CN110257421B - 一种甘蓝型油菜基因突变体ptg8的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于遗传作物基因工程技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法及其应用。其技术要点包括根据甘蓝型油菜BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a基因核苷酸序列设计并筛选两个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；构建双靶点基因编辑载体BnPTG8载体；BnPTG8载体与受体材料遗传转化，获得基因突变体。本发明通过对多个不同来源的甘蓝型冬油菜品系进行筛选，获得了高效稳定转化基因型受体材料ZP1，对该受体材料精确编辑获得BnaC.FAD2.a单突变体和BnaC.FAD2.a&BnaA.FAD2.a基因双突体，为建立高效的冬油菜遗传转化技术平台奠定了基础，为甘蓝型油菜脂肪酸改良提供了新的种质资源。

Description

一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于遗传作物基因工程技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法及其应用。
背景技术
甘蓝型油菜的遗传转化可通过多种途径实现，其中根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化是目前最常用、转化效率最高的方法。但是农杆菌介导的转化方法受到多种因素的影响。冬油菜是我国油菜栽培的主要类型，但冬油菜的遗传转化效率较低，也缺乏高效稳定的基因型。因此，筛选农艺性状优良、转化效率高的甘蓝型冬油菜转化基因型，并建立完善与之配套高效稳定的油菜转化体系非常具有应用价值。
油菜是我国重要的油料作物和食用植物油来源。油菜的脂肪酸改良主要是从不同的用途展开，其中最受关注的一方面是提高油菜油酸含量，改善菜籽油的品质。FAD2基因是△12-油酸去饱和酶的编码基因，对油酸向亚油酸合成过程具有关键作用。
到目前为止，涉及甘蓝型油菜FAD2基因的A5拷贝已经被研究和应用，A5拷贝不同位置的突变得到了不同高油酸含量的材料。但FAD2基因C5拷贝突变及A5&C5两个拷贝同时突变能提高油酸含量的技术尚未有报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法及其应用。
本发明是这样实现的，一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法，包括以下步骤：
S1：根据甘蓝型油菜BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a基因核苷酸序列设计并筛选两个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；
S2：构建双靶点基因编辑载体BnPTG8载体；
S3：BnPTG8载体与受体材料遗传转化，获得基因突变体。
进一步，步骤S3中所用受体材料为ZP1品系植株。
进一步，步骤S1中两个靶点序列分别见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
进一步，步骤S1中针对靶点序列设计的引物序列分别见SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。
进一步，所获得的基因突变体为C5拷贝突变体，具体为BnaC.FAD2.a基因第437位处缺失3个碱基，所缺失的碱基为CAA。
进一步，所获得的基因突变体为A5&C5两个拷贝同时突变的双突变体，具体为BnaC.FAD2.a基因第440和441位处插入1个碱基，插入碱基为A；BnaA.FAD2.a基因第568-571位处缺失4个碱基，所缺失的碱基为AGCC，第599位处缺失1个碱基，所缺失的碱基为T。
进一步，步骤S2中构建双靶点基因编辑载体BnPTG8载体的步骤包括：获取sgRNA序列片段；将获得的sgRNA序列片段依次连接；将连接产物酶切后与载体连接；将连接成功的载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，得到BnPTG8载体农杆菌菌株。
如上述的甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法在油菜育种中的应用。
利用权利要求5所述的甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法获得的C5拷贝突变体在油菜育种中的应用。
利用权利要求6所述的甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法获得的A5&C5拷贝双突变体在油菜育种中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明通过对13个不同来源的甘蓝型冬油菜品系进行筛选，获得了高效稳定转化基因型受体材料ZP1，对该受体材料精确编辑获得BnaC.FAD2.a单突变体和BnaC.FAD2.a&BnaA.FAD2.a基因双突体及应用。该基因的两个拷贝分别位于甘蓝型油菜C5和A5染色体上。具体为通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a两个拷贝同时进行精确编辑，获得C5单突变体PTG8-46和A5&C5双突变体PTG8-116，经GC-MS测定，两个突变体的油酸含量与野生型相比显著升高；A5&C5双突变体的油酸含量与C5或A5单突变体相比显著升高。本发明为甘蓝型油菜高油酸育种提供了新的种质资源。
附图说明
图1是四个基因型下胚轴外植体在M3培养基上培养3周时芽分化效率比较；
图2是四种基因型愈伤诱导率和转化效率差异比较；
图3是突变体植株DNA电泳图；
图4是突变体植株基因编辑检测结果图；
图5是BnaC.FAD2.a突变体序列比较；
图6是BnaC.FAD2.a&BnaA.FAD2.a突变体序列比较；
图7是PTG8-46、PTG8-116突变体和野生型材料ZP1的油酸含量及显著性差异分析；
图8是PTG8-46和PTG8-116突变体材料油酸含量及显著性差异分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种甘蓝型油菜BnaC.FAD2.a基因突变体PTG8-46以及BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a两个基因同时突变的PTG8-116的构建方法及其应用，具体如下各实施例所示。本发明涉及到的遗传作物来源见遗传资源来源披露表，所用载体、质粒均为本领域公知公用，试剂均市售可得。
实施例1农杆菌介导的冬油菜高效遗传转化受体的筛选验证及配套的转化程序建立完善
1、不同品系外植体再生能力的鉴定
在相同条件下，13个不同品系下胚轴外植体愈伤诱导率和芽再生率差异均较大，其愈伤诱导率最高的高达90％以上，而最低的还不到1％。一般而言，愈伤诱导率较高的材料也具有较高的芽再生率。根据组织培养中各基因型愈伤诱导率和芽再生率的表现，从上述13个材料中选出ZP1、华双5号(育成品种)、中双9号(育成品种)三个品种(系)做进一步的遗传转化效率分析。
2、不同基因型材料转化效率比较
利用农杆菌介导的遗传转化，以甘蓝型油菜品系ZP1、甘蓝型油菜品种华双5号(育成品种)、甘蓝型油菜品种中双9号(育成品种)下胚轴为外植体，进行侵染实验，同时以国外育成品种Westar为对照作比较分析。其他实施例中也可以使用受体材料的子叶、叶片、茎等组织作为受体组织。建立完善配套的遗传转化程序如下：
1)灭菌
a.用75％酒精浸泡不同基因型材料种子1min。
b.将洗好的种子转入无菌容器(培养盒)中，把酒精倒入废液缸，并加入适量的消毒液(84消毒液浓度无菌水:84液＝1:1)，灭菌时间为10-15min。
c.消毒后，将消毒液倒入废液缸，用无菌水(50ml左右)冲洗种子4-5遍。
2)播种
a.用无菌镊子将灭菌好的种子播到M0，每皿10-12粒。
b.将培养皿放到无菌培养盒中，置暗光24℃下培养6天。
3)摇菌
播种4-5天后，用LB液体培养基(Kanamycin 50mg/L+Gentamicin 25mg/L)培养农杆菌CYP83A1-At载体，28℃下振荡培养((220r/min))约20h至OD值为0.6-0.8。。在28℃，180-220rpm摇床中培养约15个小时左右。测培养后菌液的OD值，一般为0.4左右较好(用无菌三角瓶或离心管，一般配两个浓度的菌液10/15μl菌液+4ml的LB)。
4)外植体的制备及侵染
a.准备菌液，吸取2ml培养好的菌株于无菌的2ml的离心管中，在离心机以每分钟6000转离心3min，倒掉上清；用与菌液相同体积的DM(加AS)重新悬浮一次，再在同样的条件下离心，弃上清后，再用相同体积DM(加AS)悬浮。将悬浮后的菌液用18ml的DM稀释(在灭菌培养皿中进行)。
b.剪切外植体，用无菌镊子和解剖刀切取播种6天后幼苗下胚轴，每个长度为0.8-1.0cm。在M1液体培养基中切取效果更佳，切取外植体时尽量一刀垂直切下。
c.将切好的外植体放到已经配制好浓度菌液的培养皿中，浸染15min(时间不能过长，避免外植体失水严重死亡或后期农杆菌抑制不住)，隔段时间摇晃一次，还差3min时吸去菌液。浸染时以每皿(20ml菌液)150-200个外植体较合适。
5)将侵染后的外植体用灭菌后的滤纸吸干，再用镊子转到M1培养基中，每皿50-60个外植体暗光下24℃培养2天后转入M2中，24℃白光16h/暗光8h培养。
6)20天后转到M3中，每20天继代一次，直至出现绿芽，24℃白光16h/暗光8h培养。转入M4生根，生根时间需2-4周，24℃白光16h/暗光8h培养。长根后将小苗移栽到温室穴盘中，前期需要覆盖塑料膜防止过度失水，一周以后可以将膜揭开。最后根据气候移至大田生长。
在愈伤诱导培养阶段统计各个材料的愈伤诱导率(诱导愈伤的外植体数/侵染的总外植体数×100％)；转入分化培养基后，待愈伤分化出芽后将芽切下进行生根培养，并取样进行PCR检测统计阳性株数计算转化效率(阳性株数/外植体总数×100％)。PCR检测反应引物、体系及程序如下：取生根移栽植株的叶片，采用Edwards((Edwards et al.,1991))方法提取植物总DNA，以引物P1(5'-GTGCCCTGAATGAACTGC-3'，见SEQ ID NO:1)和P2(5'-CAATATCACGGGTAGCCA-3'，见SEQ ID NO:2)检测转化载体上的标记基因。所用PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min 30s，28个循环后，于72℃延伸10min，扩增产物大小为522bp，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果显示，四种材料的分化能力差异显著，见图1，其中ZP1再生能力最强。同时，ZP1不论愈伤诱导率还是转化效率均高于Westar和其他材料，转化效率达到了40％以上。华双5号(育成品种)和中双9号(育成品种)与Westar相比，愈伤诱导率相当，但华双5号(育成品种)的转化效率却不到5％，而中双9号(育成品种)和Westar的转化效率均接近10％，见图2。由此可见，ZP1是适合于农杆菌转化的良好受体。
实施例2突变体材料的获得
S1：筛选靶点序列并设计引物。
从NCBI数据库中获得甘蓝型油菜BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a基因核苷酸序列，分别见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。应用在线软件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)设计20bp的靶点序列，筛选出+424～443bp，578～597bp两个碱基位点的靶点序列，分别为：CGACGCCACCATTCCAACACtgg，见SEQ ID NO:5；ACTTAGCCTTCAACGTCTCGgga，见SEQ ID NO:6。为获得完整的sgRNA序列，根据要求设计靶点序列的正向引物和反向引物，如下表1所示。
表1 靶点引物
Figure GDA0002140532580000051
S2：构建双靶点基因编辑载体BnPTG8载体。
①经过PCR反应获得完整的sgRNA序列。PCR体系如表2，引物使用如下：L5AD5-F和BnaFAD2-PS1-tR，BnaFAD2-PS1-gF和BnaFAD2-PS2-tR，BnaFAD2-PS2-gF和L3AD5-R。PCR程序如表3所示。PCR得到三种产物分别为L5AD-gR1，gR1-gR2，和gR2-L3AD。
表2 PCR体系
Figure GDA0002140532580000052
Figure GDA0002140532580000061
表3 PCR程序
Figure GDA0002140532580000062
②应用北京全式金生物技术公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit对3个反应的PCR产物进行纯化，纯化后把3个产物等体积混合，用分光光度计测其浓度，为5ng/μl，试验需用25ng，相当于5μl，连接条件及体系分别如下表所示，PCR仪器为东胜ESTWINPCR仪。
表4 连接体系
Figure GDA0002140532580000063
表5 连接条件
Figure GDA0002140532580000064
Figure GDA0002140532580000071
③上述产连接产物用ddH2O稀释200倍，进行PCR扩增，PCR体系及程序分别见表6和表7，PCR仪器为东胜ESTWINPCR仪。其中引物S5AD5-F序列为：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA，见SEQ ID NO:13，S3AD5-R序列为：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC，见SEQ ID NO:14。
表6 PCR体系
Figure GDA0002140532580000072
表7 PCR程序
Figure GDA0002140532580000073
④应用北京全式金生物技术公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit对PCR产物进行纯化。用Fok I(NEB)酶切经纯化的PCR产物，消化结束后用EasyPure Quick GelExtraction Kit纯化产物。酶切体系表8，37℃水浴1h。
表8 酶切体系
Figure GDA0002140532580000074
Figure GDA0002140532580000081
⑤用Fok I(NEB)消化pRGEB32载体，体系及条件同步骤④。
⑥用T4DNA连接酶(NEB)连接经消化的载体和消化的PCR产物，体系见表9，室温连接1h。
表9 连接体系
Figure GDA0002140532580000082
⑦连接产物转大肠杆菌测序确定。操作步骤如下：
a.取50μl冰浴上融化的Trans1-T1 Phage Resistant Chemically CompetentCell感受态细胞，加入10μl的连接产物,轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。
b.42℃水浴热激30秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟，该过程不要摇动离心管。
c.向每个离心管中加入500μl无菌液体LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，200rpm培养1小时，使细菌复苏。
d.吸取50μl已转化的感受态细胞加到含LB(25g/L)琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
e.挑取单克隆，PCR阳性鉴定，体系，程序及引物如下：
表10 PCR体系及程序
Figure GDA0002140532580000083
Figure GDA0002140532580000091
FAD2-CAS9d F：CGACGCTAATCTGGACAAAGTG，见SEQ ID NO:15；
FAD2-YM14：AAGACCGGCAACAGGATTCA，见SEQ ID NO:16。
f.选取阳性克隆测序，确定BnPTG8质粒无突变，可以用于后续试验。
⑧将构建好的载体转入农杆菌GV3101电转感受态细胞。具体步骤如下：取一管50μl GV3101电转感受态细胞置于冰上，溶化后加入0.1μg构建好的载体质粒并用移液器轻轻吸打混匀；将含有载体质粒的感受态用移液器吸入冰上预冷的电转杯中，使用Gene pulser电转仪(购自Bio-Rad公司)在1800V电压下电击6ms；向电转杯中加入500μl液体LB混匀后将菌液转到2mL离心管中，28℃摇床中150rpm培养2hrs；取100μl菌液铺固体LB平皿(含庆大霉素25μg/ml和卡那霉素50μg/ml)，吹干后28℃培养箱中培养2-3天；挑取菌斑进行PCR检测，体系和反应程序同⑦-e，阳性克隆进行摇菌分装于-80℃保存或直接用于植物转化，得到BnPTG8载体农杆菌菌株。
S3：BnPTG8载体与受体材料遗传转化，获得基因突变体。
1)灭菌
用75％酒精浸泡浸泡ZP1成熟晒干种子1min。
将洗好的种子转入无菌培养盒中，把酒精倒入废液缸，并加入适量的消毒液，本实施例中为84消毒液浓度，无菌水:84液＝1:1，灭菌时间为10-15min。
消毒后，将消毒液倒入废液缸，用无菌水约50ml左右冲洗种子4-5遍。
2)播种
用无菌镊子将灭菌好的种子播到M0培养基，每皿10-12粒。
将培养皿放到无菌培养盒中，置暗光24℃下培养6天。
3)摇菌
播种4-5天后用LB液体培养基(Kanamycin 50mg/L+Gentamicin 25mg/L)培养BnPTG8载体农杆菌菌株。在28℃，180-220rpm摇床中培养约15个小时左右。测培养后菌液的OD值，一般为0.4左右较好(用无菌三角瓶或离心管，一般配两个浓度的菌液10/15μl菌液+4ml的LB)。
4)外植体的制备及侵染
准备菌液，吸取2ml第3)步培养好的菌株于无菌的2ml的离心管中，在离心机以每分钟6000转离心3min，倒掉上清；用与菌液相同体积的DM(加AS)重新悬浮一次，再在同样的条件下离心，弃上清后，再用相同体积DM(加AS)悬浮。将悬浮后的菌液用18ml的DM稀释(在灭菌培养皿中进行)。
剪切外植体，用无菌镊子和解剖刀切取步骤2)播种6天后幼苗下胚轴，每个长度为0.8-1.0cm。在M1液体培养基中切取效果更佳，切取外植体时尽量一刀垂直切下。
将切好的外植体放到已经配制好浓度菌液的培养皿中，浸染15min(时间不能过长，避免外植体失水严重死亡或后期农杆菌抑制不住)，隔段时间摇晃一次，还差3min时吸去菌液。浸染时以每皿(20ml菌液)150-200个外植体较合适。
5)将侵染后的外植体用灭菌后的滤纸吸干，再用镊子转到M1培养基中，每皿50-60个外植体暗光下24℃培养2天后转入M2中，24℃白光16h/暗光8h培养。
6)20天后转到M3中，每20天继代一次，直至出现绿芽。
转入M4生根，生根时间需2-4周。长根后将小苗移栽到温室穴盘中，前期需要覆盖塑料膜防止过度失水，一周以后可以将膜揭开。最后根据气候移至大田生长。
S4：获得突变体植株
用CTAB方法提取步骤S3中获得的多株植株叶片的DNA，并编号，用载体上特有的序列引物扩增进行阳性检测，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。反应体系在PCR扩增仪上进行，PCR扩增反应体系如下：
Figure GDA0002140532580000101
引物序列如下(5’-3’)：
FAD2-CAS9d F：CGACGCTAATCTGGACAAAGTG，见SEQ ID NO:17；
FAD2-YM14：AAGACCGGCAACAGGATTCA，见SEQ ID NO:18。
检测结果如图3，CK1为阳性对照，CK2为阴性对照，PTG8-46#为阳性植株，PTG8-116#为阳性植株。
S5：编辑检测
对检测出来的阳性单株采用15％非变性PAGE胶进行编辑检测，根据多态性来判断是否发生编辑。反应体系在PCR扩增仪上进行，PCR扩增反应体系及引物如下：
FCP107：TCTTCCACTCCTTCCTCCT，见SEQ ID NO:19；
FCP108：CGTTGTAGATGGGAGCGTT，见SEQ ID NO:20。
Figure GDA0002140532580000111
检测结果如图4所示，PTG8-46#和PTG8-116#植株与CK相比具有核苷酸多态性。
S6：TA克隆测序验证
PCR产物的制备：
1)于灭菌PCR管中配制如下反应体系,模板为PTG8-46#和PTG8-116#植株及野生型DNA，三个模板分别扩增：
FCP107：TCTTCCACTCCTTCCTCCT，见SEQ ID NO:19；
FCP108：CGTTGTAGATGGGAGCGTT，见SEQ ID NO:20。
Figure GDA0002140532580000112
PCR程序设置为98℃变性3min；98℃15sec，59℃15sec，72℃30sec，34个循环；72℃5min；25℃10min。
2)吸取4ul PCR产物进行水平胶检测产物的质量。如果扩增产物有多条带建议凝胶回收目的片段。
3)之后参照PEASY-Blunt Simple Cloning kit试剂盒说明书将目的基因片段连入PEASY-Blunt载体中，构建测序中间载体，交由测序公司测序。
克隆反应
1)在微型离心管中依次加入PEASY-Blunt Simple cloning Vector 1ul，PCR产物4μl(根据PCR产物量可适当增减，最多不超过4μl)，轻轻混合，室温(27℃-37℃)反应5分钟，反应结束后将离心管置于冰上。
2)加连接产物于50ul Trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻轻混匀，冰浴20-30分钟后，42℃水浴热击30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl平衡至室温的LB培养基，200rpm，37℃培养1小时。吸摇好的菌液50μl(依据连接片段长度大小而定)均匀的涂在含50μg/m L Kan抗性的LB平板上，在37℃培养箱中过夜培养(为了得到较多克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板)。
菌液PCR鉴定阳性克隆：
1)挑选白色单克隆至10ul无菌水中，涡旋混合。
取2ul混合液于20ul PCR体系，用基因组FCP107/FCP108引物，见SEQ ID NO:20和SEQID NO:21，PCR程序设置为94℃变性6min；94℃30sec，59℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃10min；25℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。
2)挑取阳性克隆菌液进行测序。用M13F/M13R通用引物测序，进行序列分析，结果见图5和图6。
经测序确定：
PTG8-46为C5位点的纯合突变体，突变类型为BnaC.FAD2.a基因第437位处缺失3个碱基，所缺失的碱基为CAA。基因突变体PTG8-46的核苷酸序列见SEQ ID NO:21，蛋白质序列见SEQ ID NO:22。
PTG8-116为A5&C5位点的双纯合突变体，突变类型为：BnaC.FAD2.a基因第440和441位处插入1个碱基，插入碱基为A；BnaA.FAD2.a基因第568-571位处缺失4个碱基，所缺失的碱基为AGCC,第599位处缺失1个碱基，所缺失的碱基为T。基因突变体PTG8-116的A5拷贝核苷酸序列见SEQ ID NO:23，蛋白质序列见SEQ ID NO:24。(b)基因突变体PTG8-116的C5拷贝核苷酸见SEQ ID NO:25，蛋白质序列见SEQ ID NO:26。
实施例3 PTG8-46和PTG8-116纯合突变体植株种子脂肪酸组成测定
在实施例2获得突变体植株后自交加代，得到纯合突变体植株。
按如下步骤测定突变体种子脂肪酸组成。
样品的制备：
1)PTG8-46和PTG8-116纯合突变体两个株系，每个株系挑选3个单株，每个单株随机挑选25粒左右的饱满的种子，用研钵磨碎至粉末装入10mL的试管中，野生型ZP1种子选取同上。
2)分别加入1mL无水乙醚：石油醚(1:1)混合液以及等体积的氢氧化钾-甲醇溶液(0.5mol/L)(500ml甲醛+11.2g氢氧化钾)，室温静止60min。
3)加超纯水定容至10mL，放置10min,取500μL-600μL至进样瓶中，待测定。
4)在安捷伦公司生产的自动进样气相色谱仪上直接运行程序。
气相色谱仪参数设置：安捷伦HP7890A，检测器为氢火焰离子化检测器，自动进样1μL，分流比设置为1:45，检测器温度为250℃，进样室温度为280℃，载气为N2，流速30mL/min，尾吹为40mL/min，H2速度为30mL/min，空气流速为300mL/min，炉温设置为持续升温，180℃保持2min，然后10℃/min升至220℃保持7min。
脂肪酸成分由各脂肪酸气化后的出峰时间和标准脂肪酸出峰时间对比确定，用峰面积百分比表示脂肪酸含量，PTG8-46、PTG8-116突变体和野生型材料ZP1油酸含量测定结果如图7所示，由图7可知，PTG8-46、PTG8-116突变体和野生型材料ZP1的油酸含量相比，均达到了极显著差异。由图8可知，PTG8-46和PTG8-116突变体材料油酸含量相比达到了显著性差异。
本发明中涉及到的培养基如下：
LB培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，固体培养基加琼脂15g/L，121℃高压灭菌20min，4℃冰箱贮存备用。
DM(100ml)：MS 0.44g，蔗糖3g，定容，调PH＝5.84-5.88，灭菌，快冷使用时加抗生素AS(100μm)100μl。
M0(100ml)：1/2MS 0.22g，蔗糖3g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 0.7g，灭菌。
M1(500ml)：MS 2.2g，蔗糖15g，Mannitol 9g，2,4-D(1mg/L)0.5ml，KT(0.3mg/L)0.5ml，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使.用时加抗生素AS(100μm)500μl。
M2(500ml)：MS 2.2g，蔗糖15g，Mannitol 9g，2,4-D(1mg/L)0.5ml，KT(0.3mg/L)0.5ml，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使用时加STS 75μl，TMT(300mg/ml)0.5ml，HygromycinB(25mg/ml)250ul。
M3(500ml)：MS 2.2g，葡萄糖5g，木糖0.125g，MES 0.3g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使用时加反式-Zeatin(2.0mg/L)0.5ml，IAA(0.1mg/L)0.5ml，TMT(300mg/L)0.5ml，AgNO3 75μl，HygromycinB(25mg/ml)250μl。
M4(500ml)：MS 4.4g，蔗糖5g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar 3.5g，灭菌，快冷使用时加TMT(300mg/L)0.5ml。
STS:[Ag(SO3)2]3-现用现配，时间过长有沉淀。
母液：
硫代硫酸钠，0.1M(1.58g溶于100mLddH2O)；AgNO3，0.1M(1.7g溶于100mLddH2O)VNa2SO3:VAgNO3＝4:1，将AgNO3溶于硫代硫酸钠中。
2,4-D:1mg/mL母液，0.25g2,4-D加入少量95％酒精和1M的NaOH溶液，定容至250mL。
KT:0.03gKT先溶于1MHCL中，加水定容至100mL。
AS:100mmol/L母液，0.392gAS先溶于少量甲醇中，再加二甲基亚砜，定容至20mL。
TZ:反式Zeatin(玉米素)，2mg/mL母液，称0.04gTZ溶于少量75％酒精中，加水定容至20mL。
IAA:0.1mg/mL，100mgIAA溶于少量95％乙醇中，再加ddH2O定容至100mL，抽滤分装，保存于-20℃。
本发明中涉及到的核苷酸和蛋白质序列如下：
1.BnaC.FAD2.a核苷酸和蛋白质序列如下，核苷酸序列见SEQ ID NO:3，蛋白质序列见SEQ ID NO:27。
Figure GDA0002140532580000141
Figure GDA0002140532580000151
2.BnaA.FAD2.a核苷酸和蛋白质序列如下，核苷酸序列见SEQ ID NO:4，蛋白质序列见SEQ ID NO:28。
Figure GDA0002140532580000152
3.基因突变体PTG8-46的核苷酸和蛋白质序列如下，核苷酸序列见SEQ ID NO:21，蛋白质序列见SEQ ID NO:22。
Figure GDA0002140532580000161
4.基因突变体PTG8-116的核苷酸和蛋白质序列.(a)基因突变体PTG8-116的A5拷贝核苷酸序列见SEQ ID NO:23，蛋白质序列见SEQ ID NO:24。(b)基因突变体PTG8-116的C5拷贝核苷酸见SEQ ID NO:25，蛋白质序列见SEQ ID NO:26。
(a)
Figure GDA0002140532580000162
Figure GDA0002140532580000171
(b)
Figure GDA0002140532580000172
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(P1)
<400> 1
gtgccctgaa tgaactgc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(P2)
<400> 2
caatatcacg ggtagcca 18
<210> 3
<211> 1155
<212> DNA
<213> BnaC.FAD2.a核苷酸序列(BnaC.FAD2.a)
<400> 3
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca agaagtctga aaccgacacc 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccaag ggtgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gcttgacgac 360
accgtcggtc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag 480
aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg 540
atgttaacgg ttcagttcac tctcggctgg ccgttgtact tagccttcaa cgtctcggga 600
agaccttacg acggcggctt cgcttgccat ttccacccca acgctcccat ctacaacgac 660
cgcgagcgtc tccagatata catctccgac gctggcatcc tcgccgtctg ctacggtctc 720
ttccgttacg ccgccgcgca gggagtggcc tcgatggtct gcttctacgg agtcccgctt 780
ctgattgtca atggtttcct cgtgttgatc acttacttgc agcacacgca tccttccctg 840
cctcactacg attcgtccga gtgggattgg ttgaggggag ctttggctac cgttgacaga 900
gactacggaa tcttgaacaa ggtcttccac aatattaccg acacgcacgt ggcgcatcat 960
ctgttctcca cgatgccgca ttatcacgcg atggaagcta ccaaggcgat aaagccgata 1020
ctgggagagt attatcagtt cgatgggacg ccggtggtta aggcgatgtg gagggaggcg 1080
aaggagtgta tctatgtgga accggacagg caaggtgaga agaaaggtgt gttctggtac 1140
aacaataagt tatga 1155
<210> 4
<211> 720
<212> DNA
<213> BnaA.FAD2.a核苷酸序列( BnaA.FAD2.a)
<400> 4
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca aaaagtctga aaccgacaac 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccagg gctgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gctggacgac 360
accgtcggcc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa cactggctcc ctcgagagag acgaagtgtt tgtccccaag 480
aagaagtcag acatcaagtg gtacggcaag tacctcaaca accctttggg acgcaccgtg 540
atgttaacgg ttcagttcac tctcggcagc ctggcctttg tacttagcct tcaacgtctc 600
ggggagacct tacgacggcg gcttcgcttg ccatttccac cccaacgctc ccatctacaa 660
cgaccgtgag cgtctccaga tatacatctc cgacgctggc atcctcgccg tctgctacgg 720
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 靶点序列S1(Brassica napus)
<400> 6
cgacgccacc attccaacac tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 靶点序列S2(Brassica napus)
<400> 6
acttagcctt caacgtctcg gga 23
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(BnaFAD2-PS1-gF)
<400> 7
taggtctccc accattccaa cacgttttag agctagaa 38
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(BnaFAD2-PS1-tR)
<400> 8
cgggtctcag gtggcgtcgt gcaccagccg gg 32
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(BnaFAD2-PS2-gF)
<400> 9
taggtctccc ttcaacgtct cggttttaga gctagaa 37
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(BnaFAD2-PS2-tR)
<400> 10
cgggtctcag aaggctaagt tgcaccagcc ggg 33
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(L5AD5-F)
<400> 11
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc aacaaagcac cagtgg 46
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(L3AD5-R)
<400> 12
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa caaaaaaaaa agcaccgact cg 52
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(S5AD5-F)
<400> 13
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc a 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(S3AD5-R)
<400> 14
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(FAD2-CAS9d F)
<400> 15
cgacgctaat ctggacaaag tg 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(FAD2-YM14)
<400> 16
aagaccggca acaggattca 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(FAD2-CAS9d F)
<400> 17
cgacgctaat ctggacaaag tg 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(FAD2-YM14)
<400> 18
aagaccggca acaggattca 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(FCP107)
<400> 19
tcttccactc cttcctcct 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(FCP108)
<400> 20
cgttgtagat gggagcgtt 19
<210> 21
<211> 1152
<212> DNA
<213> PTG8-46核苷酸序列(PTG8-46)
<400> 21
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca agaagtctga aaccgacacc 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccaag ggtgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gcttgacgac 360
accgtcggtc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccac tggctccctc gagagagacg aagtgtttgt ccccaagaag 480
aagtcagaca tcaagtggta cggcaagtac ctcaacaacc ctttgggacg caccgtgatg 540
ttaacggttc agttcactct cggctggccg ttgtacttag ccttcaacgt ctcgggaaga 600
ccttacgacg gcggcttcgc ttgccatttc caccccaacg ctcccatcta caacgaccgc 660
gagcgtctcc agatatacat ctccgacgct ggcatcctcg ccgtctgcta cggtctcttc 720
cgttacgccg ccgcgcaggg agtggcctcg atggtctgct tctacggagt cccgcttctg 780
attgtcaatg gtttcctcgt gttgatcact tacttgcagc acacgcatcc ttccctgcct 840
cactacgatt cgtccgagtg ggattggttg aggggagctt tggctaccgt tgacagagac 900
tacggaatct tgaacaaggt cttccacaat attaccgaca cgcacgtggc gcatcatctg 960
ttctccacga tgccgcatta tcacgcgatg gaagctacca aggcgataaa gccgatactg 1020
ggagagtatt atcagttcga tgggacgccg gtggttaagg cgatgtggag ggaggcgaag 1080
gagtgtatct atgtggaacc ggacaggcaa ggtgagaaga aaggtgtgtt ctggtacaac 1140
aataagttat ga 1152
<210> 22
<211> 383
<212> PRT
<213> PTG8-46蛋白序列(PTG8-46)
<400> 22
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu Gly
165 170 175
Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu Tyr
180 185 190
Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Cys
195 200 205
His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu Gln
210 215 220
Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu Phe
225 230 235 240
Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr Gly
245 250 255
Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu
260 265 270
Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp
275 280 285
Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile Leu
290 295 300
Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu
305 310 315 320
Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile
325 330 335
Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val Val
340 345 350
Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro Asp
355 360 365
Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210> 23
<211> 540
<212> DNA
<213> PTG8-116，A5核苷酸序列(PTG8-116，A5)
<400> 23
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca aaaagtctga aaccgacaac 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccagg gctgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gctggacgac 360
accgtcggcc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccac actggctccc tcgagagaga cgaagtgttt gtccccaaga 480
agaagtcaga catcaagtgg tacggcaagt acctcaacaa ccctttggga cgcaccgtga 540
<210> 24
<211> 179
<212> PRT
<213> PTG8-116，A5蛋白序列(PTG8-116，A5)
<400> 24
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Thr Leu Ala Pro Ser Arg Glu Thr Lys Cys Leu Ser Pro Arg
145 150 155 160
Arg Ser Gln Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Thr Ser Thr Thr Leu Trp
165 170 175
Asp Ala Pro
<210> 26
<211> 900
<212> DNA
<213> PTG8-116，C5核苷酸序列(PTG8-116，C5)
<400> 26
atgggtgcag gtggaagaat gcaagtgtct cctccctcca agaagtctga aaccgacacc 60
atcaagcgcg taccctgcga gacaccgccc ttcactgtcg gagaactcaa gaaagcaatc 120
ccaccgcact gtttcaaacg ctcgatccct cgctctttct cctacctcat ctgggacatc 180
atcatagcct cctgcttcta ctacgtcgcc accacttact tccctctcct ccctcaccct 240
ctctcctact tcgcctggcc tctctactgg gcctgccaag ggtgcgtcct aaccggcgtc 300
tgggtcatag cccacgagtg cggccaccac gccttcagcg actaccagtg gcttgacgac 360
accgtcggtc tcatcttcca ctccttcctc ctcgtccctt acttctcctg gaagtacagt 420
catcgacgcc accattccaa acactggctc cctcgagaga gacgaagtgt ttgtccccaa 480
gaagaagtca gacatcaagt ggtacggcaa gtacctcaac aaccctttgg gacgcaccgt 540
gatgttaacg gttcagttca ctctcggctg gccgttgtac ttagccttca acgtctcggg 600
aagaccttac gacggcggct tcgcttgcca tttccacccc aacgctccca tctacaacga 660
ccgcgagcgt ctccagatat acatctccga cgctggcatc ctcgccgtct gctacggtct 720
cttccgttac gccgccgcgc agggagtggc ctcgatggtc tgcttctacg gagtcccgct 780
tctgattgtc aatggtttcc tcgtgttgat cacttacttg cagcacacgc atccttccct 840
gcctcactac gattcgtccg agtgggattg gttgagggga gctttggcta ccgttgacag 900
<210> 26
<211> 298
<212> PRT
<213> PTG8-116，C5蛋白序列(PTG8-116，C5)
<400> 26
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Lys His Trp Leu Pro Arg Glu Arg Arg Ser Val Cys Pro Gln
145 150 155 160
Glu Glu Val Arg His Gln Val Val Arg Gln Val Pro Gln Gln Pro Phe
165 170 175
Gly Thr His Arg Asp Val Asn Gly Ser Val His Ser Arg Leu Ala Val
180 185 190
Val Leu Ser Leu Gln Arg Leu Gly Lys Thr Leu Arg Arg Arg Leu Arg
195 200 205
Leu Pro Phe Pro Pro Gln Arg Ser His Leu Gln Arg Pro Arg Ala Ser
210 215 220
Pro Asp Ile His Leu Arg Arg Trp His Pro Arg Arg Leu Leu Arg Ser
225 230 235 240
Leu Pro Leu Arg Arg Arg Ala Gly Ser Gly Leu Asp Gly Leu Leu Leu
245 250 255
Arg Ser Pro Ala Ser Asp Cys Gln Trp Phe Pro Arg Val Asp His Leu
260 265 270
Leu Ala Ala His Ala Ser Phe Pro Ala Ser Leu Arg Phe Val Arg Val
275 280 285
Gly Leu Val Glu Gly Ser Phe Gly Tyr Arg
290 295
<210> 27
<211> 384
<212> PRT
<213> BnaC.FAD2.a蛋白序列(BnaC.FAD2.a)
<400> 27
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala
195 200 205
Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu
225 230 235 240
Phe Arg Tyr Ala Ala Ala Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr
245 250 255
Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr
260 265 270
Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp
275 280 285
Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile
290 295 300
Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His
305 310 315 320
Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala
325 330 335
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val
340 345 350
Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
<210> 28
<211> 222
<212> PRT
<213> BnaA.FAD2.a蛋白序列(BnaA.FAD2.a)
<400> 28
Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser
1 5 10 15
Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr
20 25 30
Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45
Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser
50 55 60
Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro
65 70 75 80
Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser
115 120 125
Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu
165 170 175
Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Ser Leu Ala
180 185 190
Phe Val Leu Ser Leu Gln Arg Leu Gly Glu Thr Leu Arg Arg Arg Leu
195 200 205
Arg Leu Pro Phe Pro Pro Gln Arg Ser His Leu Gln Arg Pro
210 215 220

Claims (3)

1.一种甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：根据甘蓝型油菜BnaC.FAD2.a和BnaA.FAD2.a基因核苷酸序列设计并筛选两个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；步骤S1中两个靶点序列分别见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；针对靶点序列设计的引物序列分别见SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
S2：构建双靶点基因编辑载体BnPTG8载体；步骤S2中构建双靶点基因编辑载体BnPTG8载体的步骤包括：获取sgRNA序列片段；将获得的sgRNA序列片段依次连接；将连接产物酶切后与载体连接；将连接成功的载体转入农杆菌 GV3101感受态细胞，得到BnPTG8载体农杆菌菌株；
S3：BnPTG8载体与受体材料遗传转化，获得基因突变体；步骤S3中所用受体材料为ZP1品系植株；
所获得的基因突变体为A5和C5两个拷贝同时突变的双突变体，具体为BnaC.FAD2.a基因第440和441位处插入1个碱基，插入碱基为A；BnaA.FAD2.a基因第568-571位处缺失4个碱基，所缺失的碱基为AGCC，第599位处缺失1个碱基，所缺失的碱基为T。
2.如权利要求1所述的甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法在油菜育种中的应用。
3.利用权利要求1所述的甘蓝型油菜基因突变体PTG8的构建方法获得的A5和C5拷贝双突变体在油菜育种中的应用。
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