JP6860481B2 - 春化非依存的なリシアンサス植物 - Google Patents

Description

本発明は、抽苔および開花の誘導に低温処理（春化）を必要としない作物のリシアンサス（ユーストマ グランディフロラム（Ｅｕｓｔｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ））植物、ならびに、それを作製するための手段および方法に関する。

リシアンサス（リンドウ科のユーストマ グランディフロラム）は、国際市場では比較的新しい花の作物であり、切り花として、また鉢植えとして、広く利用されている。その天然に存在する植物の一般名称は、テキサスブルーベル、プレイリーローズおよびプレイリーゲンティアンである。リシアンサスは、自家受粉および他家受粉の能力を備えた二倍体の生物であり、商業市場におけるほぼ全ての種子がＦ_１雑種である。Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ種は、北米の大平原諸州の草原に起源を持ち、春または初夏に開花する一年生または二年生と説明されている。ユーストマ属の他の既知の種はＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍだけであり、これは、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍとの他家受粉が可能である。２０世紀後半からの３０年未満の期間の間に、リシアンサスは実質的に無名の植物から世界における切り花用作物のトップ１０のうちの一つとなった。

野生型の花壇用の表現型（bedding phenotype）を現代の切り花用作物へと形質転換する試みは１９３０年代初頭まで遡り、主に日本で行われた。しかし、１９７７年になってやっと、最初のＦ１雑種（１９８４年頃の国際市場に「Ｙｏｄｅｌ」という名称で一連の品種が紹介された）の開発に伴って重大なブレークスルーが起こった。鉢植えまたは花壇用の植物のための、または切り花市場のための、改良品種を目的とした育種プログラムが１９８０年代後半から始まっている。現在、リシアンサス市場では、切り花用の品種に主に焦点が当てられている。

作物植物としてのリシアンサスの導入は遅れており、不適切な生育パターン、花の収量の低さ、均一性の欠如および長い生育期間を含め、栽培上の課題および経済的課題に直面している。この作物への関心が高まっていることから、科学文献が並行して増加している。しかし、この作物は未だに、経済的および栽培的に重要であるものの研究上の大きな関心を持たれない作物である「孤児作物」の花卉栽培の例と考えられている。

限られた研究では、リシアンサスにおける形質遺伝の調査に専念しているが、これらのいずれも、分子情報と遺伝メカニズムを組み合わせたものではなかった。Ｅｃｋｅｒ等（Ｅｃｋｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．２５６：２５３−２５７；Ｅｃｋｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ １９９４．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ７８：１９３−１９７）は、生育速度、葉のサイズ、茎の直径および節の数に対する明確な雑種強勢効果を示した。広範な遺伝的バックグラウンドを有する種々の近交系、Ｆ_１、Ｆ_２およびＢＣ_１の集団で実験が行われた。開花に低温を必要とする遺伝子型と必要としない遺伝子型との間での交配から生じたＦ_１、Ｆ_２およびＢＣ_１の集団の解析に基づいて、種子休眠の遺伝についてのモデルが提唱された。このモデルには、累積的効果を有する６つの二対立遺伝子の遺伝子座が含まれ、これらにおいて、少なくとも９つの「休眠をもたらす（dormancy-conferring）」アレルの存在が、表現型としての種子休眠の誘導に必要である（Ｅｃｋｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ １９９４．Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄ．１１３：３３５−３３９）。

リシアンサスは、条件的な長日植物と考えられており、光周期の影響は軽微であると考えられているものの、実験により、短日が開花に対して遅延効果を有し得ること、および、抽苔に対して負の二次的効果も有し得ることが示されている（Ｈａｒｂａｕｇｈ Ｂ Ｋ．，１９９５．ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ．３０：１３７５−１３７７）。

リシアンサスにおいて生育および開花誘導に影響する主な環境要因は温度である（Ｏｈｋａｗａ Ｋ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ Ｅ．，１９９９．Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃ．４８２：４２３−４２６）。リシアンサスの実生が最初の生育段階で１４日間超、２０℃超の温度に曝されると、ロゼットでの生育が起こり、花茎の伸長が遅延する。ロゼット葉を有する植物は、抽苔することがなく、非常に遅く散発的に開花し、これは、農業生産には適合しない。少なくとも４週間にわたる１５℃未満の低温への曝露（「春化」と呼称されるプロセス）は高温の負の影響を排除することが証明されている（Ｏｈｋａｗａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｓｃｉ．Ｈｏｒｔｉｃ．（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）．４８：１７１−１７６）。ジベレリン酸（ＧＡ）は、リシアンサスを含むいくつかの植物で茎の伸長を調節することによって春化効果において重要な役割を果たすことが見出された（Ｈｉｓａｍａｔｓｕ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｊ．Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔｉｃ．Ｓｃｉ．６７：８６６−８７１）。低温は、アラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびリシアンサスの栄養生長期のロゼット（vegetative rosette）においてＧＡの生合成を開始させＧＡ感受性を高め得る（Ｏｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１６０：１２３７−１２４５）。また、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）も、おそらくＧＡの上流で抽苔の調節に影響することによって、リシアンサスにおける春化への応答において役割を有することが示されている（Ｙａｎａｇｉｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５：１２９−３７）。

春化要求性において役割を果たす可能性があるいくつかの周知の遺伝子のリシアンサスでのホモログが調査されている（Ｎａｋａｎｏ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１４１：３８３−９３）。遺伝子は、アラビドプシスの春化メカニズムにおけるその機能に基づいて選択された。ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｃ（ＦＬＣ）は、ＭＡＤＳボックス転写因子をコードし、春化によって抑制される開花の重要な抑制因子である。ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ（ＦＴ）およびＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＣＯＮＳＴＡＮＳ １（ＳＯＣ１）は、ＦＬＣによって抑制される花成のプロモーターである。リシアンサスの相同遺伝子の機能が、遺伝子組換えアラビドプシス植物においてユーストマの遺伝子を過剰発現させることによって調べられた。春化された植物および春化されていない植物についての種々の組織および時間における発現解析により、ＥｇＦＬＣＬ（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ＦＬＣ−ｌｉｋｅ）が低温によってアップレギュレートされ、従って、低温処理前に豊富に発現しており春化によって発現抑制されるアラビドプシスのＦＬＣとは異なるということが示された。ＥｇＳＯＣ１Ｌ（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ＳＯＣ１−ｌｉｋｅ）およびＥｇＦＴＬ（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ ＦＴ−ｌｉｋｅ）は、春化後の温暖な長日条件によって誘導されるオオムギのＨｖ−ＦＴ１で観察されるのと同様のパターンで、春化後の温かい温度および長日条件によって誘導された（Ｈｅｍｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。これらの発見は、ユーストマにおける春化による開花調節が、アラビドプシス タリアナに関して発展したパラダイムとはかなり異なるということを示唆する（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１、上記のものと同じ文献）。

リシアンサスの若い実生を少なくとも４週間にわたって１５℃未満の温度に曝露させるという要件は、特に他の点ではリシアンサスの切り花の生産に非常に適しているイスラエルのような温暖な気候の国では、時間および資金の面で栽培者には重荷である。

従って、商業的に成功している系統の表現型を維持しつつも春化に非感受性であって抽苔および開花に低温処理を必要としないリシアンサス（ユーストマ グランディフロラム）植物の必要性は未だに満たされておらず、また、そのようなリシアンサス植物を有することは非常に有利であろう。

本発明は、春化要求性が調節された観賞用リシアンサス（ユーストマ グランディフロラム）植物を提供する。具体的には、本発明は、春化に依存せずに抽苔および開花するリシアンサス植物を提供し、これは、農業的な商業用途に非常に適している。

本発明は、観賞用作物であるリシアンサス Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍのゲノム中への野生型ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅｕｓｔｏｍａ ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群（linkage group）（ＬＧ）２に相当する染色体の最小セグメントの遺伝子移入が、この作物植物に必要であることが知られている低温への曝露がなくても抽苔および開花が起こるようにＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの春化要求性を改変したという予想外の発見に部分的に基づく。使用された野生型Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ寄託物（accession）は春化非依存性であり、上記のＱＴＬまたはその一部を有さないＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物では抽苔に必要とされる低温処理を受けなくても抽苔する。

Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのＬＧ−２セグメントは、約２５〜約４５ｃＭの間に位置する少なくとも１つのマーカーに関連するＱＴＬを含む。本発明の遺伝子移入されたＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物は、他の点では、その外観および農業上の要件において選りすぐりの植物と類似する。さらに、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍへのＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ由来のＱＴＬの遺伝子移入は、この種に典型的な２回目の一斉開花（flowering flush）における花茎の数の増加をもたらす。

一態様によれば、本発明は、ユーストマ エグザルタトゥムの連鎖群（ＬＧ）２に由来するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素を含む観賞用ユーストマ グランディフロラム作物植物を提供し、ここで、ＱＴＬまたはその一部は、春化非依存性をＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物に付与する。

特定の実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含むＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物は春化非依存性である。特定の例示的実施形態によれば、春化非依存性のＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍはＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ系統１４＿３０ Ｐ１ＲＩであり、その種子は２０１５年１１月２３日に寄託番号ＮＣＩＭＢ４２４９１でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された。

一部の実施形態によれば、遺伝要素は、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部からなる。

一部の実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の２５〜４５ｃＭの間に広がる区間内に位置する少なくとも１つのマーカーと関連している。一部の実施形態によれば、マーカーは、表１に列挙されるマーカーのいずれか１つである。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の３０〜４０ｃＭの間に広がる区間内に位置する少なくとも１つのマーカーと関連している。一部の実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、配列番号１〜４２のいずれか１つに記載される核酸配列を含む。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。

一部の実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、配列番号３に記載される核酸配列を含む。他の実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、配列番号１５に記載される核酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、配列番号４０に記載される核酸配列を含む。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、マーカーＳ１＿７４１５４０１８と関連している。特定の例示的実施形態によれば、マーカーは、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の位置３４．５３１６７０４６に位置する。一部の実施形態によれば、マーカーは、配列番号１５に記載される核酸配列ＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡＧＧＣＴＣＡＴＡＧＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＡＣＧＴＧＣを含む。

さらなる実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素は、観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの連鎖群２に相当する染色体内に組み込まれる。特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素は、連鎖群２に相当するＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの染色体上の約２５ｃＭ〜約４５ｃＭの位置に組み込まれる。

一部の実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部はさらに、導入されるＱＴＬまたはその一部を有さない対応する観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物における２回目の一斉開花での茎の数と比較して、２回目の一斉開花での花茎の数を増加させる。

特定の実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素を含む観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物は、導入されるＱＴＬまたはその一部を有さない対応する観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物と比較して同等の農学的形質を有する。特定の実施形態によれば、農学的形質は、限定されるものではないが、小花柄の長さ、生育速度、収量、非生物的ストレスに対する耐性および病原体に対する耐性から選択される。特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素は、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの選りすぐりの栽培品種に導入される。本発明のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍは観賞用作物植物であるが特定の系統および／または品種に限定されないということが理解されるべきである。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含むＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの花の小花柄の長さは、導入されるＱＴＬまたはその一部を有さない対応する観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物の小花柄の長さと同等である。

さらに別の実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素を含む観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの染色体に由来する有害な遺伝学的引き込み（genetic drag）を有さない。

特定の実施形態によれば、植物は、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素に関してホモ接合型である近交系植物である。他の実施形態によれば、植物は、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素に関してヘテロ接合型である雑種植物である。ＱＴＬまたはその一部に関してヘテロ接合型である植物は、本明細書に記載されるように、低温処理を受けなくても抽苔できるということが明確に理解されるべきである。

種子、切り枝、および繁殖に使用できる任意の他の植物の部分（単離された細胞および組織培養物を含む）も本発明の範囲内に包含される。上記の種子または他の繁殖用材料から生産された植物は、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部を含むということが理解されるべきである。

本発明は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上に位置するＱＴＬと恒常的に春化されているという表現型との間の、これまでに知られていなかった関連性を開示し、これは、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍのゲノム中に形質転換された際に、導入されるＱＴＬまたはその一部を有さない対応する観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物には必要であることが知られている春化のための低温に曝露されなくても抽苔および開花する能力をもたらす。

従って、別の態様によれば、本発明は、春化非依存性を付与する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、核酸配列は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物の連鎖群２に相当する染色体のセグメントに由来し、このＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物は、抽苔および開花に春化を必要としない。

特定の実施形態によれば、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのセグメントは、２５ｃＭと４５ｃＭとの間に位置する核酸配列またはその一部を含む。特定の実施形態によれば、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのセグメントは、表１に列挙される遺伝子マーカーのいずれか１つの核酸配列を含む。他の実施形態によれば、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのセグメントは、３０ｃＭと４０ｃＭとの間に位置する核酸配列またはその一部を含む。これらの実施形態によれば、セグメントは、配列番号１〜４２のいずれか１つに記載される核酸配列またはそれらの組み合わせを含む。

特定の例示的実施形態によれば、核酸配列は、配列番号１５に記載される核酸配列を含む、遺伝子マーカーＳ１＿７４１５４０１８の配列を含む。

さらに別の態様によれば、本発明は、抽苔に関して春化要求性のない観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍを作製するための方法であって、
ユーストマ エグザルタトゥムの連鎖群２に由来するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素をＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍに導入することを含み、
ＱＴＬまたはその一部がＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物に春化非依存性を付与し、それにより、開花に関して春化要求性のない観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍを作製する、
方法を提供する。

特定の実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含むＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物は春化非依存性である。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含む春化非依存性のＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物はＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ系統１４＿３０ Ｐ１ＲＩであり、その種子は２０１５年１１月２３日に寄託番号ＮＣＩＭＢ４２４９１でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された。

一部の実施形態によれば、遺伝要素は、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部からなる。

一部の実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の約２５〜約４５ｃＭに位置する少なくとも１つのマーカーまたはそれらの任意の組み合わせと関連している。一部の実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝子マーカーは、表１に列挙される群から選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の約３０〜約４０ｃＭに位置する少なくとも１つのマーカーまたはそれらの任意の組み合わせと関連している。これらの実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝子マーカーは、配列番号１〜４２のいずれか１つに記載される核酸配列を含む。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、配列番号１５に記載される核酸配列を含む、マーカーＳ１＿７４１５４０１８と関連している。

特定の実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素は、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの連鎖群２に相当する染色体中に導入される。特定の例示的実施形態によれば、セグメントは、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの連鎖群２の約２５ｃＭ〜約４５ｃＭの位置に導入される。

ＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素をＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍに導入するために、当業者に公知の任意の方法を使用してよい。

特定の例示的実施形態によれば、遺伝要素は、遺伝子移入によって導入される。

他の実施形態によれば、遺伝要素は、形質転換によって導入される。

特定の実施形態によれば、春化処理に依存せずに抽苔するＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物の選択は、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物のゲノム中の本明細書に記載されるＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ由来のＱＴＬまたはその一部の存在を検出することによって行われる。ＱＴＬまたはその一部を検出するために、当技術分野で公知の任意の方法を使用してよい。特定の例示的実施形態によれば、検出は、本明細書に記載されるようなＱＴＬ内に位置するマーカーを識別することによって行われる。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明らかになるであろう。

図１は、出蕾初期（段階１）から老化（段階９）まで定義される９つの異なる発達段階を示す。写真は、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍのピンク親株とＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍとの間での交配から得られたＦ_１雑種の花を示す。 図２は、抽苔せずにロゼットの状態である植物（図２Ａ）および抽苔した植物（図２Ｂ）を示す。 図２は、抽苔せずにロゼットの状態である植物（図２Ａ）および抽苔した植物（図２Ｂ）を示す。 図３は、花の種々の表現型を示す。図３Ａ：雄しべ数の変化。 図３は、花の種々の表現型を示す。図３Ｂ：柱頭裂片上の変化。 図３は、花の種々の表現型を示す。図３Ｃ：小花柄の長さ。 図３は、花の種々の表現型を示す。図３Ｄ：萼片の長さ。 図４は、２種の組換え近交系（ＲＩ）マッピング集団の作製の概略図を提示する。 図５は、組み合わされた組換え近交系リシアンサス集団の推定マーカー連鎖を示す。線は連鎖（高いＬＯＤスコアまたは低い組換え割合）を示し、バックグラウンドは、連鎖していないマーカー（低いＬＯＤスコアまたは高い組換え割合）を示す。 図６は、４５００個のＳＮＰマーカーおよび６９個の連鎖群から構成されるリシアンサスの連鎖地図を示す。 図７はマンハッタンプロットを示す：シーケンシングによる遺伝子型決定（genotype-by-sequencing）（ＧＢＳ）のデータを用いて構築した組み合わされたホモ接合型ＲＩ連鎖地図上のリシアンサスロゼット形成ＱＴＬ。 図８は、ＧＢＳデータを用いて構築した組み合わされたホモ接合型ＲＩ連鎖地図の連鎖群２上のリシアンサスロゼット形成ＱＴＬの詳細図を示す。 図９は、抽苔している植物の平均数についての、Ｓ１＿７４１５４０１８のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型である植物（１）とＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのＳ１＿７４１５４０１８アレルに関してホモ接合型である植物（３）との比較を示す。 図１０はマンハッタンプロットを示す：シーケンシングによる遺伝子型決定（ＧＢＳ）のデータを用いて構築した組み合わされたヘテロ接合型ＲＩ連鎖地図上のリシアンサスロゼット形成ＱＴＬ。 図１１は、ＧＢＳデータを用いて構築した組み合わされたヘテロ接合型ＲＩ連鎖地図の連鎖群２上のリシアンサスロゼット形成ＱＴＬの詳細図を示す。 図１２は、抽苔している植物の平均数についての、Ｓ１＿７４１５４０１８のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型である植物（１）とＳ１＿７４１５４０１８のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルを１つおよびＳ１＿７４１５４０１８のＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍアレルを１つ含むヘテロ接合型植物（２）との比較を示す。 図１３は、春化非依存性アレルを含む雑種のヘテロ接合型植物（Ｆ１ｐと命名）の抽苔および春化依存性の商業品種の抽苔を示す。図１３Ａ：抽苔の割合。 図１３は、春化非依存性アレルを含む雑種のヘテロ接合型植物（Ｆ１ｐと命名）の抽苔および春化依存性の商業品種の抽苔を示す。図１３Ｂ：開花しているＦ１ｐ植物の写真。 図１３は、春化非依存性アレルを含む雑種のヘテロ接合型植物（Ｆ１ｐと命名）の抽苔および春化依存性の商業品種の抽苔を示す。図１３Ｃ：ロゼット葉表現型を有するＲｏｓｉｔａ３ Ｇｒｅｅｎ植物の写真。 図１４は、Ｓ１＿７４１５４０１８のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型である植物（１）とＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍアレルに関してホモ接合型である植物（３）との間での、２回目の一斉開花における植物あたりの茎の平均数の比較を示す。 図１５は、抽苔している植物の平均数についての、ＥＧ＿００７５のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型である植物（１）とＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのＥＧ＿００７５アレルに関してホモ接合型である植物（３）との比較を示す。 図１６は、抽苔している植物の平均数についての、Ｓ１＿１８４７４０４４のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型である植物（１）とＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍのＳ１＿１８４７４０４４アレルに関してホモ接合型である植物（３）との比較を示す。

定義
用語「植物」は、本明細書において、その最も広い意味で使用される。この用語はまた、植物の発育の任意の段階で存在する構造に大規模に分化する複数の植物細胞も指す。このような構造には、限定されるものではないが、根、茎、シュート、葉、花、花弁、果実等が包含される。特定の例示的実施形態によれば、（特にユーストマ グランディフロラムに関連して）本明細書で互換的に使用される用語「観賞用植物」または「観賞用作物植物」は、その切り花のための商業栽培に好適な系統および園芸植物または鉢植え植物として好適な系統を指す。

本明細書で使用される場合、用語「植物の部分」は通常、単一細胞および細胞組織（それからリシアンサス植物が再生し得る、植物中で完全なままである植物細胞、細胞塊および組織培養物など）を含め、リシアンサス植物の部分を指す。植物の部分の例としては、限定されるものではないが、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、シュート、および種子に由来する、単一細胞および組織；ならびに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、シュート、若枝、根茎、種子、プロトプラスト、カルス等が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「抽苔」は、栄養生長期またはロゼット期から花序期または生殖生長期への移行を指す。

本明細書で使用される場合、用語「春化」は、それによって一部の植物における花の誘導が、植物を低温に一定期間曝露させることで促進されるプロセスを指す。特定の実施形態によれば、リシアンサス（ユーストマ）に関連する場合、用語「春化」は、最初の生育段階にある実生を２０℃未満（時には１８℃未満または１５℃未満）の低温に曝露させることを含む。用語「最初の生育期」は、最初の葉の出現から少なくとも約３週間または約４週間またはそれ以上の期間を指す。本明細書で使用される場合、用語「春化非依存性」または「春化非依存的」は、本質的に春化処理がなくても抽苔および開花する、商業栽培のための当技術分野で公知の最適条件下で栽培されるリシアンサス植物に適用される。

用語「遺伝子座（locus）」（複数形「loci」）は、本明細書では、所与の遺伝子が所与の種の染色体上において占める位置と定義される。

本明細書で使用される場合、用語「連鎖群」は、同一染色体上に位置する遺伝子または遺伝形質の全てを指す。連鎖群内では、互いに十分に近接している遺伝子座同士は遺伝的交雑において連鎖を示すことになる。乗り換えの確率は染色体上での遺伝子間の物理的距離に伴って上昇するため、連鎖群内で互いの位置がはるかに離れている遺伝子同士は、直接的な遺伝学的試験において検出可能な連鎖を全く示さない可能性がある。用語「連鎖群」は、大抵の場合、染色体の割り当てがまだ行われていない遺伝系において連鎖した挙動を示す遺伝子座を指すために使用される。従って、本発明の背景において、用語「連鎖群」は、染色体（の物理的実体）と同義である。

用語「ＱＴＬ」は、本明細書では、当技術分野で認識されている意味で使用される。用語「春化非依存性を付与するＱＴＬ」は、春化非依存性をコードする少なくとも１つの遺伝子または少なくとも調節領域（すなわち春化非依存性に関与する１つ以上の遺伝子の発現を制御する染色体の領域）と関連している、ユーストマの特定の染色体上に位置する領域を指す。その遺伝子の表現型の発現は、例えば、低温処理を必要としない抽苔および／または２回目の一斉開花における花の数の増加であってよい。ＱＴＬは、例えば、その産物が春化非依存性を付与する１つ以上の遺伝子を含んでよい。あるいは、ＱＴＬは、例えば、その産物が植物のゲノム中の他の遺伝子座の遺伝子の発現に影響を与えることで春化非依存性を付与する調節遺伝子または調節配列を含んでよい。本発明のＱＴＬは、１つ以上の分子ゲノムマーカーを用いてそれぞれのＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ寄託物のゲノム中におけるその遺伝学的位置を示すことによって定義されてよい。１つ以上のマーカーは次に、特定の遺伝子座を示す。遺伝子座間の距離は通常、同一染色体上の遺伝子座間での乗り換えの頻度により測定され、センチモルガン（ｃＭ）として表される。２つの遺伝子座が離れるにつれて、それらの間で乗り換えが起こる可能性が高くなる。逆に、２つの遺伝子座が近接している場合、それらの間では乗り換えが起こりにくい。一般に、１センチモルガン（Ｋｏｓａｍｂｉの地図関数（ｃＭ））は、遺伝子座（マーカー）間での１％の組換えに概ね相当する。ＱＴＬを複数のマーカーによって示すことができる場合、端点のマーカー間の遺伝学的距離がＱＴＬのサイズを示す。

用語「天然の遺伝的バックグラウンド」は、本明細書では、ＱＴＬの元の遺伝的バックグラウンドを示すために使用される。このようなバックグラウンドは、ユーストマ エグザルタトゥム（特に、開花に春化を必要としないＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）のゲノムである。従って、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ系統１４＿３０ Ｐ１ＲＩは、本発明のＱＴＬの天然の遺伝的バックグラウンドを代表する。別の種のユーストマの対応する染色体上の同じ位置または異なる位置へのＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２に由来するＱＴＬまたはその一部を含むＤＮＡの導入を伴う方法は、その天然の遺伝的バックグラウンドにない当該ＱＴＬまたはその一部をもたらすことになる。

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ接合型」は、異なるアレルが相同染色体上の対応する遺伝子座に存在する場合に存在する遺伝学的状態を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「ホモ接合型」は、同一のアレルが相同染色体上の対応する遺伝子座に存在する場合に存在する遺伝学的状態を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「雑種」は、遺伝的に異なる２個体の間での交配（限定されるものではないが、２種の近交系統の間での交配を含む）の任意の子孫を指す。

本明細書で使用される場合、用語「近交系」は、実質的にホモ接合型である個々の植物または植物系統を意味する。

用語「遺伝子移入」、「遺伝子移入された」および「遺伝子移入する」は、ある種、品種または栽培品種の遺伝的バックグラウンドから別の種、品種または栽培品種のゲノム中への遺伝子座または形質遺伝子座の所望のアレル（複数可）の伝播に対して適用される。１つの方法では、所望のアレル（複数可）は、２つの親の間での性的交配によって遺伝子移入でき、ここで、親の一方は、そのゲノム中に所望のアレルを有する。所望のアレルは、所望の遺伝子または複数の遺伝子、マーカー遺伝子座、ＱＴＬ等を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「集団」は、共通の遺伝学的起源を有する遺伝学的に不均一な植物のコレクションを指す。

用語「遺伝子操作」、「形質転換」および「遺伝子改変」は全て、本明細書では、別の生物のＤＮＡ（通常は染色体ＤＮＡまたはゲノム）中への単離されたクローン化遺伝子の導入に関して、または植物ゲノム内での遺伝子の改変に対して、使用される。

用語「分子マーカー」または「ＤＮＡマーカー」は、本明細書では互換的に使用され、核酸配列の特徴における差異を可視化するための方法において使用される分子指標を指す。このような指標の例は、特定の遺伝学的位置および染色体上での位置を規定する、多様性アレイ技術（diversity array technology）（ＤＡｒＴ）マーカー、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカー、配列特徴的増幅領域（sequence-characterized amplified regions）（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（cleaved amplified polymorphic sequence）（ＣＡＰＳ）マーカー、もしくはアイソザイムマーカー、または本明細書に記載されるマーカーの組み合わせ、である。本発明において使用されるＤＮＡマーカーは大抵、シーケンシングによる遺伝子型決定（ＧＢＳマーカー）である。

一態様によれば、本発明は、ユーストマ エグザルタトゥムの連鎖群２に由来するＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素を含む観賞用作物ユーストマ グランディフロラム植物を提供し、ここで、ＱＴＬまたはその一部はＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物に春化非依存性を付与する。

本発明は、商業的に適した切り花用作物を生産するためには生育段階初期における低温条件が必須であることがこれまで知られていたリシアンサスにおいて春化非依存性に関連する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を初めて開示する。ＱＴＬは、リシアンサスの非商業種であるユーストマ エグザルタトゥムにおいて見出された。膨大な数の表現型およびそれらに関連する遺伝子型の解析の結果、春化の必要性を本質的に失わせるＱＴＬは、春化非依存性の表現型を有するＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物の連鎖群２上に位置することが見出された。本発明の過程で使用された植物は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ系統１４＿３０ Ｐ１ＲＩであった。この系統の種子は、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関であるＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ，スコットランド）に寄託されている。寄託日は２０１５年１１月２３日であった。種子の寄託物は、本出願の出願日前に存在していた材料の代表的なサンプルである。ＮＣＩＭＢ Ｉ．Ｄ．番号はＮＣＩＭＢ ４２４９１である。

特定の実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の２５〜４５ｃＭの間に広がる区間内に位置する少なくとも１つのマーカーと関連している。特定の実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、以下の表１に提示されるマーカーから選択される。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。

特定の例示的実施形態によれば、春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群２上の３０〜４０ｃＭの間に広がる区間内に位置する少なくとも１つのマーカーと関連している。特定の実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、以下の表２に列挙されるマーカーから選択される。これらの実施形態によれば、少なくとも１つのマーカーは、配列番号１〜４２のいずれか１つに記載される核酸配列を含む。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。

遺伝単位「ＱＴＬ」は、本発明による、リシアンサス植物が抽苔および開花するために春化を必要とするという定量可能な表現型形質に直接関連するゲノム上の領域を示す。ＱＴＬは遺伝単位「遺伝子」とは異なるものであり、ＱＴＬ上において、その表現型の発現は、予測不能な多数の要因に左右される。本発明で同定された、いくつかのＱＴＬマーカーは、公知の遺伝子内に位置することが見出されている（表１を参照のこと）。これらの遺伝子は、本発明によって初めて開示される春化非依存性というＱＴＬの遺伝性形質において役割を果たすかもしれないし、果たさないかもしれない。

特定の形質は、特定のマーカーまたは特定の複数のマーカーと関連している。本発明において開示されるマーカーは、ＱＴＬの位置を示し、さらに、植物における春化非依存性という特定の表現型形質の存在と相関する。ゲノム上でのＱＴＬの位置を示す連続したゲノムマーカーは原則的には任意または非限定的であるということが留意されるべきである。一般に、ＱＴＬの位置は、表現型形質との統計学的相関を示すマーカーの連続した連なりによって示される。その連なりの外側にマーカーが見出されると（すなわち、そのマーカーが非常に離れているために、そのマーカーとＱＴＬとの間の領域で組換えが高頻度に起こり、その結果、マーカーの存在が表現型の存在と統計学的に有意なようには相関しない、ということを示す特定の閾値未満のＬＯＤスコアを有するマーカー）、ＱＴＬの境界が設定される。従って、その特定された領域内に位置する他のマーカーによってＱＴＬの位置を示すことも可能である。本発明の例示的マーカーのＬＯＤスコアは、上記の表２に示されている。

本発明のさらなる実施形態によれば、連続したゲノムマーカーはまた、個々の植物におけるＱＴＬの存在（従って表現型の存在）を示すために使用されてもよい。すなわち、それらは、マーカー支援選抜（ＭＡＳ）法において使用できる。原則として、潜在的に有用なマーカーの数は限られているが、多数のマーカーが使用されてもよい。当業者であれば、本出願において開示されるものに加えて、さらなるマーカーを容易に同定できる。ＱＴＬと連鎖している任意のマーカー（例えば、特定の閾値を越える確立したＬＯＤスコアを有しており、そのため、そのマーカーとＱＴＬとの間での組換えが交配において全くまたはほぼ全く起こらないということを示すマーカーが広がるゲノム領域の物理的境界内に含まれるもの）ならびにＱＴＬに対して連鎖不平衡である任意のマーカーが、ＭＡＳ法において使用されてよい。従って、ＱＴＬに関連するものとして本発明において同定されたマーカー（マーカーＳ１＿７４１５４０１８を含む）は、ＭＡＳ法における使用に好適なマーカーの単なる例である。さらに、ＱＴＬ（または、その特定形質付与部分）が、別の遺伝的バックグラウンドに（すなわち、別の植物種のゲノム中に）遺伝子移入される場合、その後、その形質が子孫に存在するにもかかわらず一部のマーカーが子孫においてもはや見出されないことがある。これは、このようなマーカーが元の親系統のみにおいてＱＴＬの特定形質付与部分を表すゲノム領域の外側にあるということ、および、新しい遺伝的バックグラウンドが、異なるゲノム構成を有するということを示す。

特定の実施形態によれば、本発明のＱＴＬと関連しているマーカーは表１に列挙される。他の実施形態によれば、本発明のＱＴＬと関連しているマーカーは表２に列挙され、これらは、配列番号１〜４２に記載される核酸配列を有する。一部の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、配列番号３に記載される核酸配列を有するマーカーＥＧ００７５、配列番号１５に記載される核酸配列を有するマーカーＳ１＿７４１５４０１８、および配列番号４０に記載される核酸配列を有するマーカーＳ１＿１８４７４０４４からなる群より選択されるマーカーと関連している。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、マーカーＳ１＿７４１５４０１８と関連している。特定の実施形態によれば、マーカーは、配列番号１５に記載される核酸配列を含む。

作物種Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍのゲノム中へのＱＴＬの遺伝子移入は、最初に低温に曝露されなくても抽苔して花茎を発達させる植物をもたらした。予想外にも、この遺伝子移入は、生育パターンおよび生じた花に対して有害な作用をほとんどまたは全く及ぼさなかった。さらに、この遺伝子移入は、春化要求性に影響を与えただけでなく、リシアンサスの商業栽培において一般的に誘導される２回目の一斉開花における植物あたりの花茎の数の増加をもたらした。まとめると、農業栽培に絡む費用を低減し、収量を上げるという、これら２つの形質は、大きな商業的価値をもたらす。

リシアンサスの抽苔に関しての春化の必要性を失わせるＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素の導入は、当業者に公知の任意の方法で行われてよい。作製されたＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍにおいて、ＱＴＬを含むセグメントは、その天然のバックグラウンドにないということが明白に理解されるべきである。

本明細書に開示されるように春化要求性を低減または排除できる本発明のＱＴＬまたはその任意の部分を含む核酸（好ましくはＤＮＡ）配列が、観賞用Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍを作製するために使用されてよい。特定の実施形態によれば、ＱＴＬは、適切な抽苔および開花に春化を必要とするＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ（典型的には、商業栽培に好適な品種）に導入される。本発明の教示によれば、上記の核酸配列は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍドナー植物に由来する。

春化非依存性を付与するＱＴＬまたはその一部は、当技術分野で公知の任意の方法を用いてドナー植物から単離されてよい。

春化非依存性を付与するＱＴＬ配列またはその一部は、当業者に公知の任意の方法によってレシピエントのリシアンサス植物に導入されてよい。特定の実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部は、ＱＴＬドナーをレシピエントのリシアンサス（特にＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）と交配させることによって（すなわち遺伝子移入によって）導入できる。あるいは、ＱＴＬまたはその一部を含む単離された核酸配列は、以下で説明されるように形質転換によって導入できる。任意選択で、形質転換の後に、ＱＴＬを含む子孫であって春化非依存性を示す子孫の選抜がなされる。

本発明のＱＴＬは単離されてよく、その核酸配列は、当業者に公知の任意の方法によって決定されてよい。例えば、ＱＴＬまたはその春化非依存性付与部分を含む核酸配列がＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍドナー植物から、上記植物のゲノムを断片化して本明細書に開示される上記ＱＴＬを示す１つ以上のマーカーを有する断片を選択することによって単離されてよい。その後に、または代替的に、上記植物から得られたゲノム核酸試料またはゲノム断片から上記ＱＴＬを含む核酸配列を増幅するために、上記ＱＴＬを示すマーカー配列（またはその一部）が、例えばＰＣＲを用いて、増幅プライマーとして使用されてよい。次に、増幅された配列が、単離されたＱＴＬを得るために精製されてよい。次に、ＱＴＬの核酸配列および／またはそれに含まれる任意のさらなるマーカーの核酸配列が、標準的な配列決定法によって取得されてよい。

本発明の特定の態様によれば、春化非依存性を付与する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで、核酸配列は、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物の連鎖群２に相当する染色体のセグメントに由来し、このＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物は、抽苔および開花に春化を必要としない。

単離された核酸配列を用いた植物の形質転換は一般に、植物細胞において機能するであろう発現ベクターの構築を伴う。本発明の教示によれば、このようなベクターは、本発明のＱＴＬまたはその一部を含む。典型的には、ベクターは、調節エレメントの制御下にあるか調節エレメントに機能可能に連結されている、ＱＴＬまたはその一部を含む。特定の実施形態によれば、調節エレメントは、プロモーター、およびエンハンサーおよび翻訳終結配列からなる群より選択される。ベクター（複数可）はプラスミドの形態であってよく、リシアンサス植物に核酸配列を形質転換するのに好適であることが当技術分野で知られている形質転換法を用いる抽苔に春化を必要としない遺伝子組換えＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物を作製するための方法において、単独で、または他のプラスミドと組み合わせて、使用され得る。

発現ベクターは、マーカーを含む形質転換された細胞をネガティブ選択によって（その選択マーカー遺伝子を含まない細胞の増殖を阻害することによって）、あるいはポジティブ選択によって（そのマーカー遺伝子がコードする産物をスクリーニングすることによって）、回収することを可能にする、調節エレメント（プロモーターなど）に機能可能に連結された少なくとも１つのマーカー（レポーター）遺伝子を含み得る。植物の形質転換のための数多くの一般的に使用される選択マーカーが当技術分野で公知であり、これらには、例えば、抗生物質または除草剤であってよい選択用化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に非感受性である変化した標的をコードする遺伝子が含まれる。マンノース選択などの、いくつかのポジティブ選択の方法が当技術分野で公知である。あるいは、形質転換された植物におけるＱＴＬの存在は、ＱＴＬ関連マーカーをプローブとして用いて特定される。

本発明による核酸配列を用いて植物細胞を形質転換するための方法は、当技術分野で公知である。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」または「形質転換する」は、外来の核酸配列（ベクターなど）がレシピエント細胞に侵入してレシピエント細胞を、形質転換された遺伝子改変細胞または遺伝子組換え細胞に変えるプロセスを表す。形質転換は、安定（核酸配列は、植物のゲノム中に組み込まれ、そのために、安定した遺伝性の形質を示す）または一過性（核酸配列は、形質転換された細胞によって発現されるが、そのゲノム中には組み込まれず、そのために、一過性の形質を示す）であってよい。典型的な実施形態によれば、本発明の核酸配列は、植物細胞に安定に形質転換される。

単子葉植物および双子葉植物の両方に外来遺伝子を導入する様々な方法が存在する（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ．１９９１．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７６）。

植物のゲノムＤＮＡ中への外因性ＤＮＡの安定な組み込みの主要な方法には、２つの主な手法が包含される：

アグロバクテリウムによる遺伝子導入：アグロバクテリウムによる系には、植物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる画定されたＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用が含まれる。植物組織への植菌の方法は、植物の種類およびアグロバクテリウム送達系に応じて異なる。広く使用されている手法は、植物全体への分化の開始のための良好な源となる任意の組織外植片を用いて実施できるリーフディスク法である（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５， １−９，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。補足的手法は、減圧浸潤と組み合わせたアグロバクテリウム送達系を利用する。

直接的核酸導入：植物細胞内への直接的核酸導入には様々な方法が存在する。エレクトロポレーションでは、プロトプラストが短時間、強力な電場に曝露され、小さな孔が開いてＤＮＡの侵入が可能となる。マイクロインジェクションでは、マイクロピペットを用いて核酸を細胞内に直接、機械的に注入する。微粒子照射では、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子などの微小発射体上に核酸が吸着され、この微小発射体が細胞または植物組織中へと物理的に加速される。核酸を植物に導入するための別の方法は、標的細胞の超音波処理によるものである。あるいは、植物内に発現ベクターを導入するためにリポソームまたはスフェロプラストの融合が利用されている。

リシアンサスの標的組織の形質転換の後に、上述の選択マーカー遺伝子の発現が、当技術分野において現在周知である再生と選択の方法を用いる形質転換された細胞、組織および／または植物の優先的選択を可能にする。

あるいは、本発明の教示によるＱＴＬまたはその一部は、春化非依存性を付与する核酸配列を事前に単離することなく形質転換されてもよい。

特定の例示的実施形態によれば、ＱＴＬまたはその一部の導入は、抽苔および開花に春化を必要とするＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍにＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの連鎖群のセグメントを遺伝子移入することによって実施される。

特定の実施形態によれば、方法は、
ａ．抽苔および開花に低温処理を必要とするＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物の親系統と、抽苔および開花に低温処理を必要としないＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物と、を提供する工程であって、マーカーＳ１＿７４１５４０１８に関連するＱＴＬをＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物が含む、工程；
ｂ．Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物の親系統をＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物と交配させてＦ_１後代植物を作製する工程；
ｃ．Ｆ_１後代植物を自家受粉させてＦ_２集団を作製する工程；
ｄ．Ｆ_２集団をＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの親系統と少なくとも１回戻し交配させて、戻し交配集団を作製する工程；
ｅ．マーカーＳ１＿７４１５４０１８と関連するＱＴＬを含むＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物を戻し交配集団から選択する工程；
を含む。

特定の実施形態によれば、Ｆ_２集団をＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの親系統と戻し交配させる工程（ｄ）を５回繰り返して、戻し交配集団５を作製する。

一部の実施形態によれば、マーカーＳ１＿７４１５４０１８と関連するＱＴＬを含むＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物は、抽苔および開花に春化を必要としない。

マーカーＳ１＿７４１５４０１８と関連するＱＴＬを含むＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物の選択は、当技術分野で公知の任意の方法によって実施されてよい。

一部の実施形態によれば、ＱＴＬを含む植物の選択は、本明細書に記載されるＱＴＬと関連するマーカーの存在を検出することを含む。

検出の方法は、
上記のＱＴＬに連鎖しているマーカー（好ましくは、上記のＱＴＬと連鎖していることが本明細書において特定されたマーカーから選択されるもの）の核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを提供する工程、
上記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、戻し交配集団の植物から得られたゲノム核酸と接触させる工程、および
上記のゲノム核酸への上記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションの存在を検出する工程、
を含んでよい。

あるいは、ＱＴＬの核酸配列が決定されたならば、当業者は、上記のＱＴＬの核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズできる特異的ハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチドを設計してよく、春化非依存性であると思われるリシアンサス植物において本発明のＱＴＬの存在を検出するための方法において、このようなハイブリダイゼーションプローブを使用してよい。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」なる表現は、その条件下でプローブまたはポリヌクレオチドが、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的の部分配列（subsequence）にハイブリダイズするが他の配列には本質的に全くハイブリダイズしないであろう条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列に左右され、環境が違えば異なるであろう。より長い配列は、より高い温度にて、特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ．１９９３ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｐａｒｔ Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されている。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨにおける特定の配列についての熱的融点（thermal melting point）（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、その温度において、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下での）温度である（標的配列が過剰に存在すると、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占拠される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ ナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ ナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件であろう。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されてもよい。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のものであることが多い：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳで４２℃にてインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃にてインキュベート、ならびに０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６５℃にて洗浄。ＰＣＲの場合、低ストリンジェントな増幅には、約３６℃の温度が典型的である。但し、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃〜４８℃の間で変動してよい。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するためのさらなる指針が、多数の参考文献に記載されている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．１９９５）。

以下の実施例は、より完全に本発明の一部の実施形態を説明するために提示される。しかし、これらは、本発明の広い範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変形および改変を容易に考案できる。

材料および方法

植物材料
ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ． Ｓｍｉｔｈ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍのリシアンサスプロジェクトには、６つの異なる育種企業の５０種を超える商業用雑種に由来する数百種の異なる育種系統および遺伝資源、ならびに様々な供給源から取得された野生型のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍおよびＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍが含まれる。

実生の作製および植物の生育条件
特にＨｉｓｈｔｉｌ Ｌｔｄ．ＩｓｒａｅｌのＮｅｈａｌｉｍ苗畑（イスラエル）で、３６０または４０６の標準的なリシアンサス播種用トレイにおいて播種を実施した。Ｈｉｓｈｔｉｌ Ｌｔｄ．Ｃｏｍｐａｎｙ（イスラエル）の施設で実生を生育させた。２０１０年まではＮｅｈａｌｉｍのＨｉｓｈｔｉｌ苗畑で実生を生育させ、２０１１年からはＳｕｓｙａ（イスラエル）で生育させた。標準的な商業用雑種が生育する条件の下で実生を生育させ、標準的なリシアンサスの低温（春化）要求性を満たした。

典型的には、Ｒｅｈｏｖｏｔ（イスラエル）に位置するｔｈｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍの農場において選択および種子生産を実施した。開花期は必ず、播種の時期に応じて春から夏（４月から８月）に生じた。標準的なリシアンサス用プロトコルに従って、ならびに生育条件および生育段階に合わせて、潅水および施肥を実施した。特定の症状発現の後にのみ、および開花の開始前にのみ、作物保護処理を実施した。表現型の特徴付けに使用される植物において、最初の花を折り取った。２回目の開花期に収穫を実施した。

花の受粉および種子の取扱い
自家受粉：
１．段階３（蕾が膨らみ始める；花弁が萼片よりも高い）〜段階６（外に出た雄しべ；閉じた柱頭；図１）の間の花を紙袋で覆った。
２．花を覆ってから５〜１４日後に袋を開けて手作業で自家受粉を実施した。受粉の後、再び花を紙袋内に封じた。

手作業での自家受粉によって生産された種子のみが、真の自家受粉種子であるとみなされた。

他家受粉：
１．段階３の花（蕾が膨らみ始める；花弁が萼片よりも高い；図１）を手作業で開いて、葯を除去した。除雄された花をそれぞれ、紙袋内に封じた。
２．葯の除去から７〜１４日後にそれぞれの花の紙袋を開けて、雄親の葯を柱頭に付着させることによって、あるいは７０％エタノールで滅菌したブラシであって花粉で覆ったブラシを用いて、柱頭に花粉を手作業で塗布した。手作業での受粉の後、再び花を紙袋内に封じた。

（自家受粉および他家受粉の両方について）受粉から５０〜７５日後に、果実を紙袋内に回収し、３７〜４５℃のインキュベーターまたは乾燥器の中に入れて乾燥を完了させた。播種するまで、±７℃および湿度３０％にて種子を保存した。

表現型の特徴付け
本明細書に記載される形質は、多数の形質を特徴付けるという、表現型に関する大規模な試みに基づいており、その試みに基づいて、遺伝的集団の特徴付けのための詳細な表現型カタログを作成するために１１３の形質が選択された。

種々の表現型の特徴を規格化するために、いくつかの用語についての共通言語を定義する必要があった。

花に関する段階：図１に示されるように、出蕾初期から老化までの９つの異なる発達段階が定義された。
段階１：閉じた蕾。萼片は花弁よりも高い（長い）。
段階２：蕾の膨化の開始。萼片および花弁は、ほぼ同じ長さである。
段階３：大きな蕾。萼片は花弁よりも短い。膨らんだ蕾。
段階４：開き始めた花弁。雄しべは完全には成熟していない。
段階５：花が開き始める。花弁同士が分かれている。雄しべは外に出ていない。柱頭は閉じている。
段階６：開いた花。外に出た雄しべ。閉じた柱頭。
段階７：開花期。外に出た雄しべ。開いた柱頭。
段階８：花が萎れ始める。花弁が色あせ、閉じ始める。
段階９：老化。

分枝：２つ以上の葉の対を有する分枝のみが分枝と定義された。

花蕾：苞葉から生じて１ｃｍ超の長さである花蕾のみが花蕾と定義された。

開花時期：最初の花が発達段階６（開いた花；外に出た雄しべ；閉じた柱頭；図１）に達した日。

収穫時期：２番目の花が発達段階７（開花期；図１）に達した日。

抽苔：栄養生長から開花への植物の移行は、茎の出現および伸長によって特定された（図２）。抽苔の度合は、３つの異なる時点によって定義された。
（ａ）抽苔１８週［抽苔（１８）］：播種から１８週間後における系統ごとの抽苔した植物の割合。
（ｂ）抽苔２０週［抽苔（２０）］：播種から２０週間後における系統ごとの抽苔した植物の割合。
（ｃ）抽苔２２週［抽苔（２２）］：播種から２２週間後における系統ごとの抽苔した植物の割合。

２回目の一斉開花に関連した形質：最初の一斉開花の花を収穫した後の植物であって２回目の一斉開花に至るまでの生育の間の植物を表すいくつかの形質。
（ａ）２回目の一斉開花の生存率［ＳＦ．ｓｕｒｖｉｖａｌ］：系統ごとの、収穫後に生き延びて２回目の一斉開花があった植物の割合。
（ｂ）植物あたりの２回目の一斉開花時の茎数［ＳＦ．Ｓ＿ＰＬＮ］：２回目の一斉開花における植物あたりの分枝（brunches）の数。
（ｃ）２回目の一斉開花におけるロゼット形成率［ＳＦ．ｒｏｓｅｔｔｉｎ］：系統ごとの、最初の収穫の後にロゼットを示して抽苔しなかった植物（図２Ａ）の割合。
（ｄ）２回目の一斉開花までの日数［ＳＦ．ｄａｙｓ］：系統ごとの、最初の収穫から２回目の収穫（２回目の一斉開花時の収穫）までの最小日数。

花の器官のサイズ：花の種々の器官のサイズは、ローラー（２０１１年中）を用いて、または画像解析（２０１２年中）によって、測定された。
（ａ）小花柄の長さ［Ｐｅｄｉｃｅｌ．ＬＮ］：全ての時期においてローラーによって測定された、主茎上の花を保持する最後の節間の長さ（図３Ｃ）。

４つの主な実験を通じて表現型解析を実施した。

２０１１年、温室：プラスチック製の温室内で加熱することなく８リットルのペール容器において植物を水耕栽培した。使用した栽培用培地は「Ｏｄｅｍ９３」（Ｔｕｆｆ Ｍａｒｏｍ Ｇｏｌａｎ Ｌｔｄ．、イスラエル）（凝灰岩が２／３、泥炭が１／３）であった。それぞれの組換え近交系統（ＲＩＬ）を、温室内にランダムに配置された３つの容器に植え付けた。容器はそれぞれ、５株のＲＩＬ複製体（RIL replicate）を含んだ（ＲＩＬごとに合計１５株の複製体）。さらに、ファミリーレベルでの育種および特徴付けのために、単一の容器に各ＲＩＬ由来の６株の複製体を植え付けた。温室の総面積は１５０ｍ^２であった。植え付けの日付は２０１１年２月１５日であった。開花は２０１１年４月２２日に開始した。

２０１２年、温室：２０１１年の実験に関して記載したのと同一の様式および同じ温室で植物を栽培した。この年の実験は戻し交配系統（ＢＣＬ）であるＦ５ＢＣ１を含んだため、スペースの制約が原因で、各系統を２つの容器にのみ植え付けた（系統ごとに合計１０株の複製体）。植え付けの日付は２０１２年１月１２日であった。開花は２０１１年４月１５日に開始した。

２０１２年、ネットハウス：ネットハウス内で、粗い凝灰岩層の上の薄い凝灰岩層という２相の栽培用培地を含む大きな一列のプラスチック容器において植物を水耕栽培した。単一の場所に、系統ごとに６株の複製体を植え付けた。１ｍ^２あたり３０株の植物という密度で植物を栽培した。ネットハウスの総面積は１００ｍ^２であった。植え付けの日付は２０１２年１月１２日であった。開花は２０１２年５月２２日に開始した。

２０１３年、ＳＨＴＩＬ ＮＥＴＯ温室：プラスチック製の温室内で、泥炭を含む大きな実生トレイ（１．５インチ）において植物を栽培した。１７７種の異なる系統（系統ごとに合計１１株の複製体）。播種の日付−２０１３年７月２９日；抽苔の終了−２０１３年１０月２０日。

発芽から収穫までの栽培期間全体を通じて表現型解析を実施した。主な解析は、開花期に焦点を当て、以下のように実施された：祝日等の特定のイベントは別として週に３回（日曜日、火曜日および木曜日）、各植物で最初に開いた花を記録し、撮影し、取り除いた。生育し続けて収穫時期（上記で定義した通り）に達した植物を収穫した。収穫した植物の表現型決定は、収穫の日およびその翌日に実施した。収穫された植物に関して実施されなかった他の表現型決定解析ならびに花瓶に入れた切り花の表現型決定、および育種作業は、収穫日とは別の日に実施した。

ＤＮＡ抽出
新鮮な若葉を採取し、直ちに液体窒素で凍結させた。凍結させた組織は、ＤＮＡ抽出まで−８０℃に保持した。標準的なマイクロプレップのプロトコル（Ｆｕｌｔｏｎ Ｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．１３：２０７−２０９）を用いてＤＮＡ抽出を実施した。

ＱＴＬ解析
それぞれの集団および実験について別々に、平均化した列データに対してＱＴＬマッピング解析を実施した。ＲＩＬにおける特定のマーカーについてのヘテロ接合体遺伝子型は、マーカーの解析から除外した。実験における系統ごとの形質スコアを平均化することによって、順序（ordinal）形質および二元（表現型の有無）形質の両方を、名称を付けた性質を有する形質に変換した。Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定を実施して各形質の分布の正規性仮定を調べ、形質を、正規と非正規の表現型分布を示すものとして分類した。正規および非正規の表現型分布のための方法（Ｂｏｒｍａｎ Ｋ Ｗ ａｎｄ Ｓｅｎ Ｓ．，２００９．Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＱＴＬ ｍａｐｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｒ／ｑｔｌ １ｓｔ ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））に従ってＬＯＤスコアを算出した。一般に、正規分布の形質については、一方向ＡＮＯＶＡ（マーカー回帰）に類似するｌｏｇ_１０尤度比検定を適用し、非正規分布の形質については、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の統計量を２で割ったもの（ｌｎ１０）を用いた。計算は全て、Ｒ統計ソフトウェアによって行われた。ＲＩＬにおけるホモ接合体野生型アレルまたはＢＣＬにおけるヘテロ接合体アレルに起因する差の百分率としてＱＴＬの効果（Ｅｆｆｅｃｔ）を算出した。

式中：μ（ｇｒａ）＝ＱＴＬに関してホモ接合体のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ植物の形質平均値；μ（ｅｘｓ）＝ＱＴＬに関してホモ接合体のＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ植物の形質平均値；μ（ｈｅｔ）＝ＱＴＬに関してヘテロ接合体の植物についての形質平均値。

ＱＴＬの割り当ては、いくつかの段階で行われた：
１．複数の集団のうちの１つにおける複数の実験のうちの少なくとも１つでＬＯＤスコアが２．５という閾値を超える、表現型と遺伝子型との関連性が選択された。
２．ＱＴＬについての以前の発見（Ｌａｎｄｅｒ Ｅ Ｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｒｋ Ｎ Ｊ．，１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１８１）：２０３７−２０４８．）のおかげで閾値を低くすることができるため、段階１で選択された関連性について１を超えるＬＯＤスコア（＜０．０３１のｐ値）を示す実験は全て、ＱＴＬを示す実験と断定された。
３．いくつかの隣接するマーカーが同じ形質と相関していた場合、その形質についての主なＱＴＬは、連鎖が観察された実験の数に基づいて、およびＬＯＤスコアによって、選択された。そのＱＴＬが１つのネットハウス実験だけで検出された場合、そのＱＴＬは除かれた。これは、この実験が、実験設計（系統ごとに１プロットのみ）に起因する生物学的反復数の少なさおよび／またはｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓの蔓延に影響される植物の数の多さの影響を受け、従ってその信頼性が低いためである。

ＱＴＬ地図については、いくつかの密接に関連した形質が同じ遺伝子座に関連している場合にＱＴＬを表すように形質を選択した。割り当てられた形質は、より多くの実験において有意性を示した形質であったか、有意な実験が同数の場合には、より高い平均ＬＯＤスコアを有する形質であった。いくつかの有意な実験の場合において、地図上に示されるべき効果を以下の順序で選択した：１．白集団、２０１２；２．白集団、２０１１；３．ピンク集団、２０１２；４．ピンク集団、２０１１。

実施例１：組換え近交系統（ＲＩＬ）
２００６年中に、商業用雑種ならびにＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍおよびＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの野生型寄託物に由来する種々の純系間で１４０超の交配を実施した（ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ（イスラエル）のコレクション）。２００７年におけるＦ_１集団およびそれらの親の表現型の特徴付けは、本明細書に提示される研究で使用される２種の種間組換え近交系統（ＲＩＬ）の選択を可能にした。その選択は、主に（Ａ）表現型から観察される親系統のホモ接合性；（Ｂ）Ｆ_１の均一性；および（Ｃ）親系統の表現型の特徴、に基づいていた。最終的に、２種の遺伝学的遺伝子移入集団を徹底的調査のために選択した。

Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍとピンク花および白花の栽培バックグラウンドに由来する２種のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍの系統との間での交配から２種のＲＩＬ集団を作製した。親系統の主な特徴は以下の通りである。
Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ：単一の小さな紫色の花、株立ちで生長、遅い開花、強い概日リズム挙動、ロゼットを形成する傾向が無い細い葉および細い茎。交配に使用された寄託物は非常に高い均一性を示し、これは、それがホモ接合型の純系であることを意味した。
Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍピンク：中程度のサイズの単一の花、強いピンク色、弱い頂芽優勢、短い節間、花の収量が多い、ロゼット化傾向、および、全体として典型的な夏品種の生育（良好な熱耐性、遅い生育）。
Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ白：大きな八重咲きの白い花、多くの花弁、強い頂芽優勢、花の収量が少ない、および、全体として典型的な冬品種の生育（抽苔に中程度の温度を必要とする；速い生育）。
戻し交配系統（ＢＣＬ）を作製するために、Ｆ_５ＲＩＬ系統をそれらのＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ親株と戻し交配させた。２種のＲＩＬの構築についての概要を図４に示す。

実施例２：表現型のデータ
２つの場所において、２つの別個の後代について表現型観察を実施した。２０１１年には、１つの場所における２つのＲＩＬ集団を特徴付けした。２０１２年には、２つの場所における２つのＲＩＬ集団および２つのＢＣＬ集団を特徴付けした（表３）。実験は必ず親系統およびＦ_１後代を含み、統計解析は、ランダムに植え付けられた複数の反復物に基づいていた（上述の材料および方法を参照のこと）。

実施例３：遺伝子地図
ＲＩＬ集団のそれぞれについて、利用可能な遺伝子マーカーを用いて２つの遺伝子地図を構築した。

Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈのサービスとして利用可能なシーケンシングによる遺伝子型決定（ＧＢＳ）のプラットフォーム（Ｅｌｓｈｉｒｅ Ｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．２０１１．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１９３７９）を用いてＤＮＡ多型データを作成した。このようなプラットフォームを用いて、マーカー検出およびスコア付けを同時に行い、厳密な品質管理を通過した数千個のＳＮＰを検出した。ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ＆Ｍｅｄｉｃａｌ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＫａｒｌ Ｗ．Ｂｒｏｍａｎによって開発およびコンパイルされ、およびＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ＃２１４（Ｉｎ：Ｂｒｏｍａｎ Ｋ Ｗ ａｎｄ Ｓｅｎ Ｓ Ａ． Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＱＴＬ Ｍａｐｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｒ／ｑｔｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００９）に記載された、Ｒ／ｑｔｌの遺伝子地図構築ツールを用いてＳＮＰをマッピングした。マーカーの全てのペアについての推定組換え割合（左上の三角形）およびＬＯＤスコア（右下の三角形）のプロットを作成した（図５）。約４５００種のマーカーが、隣接するマーカー同士の間の最長距離が組換え価２０％未満となるように決定されたマーカーから構成される６９種の連鎖群をもたらした（図６）。このカットオフは、連鎖群を誤って統一するのを防ぐために選択された。

実施例４：春化非依存性を付与するＱＴＬの特定
複雑な表現型の種々の構成要素の詳細を表示して複雑な隠れた生物学的事実を明らかにする一連のプログラムを発達させたＰｈｅｎｏｍｅ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）（Ｚａｍｉｒ Ｄ．，２０１３．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．１１：ｅ１００１５９５）のバイオインフォマティクス機能を用いてＱＴＬを特定した。Ｐｈｅｎｏｍｅ Ｎｅｔｗｏｒｋｓは、適切な統計モデルを集団の遺伝学的構造に合致させる多数のＲ関数およびアルゴリズムを利用する。組み合わされた両方の集団に由来するホモ接合型ＲＩにのみ基づく２０１３年のＳｈｔｉｌ Ｎｅｔｏでの実験において解析されたように、春化のための主要なＱＴＬ（Ｌｏｄ２０）は連鎖群２上に位置するということが図７から明らかである。連鎖群２の詳細な図（図８）は、ＱＴＬの効果が、その連鎖群上の３０〜４０ｃＭの間の区間内においてピークを迎えることを示す。

抽苔の表現型に影響を及ぼす最も強力なマーカーの１つがＳ１＿７４１５４０１８（配列番号１５に記載される核酸配列を有する）であった。図９に示されるように、遺伝子型１（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型）を有する植物のグループでは約１５％の植物が抽苔を示し、残りの８５％の植物がロゼットを形成して開花しなかったのに対し、遺伝子型３（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍアレルに関してホモ接合型）を有するグループでは９０％近い植物が抽苔した。これは、連鎖群２上でのＱＴＬの位置を裏付ける。表４は、効果の再現性を示すホモ接合型ＲＩについて実施された全ての実験からの抽苔データの概要を提示する。位置３０．５０４６９９２に位置する遺伝子マーカーＥＧ＿００７５（配列番号３に記載される核酸配列を有する）について図１５に示されるように、および位置３８．２０１４３９２に位置する遺伝子マーカーＳ１＿１８４７４０４４（配列番号４０に記載される核酸配列を有する）について図１６に示されるように、特定されたＱＴＬの端の近傍に位置するマーカーでも同様の結果が得られた。

予想外にも、ＱＴＬを春化非依存性と結びつける非常に類似した観察結果が、ヘテロ接合型ＲＩ雑種で見出された。この場合には、ＲＩとそれぞれのＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ親株との雑種の種子を発芽させた。図１０は、春化についての主要なＱＴＬ（Ｌｏｄ２０）が、ホモ接合型集団の場合（図７）に示されたように、連鎖群２上に位置することを示し、ＱＴＬの効果は、その連鎖群上の３０〜４０ｃＭの間の区間内においてピークを迎えた（図１１）。図１２は、遺伝子型１（Ｓ１＿７４１５４０１８のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型）を有する植物では約４０％の植物が抽苔し、残りの６０％の植物がロゼットを形成して開花しなかったのに対し、遺伝子型２を有するグループ（Ｓ１＿７４１５４０１８のＥ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルを１つおよびＳ１＿７４１５４０１８のＥ．ｅｘａｌｔａｔｕｍアレルを１つ含むヘテロ接合型植物）では９０％近い植物が抽苔したということを示す。表５は、効果の再現性を示すヘテロ接合型ＲＩを用いて実施された全ての実験からの抽苔データの概要を提示する。

これらの結果は、ホモ接合型の状態の場合にのみ有効であることが示されていた、これまでに知られている春化関連遺伝子とは逆に、春化に対する非感受性と関連するＱＴＬが優性であるということを明確に実証する。

この発見は、ファイトトロンにおいて高温条件（２８℃を１２時間および３４℃を１２時間という１日のサイクル）下で３ヵ月間、Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍの春化非依存性アレルに関してヘテロ接合型である雑種植物（Ｆ１ｐと命名）を栽培することによって、さらに確かめられた。主要な商業品種（Ｒｏｓｉｔａ Ｗｈｉｔｅ、Ｒｏｓｉｔａ２ Ｐｕｒｐｌｅ、Ａｕｂｅ Ｐｉｎｋ Ｆｌｕｓｈ、Ｐｉｃｃｏｌｏ２ Ｈｏｔ Ｌｉｐｓ、Ｒｏｓｉｔａ３ Ｇｒｅｅｎ、Ｅｏｓｉｔａ３ ＰｉｎｋおよびＴｚｉｌｉ）を対照として使用した。図１３で明確に示されるように、春化に依存する品種では最大で約２８％が抽苔したのに対し、８０％超のヘテロ接合型雑種植物が抽苔した。

実施例５：さらなる表現型に対する、春化非依存性を付与するＱＴＬの効果
野生型または祖先の植物から有益な形質を何度も遺伝子移入しようとする試みは、ドナーから受け入れ側の植物への望ましくない形質の遺伝学的引き込みが著しいという問題に直面する。しかし、本発明の植物では、望ましくない形質の引き込みを無視できただけでなく、ＱＴＬが、リシアンサスの生育パターンに典型的である２回目の一斉開花における茎の数にポジティブな影響を与えた。図１４は、遺伝子型１（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアレルに関してホモ接合型）を有する植物では２回目の一斉開花における植物あたりの茎が平均で２．５本に過ぎないのに対し、遺伝子型３（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍアレルに関してホモ接合型）の植物では２回目の一斉開花における植物あたりの茎が平均で３．５本であることを示す。

ＱＴＬは、ＱＴＬを含む植物において僅かに増大するという小花柄の長さに対する僅かに負の影響を有した。このような増大は、壊れやすい花を弱体化させるため、望ましくない。しかし、この影響は、小花柄が非常に短いという適切な遺伝的バックグラウンドを有するリシアンサス植物にＱＴＬを導入することで克服される可能性がある。

特定の実施形態についての上記の説明は、本発明の一般的性質を極めて完全に明らかにし、その結果、他者は現在の知識を適用することで、過度の実験を伴うことなく、および包括的概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を容易に改変し、および／または様々な用途に適合させることができる。従って、このような適合および改変は、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内に包含されるべきであり、また、そのように意図される。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的としており、限定を目的としたものではないということが理解されるべきである。開示される様々な機能を実行するための手段、材料、および工程は、本発明から逸脱することなく様々な代替的形態をとってよい。

Claims (19)

1. ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２に由来するＱＴＬを含む遺伝要素を含む観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物であって、
   前記ＱＴＬが、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２上の約３０ｃＭ〜約４０ｃＭの間に位置する少なくとも１つのマーカーを含み、
   前記少なくとも１つのマーカーが、配列番号３に記載される核酸配列を含むマーカーＥＧ＿００７５、配列番号１５に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿７４１５４０１８、および配列番号４０に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿１８４７４０４４からなる群より選択され、
   前記ＱＴＬが、前記観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物に春化非依存性を付与する、
   観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
2. 前記遺伝要素が、春化非依存性を付与する前記ＱＴＬからなる、請求項１に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
3. 前記植物が、前記ＱＴＬを有さない観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物では抽苔に必要とされる低温処理を受けなくても抽苔する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
4. 前記ＱＴＬが、配列番号１〜２、４〜１４、１６〜３９および４１〜４２のいずれか１つに記載される核酸配列を含む少なくとも１つの追加的なマーカーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
5. 前記少なくとも１つのマーカーが、配列番号１５に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿７４１５４０１８である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
6. 前記マーカーが、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２上の位置３４．５３１６７０４６に位置する、請求項５に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
7. 前記遺伝要素が、前記観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物の連鎖群２の中に組み込まれている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
8. 前記ＱＴＬがさらに、導入されたＱＴＬまたはその一部を有さない対応する観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物における２回目の一斉開花の間の茎の数と比較して、２回目の一斉開花の間の花茎の数を増加させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
9. 前記植物が、導入されたＱＴＬまたはその一部を有さない対応する観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物と比較して同等の農学的形質を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
10. 前記植物が、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）染色体に由来する有害な遺伝学的引き込みを有さない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
11. 前記植物が、春化非依存性を付与する前記ＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素に関してホモ接合型である近交系植物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
12. 前記植物が、春化非依存性を付与する前記ＱＴＬまたはその一部を含む遺伝要素に関してヘテロ接合型である雑種植物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物の種子であって、
    前記種子から生育した植物が、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２に由来するＱＴＬを含む遺伝要素を含み、
    前記ＱＴＬが、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２上の約３０ｃＭ〜約４０ｃＭの間に位置する少なくとも１つのマーカーを含み、
    前記少なくとも１つのマーカーが、配列番号３に記載される核酸配列を含むマーカーＥＧ＿００７５、配列番号１５に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿７４１５４０１８、および配列番号４０に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿１８４７４０４４からなる群より選択され、
    前記ＱＴＬが、前記植物に春化非依存性を付与する、
    種子。
14. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の植物から得られた細胞または組織培養物であって、
    前記細胞または組織培養物から発育した植物が、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２に由来するＱＴＬを含む遺伝要素を含み、
    前記ＱＴＬが、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２上の約３０ｃＭ〜約４０ｃＭの間に位置する少なくとも１つのマーカーを含み、
    前記少なくとも１つのマーカーが、配列番号３に記載される核酸配列を含むマーカーＥＧ＿００７５、配列番号１５に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿７４１５４０１８、および配列番号４０に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿１８４７４０４４からなる群より選択され、
    前記ＱＴＬが、前記植物に春化非依存性を付与する、
    細胞または組織培養物。
15. 抽苔に関して春化要求性のない観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物を作製するための方法であって、
    （ａ）ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２に由来するＱＴＬを含む遺伝要素を観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物に導入するステップであって、
    前記ＱＴＬが、ユーストマ エグザルタトゥム（Ｅ．ｅｘａｌｔａｔｕｍ）の連鎖群２上の約３０ｃＭ〜約４０ｃＭの間に位置する少なくとも１つのマーカーを含み、
    前記少なくとも１つのマーカーが、配列番号３に記載される核酸配列を含むマーカーＥＧ＿００７５、配列番号１５に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿７４１５４０１８、および配列番号４０に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿１８４７４０４４からなる群より選択され、
    前記ＱＴＬが、前記観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物に春化非依存性を付与する、
    ステップ；および
    （ｂ）前記観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物のゲノムにおける前記少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップ；
    を含み、それにより、抽苔および／または開花に関して春化要求性のない観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物を作製する、方法。
16. 前記遺伝要素が、春化非依存性を付与する前記ＱＴＬからなる、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＱＴＬが、配列番号１〜２、４〜１４、１６〜３９および４１〜４２のいずれか１つに記載される核酸配列を含む少なくとも１つの追加的なマーカーを含む、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つのマーカーが、配列番号１５に記載される核酸配列を含むマーカーＳ１＿７４１５４０１８である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記ＱＴＬを含む前記遺伝要素が、前記観賞用ユーストマ グランディフロラム（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）作物植物の連鎖群２の中に導入される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。

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