CN106701784B - 大豆油体蛋白基因GmOLEO1及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1及其编码蛋白与应用。该基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。本发明首次从大豆基因组中克隆得到一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1，利用植物表达载体，将本发明的GmOLEO1基因导入植物细胞，可获得油脂含量增加的转基因植株；过量表达本发明GmOLEO1基因的大豆与非转基因大豆相比，其种子油脂含量显著提高，说明GmOLEO1基因在提高植物种子特别是大豆种子油脂含量方面起着重要作用。本发明成果可运用于通过生物技术调节大豆油体蛋白基因的表达，对培育高油脂含量大豆品种具有重要意义，具有良好的应用前景。

Description

大豆油体蛋白基因GmOLEO1及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1及其编码蛋白与应用。

背景技术

植物体内的油脂在植物细胞分裂，生长及发育过程中起着至关重要的作用。植物油脂不仅是人类的重要食物之一，也是一种可再生的环保生物质能源，是人类生产生活的重要能量来源。

植物种子中油脂的合成可以分为三个阶段：第一阶段是在质体中以蔗糖作为主要碳源合成脂肪酸，第二阶段是在内质网中合成三酰甘油，第三阶段是生成的三酰甘油与油体蛋白结合形成油体。油体是植物种子中储存三酰甘油的亚细胞器，其内部储藏有液态的三酰甘油，外部由磷脂单分子层和嵌入其内的油体蛋白(oleosin)组成的半单位膜所包裹。在油料作物种子如大豆、花生和油菜中都含有大量的油体及油体蛋白。油体蛋白是高度疏水的碱性小分子量蛋白，对维持油体结构的稳定极为重要。在植物种子中油体的大小及含油量与油体蛋白的含量是直接相关的。利用RNAi抑制大豆油体蛋白异构体A的表达后，产生了新的直径约为50nm的小油体，它们逐渐合并产生比野生型大豆体积更大的油体(Schmidtand Herman,2008)。在油菜和拟南芥中，高含油量种子相比于低含油量种子来说，其油体蛋白的水平高约20％(Parthibane et al.,2012)。分析拟南芥油体蛋白基因的缺失突变体发现，种子中的油脂含量有所降低(Siloto et al.,2006)。

大豆是最重要的粮油兼用作物，大豆油占全球植物油产量的28％，居世界植物油产量第一位。因此，提高大豆种子的油脂含量对人类健康以及解决我国经济能源问题有重要意义。随着目前技术的进步，国内外已开发DGAT2A、SLC1、AtDGAT1等基因用以增加大豆油脂含量及提高油质。然而关于油体蛋白基因对大豆油脂含量的效应这方面的研究尚为空白。

综合以上分析认为，研究油体蛋白基因对大豆油脂含量的影响，发掘大豆油体蛋白基因对培育高油脂含量大豆品种具有重要意义，具有良好的应用前景。

发明内容

1、发明要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1。

本发明的另一个目的是提供该基因所编码的蛋白。

本发明的另一个目的是提供含有上述基因的载体。

本发明的又一个目的是提供上述基因或载体在培育高油脂大豆品种中的应用。

2、技术方案

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示，编码了由147个氨基酸组成的蛋白。

本发明还提供了一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1所编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示，该蛋白的分子量为15.76kDa，等电点为7.81。

应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明的油体蛋白基因GmOLEO1还包括由Seq ID NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码上述蛋白的核苷酸序列。

此外，应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列(Seq IDNO.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明编码蛋白还包括Seq ID NO.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性由Seq ID NO.2所示蛋白质衍生得到的蛋白质。

进一步地，本发明提供了一种含有该大豆油体蛋白基因GmOLEO1的载体，是将大豆油体蛋白基因GmOLEO1插入pCAMBIA3300植物过量表达载体中而成的重组表达载体pCAMBIA3300-GmOLEO1。

进一步地，本发明提供了所述大豆油体蛋白基因GmOLEO1或所述载体在培育高油脂大豆品种中的应用。

进一步地，本发明提供了一种用油体蛋白基因GmOLEO1进行大豆转化的方法，该方法是利用重组表达载体pCAMBIA3300-GmOLEO1，将权利要求1所述的基因转化大豆子叶节，再将转化后的大豆细胞培育成转基因植株。

3、有益效果

⑴本发明首次从大豆基因组中克隆得到一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1。利用植物表达载体，将本发明的GmOLEO1基因导入植物细胞，可获得油脂含量增加的转基因植株。过量表达本发明GmOLEO1基因的大豆与非转基因大豆相比，其种子油脂含量显著提高，说明GmOLEO1基因在提高植物种子特别是大豆种子油脂含量方面起着重要作用。

⑵利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmOLEO1基因导入植物细胞，可获得种子油脂含量显著提高的转基因植株。

⑶使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型的启动子或诱导性启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如可加入植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，也可不加入任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。

⑷携带有本发明GmOLEO1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培养成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

⑸本发明成果可运用于通过生物技术调节大豆油体蛋白基因的表达，从而培育在种子油脂含量方面有显著提高的大豆新品种，对培育高油脂含量大豆品种具有重要意义，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为大豆转化表达载体pCAMBIA3300-GmOLEO1载体图谱。

注：载体用bar基因作为转基因筛选标记，pCAMBIA3300-GmOLEO1载体用35S启动子后接全长GmOLEO1cDNA，用于转基因后可获得超表达GmOLEO1的转基因植株。

图2为阳性转基因大豆植株的验证结果图。

注：A图为转基因大豆的草丁膦叶片涂抹法检测结果，黑色标记的半片叶子表示未涂除草剂；主脉另一边的叶片涂有200mg/L Basta除草剂；B图为转基因大豆的PCR验证电泳图，M为2000bp Marker，C为空白对照，+为质粒阳性对照，1-10代表独立转基因株系1-10号样品；C图为

试纸条检测bar基因的表达结果图。WT为非转基因大豆，1-10为10个独立转基因株系。

图3为T1代转基因大豆的Southern blot结果分析图。

注：M，Marker；+，目的基因GmOLEO1的DNA片段；-，非转基因大豆，1-4为GmOLEO1基因超表达的4个独立转基因株系。

图4为转GmOLEO1基因大豆株系的种子中油脂含量测定结果分析图。

注：WT为非转基因大豆，OE1-4为4个独立转基因株系。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：大豆油体蛋白基因GmOLEO1的克隆和植物表达载体的构建

(1)设计引物，提取RNA，反转cDNA：

用植物总RNA提取试剂盒(DP432，天根)提取大豆威廉姆斯82叶片总RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；cDNA的合成参照TaKaRa Primer Script ^TMRT reagentkit with gDNA Eraser试剂盒说明操作。设计扩增基因GmOLEO1的引物序列如下:

Seq ID NO.3：GmOLEO1-F 5’-CCTACCACATTAATTACTCACTCTTCACTCA-3’；

Seq ID NO.4：GmOLEO1-R 5’-TCAACTTTAACGCTCATTCCTGCATTCAT-3’。

(2)PCR扩增，具体步骤如下：

步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应液(50μl体系)：10×PCR Buffer(25μl)，ddH₂O(9μl)，dNTP(10μl)，GmOLEO1-F(1.5μl)，GmOLEO1-R(1.5μl)，cDNA(2μl)，KOD FX酶(1μl)；

步骤二：反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，设定反应程序为：94℃变性2min；再98℃10sec，55℃30sec，68℃30sec，共33个循环；然后68℃延伸7min；4℃保存；

步骤三：PCR产物回收后经连接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序，序列如Seq ID NO.1所示。

(3)植物表达载体的构建

设计同源重组接头引物，以上述(2)中获得的含GmOLEO1基因的T载体为模板，扩增出带重组接头的GmOLEO1全长片段，通过无缝克隆技术将GmOLEO1基因正向导入到大豆表达载体pCAMBIA3300中，构建成重组植物表达载体pCAMBIA3300-GmOLEO1(如图1所示)。pCAMBIA3300载体在T-DNA区域带有一个选择标记基因bar，该基因编码草丁膦乙酰CoA转移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使除草剂草丁膦失活；无缝克隆所用的引物序列如下：

Seq ID NO.5：

上游引物5’-TTTGGAGAGAACACGTATGGCTGAGCTTCACTACCAAC-3’；

Seq ID NO.6：

下游引物5’-TCGGGGAAATTCGGGGTTAAGAAGCCTGCACCCCACTG-3’。

实施例2：GmOLEO1基因超表达转基因大豆的培育

(1)种子的消毒与萌发

大豆种子的表面消毒采用氯气干法灭菌。挑选成熟饱满、无病斑、无硬实的干净种子，单层排列在90*15mm的培养皿中；将培养皿开盖放入干燥器中，干燥器内放置一个500ml的玻璃烧杯，用100ml量筒量取75ml的商用漂白水加入烧杯中，用10ml量筒量取3ml的12MHCl，沿着杯壁缓缓加入；盖上干燥器的盖子，保证器皿密封，静置过夜，10～16小时，灭菌完成后，将培养皿加盖转移到无菌超净台上，打开培养皿的盖子，强风吹25～40分钟除去残留氯气；将消毒后的种子种脐朝下播种在萌发培养基(GM)上，将培养皿叠放，用保鲜膜包好，放在生物培养箱中24℃，黑暗培养16～24小时。

(2)农杆菌的准备

抽取重组载体pCAMBIA3300-GmOLEO1质粒DNA，通过电转化的方法，将重组载体转入农杆菌菌株LBA4404中，贮制于50％甘油中；转基因前2天，吸取50μl含载体的农杆菌甘油菌至5ml添加了抗生素(1/1000)的YEP液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，5g/L氯化钠，pH 7.0)中，28℃，250rpm，振荡培养24～36小时；吸取0.2～1ml饱和菌液至添加了抗生素(1/2000)的250ml YEP液体培养基中扩大培养，至OD650nm＝0.8～1.0；将菌液分装到若干个50ml无菌离心管中，离心(4000rpm，10min，25℃)，收集菌落，用25～50ml液体共培养基(LCCM)轻轻吹打，重悬沉淀后备用；LCCM培养液含1/10的B5大量、微量和维生素(Gamborget al.,1968)、3％蔗糖、有机缓冲剂2(N-吗啉)乙醇磺酸(MES)3.9g/L，pH5.4，120℃灭菌20min，在无菌环境下加入赤霉素(GA3)0.25mg/L、6-苄基腺嘌呤(BAP)1.67mg/L、半胱氨酸(Cys)400mg/L、二硫苏糖醇(DTT)154.2mg/L、乙酰丁香酮(As)200μmol/L。

(3)外植体的准备与共培养

将吸胀的大豆种子置于无菌吸水纸上，沿着种脐用手术刀纵向切割种子，将子叶和下胚轴均匀分开两瓣，去除种皮后备用；将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养皿中，放入大约50个外植体，室温侵染20～30分钟，期间经常搅动菌液，使外植体充分接触新鲜菌液；侵染结束后，将外植体取出，用无菌吸水纸吸干后置于放有无菌滤纸的共培养基(CM)上，每皿7～10个外植体，近轴面朝上，水平放置；CM培养基配方与LCCM相同，另加5g/L的琼脂(Difco Agar，Noble公司)。将培养皿叠放，用保鲜膜封好后在Percival培养箱中，23℃，黑暗共培养3～5天。

(4)筛选与再生

共培养3～5天后，切去伸长的下胚轴留取约0.5cm，30～45°斜角插在加有筛选剂的芽诱导(SI)培养基上，SI培养基含B5大量、微量和维生素、蔗糖30g/L、MES 0.59g/L、和琼脂8g/L(Sigma,USA)，120℃灭菌20min后，在无菌条件下加入BAP 1.67mg/L、替卡西林(Tic)250mg/L、头孢霉素(Cef)100mg/L。用3M透气胶带封口并转移到培养室(24℃，18/6光照强度140μmoles/m²/sec)，培养4周，每两周更换一次新鲜的SI培养基。丛生芽诱导筛选4周后，切除残余子叶，并转移到芽伸长(SE)培养基上，SE培养基含MS大量、微量和维生素(Murashigeand Skoog，1962)、蔗糖30g/L、MES 0.59g/L、琼脂(Sigma，USA)8g/L，pH5.8，120℃灭菌20min后，在无菌条件下加入GA 30.5mg/L、L-天冬酰胺(L-Asp)50mg/L、谷氨酰胺(Glu)50mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、玉米素(ZR)1mg/L、Tic 250mg/L和Cef 100mg/L，培养条件同丛生芽诱导过程，培养2～8周，每2周更换一次新鲜的SE培养基。将伸长3-4厘米的幼芽切下，在吲哚丁酸(IBA)中蘸30s～1min后插入生根培养基(RM)中，RM培养基含MS大量、微量和维生素、蔗糖20g/L、MES 0.59g/L、琼脂(Sigma,USA)8g/L、IBA 0.1mg/L、L-Asp 50mg/L、Glu50mg/L、Tic 250mg/L、Cef 100mg/L。1～2周后待根长约2-3厘米时，将生根苗从培养基中取出，洗净根部残留的培养基，转入土中移至温室培养。培养条件为24℃，18/6光照强度140μmoles/m²/sec。

实施例3：转基因材料验证

由于转基因所用载体中有编码草丁膦乙酰CoA转移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙酰化，从而使除草剂草丁膦失活。鉴定用除草剂Basta，原液稀释1000倍后(浓度为200mg/L)，对转基因幼苗进行喷洒，阴性植株枯萎死亡，阳性植株表现出明显抗性，保持良好生长。取除草剂检测存活的阳性植株的叶片提取DNA(采用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒：钟鼎公司，货号DN14-100T)，利用PCR检测标记bar基因进一步筛选阳性材料。bar基因引物序列如下：

Seq ID NO.7：上游引物5’-ATGAGCCCAGAACGACGC-3’；

Seq ID NO.8：下游引物5’-ACGTCATGCCAGTTCCCGT-3’。

最终获得8个T₀代独立转基因株系。将收获的转基因材料T₁代种子盆栽于灭过菌的混合营养土中(营养土:蛭石＝2:1)，放置于温室培养，培养条件为24℃，18/6光照强度140μmoles/m²/sec。用200mg/L草丁膦+0.1％Tween-20的组合用棉签对T₁代大豆转化植株的叶片进行涂抹，以主脉为界，涂在半片大豆叶片上，在另一半叶片上用记号笔做上标记表示未涂除草剂的对照，3-5天后观察叶片。如图2A所示，如果涂有除草剂的一半叶片相比于对照有明显的枯萎现象表示该样品为阴性；如果叶片正常则表示该样品为阳性。取草丁膦检测为阳性植株的叶片提取DNA，利用PCR扩增bar基因片段进一步筛选阳性材料。如图2B所示，转基因材料能够检测到bar基因。取以上两种方法检测均为阳性的大豆转基因植株的叶片用

试纸条(EnviroLogix Inc.，USA)检测PAT/bar蛋白，方法如下：

(1)将样品叶片组织置于一次性组织提取管的盖子与管身之间，迅速盖住盖子，得到圆形叶片组织，用杵将叶片置于提取管的底部；

(2)将杵插入管中，旋转杵碾搅碎叶片，持续按压20～30秒，加入0.5mL提取缓冲液；

(3)重复碾碎步骤使样品与缓冲液充分接触混合，拿掉杵棒；

(4)反应管保持直立，将试纸插入反应管，样品液会沿试纸上升，反应10分钟后读取结果。

如图2C所示，一个样品中试纸条如果同时显示两条红线意味着bar基因的编码产物(PAT)可以在翻译水平被检测到，同时意味着此样品为阳性的转基因材料。

实施例4：转基因材料的Southern blot杂交分析

4个T₁代植株(表现为草丁膦抗性，PCR和

试纸条检测阳性)的DNA被用于Southern分析，检测目的基因插入基因组拷贝数。具体方法如下：

(1)探针制备

制备GmOLEO1基因探针的引物序列如下:

Seq ID NO.9：GmOLEO1-PF 5’-GCTACTCCACTCAGGTCGTC-3’；

Seq ID NO.10：GmOLEO1-PR 5’-CACCCCACTGATTTGCTG-3’。

步骤一：采用PCR制备探针模板，按照以下组份配制PCR反应液(50μl体系)：10×buffer(plus Mg²⁺)(5μl)，dUTP标记混合物(5μl)，GmOLEO1-PF(1μl)，GmOLEO1-PR(1μl)，Taq酶(1μl)，DNA(1μl)，ddH₂O(36μl)；

步骤二：反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，设定反应程序为：94℃预变性5min；再94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；然后72℃复性7min；4℃保存；

步骤三：PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(钟鼎公司，货号DR01-50T)回收对照DNA，测序正确后待用。

(2)基因组DNA的提取酶切

对组织样品进行基因组DNA提取，1％琼脂糖凝胶电泳检测后对基因组进行酶切，照以下组份配制酶切体系：10×M buffer(60μl)，Hind III(30μl)，基因组(10μg)，灭菌水(补足至600μl)。内切酶分两次加入，第一次加10μl，温和搅拌，37℃消化2h，再加入10μl，温和搅拌，37℃消化过夜(约16h)，次日再加入10μl，继续反应4h。各取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。酶切后的DNA用等体积酚：氯仿抽提，产物溶于50μl去离子水。

(3)电泳

将制备好的样品进行0.7％的琼脂糖凝胶电泳，25V恒压、低温、过夜。

(4)转膜

步骤一：将胶置于平皿、用蒸馏水冲洗一次后，加入数倍体积变性液室温振荡45min；

步骤二：用蒸馏水冲洗2次，加入中和液室温振荡2×15min；

步骤三：用蒸馏水冲洗2次，加入2×SSC以平衡凝胶和带正电荷的尼龙膜5min；

步骤四：向上毛细管法进行转膜20h，取下膜作好标记，在2×SSC中漂洗一次，80℃烘烤固定2h。

(5)杂交

步骤一：预杂交：取10.0ml Hyb-100，加入杂交管中，37℃预杂交2h；

步骤二：探针变性：探针在PCR仪中100℃变性10min，立即放冰水浴冷却5min；

步骤三：杂交：排尽预杂交液，在10.0ml Hyb-100中加入20μl新变性好的探针，混匀，37℃杂交过夜。

(6)洗膜、信号检测

步骤一：杂交后室温下，20ml 2×SSC/0.1％SDS洗膜2×5min；

步骤二：65℃，20ml 1×SSC/0.1％SDS洗涤2×15min；

步骤三：再将膜置于20ml洗涤缓冲液中平衡2-5min；

步骤四：将膜在10ml封闭液中封闭30min(在摇床上轻轻摇动)；

步骤五：Anti-Dig-AP在10000rpm下离心5min，离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，2.0μl Anti-Dig-AP加入10ml封闭液混匀；

步骤六：封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的10ml抗体溶液，浸膜至少30min；

步骤七：去除抗体溶液，用20ml洗涤缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min；

步骤八：在膜的正面(核酸面)滴加1ml的CSPD，隔绝空气15-25℃反应5min，去除多

余的液体，37℃孵育10min；

步骤九：在暗房用X-ray film曝光，显影，定影，洗片，曝光记录结果。

如图3所示，非转基因大豆具有四个拷贝，由于目的基因是大豆的内源基因并且大豆是古四倍体植物，与非转基因大豆相比，T1代转基因植株展现出相同的T-DNA整合模式，并且转基因拷贝数很低，每个转基因株系仅包含一个拷贝的插入。

实施例5：大豆种子的油脂含量测定

使用近红外光谱籽粒分析仪(波通型号DA7200，瑞典)对非转基因大豆和GmOLEO1过表达大豆植株种子的油脂含量进行测定。定标曲线由农业部谷物及其产品质量检验测试中心制作。该曲线是基于900份不同籽粒油脂含量的大豆样品制作而成。曲线方程的决定系数R²为0.96，标准误差为0.50。每个样品装入60毫米的杯子进行旋转扫描，每个样品扫描3次。测定结果显示在大豆中过表达油体蛋白基因GmOLEO1后，导致种子油脂含量显著升高。如图4所示，非转基因大豆的油脂含量约为17.84％，而四个过表达株系的油脂含量分别约为20.13％、20.17％、20.07％、19.76％，相对于非转基因大豆，分别提高了12.86％、13.06％、12.52％、10.79％。

<110> 河南农业大学

<120> 大豆油体蛋白基因GmOLEO1及其编码蛋白与应用

<160> 10

<210> 1

<211> 444

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max L.）

<220>

<223>大豆油体蛋白基因GmOLEO1

<400> 1

atggctgagc ttcactacca acaacaacac caataccctc accgataccc taatgatcca 60

tacgaacaac aaactagcta ctccactcag gtcgtcaagg cggccaccgc cgtcaccgcg 120

ggcggctccc tcttgatcct cgcctcgttg atccttgccg gcaccatcat cgccctcacc 180

atcgtcacac caccgctcgt catcttcagt ccggttctcg tccccgcggt gatcaccgtc 240

gcgctgctga gcctggggtt ccttgcctcc ggcgggttcg gtgtggcggc gatcacggtg 300

ctggcgtgga tctacaggta cgtcaccggg aagtacccac ctggcgcgga tcagttggac 360

agcgcgcctc acaagatcat ggacaaggcg cgtgagatca aggactatgg acagcagcaa 420

atcagtgggg tgcaggcttc ttaa 444

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> 大豆（Glycine max L.)

<220>

<223>大豆油体蛋白基因GmOLEO1编码的蛋白质

<400> 2

Met Ala Glu Leu His Tyr Gln Gln Gln His Gln Tyr Pro His Arg Tyr

1 5 10 15

Pro Asn Asp Pro Tyr Glu Gln Gln Thr Ser Tyr Ser Thr Gln Val Val

20 25 30

Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Ile Leu Ala

35 40 45

Ser Leu Ile Leu Ala Gly Thr Ile Ile Ala Leu Thr Ile Val Thr Pro

50 55 60

Pro Leu Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Val Ile Thr Val

65 70 75 80

Ala Leu Leu Ser Leu Gly Phe Leu Ala Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala

85 90 95

Ala Ile Thr Val Leu Ala Trp Ile Tyr Arg Tyr Val Thr Gly Lys Tyr

100 105 110

Pro Pro Gly Ala Asp Gln Leu Asp Ser Ala Pro His Lys Ile Met Asp

115 120 125

Lys Ala Arg Glu Ile Lys Asp Tyr Gly Gln Gln Gln Ile Ser Gly Val

130 135 140

Gln Ala Ser

145

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>基因GmOLEO1扩增上游引物

<400> 3

cctaccacat taattactca ctcttcactc a 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>基因GmOLEO1扩增下游引物

<400> 4

tcaactttaa cgctcattcc tgcattcat 29

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>无缝克隆上游引物

<400> 5

tttggagaga acacgtatgg ctgagcttca ctaccaac 38

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223>无缝克隆下游引物

<400> 6

tcggggaaat tcggggttaa gaagcctgca ccccactg 38

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> bar基因扩增上游引物

<400> 7

atgagcccag aacgacgc 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> bar基因扩增下游引物

<400> 8

acgtcatgcc agttcccgt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> GmOLEO1基因探针制备上游引物

<400> 9

gctactccac tcaggtcgtc 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<220>

<223> GmOLEO1基因探针制备下游引物

<400> 10

caccccactg atttgctg 18

Claims (2)

1.一种大豆油体蛋白基因GmOLEO1在培育高油脂大豆品种中的应用，所述大豆油体蛋白基因GmOLEO1的核苷酸序列如序列表Seq ID NO.1所示，所述大豆油体蛋白基因GmOLEO1编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述应用的大豆转化方法，其特征在于，所述方法是利用重组表达载体pCAMBIA3300-GmOLEO1，将大豆油体蛋白基因GmOLEO1转化大豆子叶节，再将转化后的大豆细胞培育成转基因植株。

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