CN116200423B - 大豆GmGS1β2基因在调控大豆农艺和品质性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆GmGS1β2基因在调控大豆农艺和品质性状中的应用，所述大豆农艺和品质性状包括大豆种子的蛋白质含量，和/或百粒重，和/或根瘤数目。本发明中揭示了通过调控大豆中GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达，或者利用基因编辑改变GmGS1β2基因功能变异位点，能够改变大豆作物的农艺和品质性状。通过利用大豆GmGS1β2基因编码序列构建转基因大豆，其中，过表达GmGS1β2基因的大豆的百粒重显著增加、蛋白质含量显著提升和根瘤数显著增加；特别利用基因编辑改变GmGS1β2基因功能变异位点对大豆产量和品质的影响。通过调控大豆GmGS1β2基因在大豆中表达或者改变GmGS1β2基因功能变异位点能够实现改良大豆，调节大豆产量的目的，为大豆改良育种提供了新的方向。

Description

大豆GmGS1β2基因在调控大豆农艺和品质性状中的应用

技术领域

本发明属于大豆育种技术领域，具体涉及大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白在调控大豆农艺和品质性状中的应用。

背景技术

大豆的营养价值极高，富含植物蛋白、脂肪以及多种矿质营养元素，是世界重要的粮油经济作物之一，其中，提高大豆产量以及提升大豆品质是当前大豆产业发展中亟需解决的问题。

常用的提高大豆产量，改良大豆重要农艺性状和品质性状主要是通过传统育种的方式，其技术繁琐，时间一般在5-7年，甚至更长。而国内外利用转基因改良农作物经济性状的技术主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，釆用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。

其中，谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)作为植物氮素同化途径中的关键酶，主要负责将各种来源的无机氮转化为有机形式的谷氨酰胺，进而参与蛋白质等生物大分子的合成。豆科植物通过其特有的共生固氮方式在根瘤内将空气中的分子氮转化为无机氮，其中，GS在同化由根瘤类菌体产生的无机氮的过程中发挥了关键作用。具体的说，GS主要负责将根瘤中的铵同化成谷氨酰胺，直接或间接为植物提供氮素，同时还避免了氨积累对细胞造成毒害，因此豆科植物的GS受到了研究者的特别关注。已有研究表明，大豆根瘤共生膜上的Nod26蛋白主要负责对NH₃进行转运，而GS1可以与Nod26蛋白的C端结合，从而同化根瘤固氮产生的NH₄ ⁺转化为谷氨酰胺供给宿主植物利用。

目前大豆中已有多个与驯化相关的基因，比如控制裂荚的基因SHAT；控制结荚习性的基因Dt1；控制开花周期的基因E1等被报道。大豆种子蛋白含量、百粒重、根瘤数目是大豆产量相关的重要农艺性状和品质性状，对于大豆的经济价值来说具有重要意义。目前，尚未有对于控制这些相关种子性状的基因及在大豆农艺和品质性状改良上的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明首次揭示了通过在大豆中定向调控大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达水平或者利用基因编辑改变GmGS1β2基因功能变异位点，可显著调节大豆作物的百粒重、蛋白含量和/或根瘤数等重要的大豆的农艺和品质性状，从而实现改良大豆，增加大豆产量的目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白在调控大豆农艺和品质性状中的应用，所述大豆农艺和品质性状包括大豆种子的蛋白质含量，和/或百粒重，和/或根瘤数目。

本发明中首次揭示了通过调控大豆中GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达，能够改变大豆作物的农艺和品质性状。其中，GmGS1β2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的；GmGS1β2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的。具体的说，通过利用大豆GmGS1β2基因编码序列构建转基因大豆，其中，过表达GmGS1β2基因的大豆的百粒重显著增加、蛋白质含量显著提升和根瘤数显著增加；或者，通过GmGS1β2基因编码区内一处SNP非同义突变位点单碱基突变，获得突变类型GmGS1β2-A，同样能够使得大豆的百粒重、籽粒蛋白质以及根瘤数显著增加，其中，该SNP非同义突变位点为大豆基因组版本Glycine maxWm82.a2.v1的Chr18:3450376(G/A)。

本发明进一步提供了大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的上调分子的应用，用于：

(i)改良大豆的农艺和品质性状；

(ii)制备改良大豆农艺和品质性状的制剂或组合物；

或者，(iii)制备农艺和品质性状改良的大豆；

其中，所述改良大豆农艺和品质性状包括：(i)增加百粒重，和/或(ii)增加种子的蛋白质含量，和/或(iii)增加根瘤数目。

其中，本文中所述的上调分子包括：

与大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白相互作用，并提高其表达量和/或活性的上调分子；

或者，过表达大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达盒或表达构建物。

本发明进一步提供了一种制剂或组合物，包括大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的上调分子，还包括任意农学上可接受的载体或辅料。这里所述的任意农学上可接受的载体或辅料具体可提及的实例包括但不限于添加剂、粘结剂和/或保护剂等，具体可根据制剂或组合物的剂型进行调整，故这里不再具体阐述。

本发明中提供的制剂或组合物的应用，主要是用于改良大豆农艺和品质性状，其中，所述改良大豆农艺和品质性状包括：(i)增加百粒重，和/或(ii)增加种子的蛋白质含量，和/或(iii)增加根瘤数目。

本发明进一步提供了一种改良大豆农艺和品质性状或者制备农艺和品质性状改良的大豆的方法，包括步骤：

在大豆中提高GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达量和/或活性；其中，所述农艺和品质性状改良包括：(i)增加百粒重，和/或(ii)增加种子的蛋白质含量，和/或(iii)增加根瘤数目。

进一步方案，所述的提高GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达量和/或活性包括：

以与大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白相互作用的上调分子进行调控，从而提高大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达量和/或活性；

或者，在大豆中过表达大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白。

本发明进一步提供了一种转基因大豆的制备方法，将大豆GmGS1β2基因导入大豆细胞或大豆组织中，再将被转化的大豆细胞或大豆组织培育成大豆，使得所述GmGS1β2基因在大豆中过表达，得到农艺和品质性状改良的转基因大豆；

其中，所述农艺和品质性状改良包括：(i)增加百粒重，和/或(ii)增加种子的蛋白质含量，和/或(iii)增加根瘤数目。

进一步方案，所述转基因大豆采用的转基因受体为中品661。

本发明进一步提供了一种转基因大豆，采用如前所述的制备方法制得。

本发明进一步提供了一种单碱基编辑材料，通过CRISPR/Cas9技术获得GmGS1β2基因编码区内存在一处SNP非同义突变位点定向突变得到，所述SNP非同义突变位点为大豆基因组版本Glycine max Wm82.a2.v1的Chr18:3450376，多态性为G或A。在本发明的具体的实施例中，将这两种突变类型分别命名为GmGS1β2-G与GmGS1β2-A。

本发明的有益效果如下：

本发明中首次发现通过将大豆GmGS1β2基因在大豆中过表达或者利用基因编辑实现GmGS1β2基因特定位点的功能碱基变异，可显著改善大豆的农艺和品质性状，比如，提高百粒重、提高蛋白质含量、提高根瘤数目等。大豆GmGS1β2基因对大豆种子的百粒重、蛋白质含量和/或根瘤数目具有调控作用。因此，通过调控大豆GmGS1β2基因在大豆中过表达能够实现改良大豆，增加大豆产量的目的，为大豆改良育种提供了新的方向。

附图说明

图1为实施例2中通过画叶法鉴定转基因阳性植株；

图2为实施例3中转基因阳性植株的PCR鉴定结果，图中M：DNA maker(100～600bp)，1为非转基因野生型，2为GmGS1β2转基因大豆；

图3为实施例4中通过qRT-PCR验证法分析转基因阳性植株中GmGS1β2基因的表达量，图中WT为对照(非转基因野生型)；GmGS1β2-OE为过表达转基因大豆；

图4和图5分别为实施例5中大豆百粒重和蛋白质含量的方差分析结果，图中WT为对照(非转基因野生型)；GmGS1β2-OE为过表达转基因大豆；

图6和图7分别为实施例5结瘤表型分析中大豆结瘤数目对比结果，图中WT为对照(非转基因野生型)；GmGS1β2-OE为过表达转基因大豆；

图8和图9分别为实施例7结瘤表型分析中大豆结瘤数目对比结果，图中GmGS1β2-G为对照，GmGS1β2-A单碱基突变材料；

图10和图11分别为实施例7大豆百粒重和蛋白质含量分析中单碱基突变大豆对比结果，图中GmGS1β2-G为对照，GmGS1β2-A单碱基突变材料。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法(如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等编著，第三版，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商、产品说明书中所建议的条件)，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1GmGS1β2转基因大豆的构建

本实施例以“中品661”为受体，采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法构建大豆转基因材料，获得GmGS1β2转基因大豆。具体的构建方法可参见引文周航,陈福禄,傅永福,等.过表达GmAP1.2转基因大豆的遗传转化及植株发育特性[J].核农学报,2018,32(5):7.中所记载的，这里不再具体阐述。

同时，以非转基因的“中品661”品种作为野生型。

实施例2画叶法鉴定转基因阳性植株

本实施例中采用画叶法对GmGS1β2转基因大豆进行鉴定，具体步骤如下：

取大豆的两片真叶全展后，先用记号笔对主叶脉一侧的半片叶进行标记，再用稀释2000倍的Basta除草剂涂抹另外半片叶，一周后观察叶片对除草剂的反应。

结果如图1中所示的。通过图1中的结果可以看出，由于转基因阳性植株成功转入了bar基因，叶片涂抹Basta除草剂后不会受到影响，而非转基因植株的叶片涂抹除草剂后会变黄。

实施例3转基因阳性植株的PCR鉴定

大豆基因组DNA的提取

本实施例中采用CTAB法提取大豆基因组DNA，具体步骤如下：

(1)在2mL离心管中加入适量磨碎后的样品，加入800μL CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴锅10min，每3min上下翻转一次；

(2)加入800μL核酸提取液(24：1)，振荡1min后，12000rpm离心5min，吸取上清液600μL(不能吸取到其他层)转入新的1.5mL离心管；

(3)加入等体积异丙醇(预冷)，上下翻转10次左右，静置2min，12000rpm离心5分钟，弃上清；

(4)加入500μL 70％乙醇(预冷)，用枪头轻轻吹打清洗DNA絮状沉淀(注意不能将沉淀吹散)，12000rpm离心2分钟，弃乙醇；

(5)通风橱中风干30min，加入100μL ddH₂O溶解；

(6)使用紫外可见分光光度计检测DNA纯度和浓度，置于-20℃冰箱保存。

在获得转GmGS1β2基因植株，后经多年繁种，以T5代的植株DNA为模板进行PCR扩增

(1)依据GmGS1β2基因及其编码蛋白的序列设计引物。

Primer F：CATGATTTTATTATTTTTTTGTCATTTTA(SEQ ID No.3)；

Primer R：TTTTTTACCGTAAAACTTAAGAATCGTGTA(SEQ ID No.4)。

(2)以提取的大豆基因组DNA为模板，通过PCR对转基因植株中的bar基因进行定性检测，PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

PCR扩增后，PCR扩增产物使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像分体系统观察目的基因的扩增情况。

结果如图2中所示的。通过图2可以看出，以基因组DNA为模板，转基因阳性植株通过PCR扩增会出现bar基因条带，而非转基因植株则无法扩增出条带。

实施例4qRT-PCR验证法分析GmGS1β2基因在植株中的表达量

(1)植物总RNA的提取：RNA提取所用的所有试剂耗材均是无菌无RNase的，研砵、研磨棒和镊子等均清洗干净晾干后，用锡箔纸包裹后放入烘箱中120℃灭菌3h。实验台桌面、移液枪、手套等用酒精喷洒消毒。使用RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒提取植物RNA，详细试验步骤参照试剂盒使用说明书。并使用紫外可见分光光度计检测RNA纯度和浓度。

(2)反转录cDNA的合成：RNA提取完成后，使用PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒进行反转录cDNA的合成，详细试验步骤参照试剂盒使用说明书。使用紫外可见分光光度计检测cDNA纯度和浓度，并加入适量ddH₂O稀释至20ng/μl。

(3)设计引物

Real-time Primer F：GTGGAAGCCATGAGCAAAACT(SEQ ID No.5)；

Real-time Primer R：CGAGGGAAAGGAATAGAAAACA(SEQ ID No.6)。

(4)使用Universal/>qPCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR验证，分析GmGS1β2基因在植株中的表达量，其中，qRT-PCR反应体系如下：

qRT-PCR反应程序如下：

结果如图3中所示的。通过图3可以看出，用半定量PCR检测发苗15天的转基因T3代中GmGS1β2基因在根中的表达情况。qRT-PCR的验证结果显示GmGS1β2基因在转基因阳性植株中的相对表达量是野生型植株中的6.37倍。

实施例5GmGS1β2转基因大豆的农艺性状、结瘤表型分析

1、产量相关性状的测定

取10个大豆单株(T5代)，分别测量各产量性状取其均值，测定指标参考《大豆种质资源描述规范和数据标准》，具体的说，使用SC-G型万深自动考种分析及千粒重软件系统测定大豆籽粒的百粒重；使用波通DA7200近红外分析仪测定大豆籽粒的蛋白质含量。

结果如图4和图5中所示的，可以看出，GmGS1β2转基因大豆的蛋白质含量和百粒重数目相对于非转基因品种野生型显著增加，说明在大豆中过表达GmGS1β2基因，能够增加大豆的蛋白质含量和百粒重。

2、结瘤表型分析

(1)根瘤菌的培养：在超净工作台中吸取20mL大豆根瘤菌USDA205母液涂布于YMA固体培养基上，28℃倒置活化培养3-4d后，取少量活化后的菌落接种于2mL YMA液体培养基中，28℃振荡(200rpm)培养1-2d，之后吸取1mL培养后的菌液接种于20mL YMA液体培养基中，28℃振荡(200rpm)培养3-4d，最后将扩大培养后的根瘤菌菌液于4℃条件下5000rpm离心10min，并用无菌蒸馏水重悬至OD₆₀₀＝0.6。

(2)根瘤菌的接种：将T5代GmGS1β2基因过表达转基因大豆和非转基因品种野生型在温室条件下进行根瘤菌接种，大豆萌发10天后，将培养并活化好的根瘤菌以每株5mL的量轻轻浇灌在大豆幼苗根系周围，接种28天后将植物根部用清水洗净，之后取根和根瘤样品于液氮中速冻后保存于-80℃冰箱中。其中，温室材料为：将营养土与蛭石按1：3混合均匀，装入花盆中并浇水至吸水饱和，挑选无虫咬、无损伤、大小一致、种皮完整且质量良好的大豆种子，播种于花盆中，覆膜后置于温室中进行培养，萌发后选取长势一致的幼苗进行移栽，后考种、统计分析大豆农艺性状。

结果如图6和图7中所示的，可以看出，GmGS1β2基因过表达转基因大豆的根瘤数目相对于非转基因品种野生型显著增加，说明在大豆中过表达GmGS1β2基因，能够增加大豆的根瘤数目。

实施例6GmGS1β2基因单碱基突变的基因编辑大豆的构建

本实施例构建获得了GmGS1β2基因编辑材料转基因大豆，其具体的构建方法可参见引文Michno JM,Wang X,Liu J,Curtin SJ,Kono TJ,Stupar RM.CRISPR/Casmutagenesis of soybean and Medicago truncatula using a new web-tool and amodified Cas9 enzyme.GM Crops Food.2015；6(4):243-52.doi:10.1080/21645698.2015.1106063.PMID:26479970；PMCID:PMC5033229.中所记载的，这里不再具体阐述。

实施例7GmGS1β2基因单碱基突变的基因编辑大豆的表型

对实施例6中GmGS1β2基因单碱基突变的基因编辑大豆产量相关性状进行测定，具体的测定方法参考实施例5，结果如图8-11中所示的。

通过图8和图9可以看出，可以看出，GmGS1β2基因单碱基突变的基因编辑大豆GmGS1β2-A的根瘤数目相对于GmGS1β2-G野生型显著增加；此外，通过图10和图11可以看出，GmGS1β2-A的百粒重和籽粒蛋白质含量相对于GmGS1β2-G野生型显著增加，这说明在大豆中GmGS1β2基因，在调控根瘤数目、百粒重和籽粒蛋白质含量上有重要的作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的上调分子的应用，其特征在于，用于：

（i）改良大豆的农艺和品质性状；

（ii）制备改良大豆农艺和品质性状的制剂或组合物；

或者，（iii）制备农艺和品质性状改良的大豆；

其中，所述改良大豆农艺和品质性状是指增加根瘤数目；所述上调分子为过表达大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达盒或表达构建物。

2.一种制剂或组合物的应用，其特征在于，用于改良大豆农艺和品质性状，所述改良大豆农艺和品质性状是指增加根瘤数目；

所述制剂或组合物包括大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的上调分子，所述上调分子为过表达大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达盒或表达构建物。

3.一种改良大豆农艺和品质性状或者制备农艺和品质性状改良的大豆的方法，其特征在于，包括步骤：

在大豆中提高GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达量和/或活性；其中，所述农艺和品质性状改良是指增加根瘤数目；所述提高GmGS1β2基因或其编码蛋白的表达量和/或活性的方式为在大豆中过表达大豆GmGS1β2基因或其编码蛋白。

4.一种农艺和品质性状改良的转基因大豆的制备方法，其特征在于，将大豆GmGS1β2基因导入大豆细胞或大豆组织中，再将被转化的大豆细胞或大豆组织培育成大豆，使得所述GmGS1β2基因在大豆中过表达，得到农艺和品质性状改良的转基因大豆；

其中，所述农艺和品质性状改良是指增加根瘤数目。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述转基因大豆采用的转基因受体为中品661。