CN109892218B - 一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，以含有抗生素抗性标记基因的水稻基因编辑株系种子作为待筛选材料，包括如下步骤：(1)、将种子进行萌发处理，获得已萌发且胚根未伸长生长的种子；(2)、将步骤(1)获得的已萌发种子播种在含有对应抗生素的固体培养基上，进行培养然后观察，在茎叶能正常生长前提下，根能正常伸长生长的单株为含有转基因成分单株，根不能正常伸长生长的单株为无转基因成分单株。本发明的整个筛选过程可在6天时间内完成，操作过程中，不需要无菌条件和环境，大大降低了筛选的人力、物力和时间成本，为加速基因编辑技术在水稻基因设计育种或基础研究中的应用，提供了技术支撑。

Description

一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的 方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程或作物基因设计育种领域，特别是涉及一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法。

背景技术

生物技术的发展和应用，使得农作物育种从传统育种时代进入分子育种时代。传统育种周期长、投入大、风险高，且受种间隔离和不良基因连锁影响，往往多方面性状优良的品种因为一个或两个不良性状而不能通过审定，给育种工作者带来极大遗憾。已有的研究表明，CRISPR/Cas9基因编辑技术已在酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠、人类等多个物种中大量应用，是一种简单、实用、高效的基因改造工具。

相比较动物来说，基因编辑技术在植物中的应用要稍晚一些，但随着CRISPR/Cas9系统基因编辑技术越来越成熟，为改良作物品质、增加作物产量、提高作物抗虫抗逆性带来了新的机遇。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对目标性状控制基因进行定点编辑，获得的基因编辑后的株系，能加快目标性状的改良。

基因编辑植株插入核酸酶编码DNA的位点，与特异核酸酶的作用位点通常不在一条染色体上，所以可以通过后代的自然分离获得无转基因成分的遗传材料。然而，直接通过后代的自然分离来获得无转基因成分的单株，耗时较长，不利于快速推进基础研究和加快育种进程。

综上所述，现有从水稻基因编辑株系中筛选不含有转基因成分的单株的方法具有缺陷与不足，如何能快速高效的从基因编辑株系中筛选、鉴定出不含有转基因成分的单株，从而节约时间成本，尽快的将基因编辑株系应用于水稻分子设计育种或基础研究中，实属当前重要研发课题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，使其能加速基因编辑技术在水稻基因设计育种或基础研究中的有效应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术手段：

一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，以含有抗生素抗性标记基因的水稻基因编辑株系种子作为待筛选材料，包括如下步骤：

(1)、将所述水稻基因编辑株系种子进行萌发处理，获得已萌发且种子胚根未伸长生长的种子；

(2)、将步骤(1)获得的已萌发种子播种在含有对应抗生素的固体培养基上，进行培养然后观察，在茎叶能正常生长前提下，根能正常伸长生长的单株为含有转基因成分单株，根不能正常伸长生长的单株为无转基因成分单株。

作为本发明进一步地改进，还包括：

步骤(3)、针对步骤(2)获得的无转基因成份单株的进一步复苏步骤。

进一步地，所述抗生素抗性标记基因为潮霉素抗性基因；所述基因编辑株系为CRISPR/Cas 9系统基因编辑纯合株系。

进一步地，所述步骤(2)中固体培养基的基质组成成分为单蒸水、琼脂及潮霉素；所述潮霉素的含量为45mg/L-65mg/L；所述培养条件为25-35度培养箱培养28-60小时；然后观察种子生长情况，所述判断植株为无转基因成分单株的依据为根伸长生长小于等于2毫米。

进一步地，所述潮霉素的含量为50mg/L或60mg/L；所述培养条件为30度培养箱培养30小时后观察。

进一步地，还包括针对步骤(2)获得的无转基因成份单株的PCR检测验证步骤。

进一步地，所述PCR检测验证步骤中的引物为：

HYG-Q-F：5'-CGCTTCTGCGGGCGATTTG-3'；

HYG-Q-R：5'-CGGATTTCGGCTCCAACAA-3'；

Cas9-1F：5'-CACCATCTACCACCTGAGAA-3'；

Cas9-1R：5'-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3'。

进一步地，所述步骤(1)中种子萌发采用低氧处理，利用单蒸水淹没浸泡，挑选萌发状态一致的种子用于下一步播种筛选；所述萌发状态为种子破壳露白或胚芽小于2毫米。

进一步地，所述的步骤(2)中种子播种时胚芽朝上，且胚破口处或胚芽不接触固体培养基上表面。

进一步地，所述含有对应抗生素的固体培养基的筛选条件是通过对比试验获得；所述对比试验用材料包括水稻基因编辑纯合株系种子、含有抗生素抗性标记基因的阳性对照、不含抗生素抗性标记基因的阴性对照，基于对比试验获得的筛选条件可进行固体培养基的配置、萌发种子的培养及观察。

通过采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明选择萌发状态的含有抗生素抗性标记基因的水稻基因编辑株系种子作为初始筛选材料，采用其进行抗生素固体培养基培养，通过观察根的生长情况来筛选是否为不含转基因成分的单株，整个筛选过程可在6天时间内完成，操作过程中，不需要无菌条件和环境，大大降低了筛选的人力、物力和时间成本，为加速基因编辑技术在水稻基因设计育种或基础研究中的应用，提供了技术支撑。

2、本发明通过调整固体培养基中的潮霉素终浓度、培养时间等条件，探索出最佳的无转基因成分植株筛选条件，并通过PCR检测进行相互验证，证明筛选结果准确性高。同时，对筛选出的无转基因成分植株进行复苏处理，其生长状态与含有转基因成分植株无明显差异，证明此方法能快速高效稳定的从水稻基因编辑株系中获得无转基因成分植株；即采用本发明的筛选条件与复苏相互配合，能够实现在快速高效筛选出无转基因单株的同时不影响其后续稳定生长。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是水稻基因编辑株系种子低氧萌发处理，(A)种子低氧萌发处理。(B)用于平板筛选种子的标准；标尺＝1cm；NIP：不含转基因成分的野生型对照；HC229：含潮霉素抗性基因转基因种子；H1，H2：基因编辑纯合株系。

图2是快速筛选不含转基因成分单株的潮霉素浓度确定；NIP：不含转基因成分的野生型对照；HC229：含潮霉素抗性基因转基因种子。0,20,30,40,50,60mg/L代表每个筛选平板中潮霉素最终浓度。30度生长60小时。

图3是基因编辑纯合株系后代中无转基因成份单株筛选。(A)含60mg/L潮霉素的固体平板基质筛选，圈内单株为基因编辑纯合株系后代中根不伸长即不含转基因成分单株。(B)基因编辑纯合株系H1和H2后代中分离出的含转基因成分单株(左，根正常生长伸长)和不含转基因成分单株(右，根不伸长),边框图片为根不伸长单株放大图。标尺＝1cm。

图4是利用PCR检测潮霉素平板筛选结果。(A)潮霉素特异引物检测。(B)基因编辑载体VK005-1载体骨架特异性引物检测。M：DL2000；1，阴性对照ddH₂O；2，阴性对照NIP；3，阳性对照HC229；4-14：基因编辑纯合株系H1和H2后代中分离出的不含转基因成分单株(根不伸长单株)。15-17：基因编辑纯合株系H1和H2后代中分离出的含转基因成分单株(根正常伸长生长)。箭头指示引物扩增的特异性条带。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂、载体、耗材等均为市售购买产品。

本发明的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其实验设计阶段步骤如：

(1)材料准备

试验材料涉及含有潮霉素抗性基因的基因编辑纯合株系T0代种子(检测样品，基因编辑所用载体为购于北京唯尚立德生物科技有限公司的VK005-01载体)，含有潮霉素的转基因纯合种子(阳性对照，或含有转基因成分对照)，不含潮霉素的非转基因种子(阴性对照，或不含有转基因成分对照)。

(2)种子萌发处理

种子萌发采用淹水低氧处理，即利用单蒸水淹没浸泡48小时左右，挑选萌发状态一致的种子用于潮霉素固体平板筛选。

(3)含有潮霉素固体平板配制

固体平板基质组成成分为单蒸水和琼脂混合物，加热溶解后，待温度降至50度左右，加入所需浓度的潮霉素混合均匀，倒入塑料平皿中，凝固后备用，琼脂的浓度为能形成基础的固体培养基即可，质量百分比浓度0.8-1％。

(4)潮霉素筛选浓度和筛选时间的确定

分别配制终浓度为0mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L和60mg/L的潮霉素固体平板，将(2)中挑选出的阳性对照和阴性对照种子同时播种于不同浓度平板中。保鲜膜包裹放入30度培养箱中(12小时光照/12小时黑暗)培养，在培养生长15小时、30小时、45小时和60小时分别观察种子根伸长生长情况，以确定区分出含转基因成分种子和不含转基因成分种子的最佳潮霉素浓度和观察时间。此步骤确定的潮霉素浓度可应用于(3)中含有潮霉素固体平板的配置；此步骤确定的筛选时间及其它筛选条件可用于步骤(5)中的具体筛选。

(5)基因编辑株系中无转基因成分单株的筛选

将两个基因编辑纯合株系种子分别播种于潮霉素终浓度为60mg/L的固体平板中，30度培养箱(12小时光照/12小时黑暗)培养30小时后观察种子生长情况：在茎叶能正常生长前提下，根能正常伸长生长的单株为含有转基因成分单株，根不能正常伸长生长的单株为无转基因成分单株。

(6)无转基因成分单株的PCR检测验证

为增加筛选结果的可靠性，将两个检测样品株系中筛选出的根不能伸长生长的单株11株、根能正常生长的单株3株、含有潮霉素的转基因纯合植株(阳性对照)，不含潮霉素的非转基因植株(阴性对照)，分别提取DNA。然后分别设计潮霉素编码基因和载体VK005-1骨架中cas9片段的特异性引物进行PCR扩增，扩增条带分别为350bp和371bp，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

(7)筛选后的无转基因成分植株的复苏

本试验最终目的是筛选出目的基因已发生编辑、且不含有潮霉素基因或载体骨架的无转基因成分纯合植株。因此，筛选出的根不能正常伸长生长单株的成苗情况也是本试验的重点之一。从培养基中挑选出的根不能正常伸长生长单株，用清水多次冲洗或浸泡数小时以减弱其潮霉素残留，然后置于营养液中进行复苏，营养液成分参考于<<国际水稻研究所常规营养液配方>>。复苏生长6天后观察发现，与复苏前对比，种子根由于潮霉素的处理已不再伸长生长，而不定根能较好的伸长生长。把复苏后的单株种于温室管理45天后观察发现，筛选出的不含转基因成分单株经复苏处理后均能正常生长。

下面再通过具体实施例来对本发明进行进一步地说明：

实施例1.种子淹水低氧萌发

将挑选出的待检测样品、阴性和阳性对照干种子，采用淹水低氧处理，即利用单蒸水淹没、封闭浸泡48小时左右，挑选萌发状态一致的种子用于潮霉素固体平板筛选。用于筛选的种子萌发状态为种子破壳露白或胚芽鞘小于2毫米(图1)。处于淹水低氧处理的水稻种子，在吸水萌动后，只有胚芽鞘伸长生长，而胚根不伸长生长。因此，可以利用上述生理表现，在种子胚根未伸长生长前，播种于含有潮霉素抗性琼脂固体平板中，播种时胚芽朝上，且胚破口处或胚芽鞘不接触固体基质上表面。通过后续胚根是否能正常伸长生长来判断各单株是否含有转基因成分。

实施例2.快速筛选不含转基因成分单株的潮霉素浓度确定

首先，分别配制终浓度为0mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L和60mg/L的潮霉素固体平板。固体筛选平板基质组成成分为单蒸水、琼脂和潮霉素3种物质的混合物，不含其他任何营养成分，无需无菌操作。将实施例1中挑选出的阳性对照HC229和阴性对照NIP种子同时播种于不同浓度平板中。保鲜膜包裹放入30度培养箱中(12小时光照/12小时黑暗)培养，在培养生长15小时、30小时、45小时和60小时分别观察种子根和茎伸长生长情况，以确定区分出含转基因成分种子和不含转基因成分种子的最佳潮霉素浓度和观察时间。在平板筛选30小时和60小时时观察统计根和茎长度显示(表1，图2)：在0mg/L潮霉素浓度下，阳性对照HC229和阴性对照NIP主根均能正常伸长生长；在20mg/L、30mg/L和40mg/L潮霉素浓度下，阳性对照HC229主根长与0mg/L下的主根长无显著差异，而阴性对照NIP主根长能正常伸长生长，但长度与0mg/L下的主根长有显著性差异；在50mg/L和60mg/L潮霉素浓度下，阴性对照NIP主根完全不能正常伸长生长，而阳性对照HC229主根长与0mg/L下的主根长仍无显著差异。在茎(苗)长方面，阳性对照HC229在60小时生长时期内，所有检测浓度下均无显著性差异；阴性对照NIP在生长30h时苗长在所有检测浓度下均无显著性差异，而在生长60h时，随着筛选浓度的提高，苗长逐渐降低，且与0mg/L下的苗长差异达到显著水平。因此，根据上述观察结果，我们确定最佳的潮霉素筛选浓度为50mg/L或60mg/L，最佳观察时间为30-60小时之间。

表1.快速高效筛选不含转基因成分单株的潮霉素浓度和观察时间确定

实施例3.基因编辑纯合株系后代中无转基因成份单株筛选

将两个基因编辑纯合株系H1和H2中低氧萌发的种子分别播种于潮霉素终浓度为60mg/L的固体平板中，30度培养箱(12小时光照/12小时黑暗)培养30小时后观察种子生长情况：在茎叶能正常生长前提下，根能正常伸长生长的单株为含有转基因成分单株，而根不能正常伸长生长的单株为无转基因成分单株。如图3所示，在基因编辑H1和H2株系中分别鉴定出根不能正常伸长生长的单株6株和5株。为增加筛选结果的可靠性，将两个检测样品株系中筛选出的根不能伸长生长的单株11株、根能正常生长的单株3株、含有潮霉素的转基因纯合植株(阳性对照)，不含潮霉素的非转基因植株(阴性对照)，分别提取DNA。然后分别设计潮霉素编码基因特异性引物(HYG-Q-F：5'-CGCTTCTGCGGGCGATTTG-3'；HYG-Q-R：5'-CGGATTTCGGCTCCAACAA-3')和载体VK005-1骨架中cas9片段的特异性引物(Cas9-1F：5'-CACCATCTACCACCTGAGAA-3'；Cas9-1R：5'-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3')进行PCR扩增，PCR扩增采用如下程序：94℃预变性3分钟；98℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸10秒，28个循环；最后72℃再延伸5分钟。扩增条带分别为潮霉素片段350bp和Cas9片段371bp，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。设计引物具体为。如图4所示，11株根不能伸长生长的单株在用潮霉素和载体骨架特异性引物扩增时，均不能扩增出目的条带，而阳性对照和3株根能正常生长的单株均能扩增出阳性条带。因此，由上述结果可以进一步确认11株根不能正常伸长生长单株为基因编辑株系中不含转基因成分单株。

上述筛选过程，从种子浸种到鉴定出不含转基因成分单株，可在6天时间内完成。整个操作过程中，不需要无菌条件和环境，大大降低了筛选的人力、物力和时间成本。

本发明选择萌发状态的含有抗生素抗性标记基因的水稻基因编辑株系种子作为初始筛选材料，采用其进行抗生素固体培养基培养，通过观察根的生长情况来筛选是否为不含转基因成分的单株。本实施例选择了的初始筛选材料为含有潮霉素抗性标记基因的水稻基因编辑纯合株系T0代种子，本领域技术人员根据本发明的技术构思可知，抗性标记基因应不限于潮霉素抗性基因，基因编辑株系也不限于纯合株系，如双等位突变株系和嵌合突变株系也可；另外，也不限于T0代种子，也可以是T1代种子等。

现有技术中，利用潮霉素等抗生素进行筛选，一般仅是针对转基因阳性植株进行筛选，且筛选过程中有对种子(潮霉素液体浸泡种子)、叶片或大田生长期进行筛选，但上述这些方法筛选结果不准确或仅能获得转基因阳性植株，不能获得可用于后续育种或研究的无转基因成分单株。

相比之下，本发明还具有如下优点：一、种子是植物生长发育过程中最稳定的一个阶段，相比叶片作为筛选对象，能更少受到除实验处理外其他条件的干扰。利用抗性培养基对种子根是否正常伸长生长进行观察，结果更加直观；二、从种子浸种到鉴定出不含转基因成分单株，可在6天时间内完成，且不需要无菌条件下操作，检测周期短、效率高；三、筛选全程可在实验室操作，相比传统的大田种植加代获取无潮霉素标记植株，免去了育秧、移栽、管理、取样、等一大批繁琐过程，节约了大量人力物力，缩短了试验周期；四、此方法可广泛适用于水稻纯合基因编辑材料中无潮霉素基因标记或其他标记基因的筛选，筛选结果不受后期植株表型影响，也不影响植株后期生长状态。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 1

cgcttctgcg ggcgatttg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 2

cggatttcgg ctccaacaa 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 3

caccatctac cacctgagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Oryza sativa)

<400> 4

cgaagttgct cttgaagttg 20

Claims (7)

1.一种快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，以含有抗生素抗性标记基因的水稻基因编辑株系种子作为待筛选材料，包括如下步骤：

(1)、将所述水稻基因编辑株系种子进行萌发处理，获得已萌发且种子胚根未伸长生长的种子；其中，种子萌发采用低氧处理，利用单蒸水淹没浸泡，挑选萌发状态一致的种子用于下一步播种筛选；所述萌发状态为种子破壳露白或胚芽小于2毫米；

(2)、将步骤(1)获得的已萌发种子播种在含有对应抗生素的固体培养基上，进行培养然后观察，在茎叶能正常生长前提下，根能正常伸长生长的单株为含有转基因成分单株，根不能正常伸长生长的单株为无转基因成分单株；其中，种子播种时胚芽朝上，且胚破口处或胚芽不接触固体培养基上表面；

(3)、针对步骤(2)获得的无转基因成分单株的进一步复苏步骤；

所述基因编辑株系为CRISPR/Cas 9系统基因编辑纯合株系。

2.根据权利要求1所述的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，所述抗生素抗性标记基因为潮霉素抗性基因。

3.根据权利要求2所述的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中固体培养基的基质组成成分为单蒸水、琼脂及潮霉素；所述潮霉素的含量为45mg/L-65mg/L；

培养条件为25-35度培养箱培养28-60小时；然后观察种子生长情况，判断植株为无转基因成分单株的依据为根伸长生长小于等于2毫米。

4.根据权利要求3所述的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，所述潮霉素的含量为50mg/L或60mg/L；所述培养条件为30度培养箱培养30小时后观察。

5.根据权利要求1-4任一项所述的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，还包括针对步骤(2)获得的无转基因成分单株的PCR检测验证步骤。

6.根据权利要求5所述的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，所述PCR检测验证步骤中的引物为：

HYG-Q-F：5'-CGCTTCTGCGGGCGATTTG-3'；

HYG-Q-R：5'-CGGATTTCGGCTCCAACAA-3'；

Cas9-1F：5'-CACCATCTACCACCTGAGAA-3'；

Cas9-1R：5'-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3'。

7.根据权利要求1-4任一项所述的快速高效筛选水稻基因编辑株系中无转基因成分植株的方法，其特征在于，所述含有对应抗生素的固体培养基的筛选条件是通过对比试验获得；所述对比试验用材料包括水稻基因编辑纯合株系种子、含有抗生素抗性标记基因的阳性对照、不含抗生素抗性标记基因的阴性对照，基于对比试验获得的筛选条件可进行固体培养基的配置、萌发种子的培养及观察。

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