CN113125643A - 一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法 - Google Patents

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CN113125643A CN202110359749.5A CN202110359749A CN113125643A CN 113125643 A CN113125643 A CN 113125643A CN 202110359749 A CN202110359749 A CN 202110359749A CN 113125643 A CN113125643 A CN 113125643A
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李林章
高天一
古斌权
宋慧
黄芸萍
王毓洪
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Abstract

本发明属于农业选育技术领域，提供一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法，其包括准备番茄材料幼苗、配制青枯菌接种菌液，注射接种和抗病性观测鉴定的步骤；注射接种的步骤包括：待番茄幼苗生长至5‑6片叶时，用注射器吸取青枯菌接种菌液，将注射器的针头对准幼苗第一节茎的中部，沿茎斜下方方向刺穿茎部，后将针头退回至茎内部近刺入点处，注入菌液至有菌液从茎部溢出。本发明方法可以在苗期对育种群体材料的青枯病抗性进行快速鉴定，提高番茄青枯病抗病育种效率，还可为番茄青枯病抗病种质资源筛选、抗病分子机理等研究提供简便快捷的检测方法。

Description

一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法
技术领域
本发明属于农业选育技术领域，具体涉及一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法。
背景技术
番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是我国重要的蔬菜作物之一，据不完全统计，目前我国番茄种植面积将近2000万亩，其种植面积和产量均居世界首位。然而，在番茄长期连续生产过程中，土传病害日趋严重。番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种世界范围内毁灭性的土传病害，在我国长江流域及以南地区普遍发生，该病常造成番茄大幅度减产甚至绝收，导致巨大经济损失，严重威胁我国番茄产业的健康可持续发展。目前，该番茄青枯病在生产中尚无较好的防治方法，选育抗病品种仍是最有效、经济、安全的解决途径。
在番茄青枯病抗病育种过程中，其后代群体材料的抗性鉴定和筛选是最为关键的环节。当前主要应用的抗性鉴定方法为田间自然鉴定和人工接种鉴定。田间自然鉴定是在创造利于发病的自然条件下进行田间鉴定，然而，影响田间发病的因素很多，如气候条件、土壤环境及病原微生物数量等，该方法需要建立病圃、鉴定周期长、耗费人力大，结果不稳定，重复性差，不同年份鉴定结果经常存在差异。人工接种鉴定可以克服以上田间自然鉴定的缺点，环境条件相对可控，大大提高了鉴定结果的稳定性和重复性，但是目前常用的浸根法或伤根灌注法在用于大量的群体材料苗期抗性鉴定时仍然存在一些缺点，例如，鉴定时间长，需要2周，幼苗接种后需二次重新种植，接种需要菌液量大，耗时费工，效率较低。
有鉴于此，提出本发明申请。
发明内容
本发明提供注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法，该方法可以在苗期对育种群体材料的青枯病抗性进行快速鉴定，提高番茄青枯病抗病育种效率，还可为番茄青枯病抗病种质资源筛选、抗病分子机理研究提供简便快捷的检测方法。
一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法，其包括准备番茄材料幼苗、配制青枯菌接种菌液，注射接种和抗病性观测鉴定的步骤；
注射接种的步骤包括：
待番茄幼苗生长至5-6片叶时，用注射器吸取青枯菌接种菌液，将注射器的针头对准幼苗第一节茎的中部，沿茎斜下方方向刺穿茎部，后将针头退回至茎内部近刺入点处，注入菌液至有菌液从茎部溢出。
作为一种方式，配制的青枯菌接种菌液的浓度为1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)，优选为1.5～2.5×107CFU/ml。
作为一种方式，注射接种时，使注射器的针头刺入茎部的部位与水平方向的夹角为45°及以上，单次接种菌液0.1ml。
作为一种方式，注射接种时，所用注射器的针头内径为0.34～0.51mm。
作为一种方式，准备番茄材料幼苗的步骤包括：选择不同品系番茄材料的健康饱满的种子，种子经55℃温汤浸种30分钟后，常温浸种4～6小时，再在28-30℃催芽24～48小时，种子萌发露白后，播种于消毒灭菌的育苗基质进行培养，植株生长至2片真叶时，分苗移植于育苗装置中，在温室内培养待用。
作为一种方式，育苗装置为育苗穴盘，分苗移植的步骤为：每品系番茄材料移植2盘，每盘移植30株，每盘10株为1个重复，每重复间间隔2行。
作为一种方式，育苗基质的成分为泥炭、珍珠岩和蛭石。
可选地，泥炭、珍珠岩和蛭石的质量比重为6：2：2。
作为一种方式，配制青枯菌接种菌液的步骤包括：将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC或TTC培养基中划线培养，在30℃培养48小时，挑取单菌落，接种于培养基中，于30℃条件下培养48小时，然后配制所需浓度菌液备用。
作为一种方式，将分离鉴定保存的青枯病菌株于TZC或TTC琼脂培养基上划线培养，于30℃条件下培养48小时，挑取单菌落转移至NA培养基平板培养，于30℃条件下培养48小时，挑取单菌落用无菌水稀释成浓度为1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)的菌液备用。
作为一种方式，将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC或TTC培养基划线培养，于30℃培养48小时，挑取典型青枯菌菌落，接种于LB液体培养基，于30℃条件下震荡培养48小时，用紫外分光光度计测定菌液浓度，再将菌液稀释配制为1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)的菌液备用。
作为一种方式，抗病性观测鉴定的步骤包括：注射接种完毕，将番茄材料幼苗置于温室或人工气候室培养观察，期间保持温度28～30℃，空气相对湿度保持70％以上，基质湿度保持60％左右，于第7天观测调查番茄材料幼苗的发病情况、计算病情指数，判定青枯病抗性；
其中，病情指数的计算公式为：
病情指数DI＝∑(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100
上式中，级数是指青枯病发病等级的级数，判定标准为：
0级-无症状；1级-1片叶萎蔫；2级-2～3片叶萎蔫；3级-4片及以上叶萎蔫；4级-全株萎蔫或死亡；
青枯病抗性的判定标准为：抗(R)：0＜DI≤25；中抗(MR)：25＜DI≤50；中感(MS)：50＜DI≤75；感(S)：DI＞75。
作为一种方式，当首次抗性判定为抗(R)或中抗(MR)时，继续进行第二次接种注射，所用青枯菌接种菌液为首次注射时使用浓度的1～2.5倍，且在1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)的范围内。
本发明技术方案和现有技术相比具有如下优点：
1、本发明方法可在室内(温室或人工气候室)进行注射法接种鉴定，在有限的空间和较短的时间内，可在苗期对番茄育种群体材料的青枯病抗性进行快速鉴定，鉴定结果可避免受到外界环境以及其它土壤微生物等条件变化的影响。
2、本发明方法简便快捷、鉴定效率高、重复性好、鉴定结果稳定可靠，鉴定时间较短，仅需要7天即可鉴定抗病结果，特别适用于大规模的群体材料的苗期抗性鉴定。
3、本发明还可为番茄青枯病抗病育种、番茄青枯病抗病种质资源筛选、番茄青枯病抗性品种的田间应用等研究工作提供可靠的鉴定依据和简便快捷的检测方法，为抗病分子机理研究过程中所涉及的研究材料的抗性鉴定提供快捷检测方法。
4、本发明方法在室内进行，环境条件可控，不受外界气候条件和土壤环境的影响，常年均可进行。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是研究人员正在给番茄材料幼苗注射接种青枯病菌液。
图2是注射接种青枯病菌后的番茄材料幼苗正在人工气候室培养。
图3是番茄材料幼苗不同发病病情的示意分级情况。
图4是注射接种青枯病菌的番茄材料幼苗7天后的发育情况。
图5是注射无菌水的对照组番茄材料幼苗7天后的发育情况。
图6是本发明实施例1方法与常规伤根法得到的抗性鉴定结果对比情况。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现提供一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法，该方法包括准备番茄材料幼苗、配制青枯菌接种菌液，注射接种和抗病性观测鉴定的步骤；注射接种的步骤包括：
待番茄幼苗生长至5-6片叶时，用注射器吸取青枯菌接种菌液，将注射器的针头对准幼苗第一节茎的中部，沿茎斜下方方向刺穿茎部，后将针头退回至茎内部近刺入点处，注入菌液至有菌液从茎部溢出。
注射接种时操作过程动作轻柔，避免用力过度造成幼苗人为物理损伤，针头必须先沿茎斜下方的方向刺穿茎部，否则茎内部组织会障碍接种菌液注入，影响鉴定结果。
作为一种方式，配制的青枯菌接种菌液的浓度为1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)，例如，1×107CFU/ml、1.1×107CFU/ml、1.2×107CFU/ml、1.3×107CFU/ml、1.4×107CFU/ml、1.5×107CFU/ml、1.6×107CFU/ml、1.7×107CFU/ml、1.8×107CFU/ml、1.9×107CFU/ml、2.0×107CFU/ml、2.1×107CFU/ml、2.2×107CFU/ml、2.3×107CFU/ml、2.4×107CFU/ml、2.5×107CFU/ml、2.6×107CFU/ml、2.7×107CFU/ml、2.8×107CFU/ml、2.9×107CFU/ml、3.0×107CFU/ml。
接种菌液的浓度低于1×107CFU/ml时，将延缓发病病程，增加鉴定时间，不利于提高鉴定效率；接种菌液浓度高于3×107CFU/ml时，会导致选择压过高，改变品种的抗病耐受性，致使鉴定结果不准确。
为了兼顾鉴定效率和准确度，优选为接种菌液的浓度为1.5～2.5×107CFU/ml。
作为一种方式，使注射器的针头沿茎下方倾斜45°及以上(指的是针头刺入茎部的部位与水平方向的夹角为45°及以上)，例如，45°、46°、47°、48°、49°、50°、51°、52°、53°、54°、55°、56°、57°、58°、59°、60°、61°、62°、63°、64°、65°、66°、67°68°、69°、70°等。
在幼苗茎部形成较长通道，以便于控制接种注射量，单次接种菌液0.1ml，能够确保接种菌液充分地注入番茄幼苗内部，尽可能地使实际接种量与注射量一致，进而提高鉴定结果的准确度。
作为一种方式，注射接种时，所用注射器的针头内径为0.34～0.51mm，例如，0.34mm(国标6号)、0.41mm(国标6.5号)、0.51mm(国标7号)。注射器针头规格大于0.51mm时，针头过粗容易造成幼苗物理伤害而导致结果出现假阳性；小于0.34mm时，针头过细会导致菌液接种量过小，鉴定结果出现假阴性，或者需要进行多次注射以增加菌液接种量，但是多次操作对幼苗造成物理损伤的概率相对提高，也不利于提高鉴定准确性。
作为一种方式，选用针头的内径尺寸为番茄幼苗茎粗的1/3较优。
作为一种方式，准备番茄材料幼苗的步骤包括：选择不同品系番茄材料的健康饱满的种子，种子经55℃温汤浸种30分钟后，常温浸种4～6小时，再在28-30℃催芽24～48小时，种子萌发露白后，播种于消毒灭菌的育苗基质进行培养，植株生长至2片真叶时，分苗移植于育苗装置中，在温室内培养待用。
上述育苗装置可以用育苗穴盘或营养杯，育苗穴盘选用32孔、50孔或72孔。
上述育苗基质可以直接从市场上购买，也可以自制。
作为一种方式，育苗基质为自制组合物，其成分为泥炭、珍珠岩和蛭石，质量比重可以为4～6∶1～3∶2～3，例如4∶1∶2，4∶3∶2，5∶2∶3，6∶2∶3，5∶3∶3，6∶1∶2，6∶1∶3，6∶2∶2等等。
上述基质利于培育健康壮苗，防止其他非青枯病病菌感染因素干扰，可以减少鉴定误差，提高鉴定准确性。
基质经过消毒灭菌后可以进一步防止幼苗因为感染其它病菌而干扰鉴定结果。
作为一种方式，泥炭、珍珠岩和蛭石的质量比重为6∶2∶2。
作为一种方式，育苗装置为50孔育苗穴盘，分苗移植的步骤为：每品系番茄材料移植2盘，每盘移植30株，每盘10株为1个重复，每重复间间隔2行。
作为一种方式，配制青枯菌接种菌液的步骤包括：
将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC/TTC培养基中划线培养，在30℃培养48小时，挑取单菌落，接种于培养基中，于30℃条件下培养48小时，然后配制所需浓度菌液备用。
上述接种于培养基的具体方式可以是NA培养基平板培养或LB培养基液体培养。
可选地，将分离鉴定保存的青枯病菌株于TZC/TTC琼脂培养基上划线培养，于30℃条件下培养48小时，挑取单菌落转移至NA培养基平板培养，于30℃条件下培养48小时，挑取单菌落用无菌水稀释成浓度为1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)的菌液备用；
可选地，将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC/TTC培养基划线培养，于30℃培养48小时，挑取典型青枯菌菌落(即青枯菌单菌落)，接种于LB液体培养基，于30℃条件下震荡培养48小时，用紫外分光光度计测定菌液浓度，再将菌液稀释配制为1～3×107CFU/ml(OD600＝0.2)的菌液备用。
作为一种方式，抗病性观测鉴定的步骤包括：
注射接种完毕，将番茄材料幼苗置于温室或人工气候室培养观察，期间保持温度28～30℃，空气相对湿度保持70％以上，基质湿度保持60％左右，于第7天观测调查番茄材料幼苗的发病情况、计算病情指数，确定青枯病抗性；
其中，病情指数的计算公式为：
病情指数DI＝∑(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100
上式中，级数是指青枯病发病等级的级数，判定标准为：0级-无症状；1级-1片叶萎蔫；2级-2～3片叶萎蔫；3级-4片及以上叶萎蔫；4级-全株萎蔫或死亡；
抗性的判定标准为：抗(R)：0＜DI≤25；中抗(MR)：25＜DI≤50；中感(MS)：50＜DI≤75；感(S)：DI＞75。
本发明中，若非特指，所使用材料和设备为可从市场购得的常规产品，所进行的试验手段如未特别说明可以采用本领域常规技术。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明使用的番茄青枯菌菌株由浙江省农科院蔬菜所惠赠，由田间番茄青枯病发病株分离培养获得后于实验室超低温冰箱保存，其是常规菌株。
用于抗性鉴定的番茄材料如下：
合作903：上海市长征良种实验场育成的番茄品种。
桂砧1号：广西省农业科学院蔬菜研究所选育番茄砧木品种。
TZ-1：宁波市农业科学研究院蔬菜所自行选育的番茄砧木品系。
下述实施例中采用的消毒灭菌可以是可高温物理消毒，也可药剂消毒，一般用多菌灵。
健康、一致的幼苗的选择方法一般依据株高、叶数。
下述实施例中TZC/TTC培养基的具体组成如下：
胰蛋白胨(tryptone)17.0g
大豆胨3.0g
葡萄糖6.0g
氯化钠2.5g
硫乙醇酸钠0.5g
琼脂15.0g
L-胱氨酸-盐酸(L-Cys·HCl)0.25g
亚硫酸钠0.1g
1％氯化血红素溶液0.5mL
1％维生素K1溶液0.1mL
氯化三苯基四氮唑(TZC/TTC)0.4g
蒸馏水1000mL。
下述实施例中，NA培养基的具体组成如下：
蛋白胨10.0g
牛肉粉3.0g
氯化钠5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000ml。
下述实施例中，LB培养基的具体组成如下：
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl 10g
蒸馏水1000ml。
上述菌株、番茄材料品系和培养基组分仅是一种示例，并非构成对本发明的不当限定。
实施例1
注射接种法快速鉴定番茄清苦病苗期抗性的方法，具体包括如下步骤：1、准备待接种的番茄材料幼苗
选取上述三种不同的番茄材料种子各100粒，于55℃温汤浸种30分钟后，20-25℃继续浸种4-6小时，随后于28-30℃催芽24-48小时，种子萌发露白后，播种于消毒灭菌的育苗基质。育苗基质的成分主要为泥炭、珍珠岩和蛭石，质量比重为6∶2∶2。
待幼苗生长至2片真叶时，选择生长健康、一致(即株高相近、叶数相同)的幼苗，分苗移植于50孔育苗穴盘，每份番茄材料移植2盘，每盘移植30株，每盘10株为1个重复，每重复间间隔2行，移植后于温室内继续培养待用。
2、配制青枯菌接种菌液
将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC(或TTC)培养基划线培养，于30℃培养48小时，挑取典型青枯菌菌落，接种于LB液体培养基，于30℃条件下震荡培养48小时，紫外分光光度计测定菌液浓度，将菌液稀释配制为1×107CFU/ml(OD600＝0.2)备用。
3、青枯病菌液注射接种
每份材料接种30株，同时以常规伤根法接种作为对照。
番茄幼苗生长至5-6片叶时即可进行接种，使用国标6号针头注射器吸取菌液若干，将针头对准幼苗的第一节茎中部，沿茎斜下方方向刺穿茎部(针头与水平方向的夹角为45°或以上)，后将针头退回至茎内部近刺入点处，轻缓地注入菌液，有菌液从茎部溢出即可。
对照组：采用常规伤根接种法接种，用锋利的刀片沿幼苗根部2-3cm处切下以切伤部分侧根，然后沿切缝处灌入20ml的1×108CFU/ml菌液，随后轻轻将切缝处压实，使根与菌液密切结合。
4、材料抗病性观测鉴定
接种完毕，将番茄材料幼苗置于温室或人工气候室培养观察，期间保持温度28-30℃，空气相对湿度保持70％以上，基质湿度保持60％左右。
注射接种组培养至第7天，观测鉴定番茄材料幼苗的发病情况，常规伤根接种法组于第二周调查材料的发病情况。
根据番茄青枯病发病病情分级标准确定0、1、2、3、4共5个发病等级，再根据发病株数与发病等级计算病情指数，确定番茄材料的青枯病抗性。
分级标准为：0级：无症状；1级：1片叶萎蔫；2级：2-3片叶萎蔫；3级：4片及以上叶萎蔫；4级：全株萎蔫或死亡。
病情指数的计算公式如下：
病情指数＝∑(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100
上式中，∑为求和算法。
按病情指数(DI)分别划分为：抗(R)：0＜DI≤25；中抗(MR)：25＜DI≤50；中感(MS)：50＜DI≤75；感(S)：DI＞75。
三种番茄材料的抗性鉴定结果如下表1所示。
表1
Figure BDA0003005318630000101
通过对三种不同番茄材料的试验发现，使用本发明注射接种法(接种菌液浓度107cfu/ml，1周后调查)同常规伤根接种法(接种菌液浓度108cfu/ml，2周后调查)进行苗期抗性鉴定时得到的抗性鉴定结果基本吻合，如图6所示。
实施例2-4
实施例2-4与实施例1的区别仅在于接种菌液的浓度不同，具体如表2所示，其他均与实施例1保持一致(对照组与实施例1保持一致)。
表2
Figure BDA0003005318630000102
各实施例的三种番茄材料的抗性鉴定结果如下表3所示。
表3
Figure BDA0003005318630000111
实施例5
在实施例1的基础上，进一步增加了如下步骤：
首次抗性判定为抗(R)或中抗(MR)的番茄材料幼苗，继续进行第二次接种注射，所用青枯菌接种菌液为首次注射时使用浓度的1.2倍，即1.2×107CFU/ml(OD600＝0.2)，使用国标6号针头注射器吸取菌液若干，将针头对准幼苗的第一节茎中部，沿茎斜下方方向刺穿茎部，后将针头退回至茎内部近刺入点处，轻缓地注入菌液，有菌液从茎部溢出即可。
然后再参照实施例1材料抗病性观测鉴定步骤进行重复操作，判定青枯病抗性。
本实施例在首次鉴定为抗或中抗后，采用将浓度放大至合适范围的青枯菌接种菌液进行第二次鉴定筛选，如此可以进一步提高抗性鉴定的准确性，更贴近番茄品系的实际抗性，筛选出来的品系更优。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，注射接种的步骤如下：
番茄幼苗生长至3-4片叶时即可进行接种，使用国标6号针头注射器吸取菌液若干，将针头对准幼苗的第一节茎中部，沿垂直于茎的方向刺穿茎部，后将针头退回至茎内部近刺入点处，轻缓地注入菌液，有菌液从茎部溢出即可。
其他与实施例1保持一致，对照试验相同。
三种番茄材料的抗性鉴定结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0003005318630000121
从上述表格的鉴定结果对照可以看出，对比例1未采用本发明的基本技术构思，其抗性鉴定结果与常规伤根法的鉴定结果差距较大，无法反应不同番茄品系的真实的青枯病抗性，难以实际应用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种注射接种法快速鉴定番茄青枯病苗期抗性的方法，其特征在于，包括准备番茄材料幼苗、配制青枯菌接种菌液，注射接种和抗病性观测鉴定的步骤；
注射接种的步骤包括：
待番茄幼苗生长至5-6片叶时，用注射器吸取青枯菌接种菌液，将注射器的针头对准幼苗第一节茎的中部，沿茎斜下方方向刺穿茎部，后将针头退回至茎内部近刺入点处，注入菌液至有菌液从茎部溢出。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配制的青枯菌接种菌液的浓度为1~3×107CFU/ml（OD600=0.2），优选为1.5~2.5×107 CFU/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，注射接种时，使注射器的针头刺入茎部的部位与水平方向的夹角为45°及以上，单次接种菌液0.1ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，注射接种时，所用注射器的针头内径为0.34~0.51mm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，准备番茄材料幼苗的步骤包括：
选择不同品系番茄材料的健康饱满种子，种子经55℃温汤浸种30分钟后，常温浸种4~6小时，再在28-30℃催芽24~48小时，种子萌发露白后，播种于消毒灭菌的育苗基质进行培养，植株生长至2片真叶时，分苗移植于育苗装置中，在温室内培养待用。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，育苗装置为育苗穴盘，分苗移植的步骤为：每品系番茄材料移植2盘，每盘移植30株，每盘10株为1个重复，每重复之间间隔2行。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，育苗基质的成分为泥炭、珍珠岩和蛭石；
可选地，泥炭、珍珠岩和蛭石的质量比重为6:2:2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配制青枯菌接种菌液的步骤包括：
将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC或TTC培养基中划线培养，在30℃培养 48 小时，挑取单菌落，接种于培养基中，于30℃条件下培养 48 小时，然后配制所需浓度菌液备用；
可选地，将分离鉴定保存的青枯病菌株于TZC或TTC琼脂培养基上划线培养，于30℃条件下培养 48 小时，挑取单菌落转移至NA培养基平板培养，于30℃条件下培养 48 小时，挑取单菌落用无菌水稀释成浓度为1~3×107CFU/ml（OD600=0.2）的菌液备用；
可选地，将分离鉴定保存的番茄青枯菌菌株于TZC或TTC培养基划线培养，于30℃培养48 小时，挑取青枯菌单菌落，接种于LB液体培养基，于30℃条件下震荡培养 48 小时，用紫外分光光度计测定菌液浓度，再将菌液稀释配制为1~3×107 CFU/ml（OD600=0.2）的菌液备用。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，抗病性观测鉴定的步骤包括：
注射接种完毕，将番茄材料幼苗置于温室或人工气候室培养观察，期间保持温度28~30℃，空气相对湿度保持70%以上，基质湿度保持60%左右，于第7天观测调查番茄材料幼苗的发病情况、计算病情指数，判定青枯病抗性；
其中，病情指数的计算公式为：
病情指数DI＝Σ(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100
上式中，级数是指青枯病发病等级的级数，判定标准为：
0级-无症状；1级-1片叶萎蔫；2级-2~3片叶萎蔫；3级-4片及以上叶萎蔫；4级-全株萎蔫或死亡；
青枯病抗性的判定标准为：抗(R)：0＜DI≤25；中抗(MR)：25＜DI≤50；中感(MS)：50＜DI≤75；感(S)：DI＞75。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当首次抗性判定为抗(R)或中抗(MR)时，继续进行第二次接种注射，所用青枯菌接种菌液为首次注射时使用浓度的1~2.5倍，且在1~3×107 CFU/ml（OD600=0.2）的范围内。
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