CN111304236A - 基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法 - Google Patents

基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法，包括以下步骤：选取能同时作用A5 FAD2和C5 FAD2的靶位点T1、T2和T3、组装gRNA表达盒、完成A5 FAD2和C5 FAD2双位点编辑载体的构建、转入农杆菌GV3101、转化油菜，经过筛选获得A5 FAD2和C5 FAD2同时发生突变的转基因植株。本发明利用CRISPR/Cas9 system以高含油量的半冬性材料B57为受体，同时针对A5和C5上的FAD2基因同时进行编辑，获得了A5 FAD2和C5 FAD2双位点同时突变的油菜高油酸材料，其油酸含量在86.4％‑89.6％之间。

Description

基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜FAD2基因进行双位点编辑以获得高油酸含量的油菜的方法。
背景技术
在油菜不饱和脂肪酸组分中，研究者在油酸对人类健康促进作用的认识深度和广度上是最为深刻的。研究表明，地中海地区的人们患有心血管疾病的概率要远低于欧洲其他国家，其主要原因是长期食用含高油酸的橄榄油(Martínez-González and Sánchez-Villegas,2004)。已有证据表明，橄榄油中的油酸含量是降低血压的关键因子之一(Teréset al.,2008)，其不仅有利于降低血压，在止血系统中也有重要作用，如减少血小板凝聚的敏感性，降低血管性血友病和质膜血栓素B2含量以及溶纤蛋白活性等(Lopez-Miranda etal.，2007)。另一方面，高油酸菜籽油化学性质稳定，较耐贮藏，可延长货架期，并且高油酸菜籽油能有效进行甲酯化，利于生物柴油的生产。由此可见，高油酸菜籽油不仅仅在健康保健和食品加工方面非常重要，同时在工业应用上也具有重要的作用。因此，培育油菜高油酸品种是今后油菜育种的重要方向，亦是油菜品质改良的重要组成部分。
油菜高油酸品种目前通过品种审定或者品种登记的比较少。其中浙油80是由浙江省农业科学院培育出的全国唯一一个通过审定的品种。随后，华中农业大学、湖南农业大学等研究单位也有高油酸油菜品种相继育成并进行品种登记。其中浙油80油酸含量在80％～83％之间，华中农业大学等登记的高油酸品种油酸含量接近80％。
植物种子油酸合成的代谢途径已经较为清楚，诸多证据表明，在各种油料作物中，通过操纵FAD2基因，减少油酸向亚油酸转化，可以大幅度提高种子的油酸含量。如在大豆中，FAD2发生突变后，纯合体fad2-1a和fad2-1b的油酸含量达到了82％-86％(Pham etal.，2011)。在亚麻中，采用RNAi的方法，将两个FAD2基因同时沉默后，其籽粒中的油酸含量提高到了80％(Chen et al.，2015)。其他作物如玉米、棉籽、花生、亚麻荠等也可通过改变FAD2基因从而达到提高种子油酸含量的目的。通过以往的这些研究，表明了(1)各个作物种子中油酸含量与FAD2基因密切相关，且具有较高的保守性；(2)FAD2具有很高的可操纵性。即在各作物中，通过遗传操纵FAD2基因后，种子中的油酸含量均能提高。
CRISPR/Cas9 system是目前最新的基因编辑系统，虽然在油酸改良方面Okuzaki等(2018)利用CRISPR/Cas9 system针对FAD2进行了编辑，但其只编辑了甘蓝型油菜A5上的FAD2基因，使用的受体为春油菜Westar，纯合的突变体油酸含量从73％提高到了80％，效果并不太显著。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供了一种基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法，利用CRISPR/Cas9 system以高含油量的半冬性材料B57为受体，同时针对A5和C5上的FAD2基因同时进行编辑，获得了A5 FAD2和C5 FAD2双位点同时突变的油菜高油酸材料，其油酸含量在86.4％-89.6％之间。
基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)选取能同时作用A5 FAD2和C5 FAD2的靶位点T1、T2和T3，其序列如下：
T1序列：5’-CCGCCCTTCACTGTCGGAGAACT-3；
T2序列：5’-CGACGCCACCATTCCAACACTGG-3’；
T3序列：5’-TACTTAGCCTTCAACGTCTCGGG-3’；
(2)合成gRNA接头引物，进行gRNA表达盒的组装，将组装好的gRNA表达盒连入pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体中，完成A5 FAD2和C5 FAD2双位点编辑载体的构建，载体命名为P35S：BnFAD2；
(3)将构建好的P35S：BnFAD2载体转入农杆菌GV3101电转感受态细胞；
(4)通过农杆菌介导的下胚轴遗传转化油菜，经过筛选获得A5 FAD2和C5FAD2同时发生突变的转基因植株。
进一步地，步骤(2)所述gRNA接头引物序列为：
BnFAD2T1-F：gtcAGTTCTCCGACAGTGAAGGG
BnFAD2T1-R：aaacCCCTTCACTGTCGGAGAAC；
BnFAD2T2-F：gtcaCGACGCCACCATTCCAACAC
BnFAD2T2-R：aaacGTGTTGGAATGGTGGCGTCG；
BnFAD2T3-F：attgTACTTAGCCTTCAACGTCTC
BnFAD2T3-R：aaacGAGACGTTGAAGGCTAAGTA。
进一步地，所述油菜为甘蓝型油菜。
本发明研究和发现了可增加油酸含量的靶位点T1、T2和T3，通过CRISPR/Cas9基因技术对A5 FAD2和C5 FAD2同时编辑，实验证明，编辑效率为74％，双位点编辑效率高达84％。且同时针对A5和C5上的FAD2基因编辑后，得到的转基因油菜植株与对照植株相比，油酸含量显著增加，双位点同时发生编辑的植株油酸含量较对照均提高了约20个百分点。
附图说明
图1是载体P35S：BnFAD2示意图。
图2是206、230、238、240和342株系A5和C5位点基因组编辑后的序列。
具体实施方式
实施例1：CRISPR/Cas9靶位点的选择以及载体构建
CRISPR/Cas9相关载体均由刘耀光教授(华南农业大学)提供。登陆网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，将甘蓝型油菜基因组数据库(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中下载到的C5 FAD2基因序列导入，选取能同时作用A5 FAD2和C5 FAD2的靶位点T1、T2和T3，其序列为：
T1序列5’-CCGCCCTTCACTGTCGGAGAACT-3；
T2序列5’-CGACGCCACCATTCCAACACTGG-3’；
T3序列5’-TACTTAGCCTTCAACGTCTCGGG-3’。
合成gRNA接头引物(见表1)，进行gRNA表达盒的组装，将组装好的gRNA表达盒连入pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体中，即完成了A5 FAD2和C5 FAD2双位点编辑载体的构建，载体命名为P35S：BnFAD2(如图1所示)。
表1编辑靶点接头引物
Figure BDA0002365504560000031
Figure BDA0002365504560000041
实施例2：转基因油菜植株的获得
将构建好的P35S：BnFAD2载体转入农杆菌GV3101电转感受态细胞。利用农杆菌介导的下胚轴转化法转化甘蓝型油菜。
具体方法为：取避光下生长7d的甘蓝型油菜(B57)下胚轴，用手术剪剪成5-7mm长节段。用侵染悬浮液M0将OD＝0.8的农杆菌进行重悬浮后稀释20倍，侵染甘蓝型油菜的下胚轴10min。M0配方：MS基本培养基，30.0g/L蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.90后灭菌，灭菌后冷却到40℃左右加入100.0μm/L乙酰丁香酮(AS)；接着将侵染后的甘蓝型油菜下胚轴转到干燥的灭菌滤纸上吸干菌液，整齐摆入共培养培养基M1中，暗光培养2d。M1配方：MS基本培养基，30.0g/L蔗糖，18.0g/L甘露醇，1.0mg/L 2,4-D，0.3mg/L的细胞激动素(KT)，8.0g/L琼脂，补充蒸馏水至1L，调pH至5.90后灭菌，灭菌后冷却到40℃左右加入100.0μm/L AS；将共培养2d的下胚轴外植体转到愈伤诱导培养基M2中诱导愈伤组织，于光照培养室中培养。M2配方与M1配方在灭菌前配制方法相同，灭菌完后，加入30.0μm/L硫代硫酸银(STS)，300.0mg/L特美汀(Timentin)，25.0mg/L潮霉素B；大约三周后将愈伤组织转入分化培养基M3中，继续在光照培养室中培养，每18d继代一次，直至出芽。M3配方：MS基本培养基，10.0g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L吗啉乙磺酸(MES)，8.0g/L琼脂，补充蒸馏水至1L，调pH至5.90后灭菌，灭菌后冷却到40℃左右加入2.0mg/L玉米素(ZT)，0.1mg/L吲哚乙酸(IAA)，300.0mg/L特美汀(Timentin)，25.0mg/L潮霉素B；最后将再生植株移到MS基本培养基(含30g/L蔗糖)中进行生根培养。
实施例3：转基因植株阳性鉴定和编辑位点分析
通过农杆菌介导的下胚轴遗传转化共获得了148株转基因植株。利用CTAB法提取转基因植株的DNA，首先用CRISPR/Cas9检测引物对SP-L2和SP-R(SP-L2：GTCGTGCTCCACATGTTGACCG；SP-R：CCGACATAGATGCAATAA CTTC)对其进行PCR扩增，其中有120个有扩增条带，阳性率为81％。设计能分别扩增A5 FAD2和C5 FAD2基因的引物两对，其扩增片段均包含三个编辑位点。其中扩增A5 FAD2引物序列为A5-F：TGACAATAGAGTTGCTCTCAACTGT；A5-R：GCTAAGCCATTACACTGTTCAGG；扩增C5 FAD2引物序列为C5-F：CTGTAGCGTATCAAATCTCGTTC；C5-R：ATGCCACATTGAGGTAGTTCG。
使用普通taq酶进行PCR扩增，PCR反应条件为94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s，35个循环；72℃10min。PCR产物直接送到测序公司进行测序，测序引物均为NP7-2(NP7-2：AGTCTTTGCTTTTGGCTTATGC)。测序结果显示120个样品中，有31个样品在A5 FAD2和C5 FAD2位点上均未发生编辑，有14个样品只在A5 FAD2或者C5 FAD2位点上发生了编辑(包含两个A5纯合编辑和一个C5纯合编辑)，其余75个样品在A5 FAD2和C5 FAD2均同时发生了编辑，可见编辑效率为74％，双位点编辑效率高达84％。在这些双位点同时发生编辑的转基因植株中，有13株为双位点纯合突变类型，其余为双位点杂合或者一位点纯合一位点杂合的突变类型。图2所示为双位点纯合突变株系206、230、238、240和342中A5和C5位点基因组编辑后的序列。
实施例4：双位点纯合突变类型转基因植株T0代种子脂肪酸组分分析
收获T0代纯合突变类型(单位点纯合和双位点纯合)转基因植株的种子，利用气相色谱仪(岛津GC-2014)分析其脂肪酸组分。具体方法为：取15粒种子置于6×10cm牛皮纸袋中，80℃烘2h后放在干燥器中冷却；将装有种子的牛皮纸袋平放在石板上，用铁锤敲碎种子后倒入10mL磨口玻璃管中，加入苯-石油醚(1:1)试剂浸提过夜；加入1mL甲醇-KOH溶液(KOH0.4mol/L)，轻轻混匀，半小时后加纯水定容至10mL；静置20min后，取上清600μL于2mL进样瓶中，置于自动进样器(AOC-20i)上进行GC分析，结果如表2所示。
表2纯合突变类型转基因植株T0代种子脂肪酸组分分析
Figure BDA0002365504560000061
从表2中可以看出，单位点发生编辑的植株油酸含量较对照大约提高了10个百分点，而双位点同时发生编辑的植株油酸含量较对照均提高了约20个百分点。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
湖州市农业科学研究院
<120> 基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 1
ccgcccttca ctgtcggaga act 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 2
cgacgccacc attccaacac tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)
<400> 3
tacttagcct tcaacgtctc ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcagttctc cgacagtgaa ggg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaccccttc actgtcggag aac 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcacgacgc caccattcca acac 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacgtgttg gaatggtggc gtcg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attgtactta gccttcaacg tctc 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaacgagacg ttgaaggcta agta 24

Claims (3)

1.基于双位点基因组编辑获得高油酸油菜的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)选取能同时作用A5 FAD2和C5 FAD2的靶位点T1、T2和T3，其序列如下：
T1序列：5’-CCGCCCTTCACTGTCGGAGAACT-3’；
T2序列：5’-CGACGCCACCATTCCAACACTGG-3’；
T3序列：5’-TACTTAGCCTTCAACGTCTCGGG-3’；
(2)合成gRNA接头引物，进行gRNA表达盒的组装，将组装好的gRNA表达盒连入pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体中，完成A5 FAD2和C5 FAD2双位点编辑载体的构建，载体命名为P35S：BnFAD2；
(3)将构建好的P35S：BnFAD2载体转入农杆菌GV3101电转感受态细胞；
(4)通过农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法转化油菜，经过筛选获得A5FAD2和C5FAD2同时发生突变的转基因植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述gRNA接头引物序列为：
BnFAD2T1-F：gtcAGTTCTCCGACAGTGAAGGG
BnFAD2T1-R：aaacCCCTTCACTGTCGGAGAAC；
BnFAD2T2-F：gtcaCGACGCCACCATTCCAACAC
BnFAD2T2-R：aaacGTGTTGGAATGGTGGCGTCG；
BnFAD2T3-F：attgTACTTAGCCTTCAACGTCTC
BnFAD2T3-R：aaacGAGACGTTGAAGGCTAAGTA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油菜为甘蓝型油菜。
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