CN107347248B

CN107347248B - 不依赖于春化处理的洋桔梗植物

Info

Publication number: CN107347248B
Application number: CN201580064087.1A
Authority: CN
Inventors: 阿威猜·阿姆拉德; 科菲尔·班德尔; 齐尔利·普莱班; 达尼·扎米尔
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CN107347248A; US10750701B2; US20170258023A1; JP2017535268A; JP6860481B2; EP3223602A1; CA2968515C; CA2968515A1; WO2016084077A1

Abstract

本发明涉及不需冷处理(春化处理)即可诱导抽苔和开花的作物洋桔梗(洋桔梗(Eustoma grandiflorum))及其生产手段和方法。

Description

不依赖于春化处理的洋桔梗植物

技术领域

本发明涉及不需冷处理(春化处理)来诱导抽苔和开花的作物洋桔梗(洋桔梗(Eustoma grandiflorum))植物及其生产手段和方法。

背景技术

洋桔梗，即龙胆科(Gentianaceae)的洋桔梗(Eustoma grandiflorum)，是国际市场的一种相对新的花卉作物，其被广泛用作切花，并且也被用作盆栽植物。这种天然存在的植物的常用名是德克萨斯铃兰(Texas Blue Bell)、草原玫瑰(Prairie Rose)和草原龙胆(Prairie Gentian)。洋桔梗是一种二倍体生物体，具有自花和异花传粉的能力，并且商业市场中几乎所有的种子都是F₁杂交种。洋桔梗物种源自于北美平原的大草原地区，并且被描述为一年生或二年生植物，在春季或夏初开花。洋桔梗属(Eustoma)已知的唯一其他物种是E.exaltatum，其能够与洋桔梗异花传粉。在始于20世纪晚期的不到30年时间中，洋桔梗从事实上无名的植物变成了世界上前十的切花作物之一。

将适于花坛种植的野生型表型转变成现代切花作物的尝试可以追溯到早至1930年代，并且主要出现在日本。然而，重大突破直到1977年随着第一批F₁杂交种的开发才出现，所述杂交种在1984年左右作为一系列品种以“Yodel”的名称被引入国际市场。旨在改进品种以用于盆栽或花坛植物或用于切花市场的繁育项目始于1980年代晚期。当前，洋桔梗市场主要聚焦于切花品种。

洋桔梗作为作物植物的引入是缓慢的，遭遇到栽培和经济挑战，包括不适当的生长模式、花产量低、缺少均匀性和生长期长。对这种作物不断上升的兴趣导致相关科学文献的并行增加，然而，它仍被当作“孤儿作物”的花卉栽培实例，即在经济上和栽培上重要但缺乏实证研究兴趣的作物。

致力于研究洋桔梗中的性状遗传的工作有限，它们都没有将分子信息与遗传机制相结合。Ecker等的研究(Ecker R等，1993.Genet.Anal.256:253–257；Ecker R等，1994.Euphytica 78:193–197)显示了对生长速率、叶尺寸、茎直径和结的数目的明显的杂种优势效应。所述实验在具有广泛遗传背景的不同近交系、F₁、F₂和BC₁群体上进行。在源自于为开花而需要低温的基因型和不需低温的基因型之间的杂交的F₁、F₂和BC₁群体的分析的基础上，提出了种子休眠遗传的模型。所述模型包括具有累积效应的6个双等位基因的基因座，其中为了诱导表型种子休眠，必需存在至少9个“提供休眠的”等位基因(Ecker R等，1994.Plant Breed.113:335–339)。

洋桔梗被认为是一种兼性长日照植物，并且尽管据认为光周期效应弱，但实验显示短日照可能对开花具有延迟效应并且对抽苔也具有不利的次级效应(Harbaugh B K.,1995.HortScience.30:1375–1377)。

在洋桔梗中影响生长和开花诱导的主要环境因素是温度(Ohkawa K和Sasaki E.，1999.Acta Hortic.482:423–426)。当洋桔梗幼苗在第一生长阶段中暴露于高于20℃的温度超过14天时，发生莲座丛生长并且花茎的伸长被延迟。具有莲座叶的植物将不抽苔，并且以与农业生产不相容的散乱方式很晚才开花。已证实，暴露于低于15℃的低温至少4周(被称为“春化处理”的过程)消除了所述高温的负面效应(Ohkawa K等，1991.Sci.Hortic.(Amsterdam).48:171–176)。已发现，赤霉酸类(GA)通过在包括洋桔梗的许多植物中调控柄伸长而在春化效应中发挥重要作用(Hisamatsu T等，1998.J.JapaneseSoc.Hortic.Sci.67:866–871)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和洋桔梗中，低温可以启动GA生物合成并提高营养体莲座丛中的GA敏感性(Oka M等，2001.Plant Sci.160:1237–1245)。也已显示，在洋桔梗中，还原型谷胱甘肽(GSH)在对春化处理的响应中具有作用，据推测是通过影响GA上游的抽苔的调控(Yanagida M等，2004.Plant Cell Physiol.45:129–37)。

已调查了可能在春化处理要求中发挥作用的几种公知基因的洋桔梗同源物(Nakano Y等，2011.Physiol.Plant.141:383–93)。所述基因根据它们在拟南芥春化机制中的功能来选择。开花基因座C(FLOWERING LOCUS C,FLC)编码MADS盒转录因子，并且是受到春化处理阻遏的开花的关键阻遏物。开花基因座T(FT)和OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)是受FLC抑制的花的启动子。通过将洋桔梗基因在转基因拟南芥植物中过表达，来检查同源的洋桔梗基因的功能。对于进行春化处理和未进行春化处理的植物来说，在不同组织和时间中的表达分析表明EgFLCL(洋桔梗FLC样)被寒冷温度上调，因此不同于拟南芥FLC，后者在冷处理之前丰富表达并被春化处理沉默。EgSOC1L(洋桔梗SOC1样)和EgFTL(洋桔梗FT样)被春化处理后的温暖温度和长日照诱导，其方式类似于对大麦Hv-FT1所观察到的，后者被春化处理后的温暖和长日照条件诱导(Hemming等，2008)。这些发现说明，在洋桔梗中由春化处理引起的开花调控与为拟南芥开发的范式差异显著(Nakano等,2011，同上)。

将洋桔梗的幼苗暴露于低于15℃的温度至少4周的要求，在时间和金钱方面对栽培者来说是强加的负担，特别是在其他方面都高度适合于生产洋桔梗切花的气候温暖的国家如以色列。

因此，获得对春化处理不敏感且不需冷处理就能抽苔和开花，同时保持商业上成功的株系的表型的洋桔梗(洋桔梗(Eustoma grandiflorum))植物，仍存在未满足的需求，并且这也是非常有利的。

发明概述

本发明提供了具有已调整过的春化处理要求的观赏性洋桔梗(洋桔梗(Eustomagrandiflorum))植物。具体来说，本发明提供了不依赖于春化处理就能抽苔和开花的洋桔梗植物，其高度适合于农业商业用途。

本发明部分是基于下述出人意料的发现，即将等同于野生Eustoma exaltatum的连锁群(LG)2的极小染色体区段基因渗入到观赏性作物洋桔梗E.grandiflorun的基因组中，改变了洋桔梗的春化处理要求，使得在不暴露于已知为这种作物植物所需的低温的情况下发生抽苔和开花。所使用的野生E.exaltatum植物是不依赖于春化处理的，在不接受不含所述QTL或其部分的洋桔梗植物中抽苔所需的冷处理的情况下抽苔。

所述E.exaltatum LG-2区段包含与位于约25至约45cM之间的至少一个标志物相关的QTL。本发明的被基因渗入的洋桔梗植物在其他方面，在它们的外观和农学需求方面类似于优良植物。此外，E.exaltatum来源的QTL在洋桔梗中的基因渗入导致在这个物种典型的二次盛开中花茎的数目增加。

根据一种情况，本发明提供了一种观赏性洋桔梗(Eustoma grandiflorum)(E.grandiflorum)作物植物，其包含含有源自于Eustoma exaltatum的连锁群(LG)2的QTL或其一部分的遗传元件，其中所述QTL或其部分为所述洋桔梗植物提供对春化处理的不依赖性。

根据某些实施方式，包含所述QTL或其部分的E.exaltatum植物是不依赖于春化处理的。根据某些示例性实施方式，所述不依赖于春化处理的E.exaltatum是E.exaltatum株系14_30P1RI，其种子于2015年11月23日保藏在NCIMB Ltd.，保藏号为NCIMB 42491。

根据某些实施方式，所述遗传元件由所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分构成。

根据某些实施方式，所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分与位于E.exaltatum连锁群2上在25-45cM之间延伸的区间内的至少一个标志物相关。根据某些实施方式，所述标志物是表1中列出的标志物中的任一者。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

根据某些示例性实施方式，所述QTL或其部分与位于E.exaltatum连锁群2上在30-40cM之间延伸的区间内的至少一个标志物相关。根据某些实施方式，所述至少一个标志物包含在SEQ ID NO：1-42任一者中示出的核酸序列。每种可能性代表本发明的独立实施方式。

根据某些实施方式，所述至少一个标志物包含SEQ ID NO：3中示出的核酸序列。根据其他实施方式，所述至少一个标志物包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列。根据其他实施方式，所述至少一个标志物包含SEQ ID NO：40中示出的核酸序列。

根据某些示例性实施方式，所述QTL或其部分与标志物S1_74154018相关。根据某些示例性实施方式，所述标志物位于E.exaltatum连锁群2上的34.53167046位置处。根据某些实施方式，所述标志物包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列CAGCTCTTTCATCACTGTGAGGCTCATAGTCTGGCTGTTCTGCATCTGAATTTGAAACACGTGC。

根据其他实施方式，所述包含提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分的遗传元件被并入到所述观赏性洋桔梗的等同于连锁群2的染色体中。根据某些示例性实施方式，所述包含QTL或其部分的遗传元件被并入到洋桔梗等同于连锁群2的染色体上的约25cM至约45cM处。

根据某些实施方式，与在缺少所述引入的QTL或其部分的相应观赏性洋桔梗植物中在二次盛开期间的花茎数目相比，所述QTL或其部分还提供了二次盛开期间花茎数目的提高。

根据某些实施方式，所述包含含有提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分的遗传元件的观赏性洋桔梗植物与缺少所述引入的QTL或其部分的相应观赏性洋桔梗植物相比，具有等同的农艺学性状。根据某些实施方式，所述农艺学性状选自但不限于花梗长度、生长速率、产量、对非生物胁迫的抗性和对病原体的抗性。根据某些示例性实施方式，所述包含QTL或其部分的遗传元件被引入到洋桔梗优良栽培种中。应该理解，本发明的洋桔梗是观赏性作物植物，但不限于特定株系和/或品种。

根据某些示例性实施方式，包含所述QTL或其部分的洋桔梗的花梗长度等同于缺少所述引入的QTL或其部分的相应观赏性洋桔梗植物的花梗长度。

根据其他实施方式，包含所述含有提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分的遗传元件的观赏性洋桔梗植物不含源自于E.exaltatum染色体的有害遗传累赘。

根据某些实施方式，所述植物是对所述含有提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分的遗传元件纯合的近交系。根据其他实施方式，所述植物是对所述含有提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分的遗传元件杂合的杂种植物。应该明确理解，对所述QTL或其部分杂合的植物可以在不接受本文中所描述的冷处理的情况下抽苔。

种子、插条和可用于繁殖的任何其他植物部分，包括分离的细胞和组织培养物，也涵盖在本发明的范围之内。应该理解，从所述种子或其他繁殖材料产生的植物包含所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分。

本发明公开了在位于E.exaltatum的连锁群2上的QTL与组成型春化处理表型之间的迄今为止未知的关联，所述表征当被转化到洋桔梗的基因组中时，导致它在不暴露于已知为缺少所述引入的QTL或其部分的相应观赏性洋桔梗植物所需的春化处理低温的情况下，能够抽苔和开花。

因此，根据另一种情况，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含提供对春化处理的不依赖性的核酸序列，其中所述核酸序列源自于与E.exaltatum植物的连锁群2等同的染色体区段，所述E.exaltatum植物不需春化处理即可抽苔和开花。

根据某些实施方式，所述E.exaltatum的区段包含位于25cM至45cM之间的核酸序列或其部分。根据某些实施方式，所述E.exaltatum的区段包含表1中列出的遗传标志物中任一者的核酸序列。根据其他实施方式，所述E.exaltatum区段包含位于30cM至40cM之间的核酸序列或其部分。根据这些实施方式，所述区段包含在SEQ ID NO：1-42任一者中示出的核酸序列或其任何组合。

根据某些示例性实施方式，所述核酸序列包含遗传标志物S1_74154018的序列，其包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列。

根据又一种情况，本发明提供了一种不依赖于抽苔的春化处理要求的观赏性洋桔梗的生产方法，所述方法包括在洋桔梗中引入包含源自于Eustoma exaltatum的连锁群2的QTL或其一部分的遗传元件，其中所述QTL或其部分为所述洋桔梗植物提供对春化处理的不依赖性，由此产生不依赖于开花的春化处理要求的观赏性洋桔梗。

根据某些实施方式，包含所述QTL或其部分的E.exaltatum植物是不依赖于春化处理的。

根据某些示例性实施方式，包含所述QTL或其部分的不依赖于春化处理的E.exaltatum植物是E.exaltatum株系14_30P1RI，其种子于2015年11月23日保藏在NCIMBLtd.，保藏号为NCIMB 42491。

根据某些实施方式，所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分与位于E.exaltatum连锁群2上25至45cM处的至少一个标志物或其任何组合相关。根据某些实施方式，所述至少一个遗传标志物选自表1中列出的标志物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。根据其他实施方式，所述QTL或其部分与位于E.exaltatum连锁群2上约30至约40cM处的至少一个标志物或其任何组合相关。根据这些实施方式，所述至少一个遗传标志物包含SEQ ID NO：1-42中示出的核酸序列。

根据某些示例性实施方式，所述QTL或其部分与标志物S1_74154018相关，其包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列。

根据某些实施方式，所述包含QTL或其部分的遗传元件被引入到洋桔梗的等同于连锁群2的染色体中。根据某些示例性实施方式，所述区段被引入在洋桔梗连锁群2的约25cM至约45cM处。

可以使用本领域技术人员已知的任何方法将所述包含QTL或其部分的遗传元件引入到洋桔梗中。

根据某些示例性实施方式，所述遗传元件通过基因渗入来引入。

根据其他实施方式，所述遗传元件通过转化来引入。

根据某些实施方式，不依赖于春化处理而抽苔的洋桔梗植物的选择，通过检测洋桔梗植物的基因组中本文所描述的源自于E.exaltatum的QTL或其部分的存在来进行。可以使用本领域中已知的任何方法来检测所述QTL或其部分。根据某些示例性实施方式，检测通过鉴定如本文中所述位于所述QTL内的标志物来进行。

从下面的描述和附图，本发明的其他目的、特点和优点将变得明显。

附图简述

图1演示了所定义的从花蕾早期阶段(阶段1)至衰老(阶段9)的9个不同发育阶段。图片示出了从洋桔梗粉红色亲本与E.exaltatum之间的杂交获得的F₁杂交种的花。

图2示出了不抽苔并处于莲座丛状态的植物(图2A)和抽苔的植物(图2B)。

图3示出了不同的花表型。图3A：雄蕊数目的变异。图3B：柱头叶的变异。图3C：花梗长度。图3D：花萼长度。

图4提供了两种重组近交系(RI)作图群体的构建的示意图。

图5示出了合并的重组近交系洋桔梗群体的估算的标志物连锁。线指示连锁(大的LOD分值或小的重组率)，背景指示未连锁的标志物(小的LOD分值或大的重组率)。

图6示出了由4500个SNP标志物和69个连锁群构成的洋桔梗连锁图。

图7示出了Manhattan图：在使用通过测序进行基因分型(GBS)数据构建的合并的纯合RI连锁图上的洋桔梗丛叶QTL。

图8示出了在使用GBS数据构建的合并的纯合RI连锁图的连锁群2上的洋桔梗丛叶QTL的详图。

图9显示了对S1_74154018的洋桔梗等位基因纯合的植物(1)和对E.exaltatumS1_74154018等位基因纯合的植物(3)的平均抽苔数目的比较。

图10示出了Manhattan图：在使用通过测序进行基因分型(GBS)数据构建的合并的杂合RI连锁图上的洋桔梗丛叶QTL。

图11示出了在使用GBS数据构建的合并的杂合RI连锁图的连锁群2上的洋桔梗丛叶QTL的详图。

图12显示了对S1_74154018的洋桔梗等位基因纯合的植物(1)和包含S1_74154018的一个洋桔梗等位基因和一个E.exaltatum等位基因的杂合的植物(2)的平均抽苔数目的比较。

图13示出了包含春化处理不依赖性等位基因的杂交杂合植物(被称为F1p)和依赖于春化处理的商业化品种的抽苔。图13A：抽苔的百分率。图13B：开花的F1p植物的图片。图13C：具有莲座叶表型的Rosita 3绿色植物的图片。

图14显示了在对S1_74154018的洋桔梗等位基因纯合的植物(1)和对E.exaltatum等位基因纯合的植物(3)之间，在二次盛开中每株植物的平均花茎数目的比较。

图15显示了对EG_0075的洋桔梗等位基因纯合的植物(1)和对E.exaltatum EG_0075等位基因纯合的植物(3)的平均抽苔数目的比较。

图16显示了对S1_18474044的洋桔梗等位基因纯合的植物(1)和对E.exaltatumS1_18474044等位基因纯合的植物(3)的平均抽苔数目的比较。

发明详述

定义

术语“植物”在本文中以其最宽泛的意义使用。它也指称多个植物细胞，所述细胞大部分分化成在植物发育的任何阶段出现的结构。这些结构包括但不限于根、茎、枝条、叶、花、花瓣、果实等。根据某些示例性实施方式，在本文中、特别是在指称洋桔梗(Eustomagrandiflorum)中可互换使用的术语“观赏性植物”或“观赏性作物植物”，是指适合于商业化生长以获得它们的切花和用作花园或盆栽植物的株系。

当在本文中使用时，术语“植物部分”通常是指洋桔梗植物的部分，包括单个细胞和细胞组织例如在植物中完整的植物细胞、细胞团和洋桔梗植物可以从其再生的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自于花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条和种子的单个细胞和组织，以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、接穗、初生主根、种子、原生质体、愈伤组织等。

当在本文中使用时，术语“抽苔”是指从营养体或莲座丛阶段向开花或生殖生长阶段的转变。

当在本文中使用时，术语“春化处理”是指在某些植物中通过将植物暴露于寒冷一定的时间段来促进成花诱导的过程。根据某些实施方式，在指称洋桔梗(Eustoma)时，术语“春化处理”包括将处于第一生长阶段的幼苗暴露于低于20℃、有时低于18℃或低于15℃的低温。术语“第一生长季”是指从第一片叶出现开始并持续约至少三周或约四周或更长的一段时间。当在本文中使用时，术语“对春化处理的不依赖性”或“不依赖于春化处理的”是指在本领域中已知的用于商品化生长的最适条件下生长，本质上在不进行春化处理的情况下抽苔并开花的洋桔梗植物。

术语“基因座”在本文中被定义为给定基因在给定物种的染色体上占据的位置。

当在本文中使用时，术语“连锁群”是指位于同一染色体上的所有基因或遗传性状。在所述连锁群内，那些足够靠近在一起的基因座将在遗传交配中表现出连锁。由于交换的概率随着染色体上的基因之间的物理距离而增加，因此在连锁群内位置彼此远离的基因在直接遗传试验中可能不表现出任何可检测的连锁。术语“连锁群”主要用于指称在尚未做出染色体定位的遗传系统中表现出连锁行为的遗传基因座。因此，在本发明的情形中，术语“连锁群”与染色体(的物理实体)同义。

术语“QTL”在本文中以其本领域中公认的意义使用。术语“提供对春化处理的不依赖性的QTL”是指位于洋桔梗的特定染色体上，与编码对春化处理的不依赖性的至少一个基因相关的区域，或至少调控区，即染色体的控制参与对春化处理的不依赖性的一个或多个基因的表达的区域。该基因的表型表达可以是例如不需冷处理即可抽苔和/或在二次盛开中花的数目增加。QTL可以例如包含其产物提供对春化处理的不依赖性的一个或多个基因。或者，QTL可以例如包含其产物影响所述植物的基因组中其他基因座上的基因的表达，从而提供对春化处理的不依赖性的调控基因或序列。本发明的QTL可以通过使用一个或多个分子基因组标志物指明它在相应E.exaltatum条目的基因组中的遗传位置来确定。一个或多个标志物进而指明了特定基因座。基因座之间的距离通常通过同一染色体上的基因座之间的交换频率来度量，并表示成厘摩(cM)。两个基因座相隔越远，在它们之间越可能发生交换。相反，如果两个基因座紧邻在一起，则它们之间不太可能发生交换。按照惯例，1厘摩(Kosambi作图函数(cM))近似等于基因座(标志物)之间1％重组。当QTL可以由多个标志物指示时，终点标志物之间的遗传距离指示了所述QTL的大小。

术语“天然遗传背景”在本文中用于指示QTL的原始遗传背景。这种背景是Eustomaexaltatum、特别是不需春化处理即可开花的E.exaltatum的基因组。因此，E.exaltatum株系14_30P1RI代表了本发明的QTL的天然遗传背景。包括将包含来自于E.exaltatum的连锁群2的QTL或其一部分的DNA转移到另一个洋桔梗物种的相应染色体上的相同或不同位置的方法，将导致该QTL或其部分不处于其天然遗传背景中。

当在本文中使用时，术语“杂合的”意味着当不同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处时存在的遗传状况。

当在本文中使用时，术语“纯合的”意味着当相同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处时存在的遗传状况。

当在本文中使用时，术语“杂交种”是指两个遗传上不同的个体之间的杂交的任何后代，包括但不限于两个近交系之间的杂交。

当在本文中使用时，术语“近交系”意味着基本上纯合的个体植物或植物株系。

术语“基因渗入”是指将基因或性状基因座的所需等位基因从一个物种、品种或栽培种的遗传背景传递到另一个物种、品种或栽培种的基因组中。在一种方法中，所需等位基因可以通过两个亲本之间的有性杂交进行基因渗入，其中一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。所需等位基因可以包括一个或多个所需基因、标志物基因座、QTL等。

当在本文中使用时，术语“群体”是指具有共同遗传来源的植物的遗传上不均质的集合体。

术语“遗传工程改造”、“转化”和“遗传修饰”在本文中都用于将分离和克隆的基因转移到另一个生物体的DNA、通常为染色体DNA或基因组中，或者是指植物基因组内基因的修饰。

术语“分子标志物”或“DNA标志物”在本文中可互换使用，并且是指在可视化核酸序列的特征中的差异的方法中使用的分子指示物。这些指示物的实例是多样性阵列技术(DArT)标志物、限制性片段长度多态性(RFLP)标志物、扩增片段长度多态性(AFLP)标志物、单核苷酸多态性(SNPs)、插入突变、微卫星标志物、序列特征性扩增区域(SCARs)、酶切扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工酶标志物，或本文中描述的定义了特定遗传和染色体位置的标志物的任何组合。在本发明中使用的DNA标志物大部分是通过测序进行基因分型的标志物(GBS标志物)。

根据一种情况，本发明提供了一种观赏性作物洋桔梗(Eustoma grandiflorum)植物，其包含包括源自于Eustoma exaltatum的连锁群2的QTL或其一部分的遗传元件，其中所述QTL或其部分为所述洋桔梗植物提供对春化处理的不依赖性。

本发明第一次公开了洋桔梗中与对春化处理的不依赖性相关的数量性状基因座(QTL)，迄今为止已知在洋桔梗中，为了生产商业上足够的切花作物，在早期生长阶段对低温具有强制性要求。在非商业化的洋桔梗物种Eustoma exaltatum中观察到QTL。在分析了大量表型和它们相关的基因型后，发现基本上废除了对春化处理的要求的QTL位于具有对春化处理的不依赖性表型的E.exaltatum植物的连锁群2上。在本发明的过程中使用的植物是E.exaltatum株系14_30P1RI。该株系的种子已在《布达佩斯公约》下被国际保藏专业机构NCIMB Ltd.(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)保藏。保藏日期为2015年11月23日。种子的保藏物是在本申请的提交日期之前已存在的材料的代表性样品。NCIMB I.D.号为NCIMB 42491。

根据某些实施方式，所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分与位于E.exaltatum连锁群2上跨过25-45cM之间的区间中的至少一个标志物相关。根据某些实施方式，所述至少一个标志物选自下面的表1中示出的标志物。每种可能性代表了本发明的独立的实施方式。

表1：与提供对春化处理的不依赖性的QTL相关的标志物(25-45cM)

根据某些示例性实施方式，所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分与位于E.exaltatum连锁群2上跨过30-40cM之间的区间中的至少一个标志物相关。根据某些实施方式，所述至少一个标志物选自下面的表2中列出的标志物。根据这些实施方式，所述至少一个标志物包含在SEQ ID NO：1-42任一者中示出的核酸序列。每种可能性代表了本发明的独立的实施方式。

表2：与提供对春化处理的不依赖性的QTL相关的标志物(30-40cM)

遗传单位“QTL”指示染色体上与表型可定量的性状直接相关的区域，根据本发明，所述性状是洋桔梗植物为抽苔和开花而对春化处理的需求。QTL与遗传单位“基因”的区别在于表型表达依赖于大量不能预测的因素。已发现在本发明中鉴定到的QTL的几个标志物位于已知基因内(参见表1)。这些基因在本发明首次公开的对春化处理的不依赖性的QTL可遗传性状中可能发挥作用或可能不发挥作用。

具体的性状与一个或多个特定标志物相关。在本发明中公开的标志物指示了所述QTL的位置，并且此外与对春化处理的不依赖性的特定表型性状在植物中的存在相关联。应该指出，指示QTL在基因组上的位置的毗连基因组标志物在原则上是任意的或非限制性的。一般来说，QTL的位置由对表型性状表现出统计学相关性的毗连的一串标志物指示。一旦发现在该串之外的标志物(即具有低于一定阈值的LOD分值的标志物，所述阈值表明标志物如此遥远，导致在该标志物与QTL之间的区域中重组频繁地发生，使得所述标志物的存在不以统计上显著的方式与所述表型的存在相关联)，则可以设定所述QTL的边界。因此，也可以通过位于该特定区域内的其他标志物指示所述QTL的位置。本发明的示例性标志物的LOD分值显示在上文的表2中。

根据本发明的其他实施方式，所述毗连基因组标志物也可用于指示所述QTL(以及因此所述表型)在个体植物中的存在，即它们可用于标志物辅助的选择(MAS)程序。原则上，潜在有用的标志物的数目有限，但也可使用大量标志物。专业技术人员可以容易地鉴定本申请中公开的标志物的附加标志物。与所述QTL连锁，例如落于具有高于一定阈值的确立LOD分值的标志物所跨越的基因组区域的物理边界之内，从而表明在杂交中在所述标志物与QTL之间不发生或很少发生重组的任何标志物，以及与所述QTL连锁不平衡的任何标志物，都可以使用在MAS程序中。因此，在本发明中鉴定为与所述QTL相关的标志物，包括标志物S1_74154018，仅仅是适用于MAS程序的标志物的实例。此外，当所述QTL或其特定的提供性状的部分被基因渗入到另一个遗传背景中(即另一个植物物种的基因组中)时，在后代中可能不再发现某些标志物，尽管其中仍存在所述性状，表明这些标志物在仅在原始的亲本株系中代表所述QTL的特定的提供性状的部分的基因组区域之外，并且所述新的遗传背景具有不同的基因组组织体系。

根据某些实施方式，所述与本发明的QTL相关的标志物列于表1中。根据其他实施方式，所述与本发明的QTL相关的标志物列于表2中，具有SEQ ID NO：1-42中示出的核酸序列。根据某些示例性实施方式，所述QTL或其部分与选自具有SEQ ID NO：3中示出的核酸序列的标志物EG0075、具有SEQ ID NO：15中示出的核酸序列的标志物S1_74154018和具有SEQID NO：40中示出的核酸序列的标志物S1_18474044的标志物相关。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。

根据某些示例性实施方式，所述QTL或其部分与标志物S1_74154018相关。根据某些实施方式，所述标志物包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列。

所述QTL在作物物种洋桔梗的基因组中的基因渗入产生在不首先暴露于低温的情况下即可抽苔并发育花茎的植物。出人意料的是，所述基因渗入对生长模式和产生的花具有很小或没有有害影响。此外，所述基因渗入不仅影响春化处理要求，而且在洋桔梗的商业化生长中典型诱导的二次盛开中引起每株植物的花茎数目增加。合在一起，这两种降低农业生长中涉及的成本并提高产量的性状，提供了显著的商业价值。

包含所述废除洋桔梗对春化处理的需求的QTL或其部分的遗传元件的引入，可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。应该明确理解，在生产的洋桔梗中，包含所述QTL的区段不在其天然背景中。

包含本发明的QTL或其如本文中所公开的可以减少或消除春化处理要求的任何部分的核酸(优选为DNA)序列，可用于所述观赏性洋桔梗的生产。根据某些实施方式，将所述QTL引入到需要春化处理才能足够抽苔和开花的洋桔梗，通常为适合于商业化生长的品种中。根据本发明的教示，所述核酸序列源自于E.exaltatum供体植物。

所述提供对春化处理的不依赖性的QTL或其部分可以使用本领域中已知的任何方法从所述供体植物分离。

所述提供对春化处理的不依赖性的QTL序列或其一部分可以通过本领域技术人员已知的任何方法转移到受体洋桔梗植物。根据某些实施方式，所述QTL或其部分可以通过QTL供体与受体洋桔梗、特别是洋桔梗的杂交(即通过基因渗入)来引入。或者，可以通过下文中所描述的转化来引入包含所述QTL或其部分的分离的核酸序列。在转化后任选地进行包含所述QTL并表现出春化处理的不依赖性的后代植物的选择。

可以分离本发明的QTL并且可以通过专业技术人员已知的任何方法测定其核酸序列。例如，包含所述QTL或其提供对春化处理的不依赖性的部分的核酸序列可以如下所述从E.exaltatum供体植物分离：将所述植物的基因组片段化，并选择带有本文中所公开的指示所述QTL的一个或多个标志物的片段。随后或可选地，可以使用指示所述QTL的标志物序列(或其部分)作为扩增引物，使用例如PCR，以便从获自所述植物的基因组核酸样品或基因组片段扩增包含所述QTL的核酸序列。然后可以将所述扩增的序列纯化，以便获得所述分离的QTL。然后可以通过标准的测序方法获得所述QTL和/或其中包含的任何其他标志物的核苷酸序列。

根据本发明的某些情况，提供了一种分离的多核苷酸，其包含提供对春化处理的不依赖性的核酸序列，其中所述核酸序列源自于与E.exaltatum植物的连锁群2等同的染色体区段，其中所述E.exaltatum植物不需春化处理即可抽苔和开花。

用分离的核酸序列转化植物通常涉及在植物细胞中起作用的表达载体的构建。根据本发明的教示，这种载体包含本发明的QTL或其部分。通常，所述载体包含在调控元件的控制之下或可操作连接到调控元件的所述QTL或其部分。根据某些实施方式，所述调控元件选自启动子、增强子和翻译终止序列。所述载体可以采取质粒的形式，并且可以使用本领域中已知的适合于将核酸序列转化到洋桔梗植物中的转化方法，单独地或与其他质粒组合地使用在生产不需春化处理即可抽苔的转基因洋桔梗植物的方法中。

表达载体可以包括可操作地连接到调控元件(例如启动子)的至少一个标志物(报告物)基因，其允许通过负选择(通过抑制不含可选择标志物基因的细胞的生长)或通过正选择(通过筛选由所述标志物基因编码的产物)来回收含有所述标志物的转化的细胞。许多用于植物转化的常用可选择标志物基因在本领域中是已知的，并包括例如编码代谢性脱毒可能是抗生素或除草剂的选择性化学药剂的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的改变的靶的基因。几种正选择方法在本领域中是已知的，例如甘露糖选择。或者，使用与QTL相关的标志物作为探针鉴定转化的植物中所述QTL的存在。

用符合本发明的核酸序列转化植物细胞的方法在本领域中是已知的。当在本文中使用时，术语“转化”描述了外来核酸序列例如载体进入受体细胞并将其改变成转化的、遗传修饰的或转基因细胞的过程。转化可以是稳定的，其中核酸序列被整合到植物基因组中并因此代表了稳定的可遗传的性状，或者是瞬时的，其中核酸序列被转化的细胞表达，但是没有整合到基因组中，因此代表了瞬时性状。根据典型的实施方式，本发明的核酸序列被稳定地转化到植物细胞中。

存在各种不同的将外来基因引入到单子叶和双子叶植物两者中的方法(例如，Potrykus I.1991.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:205-225；Shimamoto K.等，1989.Nature 338:274-276)。

外源DNA在植物基因组DNA中的稳定整合的重要方法包括两种主要方法：

土壤杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移：土壤杆菌介导的系统包括使用含有整合到植物基因组DNA中的确定DNA区段的质粒载体。接种植物组织的方法随着植物物种和土壤杆菌递送系统而变。广泛使用的方法是叶盘程序，其可以使用为全植株分化的启动提供良好来源的任何组织外植体来进行(Horsch等，1988，《植物分子生物学手册》(PlantMolecular Biology Manual)A5,1-9,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht)。补充方法利用土壤杆菌递送系统与真空渗入的组合。

直接核酸转移：存在着各种不同的将核酸直接转移到植物细胞中的方法。在电穿孔中，将原生质体简短暴露于强电场，打开小孔以允许DNA进入。在显微注射中，使用微量移液器将核酸直接机械注入到细胞中。在微粒轰击中，将核酸吸附在微粒例如硫酸镁晶体或钨粒子上，并将所述微粒物理加速到细胞或植物组织中。用于将核酸引入植物的另一种方法是通过靶细胞的超声处理。可选地，脂质体或原生质球融合已被用于将表达载体引入植物中。

在洋桔梗靶组织的转化后，上述可选择标志物基因的表达允许使用当前本领域中公知的再生和选择方法，偏好性地选择转化的细胞、组织和/或植物。

或者，符合本发明的教示的QTL或其部分可以在不事先分离所述提供对春化处理的不依赖性的核酸序列的情况下转化。

根据某些示例性实施方式，所述QTL或其部分的转移通过将E.exaltatum连锁群区段基因渗入到需要春化处理才能抽苔和开花的洋桔梗中来进行。

根据某些实施方式，所述方法包括下列步骤：

a.提供需要冷处理才能抽苔和开花的亲本洋桔梗植物株系和不需冷处理就能抽苔和开花的E.exaltatum植物，所述E.exaltatum植物包含与标志物S1_74154018相关的QTL；

b.将所述亲本洋桔梗植物株系与E.exaltatum植物杂交，以产生F₁子代植物；

c.将所述F₁子代植物自交以产生F₂群体；

d.将所述F₂群体与所述亲本洋桔梗株系回交至少一次，以产生回交群体；

e.从所述回交群体选择包含与标志物S1_74154018相关的QTL的洋桔梗植物。

根据某些实施方式，将所述F₂群体与所述亲本洋桔梗株系回交的步骤(d)被重复5次，以产生回交群体5。

根据某些实施方式，所述包含与标志物S1_74154018相关的QTL的洋桔梗植物不需春化处理即可抽苔和开花。

包含与标志物S1_74154018相关的QTL的洋桔梗植物的选择，可以通过本领域中已知的任何方法来进行。

根据某些实施方式，包含QTL的植物的选择包括检测与本文中描述的QTL相关的标志物的存在。

所述检测方法可以包括下述步骤：提供能够在严紧杂交条件下杂交到与所述QTL连锁的标志物、优选地选自本文中被鉴定为与所述QTL连锁的标志物的核酸序列的寡核苷酸或多核苷酸，将所述寡核苷酸或多核苷酸与从回交群体的植物获得的基因组核酸相接触，以及确定所述寡核苷酸或多核苷酸与所述基因组核酸的特异性杂交的存在。

或者，在所述QTL的核苷酸序列已被确定后，专业技术人员可以设计能够在严紧杂交条件下与所述QTL的核酸序列杂交的特异性杂交探针或寡核苷酸，并且可以将这些杂交探针使用在用于检测本发明的QTL在怀疑对春化处理不依赖的洋桔梗植物中的存在的方法中。

短语“严紧杂交条件”是指探针或多核苷酸将杂交到通常在核酸的复杂混合物中的它的目标子序列，但是基本上不杂交到其他序列的条件。严紧条件是序列依赖性的，并且在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的全面指导可以在Tijssen的文献中找到(Tijssen P.1993，“使用核酸探针的杂交。第一部分：理论和核酸制备”(Hybridization With Nucleic Acid Probes.Part I.Theory and Nucleic AcidPreparation)，在《生物化学和分子生物学实验室技术》(Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)中，Elsevier)。通常，严紧条件被选择为比特定序列在确定的离子强度pH下的热解链点(Tm)低约5-10℃。Tm是(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)50％的与靶互补的探针在平衡条件下杂交到靶序列的温度(由于靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡条件下被占据)。严紧条件是在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子、通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)来说为至少约30℃并且对于长探针(例如大于50个核苷酸)来说为至少约60℃的条件。严紧条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号是至少两倍的背景杂交，优选为10倍的背景杂交。示例性的严紧杂交条件通常是：50％甲酰胺，5xSSC和1％SDS，在42℃下温育，或者5xSSC，1％SDS，在65℃下温育，并且在65℃下在0.2xSSC和0.1％SDS中清洗。对于PCR来说，约36℃的温度通常用于低严紧性扩增，尽管取决于引物长度退火温度可以在约32℃至48℃之间变化。用于确定杂交参数的其他指南提供在大量文献中，例如《分子生物学现代方法》(Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等主编，1995)。

为了更全面地说明本发明的某些实施方式，提出了下述实施例。然而，它们绝不应该被解释为限制本发明的广阔范围。本领域技术人员可以容易地设计本文中公开的原理的许多变化和修改，而不背离本发明的范围。

实施例

材料和方法

植物材料

耶路撒冷希伯来大学的Robert H.Smith农业、食品和环境学院(Robert H.SmithFaculty of Agriculture,Food and Environment,The Hebrew University ofJerusalem)的洋桔梗项目，包括从来自于6个不同育种公司的超过50种商品化杂交种起源的数百种不同繁育系和遗传资源，以及从各种不同来源获得的野生型洋桔梗和E.exaltatum。

幼苗产生和植物生长条件

播种尤其是在以色列的Hishtil Ltd.的Nehalim苗圃(Israel)，在360或406格标准洋桔梗播种托盘中进行。幼苗在以色列的Hishtil Ltd.Company的设施中生长。直至2010年之前，幼苗在Nehalim的Hishtil苗圃生长，从2011年起在Susya(Israel)生长。幼苗在标准的商品化杂交种生长条件下生长，并满足标准的洋桔梗低温(春化处理)要求。

通常，选择和种子生产在位于以色列Rehovot的耶路撒冷希伯来大学的农业、食品和环境学院(Faculty of Agriculture,Food and Environment of the HebrewUniversity of Jerusalem)的农场中进行。取决于播种时间，花期总是出现在春季至夏季(4月至8月)。按照标准的洋桔梗流程并根据生长条件和生长阶段提供灌溉和施肥。仅在特定的症状表观出现之后并仅在开花开始之前提供作物保护处理。在用于表型表征的植物中折下第一批花。在第二次开花期时进行收获。

花传粉和种子操作

自花传粉：

1.将阶段3(花蕾开始膨大，花瓣高于花萼)至阶段6(雄蕊排放，关闭柱头，图1)之间的花用纸袋覆盖。

2.在将花覆盖5-14天后，将袋子打开并进行人工自花传粉。在传粉后，将花用所述纸袋重新封闭。

只有通过人工自花传粉产生的种子才被当作真正的自花传粉种子。

异花传粉：

1.将阶段3的花(花蕾开始膨大，花瓣高于花萼，图1)人工打开并除去花药。将每朵去雄的花封闭在纸袋中。

2.在除去花药后7–14天，将每朵花的纸袋打开，并通过将雄性亲本的花药附着于柱头或通过使用用70％乙醇消毒且覆盖有花粉的刷子，将花粉人工施加到柱头上。在人工传粉后，将花重新封闭在纸袋中。

从传粉(自花和异花传粉两者)起50-75天后，将果实收获在纸袋中并保持在37-45℃下的温箱或干燥箱中以完成干燥。将种子储存在±7℃和30％湿度下，直至播种。

表型表征

本文中描述的性状是基于广泛的表型尝试，以表征大量的性状，在其基础上选择了113个性状，为遗传群体的表征产生详细的表型目录。

为了将不同的表型特征标准化，必需定义几个术语的通用语言：

花龄：如图1中所述，从花蕾早期阶段至衰老定义了9个不同的发育阶段。阶段1：花蕾关闭，花萼高于(长于)花瓣；阶段2：花蕾膨大开始，花萼和花瓣近似等长；阶段3：大的花蕾，花萼短于花瓣，花蕾膨大；阶段4：花瓣开始展开，雄蕊未完全成熟；阶段5：花开始打开，花瓣分开，雄蕊未排放，柱头关闭；阶段6：花打开，雄蕊排放，柱头关闭；阶段7：开花期，雄蕊排放，柱头打开；阶段8：花开始枯萎，花瓣凋谢并开始关闭；阶段9：衰老。

分枝：只有具有两对或更多对叶的分枝被定义为分枝。

花蕾：只有从花苞唤醒并且长度超过1cm的花蕾才被定义为花蕾。

开花时间：第一批花达到阶段6(花打开，雄蕊排放，柱头关闭，图1)的日子。

收获时间：第二批花达到发育阶段7(开花期，图1)的日子。

抽苔：植物从营养生长向开花的转变通过花茎的外观和伸长来鉴定(图2)。抽苔的程度由3个不同时间点来定义：

(a)18周抽苔[抽苔(18)]：播种后18周时每种株系的抽苔植物的百分率。

(b)20周抽苔[抽苔(20)]：播种后20周时每种株系的抽苔植物的百分率。

(c)22周抽苔[抽苔(22)]：播种后22周时每种株系的抽苔植物的百分率。

二次开花的相关性状：在一次开花的花收获后和直至二次开花前的生长期间描述植物的多种性状。

(a)二次开花存活率[SF.存活率]：每种株系的在收获后存活并具有二次开花的植物的百分率。

(b)每株植物的二次开花的茎[SF.S_PLN]：在二次开花中每株植物的分枝数目。

(c)二次开花中的莲座丛形成[SF.莲座丛]：每种株系的在一次收获后显示出莲座丛并且不抽苔的植物的百分率(图2A)。

(d)到二次开花的天数[SF.天数]：每种株系从一次收获至二次收获(二次开花收获)的最少天数。

花器官尺寸：不同花器官的尺寸使用滚轮(2011年期间)或通过图像分析(2012年期间)来测量。

(a)花梗长度[花梗.LN]：在主干上带有花的最后节间的长度，在所有花季中通过滚轮来测量(图3C)。

所述表型分析通过四个主要实验来进行：

2011年温室实验–在没有加热的塑料温室中，使用水耕法将植物在8升桶容器中生长。使用的生长介质是“Odem 93”(Tuff Marom Golan Ltd.,Israel)(2/3凝灰岩，1/3泥炭)。将每种重组的近交系(RIL)种植在随机分布于温室中的3个容器中。每个容器含有5株RIL平行样(每种RIL总共15株平行样)。此外，将来自于每种RIL的6株平行样种植在单个容器中用于繁育和家族水平上的表征。温室的总大小为150m²。种植日期为2011年2月15日；开花始于2011年4月22日。

2012年温室实验–以对2011年实验所描述的一致的方式并在同一温室中生长植物。由于这一年的实验包括回交株系(BCL)F5BC1，由于空间限制，每种株系仅种植在两个容器中(每种株系总共10株平行样)。种植日期为2012年1月12日；开花始于2012年4月15日。

2012年网棚实验–在网棚中，使用水耕法将植物生长在大的单排塑料容器中，所述容器含有在粗的凝灰岩层上覆盖有凝灰岩薄层的两相生长介质。将来自于每种株系的6株平行样种植在单一位置中。植物以每m² 30株植物的密度生长。网棚的总大小为100m²。种植日期为2012年1月12日；开花始于2012年5月22日。

2013年SHTIL NETO温室实验–在塑料温室中，将植物生长在含有泥炭的大的幼苗托盘(1.5英寸)中。177种不同株系(每种株系总共11株平行样)。播种日期–2013年7月29日；抽苔结束–2013年10月20日。

沿着从萌发到收获的整个生长季进行表型分析。主要分析聚焦于开花期，并且如下进行：除了特定假期事件等之外每周三次(星期日、星期二和星期四)，来自于每株植物开放的第一批花被记录、照相并除去。收获继续生长并达到收获时间(如上文中所定义)的植物。在收获当天和第二天进行收获的植物的表型分型。关于收获的植物的没有进行的其他表型分析以及对置于花瓶中的切花的表型分型和繁育工作，在收获日的隔日进行。

DNA提取

收获新鲜的幼叶并立即用液氮冷冻。将冷冻的组织保持在-80℃下直至进行DNA提取。DNA提取使用标准的微量制备流程来进行(Fulton T M等，1995.PlantMol.Biol.Report.13:207–209)。

QTL分析

QTL作图分析在每个群体和实验的平均原始数据上分开地进行。将RIL中特定标志物的杂合子基因型从所述标志物的分析中移除。通过对实验中每种株系的性状分值进行平均，将序数和二元(是/否的表型)性状两者转变成具有标称本质的性状。进行Shapiro-Wilk检验以检查每种性状分布的正态假设，并将所述性状分类为表现出正态和非正态的表型分布的性状。依照用于正态和非正态表型分布的方法计算LOD分值(Borman K W和Sen S.,2009.《使用R/qtl进行QTL作图的指南》(A guide to QTL mapping with R/qtl)，第一版，(Springer New York))。一般来说，对于正态分布的性状来说，使用与单向ANOVA(标志物回归)类似的log₁₀似然率试验，而将除以2(ln10)的Kruskal-Wallis检验统计量用于非正态分布的性状。所有计算通过R统计软件进行。QTL效应被计算为归因于RIL中的纯合子野生型等位基因或BCL中的杂合子等位基因的差的百分率。

其中：μ(gra)＝对于QTL来说纯合子洋桔梗植物的性状平均值；μ(exs)＝对于QTL来说纯合子E.exaltatum植物的性状平均值；μ(het)＝对于QTL来说杂合子植物的性状平均值。

QTL的指派分几个阶段进行：1.选择在一个群体中，在至少一个实验中高于2.5LOD分值的阈值的表型基因型关联。2.当阈值由于先前的QTL发现而可能降低时(Lander E S和Schork N J.,1994.Science 265(5181):2037–2048.)，将对于在阶段1中选择的关联来说显示出高于1LOD分值(<0.031p值)的所有实验宣布为显示出所述QTL的实验。3.如果大量邻近标志物与同一形状相关，所述性状的主要QTL在观察到连锁的实验的数目的基础上并通过LOD分值来选择。如果所述QTL仅在一个网棚实验中检测到，则它由于这个实验因实验设计(每种株系仅仅一块样地)而苦于生物学重复样减少和/或受硬蓟马侵袭影响的植物数目较高而降低，并因此不太可靠。

对于QTL图谱来说，在几个密切相关的性状与同一基因座相关联的情况下，选择代表所述QTL的性状。所述被指派的性状是在更多实验中显示出显著性的性状，或者在显著实验的数目相同的情况下是具有较高平均LOD分值的性状。在几个显著实验的情况下，按照下述顺序选择将在所述图谱上显示的效果：1.白色群体，2012年；2.白色群体，2011年；3.粉色群体，2012年；4.粉色群体，2011年。

实施例1：重组近交系(RIL)

在2006年期间，在源自于洋桔梗和E.exaltatum的商品化杂交种和野生型保藏品的不同纯系(Hebrew University of Jerusalem,Israel的保藏)之间进行了超过140次杂交。在2007年进行的F₁群体和它们的亲本的表型表征，允许选择在本文提出的研究中使用的两个种间重组近交系(RIL)群体。所述选择主要是基于：(A)从表型所观察到的亲本株系的纯合性；(B)F₁的均匀性；以及(C)亲本株系的表型特征。最终选择了两个遗传基因渗入群体用于深入调查。

这两个RIL群体从E.exaltatum与来自于粉花和白花栽培背景的两个洋桔梗株系之间的杂交构建。亲本株系的主要特征是：E.exaltatum：小的单个紫花，丛生，晚花，强烈昼夜节律运动，窄叶和窄茎并且没有形成莲座丛的倾向。用于杂交的保藏品显示出非常高的均匀性，表明它是纯合的纯系。粉花洋桔梗：中等大小的单个花，浓郁的粉色，微弱顶端优势，短节间，花产量高，形成莲座丛的倾向和总体典型的夏季品种生长(良好的耐热性，生长缓慢)。白花洋桔梗：大的双白花，花瓣多，强烈顶端优势，花产量低，总体典型的冬季品种生长(适度的抽苔温度要求，生长快速)。将F₅RIL株系与它们的洋桔梗亲本回交，以便产生回交株系(BCL)。两种RIL的构建示意图呈现在图4中。

实施例2：表型数据

在两个地点对两批分开的子代进行表型观察。在2011年，在一个地点对两个RIL群体进行表征；在2012年，在两个地点对两个RIL和两个BCL群体进行表征(表3)。实验总是包括亲本株系和F₁子代，并且统计分析是基于以随机方式种植的多个重复样(参见上文的材料和方法)。

表3：表型收集的概述

*所有实验也包括亲本株系、原始的F₁和对照杂交种品种。

**将不同性状指派给表型目录中所描述的表型组(参见材料和方法)。

实施例3：遗传图谱

使用每个RIL群体的可用遗传标志物构建了两个遗传图谱。

使用可以在康奈尔大学基因组学研究所(Cornell University at theInstitute of Genomic Research)作为服务获得的通过测序进行基因分型(GBS)平台，产生DNA多态性数据(Elshire R J等，2011.PLoS One 6:e19379)。使用这一平台，标志物检测和评分同时进行，并检测到数千个通过严谨质量控制的SNP。使用R/qtl的遗传图谱构建工具对所述SNP进行作图，所述工具由威斯康辛大学生物统计学和医学信息学院(Universityof Wisconsin-Madison,Department of Biostatistics&Medical Informatics)的KarlW.Broman开发并编纂，并描述在#214技术报告中(在Broman K W和Sen S A.，《使用R/qtl进行QTL作图的指南》(Guide to QTL Mapping with R/qtl)，New York:Springer；2009中)。产生所有成对标志物的估算重组率(左上三角形)和LOD分值(右下三角形)的图(图5)。约4500个标志物产生69个由标志物构成的连锁群，其中相邻标志物之间的最长距离被固定为小于20％重组(图6)。选择该截止值是为了防止连锁群的假统一。

实施例4：提供对春化处理的不依赖性的QTL的鉴定

所述QTL使用Phenome Networks(Rehovot,Israel)的生物信息学能力来鉴定，其开发了一组程序来显示复杂表型的不同组分的详细情况，以揭示复杂且隐藏的生物学知识(Zamir D.,2013.PLoS Biol.11:e1001595)。Phenome Networks利用了大量R函数和将适合的统计模型匹配到群体的遗传结构的算法。从图7显然看出，针对春化处理的主要QTL(Lod20)位于连锁群2上，正如2013年在Shtil Neto进行的仅基于来自于合并的两个群体的纯合RI的实验中所分析的。连锁群2的详图(图8)显示，QTL效应峰值位于该连锁群上30-40cM之间的区间。

影响抽苔表型的最强标志物之一是S1_74154018(具有SEQ ID NO：15中示出的核酸序列)。如图9中呈现的，在具有基因型1(对洋桔梗等位基因纯合)的植物组中，约15％的植物显示出抽苔，其余85％的植物产生莲座丛并且不开花，而在具有基因型3(对E.exaltatum等位基因纯合)的组中，接近90％的植物抽苔，支持了所述QTL位于连锁群2上。表4提供了来自于对纯合RI进行的所有实验的抽苔数据的概述，显示出所述效应的可重复性。使用位置更接近鉴定到的QTL的边缘的标志物获得了类似结果，正如图15中对位于30.5046992位置处的遗传标志物EG_0075(具有SEQ ID NO：3中示出的核酸序列)和图16中对位于38.2014392位置处的遗传标志物S1_18474044(具有SEQ ID NO：40中示出的核酸序列)所显示的。

表4：纯合Eustoma RI相对于标志物S1_74154018的抽苔数据的概述

P-粉花亲本；W-白花亲本；RIL-重组近交系

出人意料的是，对于杂合的RI杂交种，发现了非常相似的将QTL联系到对春化处理的不依赖性的观察。在这种情况下，将具有相应洋桔梗亲本的RI的杂交种的种子萌发。图10显示，针对春化处理的主要QTL(Lod 20)位于连锁群2上，正如对纯合群体所显示的(图7)，并且QTL效应峰值位于该连锁群上30-40cM之间的区间(图11)。图12显示，从具有基因型1(对S1_74154018的洋桔梗等位基因纯合)的植物，约40％的植物抽苔，其余60％的植物产生莲座丛并且不开花，而在具有基因型2的组(包含S1_74154018的一个洋桔梗等位基因和一个E.exaltatum等位基因的杂合植物)中，接近90％的植物抽苔。表5提供了来自于使用杂合RI进行的所有实验的抽苔数据的概述。

这些结果清楚地证实，与对春化处理的不敏感性相关的QTL是显性的，这与迄今为止已知的与春化处理相关的基因相反，后者被显示为仅在纯合状态下有效。

表5：杂合的Eustoma RI相对于标志物S1_74154018的抽苔数据的概述

通过将对E.exaltatum春化处理不依赖性等位基因杂合的杂种植物(命名为F1p)在高温条件(28℃12h和34℃12h的日周期)在人工气候室中生长三个月，进一步验证了这一发现。使用主导的商品化品种(Rosita White、Rosita 2 Purple、Aube Pink Flush、Piccolo 2 Hot Lips、Rosita 3 Green、Eosita 3 Pink和Tzili)作为对照。正如在图13中清楚地显示的，超过80％的杂合杂种植物抽苔，与此相比在春化处理依赖性品种中最多约28％抽苔。

实施例5：提供对春化处理的不依赖性的QTL对其他表型的影响

将来自于野生型或祖先植物的有益性状多次基因渗入的尝试，遭遇到不想要的性状从供体进入受体植物的显著遗传累赘的问题。然而，在本发明的植物中，不仅不想要的性状的累赘可以忽略，而且QTL正面影响洋桔梗的生长模式所典型具有的二次盛开中花茎的数目。图14显示基因型3的植物(对E.exaltatum等位基因纯合)在二次开花中每株植物平均3.5个花茎，与此相比具有基因型1的植物(对洋桔梗等位基因纯合)在二次开花中每株植物仅仅2.5个花茎。

所述QTL对花梗长度具有轻微的负面影响，花梗长度在包含QTL的植物中略微增加。这种增加是不想要的，因为它减弱了倾向于折断的花。然而，这种影响可以通过将所述QTL引入到具有非常短花梗的适合遗传背景的洋桔梗植物中来克服。

上述具体实施方式的描述如此充分地揭示了本发明的一般性质，使得其他人通过使用目前的知识，不需过多实验并且不背离所述一般概念即可容易地修改和/或改编这些特定实施方式以适应于各种不同应用，因此，这些改编和修改应该并且打算被理解为在所公开的实施方式的等同性意义和范围之内。应该理解，在本文中使用的短语或术语是出于描述而不是限制的目的。用于执行各种公开的功能的手段、材料和步骤，可以采取各种不同的可替选形式而不背离本发明。

序列表

<110> 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研究发展有限公司

<120> 不依赖于春化处理的洋桔梗植物

<130> SCT172511-30

<150> US 62/083912

<151> 2014-11-25

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 1

cagctcttat gtgacataag aaatgttaca aaatgcatgc agtattcgat gtaaattacc 60

gacg 64

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 2

ctgcaaacat cagtcttatt gcagttaaaa cagaaaatag gcatagaaaa acaagtaggg 60

aatg 64

<210> 3

<211> 590

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 3

gaaggcaaaa atttttgagg agatgagccg caaaagagag agagcttctc aagccggcta 60

ctttccgagc tcttttccga aacgccggcg gcccagtgtc ccccgacgcg atctccccga 120

cgactcaaaa tttactctcg acgtcccctc ttccccggcg gcctcctcca agcagcaaaa 180

cacggtggtg gtgagtgggc tgccgaccga ttgctccgtg ttggacctga aatcccgctt 240

cgagatctat ggctctattt ctcgcacccg aatggaccct aatggtcttg cttacatcac 300

ttttcggtcc catgattccg ccacttccgc cgtctccgcc gccctcgacc cttctttccg 360

catcacctta ctctctaaac ctgtacaagt gatgtgggct actgacccgg taccgcagtg 420

gagggaaggt gtgacaaaga aagaaggtgc atcatcaaga ctgttgtctt caagctagtg 480

aggcctgacg tacctctatg tacgcgaggg agaggtaata aattgatttc agctattgtt 540

aatccagaga aaaggataat ggtaatggca ttggcaatga tgaaagggaa 590

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 4

ctgcgattcc aaaaacgtgg aaggaagcaa actccgatgc aacaagttat tccctattga 60

atga 64

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 5

cagcaccaaa taattcaatt gcctgatttt cccggtggaa tcgaggcttt tgagctatgt 60

gcta 64

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 6

cagcaatgtt attcactggt ctctatctag tggcgctagg agttggaggc atcaagggat 60

ccct 64

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 7

cagcatctgc gcacctgtta gtgcctgggg cgccacaaag tgaatgtatg ttaaagttaa 60

ggtt 64

<210> 8

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 8

cagcaaaagt gcaatgatta gcaaccaagg cgccaaacag agcaacagtc caaattctaa 60

tagc 64

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 9

ctgcattctg ttcaaaaagc atggccatgt taaacgtatc cagcaaaatt ttctccaaaa 60

gaaa 64

<210> 10

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 10

ctgcattctt catttttggt actactccta tcttatagtc ttttgcatat tcctctgtgt 60

tttc 64

<210> 11

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 11

cagcacctgg atttgggctt gaaaggggaa aagctgaggg tacacatact ggatttacag 60

ttgg 64

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 12

ctgcttgaaa atttgttgca ggttcaaatg cgtgattcta tccgtggtca gccttgcctc 60

gatg 64

<210> 13

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 13

cagctgtcca agttttgcac gcgccaaaag ctcgaccaga tcattctgag gcaattgtgg 60

agga 64

<210> 14

<211> 1400

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 14

aagtaggtcg gagggggagt gcccttcctt ttgtgctcac tgctacgtaa cttcttcttt 60

ttgtttttgc gtggagtctt gacatcattg taacctattc tgatgctagg gtggtcatct 120

ttttgtatcg gccaaatccc tgggaatctg tgttcaccac ccccgtattt gatgagcaag 180

ctcttgccca aaggttacac tttctttgat gcattatccc ctggactaca tcggctaacc 240

tattctgatt ctagggtggt cttctttttg tatcggccaa atccctggga acctgtgttt 300

accacccccg gatttgatga gcaagctctt gctcaaagta actttctttg atgcattatc 360

ccctggacta cataggctag attatcttta actttgagac attttgtttc ctacactgac 420

aagtagatca ccattcattt ggcaatgaac ttatctcctt ggttgagcct atatcaagtc 480

tccgtttttc ctgcatgaat acaactttat ccttaattct tgccctgatc tttagacatt 540

gccattgaaa ctatttagtc cgggttctgc tttcgtcgag tcaacttctg tgtgaaagac 600

ggactagact catcatggaa gaaaacctta gagtcagatc actatgggca ccctcgagct 660

tatttgtttg ctttgagagg aattccataa ctagtccagc gcccaagaag ttgtttcagt 720

ccttggatat tttctcttgt gataacacag ttgtatctca ccataagcac tccatgaacc 780

cctttcaacg tttctccaaa ccaatatcag gacattgctg tgtataccga agccaattta 840

tacatttata gtgatttatc agggcacgaa attgacatta ctggatgata tttgtactac 900

atggtaatgc agaaatgcaa tccgattcat taacgcttta gcaagacacc acggaaagag 960

tatgcctttc tggccatgtt cttgcagcgt tctgaaatgc tccaacgaaa gctctttgcc 1020

aaaagaacgt taaaaaaggc aggggatatg aacaatttca cagcacctag ctagtcgtac 1080

gttaactcgc accataaaaa tatgtaacag aaagagtaca ctccctccgt cccatcttat 1140

aattccacaa actattttga gatgtccaaa cttacaagtc tgcatgcttt aaattgtgaa 1200

agaaagcgga atcttttgct actttctcct tttctaaagt acacgcagtt aaaaaatgca 1260

cctaacttct tgtggcgaaa gttggaatac cttattttat gctatgtctc acttccacaa 1320

ggtcttacat tttagaacag agggcagctg ctaatgatag tgccactttc aaggaacaag 1380

gaaacaagac ccacctgatt 1400

<210> 15

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 15

cagctctttc atcactgtga ggctcatagt ctggctgttc tgcatctgaa tttgaaacac 60

gtgc 64

<210> 16

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 16

cagcaaaagt gaaatataag gtcttgcagt catgccgcct atgaccatct gaaaggatga 60

tttc 64

<210> 17

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 17

ctgcaaaatt caaatgtgac gttttggtaa atcctcaacc ataacggagc ccaaacctct 60

gtga 64

<210> 18

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 18

ctgcaccacc atgggataga ccaccagcat ttgaaccata aggttccata ttgaaagact 60

ggtt 64

<210> 19

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 19

cagcaagtgg ctccatattg cttttatttg caaatatgca aatggttctc ctagataacc 60

gtgc 64

<210> 20

<211> 64

<212> PRT

<213> Eustoma exaltatum

<400> 20

Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys

1 5 10 15

Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Thr Thr Gly Cys

20 25 30

Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Thr Thr Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr

35 40 45

Gly Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala

50 55 60

<210> 21

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 21

ctgccgcctc ctgaatgaat gtgcgcggaa tgcagattga attcgtgctg aaaaaaaaaa 60

aaaa 64

<210> 22

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 22

ctgcgatttc ttttcagatc tctagcatgg aaaagtgatt acctttatca gctagcctag 60

ttgc 64

<210> 23

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 23

cagcatgcaa ctaggctagc tgataaaggt catcactttt ccatgctaga gatctgaaaa 60

gaaa 64

<210> 24

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 24

ctgctaataa atttcttccc ccaaccccaa acccccataa attactatct tgctgacgtg 60

gaaa 64

<210> 25

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 25

cagctggaaa aagctttaga gaagacatat atgaatcctt gtttggagaa tatgaagggt 60

ggat 64

<210> 26

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 26

ctgcctgaaa atttggagaa agagaagtcc tgaatcagtg tcctttacaa aatttaattg 60

gcat 64

<210> 27

<211> 566

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 27

gaacaggatg tttgggataa ggatttggat atgtacaata attttttcca caaattgaaa 60

gtgattaagc agaacagtat tccaaaactc ttcctgttgg ccaattatat aaagtctaat 120

agagcaagtg tgtcagctgg tggtctttct actcctggca ttgtcacgaa gccactacgc 180

gcaagtatgc tttctgcatc tctacgacgt gctatgggca gaggcacagg gtgtaatgga 240

gatgttcgta atctgactct ttctagtctg ctccatggga gaaaaattct agtagttgat 300

gataacaagg tcaatcttaa agtcgctgag ggtttcctca agaagtatgg ggctgaggtg 360

gtgcgagtgg aaagtggaaa aagaagcagt ttcactgctg cagccacccc accaatttga 420

tgcctgtttc atggatattc aaatgccaga aatggatggg tttgaagcaa caaagagaat 480

tcggaacaca gaatatgaga tcaattctca gcttgaaagc ggagaacttt cagttgaaga 540

atatgcaaat ctttcaagtg gcatgt 566

<210> 28

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 28

ctgcatttgg atcataaaca agagtgctgt agtaaggatc ctcctcctgt gaaaacagca 60

gaaa 64

<210> 29

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 29

cagcacaacg gatgccagtt acaatgtgca agagttgttt tggagcttca ccaatacaga 60

tatc 64

<210> 30

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 30

ctgcctgagg tgtttcctgc ttttacatct tcagatggca tacaacatat gaactttgga 60

gtgg 64

<210> 31

<211> 64

<212> PRT

<213> Eustoma exaltatum

<400> 31

Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Ala

20 25 30

Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr

35 40 45

Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala

50 55 60

<210> 32

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 32

ctgccgctat tttctcgcgg agattgaact tctcagaaat tagcggccgg acatcttcag 60

cgcc 64

<210> 33

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 33

cagcaaattg ttgacggatc tttggcctca atgattgacc cgtggttggc agaaaaaaaa 60

aaaa 64

<210> 34

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 34

ctgcgctaga gcatgctaaa gcactagctg atcaggaatt gcagagaact acggaagaac 60

ttca 64

<210> 35

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 35

ctgcttctca ttttgttgat ttggttaagt gctggctgga gaatgttgaa cagaacccaa 60

gcaa 64

<210> 36

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 36

cagcttgaga tgtgcatatt gatcacagat ctcatgagat tttttcaccc tactatcacg 60

tgtc 64

<210> 37

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 37

ctgcaaaatt tgattgagtc tttggatggc attgaacatc aaggtcattt ggcattcgag 60

acac 64

<210> 38

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 38

ctgcacctca atacagagcc cgggaacatt aaacgttttg aacataatct caccagtgta 60

ttcc 64

<210> 39

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 39

ctgcatatca tggtaatctt gattttgtag gtagagttct gaaagaaggg tatgatgtga 60

atct 64

<210> 40

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 40

cagcaggagc ttgcaagcga agctccagga taagcacggt tcgtggctaa ccacctccgc 60

agaa 64

<210> 41

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 41

ctgcagttat ttaatcaaac tgcctcttta aaaccttgat tcttgactca atgtgagggc 60

tagc 64

<210> 42

<211> 64

<212> DNA

<213> Eustoma exaltatum

<400> 42

ctgcaaatga aaccacaagt taacaaattg ccagattaaa atgatataac tgcaaatgaa 60

acca 64

Claims

1.一种对抽苔的春化处理要求不依赖的观赏性洋桔梗作物植物的生产方法，所述方法包括在观赏性洋桔梗作物植物中引入含有位于Eustoma exaltatum的连锁群2上30cM至40cM处的QTL的遗传元件，其中所述QTL包含至少一个标志物，所述至少一个标志物选自包含SEQ ID NO：3中示出的核酸序列的标志物EG_0075、包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列的标志物S1_74154018和包含SEQ ID NO：40中示出的核酸序列的标志物S1_18474044。

2.权利要求1的方法，其中所述QTL含有包含SEQ ID NO：15中示出的核酸序列的标志物S1_74154018。

3.权利要求1的方法，其中所述标志物位于E.exaltatum连锁群2上的34.5316705cM处。

4.权利要求1的方法，其中包含所述QTL的遗传元件被引入到所述观赏性洋桔梗作物植物的连锁群2中。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中包含引入的QTL的所述观赏性洋桔梗作物植物与缺少引入的QTL的相应观赏性洋桔梗作物植物相比，具有等同的农艺学性状。

6.权利要求1-4任一项的方法，其中包含引入的QTL的所述观赏性洋桔梗作物植物不含源自于E.exaltatum染色体的有害的遗传累赘。