CN117025634A - 番茄镉积累相关的遗传位点、分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，公开了番茄镉积累相关的遗传位点、分子标记及其应用，该遗传位点为Glu基因，其gDNA序列如SEQ ID NO.1所示；该分子标记为Glu‑CAPs，对应的基因为cDNA为Solyc03g115200.2，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；5’UTR的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，在5’UTR区存在缺失突变，第240‑241位的TA两个碱基缺失；Glu‑CAPs的正向引物序列Glu‑caps‑Fw1如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列Glu‑caps‑Rv1如SEQ ID NO.5所示。本发明遗传位点、分子标记可为低镉积累番茄品种的筛选与育种提供选择标记，对高品质番茄品种的选育具有指导作用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及番茄镉积累相关的遗传位点、分子标记及其应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)起源于南美洲安第斯山脉，因其风味独特，营养丰富，果实光鲜，易于种植等优点，如今已在全球广泛种植。
解决重金属流入到人体中的问题一般有以下三种方法：一是要对各地土壤中各重金属含量进行测定，进行有针对性的土壤修复和改良；二是选育一部分低重金属积累品种，应用于轻度污染地区；三是通过一些可以超富集植物对耕地中重金属积累，从而降低耕地中重金属的含量，从而降低通过食物流向人体的重金属。目前应用最为广泛的方法是通过土壤修复后，种植筛选低积累重金属积累品种，以及培育低重金属积累新品种。
因此，为满足市场需求和耕地现状，筛选、选育低镉积累番茄品种势在必行。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供了番茄镉积累相关的遗传位点、分子标记及其应用。本发明遗传位点和分子标记可为低镉积累番茄品种的筛选与育种提供选择标记，对高品质番茄品种的选育具有指导作用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种番茄镉积累相关的遗传位点，所述遗传位点为Glu基因，其gDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了针对上述遗传位点开发的分子标记，所述分子标记为Glu-CAPs，对应的基因为Solyc03g115200.2，如cDNA的序列如SEQ ID NO.2所示，5’UTR的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，在5’UTR区存在缺失突变，第240-241位的TA两个碱基缺失。
在以上技术方案中，所述Glu-CAPs的正向引物序列Glu-caps-Fw1如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列Glu-caps-Rv1如SEQ ID NO.5所示。
在以上技术方案中，采用所述正向引物和反向引物对待检测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经酶切、凝胶电泳后，进行结果分析判断是否携带低镉积累目的基因。
本发明还提供了一种番茄镉积累检测方法，以上述分子标记对番茄基因组进行PCR扩增，扩增产物利用MseI酶切，三种单倍型分别为纯合低积累型179bp、纯合高积累性84bp+95bp、杂合型179bp+84bp+95bp。
在以上技术方案中，PCR反应体系为：总体积为50μl，其中ddH2O 17.0μl，Buffer25.0μl，dNTP1.0μl，正向引物和反向引物均为2.0μl，phanta DNA聚合酶1.0μl，模板DNA1.0μl；
PCR扩增具体步骤为：95℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，39个循环，72℃再延伸5min，最后在4℃下保存。
本发明还提供了一种降低番茄镉积累的方法，利用基因工程手段，对上述Glu基因进行改造，使得该基因功能缺失，从而降低番茄镉积累。
本发明还提供了上述遗传位点和分子标记在番茄低镉积累品种筛选上的应用。
本发明还提供了上述遗传位点和分子标记在番茄育种上的应用。
本发明的有益效果在于：本发明遗传位点、分子标记可为低镉积累番茄品种的筛选与育种提供选择标记，对高品质番茄品种的选育具有指导作用。
附图说明
图1是HX(a)、HF 12(b)、HF 15(c)、JNBL(d)四个品种番茄全生育期不同处理浓度叶、茎、果的镉积累图；
图2番茄镉积累曼哈顿图(a)和QQ散点图(b)；
图3.Glu基因不同单倍型中Cd积累量；
图4是Glu基因转入酵母AH109菌株中在40μmol镉浓度下酵母生长情况图；其中BD是空载体对照；
图5是Glu-OE番茄植株T0代PCR检测图，1-22为转化再生植株，其中8、10、11、14、17为阴性；
图6是Glu-OE转基因T1代株系与CK(TS-701)中Glu基因相对表达量检测图，其中：不同处理标有不同字母的表示处理间差异显著(p<0.05)；
图7是Glu-OE转基因T1代株系与CK(TS-701)镉积累含量测定图，其中：不同处理标有不同字母的表示处理间差异显著(p<0.05)；
图8是Glu基因标记选择F3群体不同带型的PCR检测部分结果图，其中：3、5、6、24为纯合高积累单株；9-15为纯合低积累单株；1、2、4、7、8、17-23为杂合单株；
图9是Glu基因分子标记在不同基因型植株镉处理后镉积累量图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
本发明利用541份番茄种质资源(包括506份自然群体材料和35份商品种材料)，对其进行镉处理后，测定镉含量差异，并选取极端材料构建RIL群体；并对506份自然群体材料进行全基因组关联分析，筛选出候选基因，并利用RIL系F3进行标记的开发和验证；利用541份番茄中的4份商品种番茄进行全生育期各部分镉积累情况测定，调查番茄在不同浓度镉污染情况下镉积累情况；根据番茄镉全生育期积累规律扩展商品种番茄35份，对其进行苗期镉积累测定，从而筛选出镉积累量低的品种应用于生产；对于镉高积累品种，利用嫁接低镉积累番茄砧木进行生产，也可降低接穗部分的镉含量。
本发明所用的541个番茄品系均来自于华中农业大学番茄课题组，其中506个品系的番茄均为重测序材料；所用的35份番茄品种均为商品种材料，来自于高校、科研院所、育种公司等机构，源于不同地区以及不同类型，大部分为F1材料。
本发明所用基质中育苗基质为山东商道生物科技有限公司购买，有机枕为陕西霖科生态工程有限公司与西北农林科技大学共同研制。
一、番茄品种镉积累规律试验
选取4个番茄品种：JNBL、HX、HF12、HF15。种子经催芽后，播种至育苗基质中，待苗生长至五叶一心时，定植于条形种植槽(490mm×20mm×140mm)，土壤为育苗基质，分别用不同浓度镉处理，分别为0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、4mg/kg共六个处理浓度。种植期间进行正常的栽培管理至2-3薹果成熟，分别采收植株的茎、叶、红熟果，而后烘干、研磨装入自封袋中密封保存。
番茄在无污染、轻微污染、轻度污染、中度污染、重度污染等污染情况下各部位镉积累情况见表1和图1所示。
表1不同品种番茄全生育期不同处理浓度各个部位镉积累(mg/kg)
镉积累量测定的具体步骤如下：
1、烘干研磨：选取番茄所需测定部位的样品，清理杂质后，放入牛皮纸袋内，标注样品信息，放于烘箱中，75℃烘干至恒重。使用研钵或粉碎机进行研磨，至粉末状；
2、消解管空消：取消解管按自来水、蒸馏水、ddH2O顺序依次冲洗2-3次，置于烘箱，设定为100℃，约1h，干燥后加入10ml浓硝酸(GR)至消解管，微波消解仪(Mars6 Xpress)(培安CEM)，190℃，40min(升温20min，反应40min，降温20min)，取出消解管倒出浓硝酸，清洗消解管按自来水、蒸馏水、ddH2O顺序依次冲洗2-3次，置于烘箱，设定为100℃，约1h；
3、加样：选取样品，果实样品称取0.5000g；叶、茎、地上部等样品称取0.2g；根部样品称取0.05g。加样时，用纸槽送入消解管底部。加入10ml浓硝酸(GR)至消解管；
4、消解：使用微波消解仪，设定190℃，40min，选择设定好的程序进行消解，升温20min至190℃，190℃反应40min，降温时间20min至100℃以下。
5、赶酸：消解完的样品冷却至90℃左右，于通风橱中开盖，再放置于赶酸仪上180℃加热，约90min直至剩余溶液少于1mL。
6、定容：倒入50ml离心管中，用ddH2O润洗消解管壁3次，定容至25ml。使用定性滤纸对样品进行过滤至10ml离心管中，吸取0.5ml加入ddH2O 4.5ml稀释10倍。
7、测定：将样品送至华中农业大学资源与环境学院，使用石墨炉原子积累光谱仪(Agilent 200Series AA)对镉含量进行测定。
根据试验结果得出以下结论：
(1)4个品种的各个器官Cd积累，随着Cd处理浓度增大而增大。
(2)4个品种各个器官镉积累情况为：叶＞茎＞果。
(3)4个品种中镉吸情况为：HF12＞JNBL＞HF15＞HX。
(4)4个品种中有3个品种在浓度为4mg/kg浓度及以下处理下果实中重金属含量未超标，仅HF12在镉处理浓度为4mg/kg时果实中镉浓度为0.0677mg/kg，超过了国家农产品安全质量无公害蔬菜安全要求(GB 2762—2017)，果菜类Cd的最大限度为0.05mg/kg(FW)。
二、35份商品种及506份品系番茄镉积累测定试验
2020年秋季种植重测序材料，播种前铺盖好种植槽，种植槽位于华中农业大学校园内，蔬菜分中心薄膜温室中。种植槽长17m宽0.36m高0.4m，槽内铺膜，膜上铺上处理后的基质土，土壤分为育苗基质混合有机枕，有机枕共119袋，育苗基质共4袋，有机枕重量采取随机抽样10包称重计算平均值为6.232kg/包，育苗基质4袋共计48.24kg，有机枕共计741.608kg，土壤总计789.84kg，混合后土壤含水量为27.64％，计算得出土壤干重为571.52kg，因此需要施加571.52mg镉，液配制选用CdCl2·2.5H2O(相对分子质量：228g/mol)称取8.14g CdCl2·2.5H2O配制10mg/mL镉溶液为母液共400mL。
播种506份番茄重测序品系，及35份商品种，每个系挑选20粒饱满的种子放在滤纸折成的纸槽中，每个槽中对应放上标签并均匀撒上20粒左右的种子，加入清水待种子和滤纸吸水后放入组培间内催芽2-3d，待有大量种子露白后，均匀播在1mg/kg的镉处理过的基质中，每个品系播种10-15粒，每个系间距为0.11m，种植后铺上少量蛭石，浇水至土壤完全湿润浸透，浇完水后覆盖透明薄膜，保温保湿，催芽催苗，减少带帽出土。
播种3d后部分破土出苗，温度较高时揭膜降温避免高温高湿造成徒长，低温时盖膜保温保湿，提高出苗率。10d后将同系中较密集的植株均匀栽植，避免相互影响生长。播种后13d施用杀虫剂杀灭白粉虱斜纹夜蛾等害虫，并少量多次补水。25d后开始间苗，每个株系保留3-5株。
在第32d时对所有株系取样并测量相关数据，分别取每个株系的地上部和根，并测量地上部高度、根长、地上部总重、根系总重量。测量完后放入牛皮纸袋中并在纸带上标注编号及部位，置于温室中晾晒，使其失去部分水分，待植株萎蔫失水后，置于烘箱中烘干脱水至完全脱水，研磨样品使用研钵或小型研磨机，研磨至细粉后放入自封口袋中袋口注明编号及部位，用于镉含量测定。
2020年11月上旬至2021年2月上旬，对样品采用微波消解仪进行消解，消解后经过定容、稀释后使用石墨炉原子积累光谱仪对样品镉含量进行测定(表2)。
表2.不同番茄品种苗期地上部和根部镉积累及转运
一般不同品种作物，地上部和根部镉转运和积累存在差异。因此从根部向地上部转运水平一般使用转运系数来描述。我们调查了35份番茄品种苗期镉积累情况(表2)，从中可初步选择出低镉积累的番茄品种。以及选择出根部高积累而地上部低积累的低转运系数品种，可以安全生产番茄的同时兼顾对中轻度污染地区有一定修复功能。
通过试验筛选出HF11、PT5064、OBB、HF12、HX、LB、BGQF等低镉积累品种，为番茄低镉种植筛选出适合的品种。
通过试验筛选出HF11和PT5064两个品种为低转运系数(地上部积累量/根部积累量)品种，转运系数分别为0.44和0.60，可用于一定程度的土壤镉污染地区的生产兼修复。
三、F1材料栽培管理
实验所用的506份番茄重测序材料，来自于华中农业大学番茄课题组，进行镉积累测定实验，根据镉积累数据，从中选出镉低积累极端材料和镉高积累极端材料各5个品系。
2021年2月上旬播种极端材料10个品系，播种于华中农业大学蔬菜分中心智慧温室中，温度控制在25-28℃，使用育苗基质，播种在50孔穴盘中，每穴播种2-3粒，播种后覆盖蛭石并浇水，期间保持基质湿润，待发芽后减少浇水量，以免幼苗徒长，待苗长出真叶即可进行间苗，每穴保留1株。3月下旬，当苗生长至5-8片真叶时，运至华中农业大学黄土坡基地定植，每个系定植15株，株间距30cm。待生长至20cm高时用竹竿搭架子并施加约100g复合肥。期间要整枝、打岔、绑蔓、除草等工作。4月下旬人工授粉。授粉选取未开放的花苞，去掉一片花萼、两片花瓣、全部雄蕊，此法可尽量保证不易落花，且方便判断最易授粉成功的时机(花瓣展开上弯且呈金黄色)对其进行人工杂交授粉，从而获得F1。
四、RIL群体栽培管理
2021年下半年播种F1(TS-540×TS-411)在华中农业大学蔬菜分中心智慧温室中采用穴盘育苗，共播25穴，成苗约16株，利用开发的LCT1分子标记鉴定均为杂合F1，定植在黄土坡，通过正常栽培措施，自交留种，获得F2约500粒。
2022年1月13日播种F2群体，播种和种植地位于武汉市汉南区的武汉楚为生物有限公司汉南农场，采用50孔穴盘育苗，电加热线作为早春育苗热源，同时覆膜保温保湿，再加以小拱棚提升温度。3月29日定植于汉南农场，露天种植苗间距约30cm生长至5月11日提取373份材料DNA，F2群体中单株间差异较大，6月15日调查F2群体生物学性状，包括：茎粗、花序长度(第5-6薹)、单薹花数、单薹坐果数、坐果率等性状。6月28日对所有F2群体收果，带回果实调查F2群体果实单果重、果实横径、果实纵径、果实硬度、果实糖度，果实心室数，调查性状后随即剖果留种，种子泡在番茄汁中发酵1-2d后清理晾干整理放入牛皮纸袋中存在于-20℃保存，整理后收种370份F2群体种子。
2022年7月27日播种F3群体，播种地在蔬菜分中心连栋温室中，9月2日定植于华中农业大学黄土坡基地。期间种植方法与上一季相同。获得F3群体种子200份。
五、番茄低镉积累相关基因Glu候选
我们结合35份商品种及506份品系番茄镉积累量以及基因组SNP数据，进行全基因组关联分析(GWAS)。GWAS分析的核心是SNPs与表型的关联，我们根据显著性P值从众多SNPs中筛选出最有可能影响该表型的变异，并挖掘相关的基因。但基于SNPs的全基因组关联分析不能直接检索出与表型高度关联的InDels，而基因组上存在着大量的InDels，其对表型的效应通常会强于SNPs。加之由于连锁不平衡现象(linkage disequilibrium)的存在，除了leading SNP，很有可能存在与leading SNP连锁的未知InDels能够更大程度地影响表型。因此，我们检索了leading SNP上下游分别125Kb范围内的总共36个基因，并调取了它们的InDels数据(图2，表3)。最终我们发现，一个编码葡萄糖苷酶的基因Glu(Solyc03g115200.2)的5’UTR区存在一个“TA”的缺失，通过单倍型分析我们发现Glu基因的缺失型突变Glu-TA会积累更多的镉。同时，由于葡萄糖苷酶涉及到纤维素的水解过程，而纤维素是植物细胞壁固持镉的主要成分，因此我们猜测该基因的5’UTR区的缺失突变会导致番茄根系细胞壁的改变从而影响番茄根系对镉的固持能力(图3)。
表3.番茄耐镉基因组关联分析leading SNP上下游125kb范围内的基因
根据曼哈顿图显示，当-log10P＝6时，能在不同染色体上显著关联有多个SNP位点(图2)。且期望值预观测值前端基本重合，后段有一定扬起，说明模型合理，群体结构与亲缘关系对关联结果影响较小，SNP位点可靠，假阳性低。关注到3号染色体上SNP较为显著，并根据SNP位点物理距离的上下游200kb上基因的注释，同时参考拟南芥、水稻中元素积累、抗逆、胁迫应答的相关基因，得到若干候选基因如Glu，将这些基因进行酵母镉耐受筛选实验和番茄遗传转化实验。同时参考拟南芥、水稻中元素积累、抗逆、胁迫应答的相关基因，得到若干候选基因，将这些基因进行酵母镉耐受筛选试验和番茄遗传转化试验。
六、载体构建和番茄遗传转化
使用番茄材料TS-701和TS-9分别做为Glu(Solyc03g115200.2)的模板，引物由天一辉远生物科技公司合成。PCR反应体系：总体积为50μl，其中ddH2O17.0μl，Buffer25.0μl，dNTP1.0μl，正向引物和反向引物均为2.0μl，phanta DNA聚合酶1.0μl，模板DNA1.0μl。PCR反应程序如下：
Glu基因扩增程序如下：95℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，39个循环，72℃再延伸5min，最后在4℃下保存。
分别扩增CDS区段，同源重组连接到35S启动子驱动的pHELLSGATE8载体上，构建超量表达载体。将以上两个重组质粒通过电转的方法分别转入农杆菌C 58菌株，再分别通过农杆菌介导的遗传转化方法转入番茄材料TS-701和TS-9中。番茄遗传转化方法见本课题组前人方法(欧阳波，几种病程相关蛋白基因转化番茄的研究，华中农业大学博士学位论文，2002)
七、酵母异源表达试验
选用pGBKT7质粒，利用同源重组的方法，分别构建Glu基因的BD重组质粒，以探究这Glu基因在酵母中异源表达后，对镉转运的影响。
AH109酵母菌菌株经活化后经平板划线法，2d后分离单克隆菌株，用2×YPDA液体培养基培养12-16h后3500r/min，离心1min，收集菌块，加入LiAC 34μl、1/5Carrier 50μl、PEG 240μl后吸打混匀再加入BD质粒后混匀。金属浴42℃，1h，用无菌ddH2O悬后离心3500r/min，去上清清洗3次。取100μl涂板置于培养箱中。用枪头刮取菌落加入300-500μl无菌水吸打混匀后检测浓度OD600，加入无菌水稀释，使得OD600值为1，而后稀释10倍、100倍、1000倍。
配制SD-Trp固体培养基：YNB 0.67g，Agr 2g，H2O 83.5ml，121℃，20min灭菌后加入-Trp/10×OD 10ml，40％Glu 5ml，CdCl2 1.5ml/2ml后，倒平板。
将转入不同载体后稀释的不同浓度的菌液滴在SD-Trp固体培养基上置于培养箱中，2-3d后观察酵母生长情况并拍照记录。
通过对酵母菌不同菌株镉处理后试验表明，AH109对添加镉后的培养基有一定的敏感性，因此使用AH109酵母菌进行镉转运试验。试验结果显示如图4，图4是酵母生长速率实验，BD是空载。Glu表达后与对照相比酵母生长受到抑制。酵母生长速率实验表明，Glu在酵母异源表达后，在镉处理的培养基上生长速率明显被抑制，因此该基因可能与耐镉性相关(图4)。
八、Glu转基因植株的镉积累测定
通过利用番茄遗传转化体系，创建Glu基因超量表达株系，对T0代阳性苗，筛选后种植收种，留种播下T1代，经阳性检测选出阳性苗(图5)进行后续试验操作。阳性植株经种植收种后播下T1代，对其连续多次喷施卡那霉素筛选，5-7d后剪去发黄个体，其余植株进行镉处理，待苗长至3-5叶后，提取DNA用于阳性检测，最终留下阳性的T1代单株。
30d后提取各单株RNA后通过反转录和q-PCR后得到其表达量差异。由图6可见，转基因植株相对照植株，表达量高出CK(TS-701)45.6倍，且差异显著，因此OE-N系为转基因T1代超量表达株系。镉处理45d后对地上部收取，消解后测定转基因(Glu-OE)材料与背景材料(TS-701)植株地上部镉含量(图7)。
图7显示，经镉处理后的植株样品经消解后测得其镉积累情况与背景材料(TS-701)镉积累差异，经过试验结果计算与分析，超量表达株系镉积累高于背景材料46％，且差异显著，因此该基因对镉积累有一定功能。
九、番茄低镉积累主效位点Glu标记开发及验证
利用F3群体作为Glu基因标记的验证材料，验证不同带型的单株基因型与镉积累量是否有关联。所用引物见表4。
表4分子标记引物序列
PCR反应体系：总体积为10μl，其中ddH2O 7.3μl，Buffer1.0μl，dNTP0.2μl，正向引物和反向引物均为0.2μl，Taq DNA聚合酶0.1μl，模板DNA1.0μl。PCR反应程序如下：
Glu基因扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环，72℃再延伸5min，最后在4℃下保存
在检测的分子标记中，Glu需要用MseI酶对扩增产物进行酶切37℃，酶切1h。
酶切体系：总体积为12.5μl，其中PCR产物10μl，酶0.2μl，ddH2O 1.05μl，tangoBuffer 2.5μl。
凝胶电泳：对PCR扩增反应产物进行凝胶电泳检测。一般情况下使用1％浓度的琼脂糖凝胶，所区分条带差距较小的需使用2％或是3％浓度的琼脂糖凝胶，在100V-130V条件下进行电泳，在凝胶成像系统中观察条带大小，分析结果。
如图8可区分三种带型和三种表现型分别为纯合低积累型179bp、纯合高积累型84bp+95bp、杂合型179bp+84bp+95bp。
进一步对不同基因型番茄材料进行镉处理后，测定植株镉积累量。图9是Glu分子标记不同带型番茄植株，在镉处理后整株地上部的镉吸收量情况。由图可见，Glu标记不同带型的植株镉含量存在差异。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种番茄镉积累相关的遗传位点，其特征在于：所述遗传位点为Glu基因，其gDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.针对权利要求1所述遗传位点开发的分子标记，其特征在于：所述分子标记为Glu-CAPs，对应的基因为Solyc03g115200.2，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，5’UTR的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，在5’UTR区存在缺失突变，第240-241位的TA两个碱基缺失。
3.根据权利要求2所述分子标记，其特征在于：所述Glu-CAPs的正向引物序列Glu-caps-Fw1如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列Glu-caps-Rv1如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求3所述分子标记，其特征在于：采用所述正向引物和反向引物对待检测番茄的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经酶切、凝胶电泳后，进行结果分析判断是否携带低镉积累目的基因。
5.一种番茄镉积累检测方法，其特征在于：以权利要求2所述分子标记对番茄基因组进行PCR扩增，扩增产物利用MseI酶切，三种单倍型分别为纯合低积累型179bp、纯合高积累型84bp+95bp、杂合型179bp+84bp+95bp。
6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于：PCR反应体系为：总体积为50μl，其中ddH2O 17.0μl，Buffer25.0μl，dNTP1.0μl，正向引物和反向引物均为2.0μl，phanta DNA聚合酶1.0μl，模板DNA1.0μl；
PCR扩增具体步骤为：95℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，39个循环，72℃再延伸5min，最后在4℃下保存。
7.一种降低番茄镉积累的方法，其特征在于：利用基因工程手段，对权利要求1所述Glu基因进行改造，使得该基因功能缺失，从而降低番茄镉积累。
8.权利要求1所述遗传位点和权利要求2所述分子标记在番茄低镉积累品种筛选上的应用。
9.权利要求1所述遗传位点和权利要求2所述分子标记在番茄育种上的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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