CN109937736A

CN109937736A - 一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用

Info

Publication number: CN109937736A
Application number: CN201910286987.0A
Authority: CN
Inventors: 娄丽娜; 苏小俊; 刘哲; 刘晓宏
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-06-28

Abstract

本发明公开了一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用，属于农业技术领域，取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟上人工摩擦接种，接种后12～15天采收病叶；将病叶加入磷酸缓冲液、金刚砂，研磨至匀浆；丝瓜种子消毒后人工培养至幼苗2片真叶完全展开，或者3‑4片真叶时，均可接种；取上述匀浆置于待接种的丝瓜真叶上，沿一个方向，轻轻涂抹数次，清水冲洗；接种后置于26～28℃的人工气候箱内培养，幼苗正常生长管理。本发明以少量的感病材料即可完成高效的接种，同时对材料的抗病性进行分级，建立一个适用于丝瓜病毒病抗病性评价的分级标准，在抗性筛选、抗病种质挖掘及抗病品种选育等方面具有重要作用。

Description

一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用

技术领域

本发明涉及一种抗病性鉴定方法，特别是涉及一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用，属于农业技术领域。

背景技术

丝瓜病毒病是丝瓜的重要病害之一，造成丝瓜产量和营养品质的下降，食用价值降低，极大地影响到丝瓜的商品价值，黄瓜花叶病毒是引起丝瓜病毒病的主要病原，黄瓜花叶病毒被列为世界十大植物病毒之一，寄主范围广，可浸染100多个科的1000多种植物，危害严重，丝瓜黄瓜花叶病毒的高效接种是丝瓜病毒病抗性机制研究的重要基础，是实现丝瓜黄瓜花叶病毒高效防控的关键；选育抗病毒病品种是最为经济有效的防治措施，在抗性资源的挖掘和利用中，抗病性鉴定方法是最关键的步骤，提供一种简便有效的接种鉴定方法对丝瓜种质及育成材料的抗病性进行相对科学、直观的评价，对抗病种质的筛选及抗病品种的选育工作，具有重要的借鉴意义。

机械摩擦接种是目前常用的病毒病接种方法，这种方法一般采用接种前，先在叶片上喷洒金刚砂完成，但是，机械摩擦接种需要较多的感病材料，且金刚砂的用量不好控制，费时费力，有一定技术难度。

目前，丝瓜病毒病的鉴定，主要采用田间自然发病的方式，或者是采用丝瓜病毒病叶片，作为病原物对丝瓜的其他品种进行接种鉴定，由于丝瓜病毒病是由多种病原引起的，对接种结果的影响比较复杂，无法明确起主要作用的病原的作用，且不利于重复性的鉴定，对接种结果的一致性和客观性造成影响，直接影响到接种结果的可靠性。关键、单一病原物的接种及抗病性鉴定方法的建立，是丝瓜病毒病抗病研究的关键。

发明内容

鉴于目前缺乏丝瓜病毒病主要病原-黄瓜花叶病毒在丝瓜上的接种及鉴定方法的现状，针对传统摩擦接种方法的不足，本发明的主要目的是为了提供一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用，以少量的感病材料即可完成高效的接种，同时对材料的抗病性进行分级，建立一个适用于丝瓜病毒病抗病性评价的分级标准，在抗性筛选、抗病种质挖掘及抗病品种选育等方面具有重要作用。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，包括如下步骤：

步骤1：取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟上人工摩擦接种，接种后12～15天采收病叶；

步骤2：将病叶加入磷酸缓冲液、金刚砂，研磨至匀浆；

步骤3：丝瓜种子消毒后人工培养至幼苗2片真叶完全展开，或者3-4片真叶时，均可接种；

步骤4：取上述匀浆置于待接种的丝瓜真叶上，沿一个方向，轻轻涂抹数次，清水冲洗；

步骤5：接种后置于26～28℃的人工气候箱内培养，幼苗正常生长管理。

进一步的，磷酸盐缓冲液为PH值为7.0的0.03mol/L磷酸盐缓冲液；每1g枯斑三生烟病毒叶片加入5ml磷酸缓冲液。

进一步的，加入金刚砂与病毒叶片、磷酸缓冲液一起研磨，黄瓜花叶病毒病叶片与金刚砂的质量比为2:1；匀浆的用量为500ul～1ml，接种2次，间隔2～3天。

进一步的，丝瓜种子用10％磷酸三钠溶液浸种20min，然后用清水冲洗干净，温水浸泡过夜，黑暗条件下，28℃恒温箱催芽，每天用清水淋洗1～2次。

进一步的，种子露白后，播种于5×10的营养穴盘中生长，生长期温度为：昼26～28℃，夜20～22℃；幼苗1片真叶时，移栽入直径8-10cm的营养钵中生长，2片真叶完全展开时即可接种。

进一步的，丝瓜育苗基质为经高温蒸汽灭菌的草炭和蛭石，草炭和蛭石的质量比为1V:2V。

进一步的，接种后21天，对丝瓜幼苗进行病情调查，对黄瓜进行分级，分级标准为：

0级：无病症；

1级：接种叶出现少数褪绿斑或心叶明脉；

3级：中、上部叶片花叶；

5级：中、上部叶片重花叶，极少数叶片皱缩或畸形；

7级：多数叶片重花叶，部分叶片皱缩、畸形或有坏死斑点，植株稍矮化；

9级：多数叶片重花叶、畸形或有坏死斑点，植株明显矮化甚至死亡；

病情指数计算方法为：

病情指数＝∑[(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100；

品系群体抗病性划分标准为：

高抗(HR)，0<病情指数≤5；

抗病(R)，5<病情指数≤20；

中抗(MR)，20<病情指数≤40；

感病(S)，40<病情指数≤60；

高感(HS)，病情指数>60。

一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种抗病性鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1：取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在枯斑三生烟上人工摩擦接种，接种后12～15天采收病叶；每1g病叶加入5ml，PH值为7.0的0.03mol/L磷酸盐缓冲液，随后按照黄瓜花叶病毒病叶片与金刚砂的质量比为2:1，加入金刚砂，研磨至匀浆；

步骤2：丝瓜种子用10％磷酸三钠溶液浸种20min，然后用清水冲洗干净，温水浸泡过夜，黑暗条件下，28℃恒温箱催芽，每天用清水淋洗1～2次；

步骤3：种子露白后，播种于5×10的营养穴盘中生长，生长期温度为：昼26～28℃，夜20～22℃，移栽入直径8～10cm的营养钵中生长，2片真叶完全展开时即可接种；

步骤4：取上述匀浆置于待接种的丝瓜真叶上，沿一个方向，轻轻涂抹数次，清水冲洗，病毒匀浆的用量为500ul～1ml，接种2次，间隔2～3天；幼苗正常生长管理；

步骤5：接种后21天，对黄瓜进行标准分级，分级标准为：

0级：无病症；

1级：接种叶出现少数褪绿斑或心叶明脉；

3级：中、上部叶片花叶；

5级：中、上部叶片重花叶，极少数叶片皱缩或畸形；

9级：多数叶片重花叶、畸形或有坏死斑点，植株明显矮化甚至死亡。

进一步的，病情指数计算方法为：

病情指数＝∑[(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100；

品系群体抗病性划分标准为：

高抗(HR)，0<病情指数≤5；

抗病(R)，5<病情指数≤20；

中抗(MR)，20<病情指数≤40；

感病(S)，40<病情指数≤60；

高感(HS)，病情指数>60。

一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种抗病性鉴定方法的应用，可应用于鉴定丝瓜资源中的黄瓜花叶病毒病抗性。

本发明的有益技术效果：本发明提供的丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用，采用纯化的黄瓜花叶病毒对丝瓜幼苗进行接种，比目前生产上采用丝瓜病毒病叶片(混合病毒)接种，具有病原纯和，接种结果可靠，重复性好等优点，同时，对传统的、常用的病毒病接种方法，机械摩擦接种法进行了改良，省略了接种前在植株上喷洒金刚砂的步骤，采用将金刚砂同病毒叶片及磷酸盐缓冲液一起配制成匀浆，同时限定了黄瓜花叶病毒病叶片与金刚砂的质量比，这样有利于控制金刚砂的用量，有利于病毒叶片的研磨更加均匀，使得寄生在叶片细胞的病毒更容易释放，同时在摩擦的过程中制造伤口，使病毒能够有效浸染接种植物，简化了接种方法，提高了丝瓜接种黄瓜花叶病毒的效率。

附图说明

图1为按照本发明的丝瓜黄瓜花叶病毒的分级标准示意图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

如图1所示，本实施例提供的丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种抗病性鉴定方法，包括如下步骤：

步骤5：接种后21天(三周)后，对黄瓜的分级标准进行，0级：无病症；1级：接种叶出现少数褪绿斑或心叶明脉；3级：中、上部叶片花叶；5级：中、上部叶片重花叶，极少数叶片皱缩或畸形；7级：多数叶片重花叶，部分叶片皱缩、畸形或有坏死斑点，植株稍矮化；9级：多数叶片重花叶、畸形或有坏死斑点，植株明显矮化甚至死亡；

病情指数＝∑[(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100；

品系群体抗病性划分标准为：

高抗(HR)，0<病情指数≤5；

抗病(R)，5<病情指数≤20；

中抗(MR)，20<病情指数≤40；

感病(S)，40<病情指数≤60；

高感(HS)，病情指数>60；

病级分布如附图1；

步骤6：抗病性鉴定试验设三次重复，每处理10株，试验材料以易感病材料“本地丝瓜”和抗病材料“抗病白皮丝瓜”作为对照品种。

依据病害程度调查结果，按照病害分级和病情指数对丝瓜10份资源进行评价。

本实验中，材料鉴定结果如表1，在鉴定的10份丝瓜资源材料中，发现4份材料属于中抗(MR)，病情指数介于20<病情指数≤40；5份感病材料(S)，病情指数介于40<病情指数≤60；2份高感材料(HS)，病情指数>60；与对照相比，未发现高抗和抗病材料，说明在丝瓜的抗黄瓜花叶病毒的研究中需要进一步扩大种质资源筛选范围，为丝瓜病毒病研究提供材料基础。

表1丝瓜10份种质资源黄瓜花叶病毒病的抗病性鉴定结果

综上所述，在本实施例中，本实施例提供的丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种、抗病性鉴定方法及应用，以黄瓜上黄瓜花叶病毒病的分级标准为参考，制定了适合的丝瓜病毒病的分级标准，并以10份丝瓜资源为材料，采用本发明的方法，对黄瓜花叶病毒病的抗性进行了分级，建立了一个适用于丝瓜病毒病抗病性评价的分级方法，在抗性筛选，抗病种质挖掘及抗病品种选育等方面具有重要作用。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2：将病叶加入磷酸缓冲液、金刚砂，研磨至匀浆；

2.根据权利要求1所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液为PH值为7.0的0.03mol/L磷酸盐缓冲液；每1g枯斑三生烟病毒叶片加入5ml磷酸缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，加入金刚砂与病毒叶片、磷酸缓冲液一起研磨，黄瓜花叶病毒病叶片与金刚砂的质量比为2:1；匀浆的用量为500ul～1ml，接种2次，间隔2～3天。

4.根据权利要求1所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，丝瓜种子用10％磷酸三钠溶液浸种20min，然后用清水冲洗干净，温水浸泡过夜，黑暗条件下，28℃恒温箱催芽，每天用清水淋洗1～2次。

5.根据权利要求1所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，种子露白后，播种于5×10的营养穴盘中生长，生长期温度为：昼26～28℃，夜20～22℃；幼苗1片真叶时，移栽入直径8-10cm的营养钵中生长，2片真叶完全展开时即可接种。

6.根据权利要求1所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，丝瓜育苗基质为经高温蒸汽灭菌的草炭和蛭石，草炭和蛭石的质量比为1V:2V。

7.根据权利要求1所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种方法，其特征在于，接种后21天，对丝瓜幼苗进行病情调查，对黄瓜进行分级，分级标准为：

0级：无病症；

1级：接种叶出现少数褪绿斑或心叶明脉；

3级：中、上部叶片花叶；

5级：中、上部叶片重花叶，极少数叶片皱缩或畸形；

病情指数计算方法为：

病情指数＝∑[(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100；

品系群体抗病性划分标准为：

高抗(HR)，0<病情指数≤5；

抗病(R)，5<病情指数≤20；

中抗(MR)，20<病情指数≤40；

感病(S)，40<病情指数≤60；

高感(HS)，病情指数>60。

8.一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种抗病性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤5：接种后21天，对黄瓜进行标准分级，分级标准为：

0级：无病症；

1级：接种叶出现少数褪绿斑或心叶明脉；

3级：中、上部叶片花叶；

5级：中、上部叶片重花叶，极少数叶片皱缩或畸形；

9.根据权利要求8所述的一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种抗病性鉴定方法，其特征在于，病情指数计算方法为：

病情指数＝∑[(病情级别×该级株数)/(调查总株数×9)]×100；

品系群体抗病性划分标准为：

高抗(HR)，0<病情指数≤5；

抗病(R)，5<病情指数≤20；

中抗(MR)，20<病情指数≤40；

感病(S)，40<病情指数≤60；

高感(HS)，病情指数>60。

10.一种丝瓜黄瓜花叶病毒苗期接种抗病性鉴定方法的应用，其特征在于，可应用于鉴定丝瓜资源中的黄瓜花叶病毒病抗性。