandei e outros, Plant Mol. Biol, 29: 995-1004, 1995); o promotor da quitinase de Arabidopsis (Samac e outros, Plant Cell, 3:1063-1072, 1991); os promotores LTP (Proteína de Transferência de Lipídeos) do brócolis (Pyee e outros, Plant J., 7: 49-59, 1995); da chalcona isomerase da petúnia (Van Tunen e outros, EMBO J. 7: 1257, 1988); da proteína 1 rica em glicina do feijão (Keller e outros, EMBO L., 8: 1309-1314, 1989); da patatina da batata (Wenzler e outros, Plant Mol. Biol., 12: 41-50, 1989); o promotor de Actina 7 de Arabidopsis (Número de acesso do Genbank U27811.1 GI:1002528, 17APR-1997 e Pedido de Patente PCT: WO0144457A2; cuja totalidade é in53 corporada aqui como referência); o promotor da Actina 8 de Arabidopsis (An e outros, Plant J. 10: 107-121 (1996) e Pedido de Patente PCT: WO0144457A2); o promotor da subunidade pequena 4 da Rubisco de Arabidopsis (Krebbers e outros, Plant Mol. Biol. 11: 745-759 (1988)); o promotor do gene da napina de Brassica (Patente U.S. N^e 5.420.034, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o promotor Suc2 de Arabidopsis (Truernit e outros, Planta 196: 564-570 (1995)); promotor do fator EF-1 alfa de alongamento de Arabidopsis (Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219: 106-112 (1989)); e o promotor de conglicina 7s α beta de Glycine max, Sphas (Doyle e outros, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)).

As construções da presente invenção também podem incluir regiões não-traduzidas a 5' adicionais (5' UTR) ou líderes de uma molécula de polinucleotídeo de mRNA ou gene que podem desempenhar uma função importante no início da tradução. Algumas 5' UTRs podem atuar como intensificadores da tradução e podem também ser incorporadas como parte do vetor recombinante. Por exemplo, as moléculas de polinucleotídeos líderes a 5' não-traduzidas derivadas de genes de proteínas de choque térmico demonstraram aumentar a expressão gênica em plantas (vide, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.659.122, cuja totalidade é incorporada aqui como referência e a Patente U.S. N° 5.362.865, cuja totalidade é incorporada aqui como referência). Assim o vetor recombinante pode conter preferencialmente uma ou mais sequências líderes não-traduzidas a 5' que servem para aumentar a expressão da sequência de ácido nucléico. Tais sequências intensificadoras podem ser desejáveis para aumentar ou para alterar a eficiência de tradução do mRNA resultante. As sequências de ácidos nucléicos a 5' preferidas incluem o líder da Actina 7 de Arabidopsis (Número de acesso do Genbank U27811.1 GL1002528, 17-APR-1997 e Pedido de Patente PCT: WO0144457A2; cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o líder da Actina 8 de Arabidopsis (An e outros, Plant J. 10: 107-121 (1996) e Pedido de Patente PCT: WO0144457A2); o líder da subunidade pequena 4 da Rubisco de Arabidopsis (Krebbers e outros, Plant Mol. Biol. 11: 745-759 (1988)); o líder do gene da napina de Brassica (Patente U.S. N° 5.420.034, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o líder de Suc2 de Arabidopsis (Truernit e outros, Planta 196: 564-570 (1995)); o líder do gene

Hsp70 de Petunia hybrida (Winter e outros, Mol. Gen. Genet. 211: 315-319 (1988)); o líder do gene EPSPS de Arabidopsis (Klee e outros, Mol. Gen.

Genet. 210: 437-442 (1987)); o lidero do fator EF-1 alfa de alongamento de Arabidopsis (Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219: 106-112 (1989)); e o líder da conglicina 7sa beta de Glycine max (Doyle e outros, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)). Estas moléculas de polinucleotídeos reguladoras a montante adicionais podem ser derivadas de uma fonte que é nativa ou he10 teróloga em relação aos outros elementos presentes na construção.

Em adição, as construções podem incluir moléculas de polinucleotídeos reguladoras adicionais da região não traduzida a 3' (3' UTR) dos genes de plantas. Uma 3' UTR ou terminador fornece tipicamente um sinal de término da transcrição e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilados na extremidade a 3' do mRNA. Geralmente, as sequências de ácidos nucléicos localizadas algumas centenas de pares de bases a jusante do sítio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. Em adição, algumas 3' UTRs fornecem propriedades adicionais tal como o aumento da estabilidade do mRNA como na 3' UTR do gene inibidor II de proteinase da batata (An e outros, The Plant Cell 1: 115-122 (1989)). Outras 3' UTRs podem fornecer sequências que aumentam a degradação do mRNA tal como o motivo 5'-UUAUUUAUU-3' que é mostrado como contribuindo para a menor estabilidade de mensagens de RNA em células de animais (Zubiaga e outros, Mol. Cell Biol. 15: 221925 2230 (1995)). Estas moléculas de polinucleotídeos reguladoras adicionais podem ser derivadas de uma fonte que é nativa ou heteróloga em relação aos outros elementos presentes na construção.

As 3' UTRs ou terminadores preferidos são a 3' UTR do gene do inibidor II da proteinase da batata (An e outros, The Plant Cell 1: 115-122 (1989)); o terminador E9 da subunidade pequena da Rubisco da ervilha (Coruzzi e outros, EMBO J. 3: 1671-1679 (1984)); o terminador 35S do vírus mosaico da couve-flor; o terminador do gene da napina de Brassica (Patente

U.S. Ν² 5.420.034); o terminador do gene da conglicina 7sa beta de Glycine max (Doyle e outros, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)); o terminador Arc5 de Phaseoulus vulgaris (Goossens e outros, Eur. J. Biochem. 225: 787795 (1994)); o terminador da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Rojiyaa e outros, 1987, Número de acesso do Genbank E01312 e Pedido de Patente U.S. N² US20020192813A1, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); e o terminador do gene ADR12 de Glycine max (Datta e outros, Plant Mol. Biol. 21: 859-869 (1993)).

Um vetor ou uma construção também podem incluir elementos reguladores derivados de íntrons de certos genes. Os exemplos dos tais incluem o íntron 1 de Adh (Callis e outros, Genes and Develop. 7:1183-1200 (1987); o íntron da sacarose sintase (Vasil e outros, Plant Physiol. 97:15751579 (1989); e o elemento TMV omega (Gallie e outros, The Plant Cell 7:301-311 (1989)). Os íntrons preferidos são o íntron da Actina 7 de Arabidopsis (Número de acesso do Genbank U27811.1 Gl: 1002528, 17-APR1997 e Pedido de Patente PCT: WO200144457A2; cuja totalidade é incorporada aqui como referência); o íntron da Actina 8 de Arabidopsis (An e outros, Plant J. 10: 107-121 (1996) e Pedido de Patente PCT: WO200144457A2); e o íntron do fator EF-1 alfa de alongamento de Arabidopsis (Axelos e outros, Mol. Gen. Genet. 219: 106-112 (1989)). Estes e outros elementos reguladores podem ser incluídos quando apropriado.

Um vetor ou uma construção também podem incluir um marcador que pode ser selecionado. Os marcadores que podem ser selecionados podem também ser utilizados para selecionar plantas ou células vegetais que contêm o material genético exógeno. Os exemplos dos tais incluem, mas não estão limitados a um gene neo (Potrykus e outros, Mol. Gen. Genet. 799:183-188 (1985)), que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionado utilizando canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica a resistência a bialaphos; um gene de EPSP sintase mutante (Hinchee e outros, Bio/Technology 6:915-922 (1988)), que codifica resistência ao glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência a bromoxinila (Stalker e outros, J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (1988)); um gene de acetolactato sintase (ALS) mutante que confere resistência à imidazolinona ou à sulfoniluréia (por exemplo, Patente U.S. N^s 6.222.100, cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene DHFR resistente ao metotrexato (Thillet e outros, J. Biol. Chem. 263:12500-12508 (1988)); tolerância conferida a Dicamba, por exemplo, por um gene para dicamba monooxigenase (DMO) de Pseudomonas maltophilia (Pedido de Patente U.S. 20030135879, cuja totalidade é incorporada aqui como referência).

Um vetor ou uma construção também podem incluir um marcador que pode ser verificado. Os marcadores que podem ser verificados podem ser utilizados para monitorar a expressão. Os exemplos de marcadores que podem ser verificados incluem um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5/387-405 (1987), cuja totalidade é incorporada aqui como referência; Jefferson e outros, EMBO J. 6.3901-3907 (1987), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene de lócus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (coloração vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta e outros, Stadler Symposium 77:263-282 (1988), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene de β-lactamase (Sutcliffe e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75:3737-3741 (1978), cuja totalidade é incorporada aqui como referência), um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow e outros, Science 234:856-859 (1986), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene xylE (Zukowsky e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:1101-1105 (1983), cuja totalidade é incorporada aqui como referência) que codifica uma catechol dioxigenase que pode converter cathecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikatu e outros, Bio/Technol. 8:241-242 (1990), cuja totalidade é incorporada aqui como referência); um gene de tirosinase (Katz e outros, J. Gen. Microbiol. 729:2703-2714 (1983), cuja totalidade é incorporada aqui como referência) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez se condensa em melanina; e uma a57 galactosidase.

Qualquer uma das técnicas conhecidas no estado da técnica para a introdução de transgenes em plantas pode ser utilizada para preparar uma planta resistente a doença fúngica de acordo com a invenção. Acreditase que os métodos adequados para a transformação de plantas incluem virtualmente qualquer método através do qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como através de eletroporação como ilustrado na Patente U.S. N² 5.384.253; bombardeio de microprojéteis como ilustrado nas Patentes U.S. N— 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865; transformação mediada por Agrobacterium como ilustrado nas Patentes U.S. N— 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301; e transformação de protoplastos como ilustrado na Patente U.S. N² 5.508.184. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de virtualmente qualquer espécie de planta podem ser transformadas de forma estável e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas. As técnicas úteis no contexto da transformação de algodão são descritas nas Patentes U.S. N— 5.846.797. 5.159.135. 5.004.863 e 6.624.344; e as técnicas para a transformação de plantas de Brassica, em particular, são descritas, por exemplo, na Patente U.S. N² 5.750.871; e as técnicas para a transformação de soja são descritas, por exemplo, em Zhang e outros (Plant Cell Tissue Organ Cult 56:37-46 (1999) e Patente U.S. N² 6.384.301).

Tendo agora descrito de forma geral a invenção, a mesma será mais facilmente entendida através da referência aos exemplos a seguir que são fornecidos com a finalidade de ilustração e não é pretendido que sejam limitantes da presente invenção, a não ser que seja especificado.

Exemplos

Exemplo 1: Cruzamento de Linhagens Quase Isogênicas contendo loci de resistência à ASR

Mil e quatrocentos marcadores de polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNP), distribuídos aleatoriamente ao longo dos 20 grupos de ligação do mapa de ligação genética da soja, foram utilizados para identificar marcadores de SNP ligados fortemente ao lócus 1 de resistência à ASR. Um conjunto de linhagens de soja consistindo em linhagens quase isogênicas (NILs) desenvolvidas partindo de um cruzamento entre Williams 82 e o doador do lócus 1 de resistência à ASR, Pl 200492. Linhagens derivadas de Pl 200492 foram utilizadas para identificar marcadores de SNP que eram polimórficos entre Williams 82 e Pl 200492. Estes marcadores de SNP polimórficos foram então utilizados para mapear a localização do lócus 1 de resistência à ASR utilizando uma população retrocruzamento segregante, L852378. A L85-2378 foi desenvolvida através do cruzamento de Williams 82 com Pl 200492 e cinco ciclos de retrocruzamento ou essencialmente 6 doses de Williams 82, foram realizadas para recuperar a maior parte das características desejáveis de Williams 82. Assim, é criada a L85-2378 consistindo em indivíduos quase iguais ao parental recorrente, Williams 82, mas cada NIL individual carrega quantidades variáveis ou mosaico de regiões genômicas do parental doador, Pl 200492.

A população inteira foi genotipada com os marcadores de SNP polimórficos identificados anteriormente e foi subsequentemente avaliada em relação à resistência à ferrugem da soja utilizando um ensaio de estufa. As associações entre o genótipo do marcador de SNP e o fenótipo de resistência à ferrugem da soja foram avaliadas. Os marcadores de SNP observados como estando em altos desequilíbrios de ligação com a resposta fenotípica da doença do lócus 1 de resistência à ASR eram NS0093250, NS0119710, NS0103004, NS0099454, NS0102630, NS0102915, NS0102913, NS0123728, NS0129943, NS0102168, NS0092723, NS0098177, NS0127343 e NS0101121 e são apresentados na Tabela 1 e indicados como as SEQ ID NOs: 67 até 80. Todos estes marcadores de SNP são mapeados em uma região no grupo de ligação G do mapa de ligação genética da soja público. A Tabela 1 lista as sequências para os iniciadores para a amplificação pela PCR, indicadas como as SEQ ID NOs: 1 até 28 e as sondas, indicadas como as SEQ ID NOs: 100 até 127, correspondendo a estes marcadores de SNP. Dois marcadores de SNP foram identificados como sendo úteis no monitoramento da introgressão positiva do lócus 1 de resistência à

ASR e correspondem aos marcadores de SNP NSO102913 e NSO129943 e correspondem às SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 75, respectivamente.

A eficiência do lócus 1 de resistência à ASR contra os isolados de ferrugem da soja do Alabama foi também avaliada nas populações F2:3 a seguir: AG4403 x Pl 200492, AG3302 x Pl 200492, AG3201 x Pl 200492, AG26932 x Pl 200492, AG2402 x Pl 200492. Em cada uma das populações, uma proporção de segregação de 3:1 foi observada indicando um padrão de herança de um único gene dominante.

Após o procedimento descrito para o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 3 de resistência à ASR foi mapeado utilizando NILs desenvolvidas partindo do cruzamento entre Williams 82 e o parental doador, Pl 462312, seguido por cinco ciclos de retrocruzamento ou essencialmente 6 doses de Williams 82, foram realizadas para recuperar a maior parte das características desejáveis de Williams 82. Assim, é criada a L85-2378 consistindo em indivíduos quase iguais ao parental recorrente, Williams 82, mas cada linhagem quase isogênica individual carrega quantidades variáveis ou mosaico de regiões genômicas do parental doador, Pl 200492. A população inteira foi genotipada com o conjunto de marcadores de SNP polimórficos identificados anteriormente e foi subsequentemente avaliada em relação à resistência à ferrugem da soja utilizando um ensaio de estufa. As associações entre o genótipo do marcador de SNP e o fenótipo de resistência à ferrugem da soja foram avaliadas. Os marcadores de SNP observados como estando em altos desequilíbrios de ligação com o lócus 3 de resistência à ASR eram NS0099746, NS0123747, NS0126598, NS0128378, NS0096829, NS0125408, NS0098902, NS0099529, NS0097798, NS0137477,

NS0095322, NS0136101 e NS0098992 e são apresentados na Tabela 1 e indicados como as SEQ ID NOs: 81 até 93. Estes marcadores foram todos mapeados em LG C2 do mapa genético da soja público. A Tabela 1 lista as sequências para os iniciadores para a amplificação pela PCR, indicadas como as SEQ ID NOs: 29 até 54 e as sondas, indicadas como as SEQ ID NOs: 128 até 153, correspondendo a estes marcadores de SNP. O marcador utilizado para monitorar a introgressão do lócus 3 de resistência à ASR corres60 ponde ao marcador de SNP NSO137477 e é indicado como a SEQ ID NO: 90. Para confirmar a suposta localização do lócus 3 de resistência à ASR, uma população F3:4 segregante foi desenvolvida entre AVRDC-8 e AG4403. AVRDC-8 é uma linhagem desenvolvida pelo Asian Vegetable Research and Development Center in Taiwan por cruzamento de Ankur (linhagem contendo o lócus 3 de resistência à ASR) e Pl 230970 (doador do lócus 2 de resistência à ASR). Esta população está sendo atualmente genotipada em relação aos marcadores de SNP e avaliada em relação à reação de resistência contra um isolado de ferrugem da soja de Loxley, AL para validar a localização do lócus 3 de resistência à ASR.

As localizações aproximadas do lócus 2 de resistência à ASR e do lócus 4 de resistência à ASR foram determinadas posteriormente com base em uma análise dos polimorfismos entre um conjunto de linhagens Pl que são conhecidas por conterem o lócus 2 de resistência à ASR ou o lócus 4 de resistência à ASR, Pl 230970, Pl 459025B, o doador do lócus 2 de resistência à ASR e do lócus 4 de resistência à ASR, respectivamente e outras linhagens que foram relatadas na literatura como contendo qualquer um dos QTLs. Com base na análise dos polimorfismos, qualquer marcador de SNP polimórfico é uma região candidata próxima aos loci de resistência à ASR. Para o lócus 2 de resistência à ASR, duas regiões candidatas foram identificadas e o lócus fica mais provavelmente localizado no grupo de ligação J, próximo ou dentro do agrupamento de resistência à doença Podridão Parda do Caule, de resistência ao Nematoide do Cisto da Soja e Mancha Foliar olho de rã ou dentro do grupo de ligação N. O lócus 4 de resistência à ASR fica provavelmente localizado no grupo de ligação N.

Tabela 1: Marcadores de SNP para a identificação e para a seleção do lócus 1 de resistência à ASR e do lócus 3 de resistência à ASR.

MARCADOR	SEQ ID	SEQ ID INICIADOR PARA FRENTE	SEQ ID INICIADOR INVERSO	SEQ ID SONDA 1	SEQ ID SONDA 2
NS0093250	67	1	2	100	101
NS0119710	68	3	4	102	103

MARCADOR	SEQ ID	SEQ ID INICIADOR PARA FRENTE	SEQ ID INICIADOR INVERSO	SEQ ID SONDA 1	SEQ ID SONDA 2
NS0103004	69	5	6	104	105
NS0099454	70	7	8	106	107
NS0102630	71	9	10	108	109
NS0102915	72	11	12	110	111
NS0102913	73	13	14	112	113
NS0123728	74	15	16	114	115
NS0129943	75	17	18	116	117
NS0102168	76	19	20	118	119
NS0092723	77	21	22	120	121
NS0098177	78	23	24	122	123
NS0127343	79	25	26	124	125
NS0101121	80	27	28	126	127
NS0099746	81	29	30	128	129
NS0123747	82	31	32	130	131
NS0126598	83	33	34	132	133
NS0128378	84	35	36	134	135
NS0096829	85	37	38	136	137
NS0125408	86	39	40	138	139
NS0098902	87	41	42	140	141
NS0099529	88	43	44	142	143
NS0097798	89	45	46	144	145
NS0137477	90	47	48	146	147
NS0095322	91	49	50	148	149
NS0136101	92	51	52	150	151
NS0098982	93	53	54	152	153

Exemplo 2: Coleta e propagação de esporos.

Os urediniosporos da Ferrugem Asiática da Soja de Phakopsora pachyrhizi foram coletados de plantas infectadas na estação Monsanto Loxley Agronomy (Loxley, AL), referida aqui como a cepa Loxley.

As plantas de soja foram inoculadas através da aspersão da par5 te inferior das folhas com esporos suspensos em água contendo 0,01% de Tween-20. O desenvolvimento de lesões era visível sem aumento em torno de 7 até 10 dias com a esporulação ocorrendo 12 até 14 dias após a infecção. Os esporos das plantas infectadas foram coletados e ressuspensos em água deionizada esterilizada contendo 0,01% de Tween 20. A concentração de esporos foi determinada utilizando um hemocitômetro.

Exemplo 3: Ensaio de folhas removidas em relação à Resistência À Ferrugem Asiática da Soja

Dois tipos de tecido foliar foram avaliados em relação à fenotipagem da doença ASR. Folhas unifoliadas, sete até dez dias após a emergência ou folhas trifoliadas V3, vinte e um até vinte e oito dias após a emergência, foram analisadas. Aproximadamente dois dias após a emergência do solo, a planta de soja carrega um par de folhas unifoliadas que estão completamente desenroladas aproximadamente cinco dias depois e constituem as primeiras 'folhas verdadeiras'. Aproximadamente sete dias após a emergência, as folhas trifoliadas aparecem (compreendendo três folhas na extremidade de um pecíolo). Três conjuntos emergem em sequência e as primeiras folhas trifoliadas são designadas como o estágio V1 e estão totalmente expandidas dez dias após a emergência. Os dois estágios V seguintes ocorrem com uma diferença de uma semana. De forma notável, as folhas são inoculadas com a doença após terem tanto se desenrolado quanto endurecido, isto é, não estão novas nem verdes. As unifoliadas tendem a endurecer muito rapidamente, em torno de 8-1 Od após a emergência, enquanto que as trifoliadas V2 e V3 podem não se desenrolar ainda até 24-28 dias após a emergência.

Três papéis de filtro Watmann #1 de 3,2 cm de diâmetro são colocados em cada um dos 6 poços de uma placa de cultura de 6 poços (o volume do poço é de 15,5 mililitros). As folhas são cortadas em pedaços de 3 centímetros por 3 centímetros e colocadas na superfície dos papéis de filtro Watmann com a parte inferior (porção estomatal) da folha voltada para cima. Aproximadamente 2,0 mililitros de água deionizada esterilizada são colocados em cada poço da placa de cultura de tecido de 6 poços. Os urediniospo63 ros da Ferrugem Asiática da Soja de Phakopsora pachyrhizi são suspensos em água deionizada esterilizada contendo 0,01% de tween 20 em uma concentração de 1 X 10⁵ urediniosporos por mililitro. Aproximadamente 50 microlitros de suspensão de esporos são aplicados em cada pedaço de folha utilizando um vaporizador (Modelo Badger 155 Anthem, Badger Air-Brush Co., Franklin Park, IL) com um compressor (Modelo TC-20, Airbrush Depot, San Diego, CA) com ajuste de 1 quilograma por centímetro quadrado para umidade. A placa de 6 poços é então selada com parafilme e colocada em uma câmara de crescimento ajustada a 22 graus Celsius, com um fotoperíodo de 12 horas de período de dia. As placas foram verificadas a cada 2 ou 3 dias para monitorar a progressão da doença e para garantir que os poços não secaram. A água deionizada é adicionada para completar o volume original no poço quando necessário ou a umidade relativa da incubadora é ajustada em aproximadamente 80%. Os sintomas iniciais de lesões em desenvolvimento devem ser evidentes sob um microscópio de dissecação aproximadamente 3 até 5 dias após a inoculação. As lesões de esporulação devem ser evidentes 9 até 14 dias após a inoculação. Os escores médios de gravidade da ferrugem da soja são calculados partindo de vários testes. O escore de gravidade da ferrugem utiliza uma escala de classificação de 1 até 5; 1 - sendo imune, 2 - demonstrando lesões vermelhas/marrons ao longo de menos de 50% da área da folha, 3 - demonstrando lesões vermelhas/marrons ao longo de mais de 50% da área da folha, 4 - demonstrando lesões queimadas ao longo de menos de 50% da área da folha e 5 - e demonstrando lesões queimadas ao longo de mais de 50% da área da folha. As seções de folha podem permanecer viáveis neste ensaio durante até 2 meses.

Experimentos utilizando soja susceptível à Ferrugem Asiática da Soja, Lee 74 demonstram de forma coerente altos níveis de infecção para cada ensaio realizado. Experimentos adicionais avaliando um suposto germoplasma resistente foram capazes de diferenciar números de acesso tolerantes dos susceptíveis como demonstrado na Tabela 2. O número de acesso PI 200487 demonstrou um fenótipo de resistência lenta à ferrugem. Es64 tão em andamento esforços para identificar marcadores que serão utilizados na introgressão do lócus de resistência identificado no Pl 200487 para o germoplasma de elite.

Em adição, a comparação da avaliação da ASR de tecido foliar 5 unifoliado e trifoliado mostrou que leva aproximadamente 45 dias partindo da semente até o ponto de dados para os trifoliados e aproximadamente 23 dias para os unifoliados. A redução do tempo de ensaio na metade, economiza significativamente o ensaio de folhas removidas e o tempo necessário para determinar a classificação de resistência à doença. Reduzindo 3 sema10 nas, as plantas podem ser propagadas em uma escala de tempo mais rápida e as plantas susceptíveis podem ser separadas mais cedo, economizando espaço no campo e na estufa.

Tabela 2: Escore médio de ferrugem para os números de acesso resistentes e susceptíveis como determinado utilizando tecido foliar unifoliado e trifolia15 do; indica que o ensaio não foi realizado.

Número de acesso	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem Unifoliada Removida	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem Folha Removida
Lee 74	5,0	5
Pl200487	1,89	2,25
Pl 200492 (lócus 1 de resistência à ASR)	1,00	2
Pl200499	-	5
Pl 230970	2,5	3
Pl 368038	-	3
Pl 368039	-	2
Pl 462312	-	2
Pl 547875	-	2
Pl547878	-	4,25
Pl 547879	-	5
Tiana	-	5
Williams	-	5
AVRDC-8	1.8	2,25

Número de acesso	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem Unifoliada Removida	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem Folha Removida
Dowling	-	5

Exemplo 4: Teste de cruzamentos de Elite em relação à resistência a P. pachyrizi com o lócus 1 de resistência à ASR, o lócus 2 de resistência à ASR e o lócus 3 de resistência à ASR introgredidos.

Os cruzamentos com a linhagem parental resistente doadora, PI 5 200492, contendo o lócus 1 de resistência à ASR foram realizados com várias linhagens de elite da soja para monitorar a introgressão positiva do lócus 1 de resistência à ASR. Os ensaios de folhas em relação à resistência para a cepa Loxley foram realizados utilizando linhagens derivadas de cruzamentos com o número de acesso da linhagem parental resistente, PI 200492 (Ιοί 0 cus 1 de resistência à ASR) assim como os números de acesso resistentes conhecidos (PI 230970 (lócus 2 de resistência à ASR) e PI 462312 (lócus 3 de resistência à ASR)) e linhagens de elite susceptíveis. Os escores de resistência para todas as linhagens testadas são apresentados na Tabela 3. Os escores médios de gravidade de ferrugem eram derivados de 4 plantas, cada uma com 4 replicações e classificadas em 4 dias diferentes (10DAI, 17DAI, 24DAI, 32DAI).

Tabela 3: Escore Médio de Gravidade de Ferrugem de eventos de retrocruzamento de ASR e linhagens de elite.

Cruzamento	Progênie do Cruzamento	Loci/lócus de resistência à ASR	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
Vários cruzamentos para a introgressão tanto do lócus 2 de resistência à ASR quanto do lócus 3 de resistência à ASR	AVRDC-8	Lócus 2 de resistência à ASR/Lócus 3 de resistência à ASR	1,7
Linhagem Susceptível Conhecida	Dowling	Susceptível	5
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1137.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GLAG4801//L85-	JN1137.2	Lócus 1 de	5

Cruzamento	Progênie do Cruzamento	Loci/lócus de resistência à ASR	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
2378/L86-1753		resistência à ASR (MAS)
GL AG4801//L852378/L86-1754	JN1137.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1755	JN1137.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1153.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1753	JN1153.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1754	JN1153.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1755	JN1153.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1160.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	4,8
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1160.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1160.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1160.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1163.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1163.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	4,8
GLAG4801//L85-	JN1163.3	Lócus 1 de resistência à	1

Cruzamento	Progênie do Cruzamento	Loci/lócus de resistência à ASR	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
2378/L86-1752		ASR (MAS)
GL AG4801//L852378/L86-1752	JN1163.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	5
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1691.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	4,5
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1691.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	4,6
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1691.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	4,6
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1691.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	3
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1692.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1,1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1692.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1692.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1692.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1742.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1742.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1742.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1742.4	Lócus 1 de resistência à	1

Cruzamento	Progênie do Cruzamento	Loci/lócus de resistência à ASR	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
		ASR (MAS)
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1765.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1,2
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1765.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1765.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1765.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1774.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1774.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1774.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG5501//L852378/L86-1752	JN1774.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL4504D0C//L852378/L86-1752	JN1866.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL4504D0C//L852378/L86-1752	JN1866.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL4504D0C//L852378/L86-1752	JN1866.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL4504D0C//L852378/L86-1752	JN 1866.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2242.1	Lócus 1 de resistência à	1

Cruzamento	Progênie do Cruzamento	Loci/lócus de resistência à ASR	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
		ASR (MAS)
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2242.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2242.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2242.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2243.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2243.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	2,4
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2243.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2243.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1,3
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2250.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2250.2	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2250.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1,2
GL CGL5400E1X//L852378/L86-1752	JN2250.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4403//L852378/L86-1752	JN774.1	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4403//L852378/L86-1752	JN774.2	Lócus 1 de resistência à	1,1

Cruzamento	Progênie do Cruzamento	Loci/lócus de resistência à ASR	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
		ASR (MAS)
GL AG4403//L852378/L86-1752	JN774.3	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1
GL AG4403//L852378/L86-1752	JN774.4	Lócus 1 de resistência à ASR (MAS)	1

As linhagens que contêm o lócus 1 de resistência à ASR exibiam maior resistência à cepa Loxley. A introgressão do lócus 1 de resistência à ASR foi confirmada por MAS.

Exemplo 5: Teste de Números de acesso da Soja em relação à Resistência 5 à ASR utilizando o Ensaio de Folha Removida

Setecentos supostos números de acesso resistentes à ASR foram identificados com base nos ensaios de estufa, utilizando uma população mista de isolados de ASR de origem estranha. Os ensaios de folhas em relação à resistência à ASR foram realizados como descrito no Exemplo 3 uti10 lizando um subconjunto de duzentos e cinquenta dos setecentos supostos números de acesso resistentes USDA. Um conjunto complementar de duzentos e cinquenta números de acesso susceptíveis à ASR da USDA foi selecionado para comparação no ensaio de folhas com base na comparação das maturidades e das origens geográficas dos duzentos e cinquenta núme15 ros de acesso resistentes. Os escores médios de gravidade de ferrugem dos números de acesso resistentes principais (aqueles que exibiam um escore médio de gravidade de ferrugem de 1 até 2) são apresentados na Tabela 4 a seguir. Mil e quatrocentos marcadores de SNP, distribuídos a cada 5 centimorgans ao longo dos 20 grupos de ligação do mapa de ligação genética da soja, serão utilizados para identificar os marcadores úteis para acompanhar a introgressão dos loci de resistência à ASR possuídos pelos números de acesso resistentes no germoplasma de elite.

Tabela 4: Números de Acesso Resistentes à ASR com Escore Médio de Gravidade de Ferrugem.

Número de acesso	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
PI200488	1,0
PI200492	1,0
PI203398	1,0
PI307884B	1,0
PI416764	1,0
PI416826A	1,0
PI417117	1,0
PI417132	1,0
PI423967	1,0
PI506947	1,0
PI507009	1,0
PI507259	1,0
PI561305	1,0
PI567031B	1,0
PI567034	1,0
PI567056A	1,0
PI567058D	1,0
PI567190	1,0
PI605773	1,0
PI605829	1,0
PI605865B	1,0
PI379620	1,3
PI416873B	1,3
PI417128	1,3
PI417463	1,3
PI567123A	1,3
PI578457A	1,3
PI615437	1,3
PI379621	1,3
PI567102B	1,3
PI594172A	1,3
PI628932	1,3

Número de acesso	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
PI079648	1,5
PI291309C	1,5
PI416886	1,5
PI417503	1,5
PI506491	1,5
PI506677	1,5
PI506695	1,5
PI507193	1,5
PI567046A	1,5
PI567053	1,5
PI567189A	1,5
PI605891B	1,5
PI200455	1,8
PI232989	1,8
PI594494A	1,8
PI597405D	1,8
PI069533	2,0
PI084674	2,0
PI230970	2,0
PI291278	2,0
PI341252	2,0
PI417126	2,0
PI417134	2,0
PI417208	2,0
PI423923	2,0
PI437609A	2,0
PI471900	2,0
PI497969	2,0
PI506628	2,0
PI547875	2,0
PI567024	2,0
PI567025A	2,0

Número de acesso	Escore Médio de Gravidade de Ferrugem
PI578471A	2,0
PI594512C	2,0
PI594561	2,0
PI605781A	2,0
PI605838	2,0
PI606405	2,0
PI606440A	2,0
PI615445	2,0

Em adição, os marcadores de SNP distribuídos proximais e distais ao lócus 3 de resistência à ASR foram genotipados em relação a um conjunto de oitenta e nove números de acesso resistentes. Foi observado que quatro marcadores de SNP adicionais (NS0103749, NS0118897,

NS0119715 e NS0130920) estavam associados com o lócus de resistência à ASR e estão listados na Tabela e indicados como as SEQ ID NOs: 94 até 97. A Tabela 5 lista as sequências dos iniciadores para a amplificação pela PCR, indicadas como as SEQ ID NOs: 55 até 62 e as sondas, indicadas como as SEQ ID NOs: 154 até 161, correspondendo a estes marcadores de

SNP.

Esta informação será utilizada para identificar novas fontes de resistência úteis na priorização da introgressão da ASR e outros loci de resistência a agentes patogênicos.

Tabela 5: Marcadores de SNP para a identificação e para a seleção do lócus 15 3 de resistência à ASR.

MARCADOR	SEQ ID	SEQ ID INICIADOR PARA FRENTE	SEQ ID INICIADOR INVERSO	SEQ ID SONDA 1	SEQ ID SONDA 2
NS0103749	94	55	56	154	155
NS0118897	95	57	58	156	157
NS0119715	96	59	60	158	159
NS0130920	97	61	62	160	161

Exemplo 6: Utilização de estudos de associação para a identificação de QTLs que conferem resistência a doenças fúngicas

A identificação de regiões ou genes associados com a doença é a primeira etapa em direção ao desenvolvimento de variedades resistentes. Quatro loci para resistência à ferrugem (lócus 1 de resistência à ASR, lócus 2 de resistência à ASR, lócus 3 de resistência à ASR, lócus 4 de resistência à ASR) foram identificados anteriormente. Neste exemplo, o desequilíbrio de ligação e o mapeamento de associação de haplotipos foram aplicados em uma amostra de dados de controle de caso de germoplasma de soja.

Quatrocentos e noventa e duas linhagens de soja (246 pares resistentes-susceptíveis) foram classificados em relação à resistência à ferrugem assim como submetidas ao fingerprinting utilizando 797 SNPs. A resistência a doenças foi classificada em escalas de 1 até 5 em uma mistura de isolados de Phakopsora pachyrhizi, com menos de 3 como resistentes e mais de 4 como susceptíveis. Especificamente, o teste de controle de caso, o teste exato de Fishers, o teste F de marcador isolado e a regressão de tendência de haplotipo foram explorados em tamanhos de janela de 3, 5 e 9 SNPs consecutivos. Vários resultados de teste associam significativamente dois marcadores de SNP de duas janelas de haplotipos separadas, referidas aqui como janelas 1 e 2 de haplotipos de resistência a doenças fúngicas, no cromossomo 13 24-45 cM com resistência à doença fúngica; Os marcadores de SNP NS0103033 e NS0124935 ficam localizados nas janelas 1 e 2 de haplotipos de resistência a doenças fúngicas, respectivamente. Os iniciadores para NS0103033 (SEQ ID NO: 98) são indicados nas SEQ ID NOs: 63 e 64 e as sondas são indicadas nas SEQ ID NOs: 162 e 163. Os iniciadores para NS0124935 (SEQ ID NO: 99) são indicados nas SEQ ID NOs: 65 e 66 e as sondas são indicadas nas SEQ ID NOs: 164 e 165. Os escores de resistência para cada um dos haplotipos e o alelo marcador para cada haplotipo estão indicados na Tabela 5. Cada janela é denominada por cinco marcadores de SNP e os alelos para cada um é indicada como a sequência do haplotipo. O alelo para NS0103033 na janela 1 de haplotipo e NS0124935 na janela 2 de haplotipo são indicados em negrito. Para NS0103033, o SNP é realmente um indel de 9 pb em que Z representa a deleção (*********) θ W representa a inserção (GAAGTGGAT).

As variedades que contêm os haplotipos resistentes da janela 1 e/ou 2 do haplotipo estão indicadas na tabela 6. Este esforço de mapeamento identificou QTLs adicionais de resistência à doença ARS em adição aos loci de resistência à ARS definidos anteriormente.

Tabela 5: Sumário da classificação das linhagens contendo haplotipos resistentes nas janelas 1 e 2 de haplotipos de resistência à ASR. Um escore de resistência de 0 indica que a linhagem era resistente e um escore de 1 indica que a linhagem foi denominada susceptível.

Lócus de resis- Janela 1 de Sequência do Escore de Resistêntência à ASR Haplotipo Haplotipo cia

1

5	Haplotipo 1	AAZA?	5	0
6	Haplotipo 2	AGWGA	26	10
7	Haplotipo 3	AGWGG	34	15
8	Haplotipo 4	TAZAG	5	0
9	Haplotipo 5	TAZGA	13	5
			0	1
10	Haplotipo 6	CGTTG	8	1
11	Haplotipo 7	GGTTC	26	11
12	Haplotipo 8	GGCCC	12	6
13	Haplotipo9	GGT-C	4	0

Tabela 6: Classificações de doenças para germoplasma resistente contendo 10 haplotipos nas janelas 1 e/ou 2 de resistência à ASR no cromossomo 13.

Linhagem	Classificação	Haplotipo de resistência da janela 1 do haplotipo	Haplotipo de resistência da janela 2 do haplotipo
Pl 164885	2,5	X	X
Pl 165524	2	X	X
Pl 166028	2		X
PI189968	2	X	X
PI200446	2	X
PI200488	2,5		X
PI205901B	2,5	X

Linhagem	Classificação	Haplotipo de resistência da janela 1 do haplotipo	Haplotipo de resis tência da janela 2 do haplotipo
PI222549	2,5	X
PI224270	2,5	X
PI227331	2,5	X	X
PI229333	2,5		X
PI238109	2,3	X
PI240667A	1	X
PI258383	2	X
PI291309C	2	X
PI341252	2,5	X	X
PI374189	2,3	X
PI398335	2	X
PI399070	2,5	X
PI407831	2,5	X
PI407833C	2		X
PI407845A	2,5	X
PI407858	2,3	X	X
PI407881	2,3	X
PI408088	2,3	X
Ρ1408134B	2	X
PI408272B	2	X
PI417122	2,5	X
PI417126	2,5	X
PI417235	2	X
PI417335	2,3	X
PI423717	2	X
PI423722	2,3	X
PI423730B	2,3	X
PI423852	2,3	X	X
PI424190	2,5	X
PI434973A	2,5	X
PI437110A	2,3	X
PI437437A	1,5		X

Linhagem	Classificação	Haplotipo de resistência da janela 1 do haplotipo	Haplotipo de resis tência da janela 2 do haplotipo
PI437740B	2,3	X	X
PI437921	2	X
PI437982	2,3	X	X
PI438073	2,3	X
PI438371	2,5	X
PI438480	2,5	X
PI479735	2,3	X
PI497965	2,5	X
PI506737	2	X
PI506863	2	X
PI507142	2,5		X
PI508269	2	X
PI548325	2	X
PI561289	2	X	X
PI561329	2,5	X
PI561330A	2		X
PI561337	2		X
PI561377	2,3		X
PI566978	2,5	X
PI567010B	2,3	X
PI567093B	2	X	X
PI567104B	2,5	X	X
PI567108B	2,5	X	X
PI567129	2,3	X	X
PI567140B	2,5	X
PI567174C	2,3		X
PI567175C	2	X	X
PI567300A	2	X
PI567409A	2,3	X
PI567470	2	X
PI567473C	2,5	X
PI567474	2,3	X

Linhagem	Classificação	Haplotipo de resistência da janela 1 do haplotipo	Haplotipo de resistência da janela 2 do haplotipo
PI567489A	2	X
PI567507B	2	X
PI567554A	2	X
PI567560	2,5	X	X
PI567561	2,5	X
PI567675	2,3		X
PI567692	2	X	X
PI567718	2	X	x
PI567780A	2,3	X
PI578305B	2,5	X
PI587598A	2,5	X
PI587914B	2		X
PI587922A	2		X
PI587935A	2,3		x
PI588000	2,5		X
PI588034	2,5		x
PI592962B	2,3	X
PI594525	2,5	X	X
PI594538A	2	X	X
PI594767B	1	X
PI597480A	2,3	x
PI603293B	2,3	X
PI603296	2,5		X
PI603429D	2,5	X
PI603564A	2,3	X
PI603612	2,3	X	X
PI603704A	2,5	x	x
PI605891B	2,5	x
PI628870	1,5		X
PI628932	2,4	X

Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para os versados na técnica que a invenção pode ser mo79 dificada em arranjo e detalhes sem se afastar de tais princípios. São reivindicadas todas as modificações que estão dentro do espírito e do âmbito das reivindicações em anexo.

Todas as publicações e os documentos de patentes publicados citados neste relatório descritivo são incorporados aqui como referência até a mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual estivesse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado como referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Baley, George James

Butruille, David

Concibido, Vergei C

Eathington, Samuel R

Haverdink, Michael D

Kruger, Warren M

LeDeaux, John R

Narvel, James

Pitkin, John W

Tamulonis, John P

Xie, Chongqing <120> PROCESSO PARA IDENTIFICAR LOCI DE CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS DE RESISTÊNCIA A DOENÇAS NA SOJA E COMPOSIÇÕES DOS

MESMOS

<130>	38-21 (53517)
<140>	60/808430
<141>	2006-05-25
<160>	165
<210>	1
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sequência Artificial

<220>

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para seleção de uma planta de soja resistente à ferrugem asiática da soja (ASR), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   5 a) isolamento de ácidos nucléicos de uma pluralidade de plantas de soja;

   b) detecção nos ditos ácidos nucléicos isolados da presença de uma ou mais moléculas marcadoras associadas com o lócus 3 de resistência à ASR a 10 centimorgans ou menos da molécula marcadora NS0137477 compreendendo SEQ ID NO: 90 e em que o referido lócus 3 de resis10 tência a ASR é obtenível a partir da variedade de soja PI 462312; e

   c) seleção de uma planta de soja que compreende a referida uma ou mais molécula marcadora, selecionando assim uma planta de soja resistente à ASR.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 15 fato de que a referida planta de soja resistente à ASR é resistente ao patógeno Phakopsora meibomiae.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja resistente à ASR é resistente ao patógeno Phakopsora pachyrhizi.

   20
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula marcadora é NS0137477 compreendendo SEQ ID NO: 90.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta de soja resistente à ASR compreende ainda um

   25 ou mais loci de resistência à ASR selecionados a partir do grupo consistindo nos loci de resistência à ASR 1,2 e 4-13.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o lócus 1 de resistência à ASR está mapeado a 10 centimorgans ou menos de uma ou mais moléculas marcadoras selecionadas a partir do

   30 grupo consistindo em NS0093250 compreendendo SEQ ID NO: 67, NS0119710 compreendendo SEQ ID NO: 68, NS0103004 compreendendo SEQ ID NO: 69, NS0099454 compreendendo SEQ ID NO: 70, NS0102630

   Petição 870180015024, de 26/02/2018, pág. 9/10 compreendendo SEQ ID NO: 71, NS0102915 compreendendo SEQ ID NO: 72, NS0102913 compreendendo SEQ ID NO: 73, NS0123728 compreendendo SEQ ID NO: 74, NS0129943 compreendendo SEQ ID NO: 75, NS0102168 compreendendo SEQ ID NO: 76, NS0092723 compreendendo

   5 SEQ ID NO: 77, NS0098177 compreendendo SEQ ID NO: 78, NS0127343 compreendendo SEQ ID NO: 79 e NS0101121 compreendendo SEQ ID NO: 80, em que os referidos loci 5-9 de resistência à ASR estão mapeados a 10 centimorgans ou menos da molécula marcadora NS0103033 compreendendo SEQ ID NO: 98, e em que os referidos loci 10-13 de resistência à ASR

   10 estão mapeados a 10 centimorgans ou menos da molécula marcadora NS0124935 compreendendo SEQ ID NO: 99.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida uma ou mais moléculas marcadoras são selecionadas a partir do grupo consistindo em NS0096829 compreendendo SEQ ID NO:

   15 85, NS0098902 compreendendo SEQ ID NO: 87, NS0099529 compreendendo SEQ ID NO: 88, NS0097798 compreendendo SEQ ID NO: 89, NS0137477 compreendendo SEQ ID NO: 90, NS0095322 compreendendo SEQ ID NO: 91, NS0136101 compreendendo SEQ ID NO: 92 e NS0098982 compreendendo SEQ ID NO: 93.

   Petição 870180015024, de 26/02/2018, pág. 10/10