CN112538516A - 一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法 - Google Patents

一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法 Download PDF

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袁晓伟
李兴盛
蒋新萍
李英杰
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Abstract

本发明涉及植物病毒接种领域，具体涉及一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种的方法，该方法采用针管注射的方式，在西葫芦植株培养至子叶完全展开时即可接种，较之现有的针管注射方法，接种时间大大提前，接种10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，上述方法易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小更接近田间发病情况，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。

Description

一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法
技术领域
本发明涉及植物病毒接种领域，具体涉及一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法。
背景技术
西葫芦是世界性大宗蔬菜之一，也是我国主要瓜类蔬菜。每年西葫芦种植面积约在500万亩以上，其中山东、山西、云南、西北等地区为我国重要的西葫芦优质产区。西葫芦病毒病是一种普遍发生且危害性很大的病害。侵染西葫芦的病毒主要有以下3种：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)，其中黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是引发西葫芦病毒病的最重要病原之一。CMV侵染西葫芦后表现为渐进的发病过程。发病早期幼嫩的叶片基部黄化，然后黄化症状逐渐扩展到整个叶片；随后新生叶片表现出明显的花叶；随着植株发育，叶片出现严重皱缩，植株矮化，叶色表现为无光泽的深绿色。西葫芦感染CMV症状的严重程度取决于感染时的株龄，一般幼苗期感染CMV会造成秃顶、矮化并减产，严重时可造成绝收；而成株感染CMV后的症状相对较轻。
抗病性鉴定是抗病材料筛选和抗病品种选育的基础，其关键在于能够准确反映材料的抗性水平。机械摩擦接种是目前常用的病毒病接种方法，这种方法一般采用接种前，先在叶片上喷洒金刚砂完成，但是机械摩擦接种需要较多的感病材料，且金刚砂的用量不好控制，费时费力有一定技术难度。目前，西葫芦病毒病的鉴定，主要采用田间自然发病的方式。由于西葫芦病毒病是由多种病原引起的，对接种结果的影响比较复杂，无法明确起主要作用的病原的作用，且不利于重复性的鉴定，对接种结果的一致性和客观性造成影响，直接影响到接种结果的可靠性。现有技术中有出现过一种辣椒黄瓜花叶病毒病苗期接种方法，其在辣椒苗两片真叶期对子叶进行注射接种病毒，但是这种方法并不适用于西葫芦植株，两者的生长速度和形态具有较大的差异，且上述现有技术接种的时间较晚，难以满足抗病性鉴定的要求。
因此能否提供一种针对西葫芦植株的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，成为本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，该方法采用针管注射的方式，在西葫芦植株培养至子叶完全展开时即可接种，较之现有的针管注射方法，接种时间大大提前，接种10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，上述方法易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小更接近田间发病情况，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。
本发明的具体技术方案如下：
一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，具体步骤如下：
(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在子叶展平期西葫芦幼苗上人工注射接种，接种后三周采收发病叶片；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆后离心，其上清液即为接种液；
上述采收的发病叶片表现为皱缩或花斑或两者兼具；
(2)西葫芦种子消毒后人工培养至子叶完全展开时即可接种；
(3)接种时，用2mL无菌注射器吸取2mL接种液，用针头在子叶背面扎出1个针孔，去掉针头将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后昼夜温度保持在15-18℃，3天后温度调整为昼23℃-25℃，幼苗正常生长管理即可。
其中，步骤(1)中所述的磷酸缓冲液优选为pH值为7的0.01mol/L的磷酸缓冲液；每克病叶加入2.5mL所述的磷酸缓冲液进行冰浴匀浆；
所述的离心的条件为4000rpm/min，离心10分钟。
步骤(2)中西葫芦种子首先在2％的次氯酸钠中消毒10分钟后，再用无菌水冲洗3-4次再进行播种；
人工培养西葫芦种子的方法优选为：西葫芦种子消毒后在培养皿中于30℃黑暗条件下催芽36h；种子萌发后播种于7×7的营养钵中生长，生长期温度为昼25℃/夜20℃，幼苗2片子叶完全展开时即可接种；人工培养西葫芦种子和幼苗时需用防虫网防护，防止蚜虫或粉虱传染其他病毒病影响最终的结果。
接种完成后10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，从而快速鉴定和筛选西葫芦资源中具有黄瓜花叶病毒病抗性的种质资源，以及西葫芦抗黄瓜花叶病毒病新品种选育工作。
与现有技术相比，特别是与与辣椒苗相比，本发明所选取的西葫芦子叶展平时子叶及整个植株大很多，且生长速度更快，对病毒病的抗性更好，因此可以在更短的时间内对抗病性进行鉴定，较之现有技术明显缩短了整个步骤所需的时间，更加适合西葫芦幼苗的接种。
综上所述，采用这种接种方法，接种10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，上述方法易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小更接近田间发病情况，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。
附图说明
图1为接毒前子叶展平期西葫芦幼苗；
其中，R1、R2为抗黄瓜花叶病毒病的西葫芦自交系，S1、S2为感黄瓜花叶病毒病的西葫芦自交系；
图2为接种CMV后10天西葫芦幼苗；
其中，R1、R2为抗黄瓜花叶病毒病的西葫芦自交系，S1、S2为感黄瓜花叶病毒病的西葫芦自交系，CK1组注射0.01mol·L-1的磷酸缓冲液，CK2组用混有0.01Mol·L-1的磷酸缓冲液的石英砂摩擦，I1注射接种CMV，I2摩擦接种CMV；由图可见采用注射接种方式获得的幼苗染病效果明显，摩擦接种的染病效果较之有一定的差距；
图3为RT-PCR检测西葫芦幼苗中是否受CMV侵染的凝胶电泳图；
其中，1为CK1组R1，2为CK1组S1，3为CK1组S2，4-7分别为I1组R1、R2、S1、S2，8为CK2组R1，9为CK2组S1，10为CK2组S2，11-14分别为I2组R1、R2、S1、S2；
由图可知，注射接种和摩擦接种的幼苗均能检测到CMV病毒，但摩擦接种病毒量有多有少难以控制，注射接种剂量更好控制。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；
实施例1西葫芦幼苗摩擦接种和注射接种CMV发病情况
所采用的接种方法如下：
(1)西葫芦种子在2％的次氯酸钠中消毒10分钟后，用无菌水冲洗3-4次；
(2)西葫芦种子消毒后在培养皿中于30℃黑暗条件下催芽36h。种子萌发后播种于7×7的营养钵中生长，生长期温度为昼25℃/夜20℃，幼苗2片子叶完全展开时即可接种。具体形态如图1；
(3)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在子叶展平期西葫芦幼苗上人工注射接种，接种后三周采收发病叶片；采收的发病叶片表现为皱缩或花斑或两者兼具；
(4)每1g病叶加入2.5mlpH值为7的0.01mol/L的磷酸缓冲液混合石英砂研磨成匀浆即摩擦接种液，并摩擦接种到相应西葫芦幼苗子叶上。
(5)每1g病叶加入2.5mlpH值为7的0.01mol/L的磷酸缓冲液冰浴匀浆，4000转/分离心10分钟，其上清液即为注射组接种液；用一次性注射器(2mL)吸取2mL菌液，去掉针头，将菌液在西葫芦子叶的背面缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液。
(6)接种后，幼苗昼夜温度保持在15-18℃，3天后生长温度调整为昼23℃-25℃，正常生长管理。
(7)接种10天后对西葫芦幼苗进行病情调查,结果如下：
如图2所示，因创伤面小，注射接种对照组较摩擦接种对照组西葫芦幼苗长势好，同理注射接种组较摩擦接种组西葫芦幼苗长势好；注射接种组及摩擦接种组中感病西葫芦幼苗均表现花叶及叶面卷曲的CMV发病情况。
实施例2RT-PCR检测田间发病西葫芦病毒病侵染种类
1、从实施例1获得的各个植株的西葫芦叶片中取嫩叶，迅速液氮冷冻后存-80℃；
2、总RNA的提取
分别称取样品各0.5g放入-80℃深冻研钵中加液氮充分研磨，迅速转入到液氮预冷的无RNase的无菌1.5mLeppendorf管中，加入1mL4℃预冷的Trizol提取液中，充分混匀后静置5min，4℃，12,000g离心5min。上清用200μL氯仿抽提一次，4℃，12,000g离心15min。上清加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静置10min，于4℃，12,000g离心15min。弃上清液，沉淀用70％预冷的乙醇洗涤一次，充分干燥后溶于30μL DEPC处理的ddH2O中-20℃保存备用。
3、cDNA第一链的合成
使用天根FastQuant cDNA第一链合成试剂盒。将模板RNA在冰上解冻，取2μg模板RNA，按照说明书基因组DNA的去除体系配置混合液，42℃孵育3min，以除去基因组DNA；按说明书加入反转录体系混合液，42℃孵育15min，95℃灭活3min，置冰上待用。
4、RT-PCR反应
本实施方式中使用2对引物，分别是用于检测黄瓜花叶病毒的引物对：CMV-F(SEQID NO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)；用做内参的16S引物对：16S-F(SEQ ID NO.3)/16S-R(SEQID NO.4)。
PCR反应体系为25μL，其中包括10×PCR Buffer 2.5μL，0.5mM dNTPs，以0.5μL上述cDNA或已知片段质粒为模板，引物各5μM，1U Taq DNA聚合酶，无菌超纯水补齐至25μL；
扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；
5、电泳检测
取5μL PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，110V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，1-14个样品中均能检测到16S且在感病西葫芦植株中检测到CMV特异条带，结果如图3所示，可见注射接种和摩擦接种的幼苗均能检测到CMV病毒，但摩擦接种病毒量有多有少难以控制，注射接种剂量更好控制更一致，便于实验后期感抗病鉴定。
可见采用这种接种方法，接种10天后即可对西葫芦幼苗进行病情调查，上述方法易于控制病毒接种量且对叶片损伤较小更接近田间发病情况，接种液可直接注射到叶肉细胞，易于观察，减少漏接。
序列表
<110> 山东省华盛农业股份有限公司
<120> 一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
aaccyggkta cacgttcaca tctat 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ggaatkcgtt grtgctcg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)取纯化后的黄瓜花叶病毒病菌株，在子叶展平期西葫芦幼苗上人工注射接种，接种后三周采收发病叶片；将病叶加入磷酸缓冲液冰浴匀浆后离心，其上清液即为接种液；
(2)西葫芦种子消毒后人工培养至子叶完全展开时即可接种；
(3)接种时，用2mL无菌注射器吸取2mL接种液，用针头在子叶背面扎出1个针孔，去掉针头将接种液缓慢注入，使两片子叶充满病毒接种液，接种后昼夜温度保持在15-18℃，3天后温度调整为昼23℃-25℃，幼苗正常生长管理即可。
2.根据权利要求1所述的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法,其特征在于：步骤(1)中所述的磷酸缓冲液优选为pH值为7的0.01mol/L的磷酸缓冲液；每克病叶加入2.5mL所述的磷酸缓冲液进行冰浴匀浆；所述的离心的条件为4000rpm/min，离心10分钟。
3.根据权利要求1所述的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法,其特征在于：步骤(1)中采收的发病叶片表现为皱缩或花斑或两者兼具。
4.根据权利要求1所述的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法,其特征在于：步骤(2)中西葫芦种子首先在2％的次氯酸钠中消毒10分钟后，再用无菌水冲洗3-4次再进行播种。
5.根据权利要求1所述的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法,其特征在于：人工培养西葫芦种子的方法为：西葫芦种子消毒后在培养皿中于30℃黑暗条件下催芽36h；种子萌发后播种于的营养钵中生长，生长期温度为昼25℃/夜20℃，幼苗2片子叶完全展开时即可接种。
6.根据权利要求1所述的西葫芦黄瓜花叶病毒病苗期注射接种方法,其特征在于：人工培养西葫芦种子和幼苗时需用防虫网防护，防止蚜虫或粉虱传染其他病毒病。
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