CN116286946A - 一种无外源dna的植物基因编辑方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无外源DNA的植物基因编辑方法，通过采用含有移动TLS(tRNA like sequence)基因编辑元件的发根农杆菌侵染植物的营养体，之后进行培养至营养体萌发出转基因毛状根，含有移动TLS基因编辑元件所转录的RNA在移动TLS的带动下从根部移动到营养体新生长的器官以编辑植物基因组。与现有方法相比，本发明的方法无需组培、嫁接和根诱导芽，不受基因型和物种限制的，操作简单，可应用到所有具有茎并能诱导毛状根的草本和木本植物，可以极大地促进CRISPR/Cas9、Cpf1等基因编辑技术在基因功能验证和基因工程育种的应用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种简单高效、无需组培的无外源DNA的植物基因编辑方法。
背景技术
针对作物高产稳产和优质重要农艺性状进行的传统育种和分子设计育种，一直是科研工作者和育种专家进行作物遗传改良的主要手段。其中使用CRISPR/Cas9系统的高精度植物基因组编辑技术以引入有益的基因功能或去除不利的基因功能方向的研究获得突飞猛进的发展。无外源DNA、DNA-free或Transgene-free基因组编辑技术，能够产生非转基因的基因组编辑植物或动物，消除了基因编辑载体整合到基因组中带来的风险，也减少了基因编辑的脱靶率。这很大程度上缓解了人们对基因编辑产品在环境和食品安全方面的顾虑，对于基因编辑育种的推广具有重要的价值。但是这种基于遗传转化、组织培养和转基因元件分离的基因编辑技术既昂贵又费时费力，从而使其不适用于大多数重要农作物。
研究论文“Cut-dip-budding delivery system enables geneticmodifications in plants without tissue culture”公开了一个极其简单的切-浸-萌芽(CDB)递送系统，使用发根农杆菌侵染切后的根茎交界处，上部分茎产生转化根，再由转化根产生转化的植株。利用CDB递送系统成功地实现了多个植物家族的植物物种的遗传转化，包括两种草本植物(橡胶草和小冠花)、一种块茎类根茎植物(甘薯)和三种木本植物物种(臭椿、辽东楤木和重瓣臭茉莉)。这些植物以前很难或不可能进行遗传转化，但CDB递送系统在非无菌条件下，无需组织培养，使用一个非常简单的外植体浸泡过程，就能在这些植物中进行有效的转化或基因编辑。但该方法需要根诱导成芽和植株，受根难于诱导成芽的物种限制，不能实现无外源DNA基因编辑。
研究论文“Heritable transgene-free genome editing in plants bytransfer of Cas9 and gRNA transcripts from transgenic donor rootstocks tografted wild-type shoots”公开了通过使用移动TLS(tRNA like sequence)和CRISPR工具(又称“基因剪刀”)，将嫁接与“移动”CRISPR剪辑工具相结合，实现了植物跨物种的远距离基因编辑。这种技术方法可以简化和加快新型、遗传稳定的商业作物品种的开发。但该方法需要遗传转化和嫁接，操作技术复杂，嫁接也受物种限制。
目前，还没有报道简单高效、无需组培、不受基因型和物种限制的无外源DNA的植物基因编辑方法。
发明内容
本发明开发了一种无需组培和嫁接、不受基因型和物种限制的简单高效的无外源DNA的植物基因编辑方法，可应用到所有具有茎并能诱导毛状根的草本和木本植物，可以极大地促进基因编辑技术在基因功能验证和基因工程育种的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种无外源DNA的植物基因编辑方法，采用含有移动TLS基因编辑元件的发根农杆菌侵染植物的营养体，之后进行培养至营养体萌发出转基因毛状根，含有移动TLS基因编辑元件所转录的RNA在移动TLS的带动下从根部移动到营养体新生长的器官以编辑植物基因组。
进一步地，所述植物为具有茎并能诱导毛状根的植物。
更进一步地，所述植物为草本植物或木本植物。优选地，草本植物为白菜、辣椒、番茄、黄瓜、洋葱、小麦、水稻等；木本植物为苹果、梨、桃等。
如图1所示，在本发明中，上述方法包括以下步骤：
步骤1，根据待编辑的目的基因设计sgRNA，合成带有移动TLS的sgRNA表达盒；
步骤2，将步骤1得到的sgRNA表达盒插入到CRISPR/Cas9基因编辑载体骨架，并在cas9蛋白基因末端添加移动TLS序列，构建得到含有移动TLS基因编辑元件，然后将含有移动TLS基因编辑元件转化发根农杆菌；
步骤3，将步骤2转化后的发根农杆菌侵染植物的营养体，如胚轴、茎、枝条等，培养后至营养体萌发出转基因毛状根，继续培养，含有移动TLS基因编辑元件所转录的RNA在移动TLS的带动下从根部移动到营养体新生长的器官以编辑植物基因组。
在本发明的一个实施例中，以白菜、辣椒和番茄的DMP9基因为目的基因，选用可移动元件TLS2，以pYLCRISPR/Cas9P35S-N作基因编辑载体骨架进行了植物基因编辑，实现了无外源DNA的植物基因编辑。
本发明结合发根农杆菌诱导毛状根转化系统和TLS(tRNA like sequence)移动元件介导的可移动CRISPR/Cas9基因编辑技术，以可移动CRISPR/Cas9基因编辑载体转化发根农杆菌，发根农杆菌侵染生根产生可移动基因编辑元件，运输到新生长的嫩芽、植株、叶片、花、果实、种子等器官发生基因编辑，开发了一种简单高效的无外源DNA的植物基因编辑方法。
与现有方法相比，本发明的方法无需组培、嫁接和根诱导芽，不受基因型和物种限制的，操作简单，可应用到所有具有茎并能诱导毛状根的草本和木本植物，可以极大地促进CRISPR/Cas9、Cpf1等基因编辑技术在基因功能验证和基因工程育种的应用。
附图说明
图1为本发明中发根农杆菌和TLS移动元件介导的可移动CRISPR/Cas9基因编辑方法的流程示意图。
图2为实施例1中可移动CRISPR/Cas9基因编辑载体图。
图3为实施例1中白菜、辣椒和番茄DMP9基因编辑位点检测序列比对图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
1、基因编辑载体构建和发根农杆菌转化
1.1目的基因sgRNA设计
敲除植物DMP9基因可以构建植物单倍体诱导系，本实施例选择白菜、辣椒和番茄DMP9同源基因，利用华中农业大学设计工具http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/设计白菜、辣椒和番茄DMP9基因sgRNA序列，软件根据On-target/off-target scores、location(geneexon,intron,UTR or inttergenic)和CG content(30％-80％ CG content)等参数优选引物序列如表1。
表1sgRNA序列
按照Friedrich Kragler课题组题(Lei Yang等，2023)的方法人工合成带有可以移动元件TLS2序列的sgRNA的表达盒，序列如下所示：
cgacttgccttccgcacaatacatcatttcttcttagctttttttcttcttcttcgttcatacagtttttttttgtttatcagcttacattttcttgaaccgtagctttcgttttcttctttttaactttccattcggagtttttgtatcttgtttcatagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaatttgattgaataaaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgggaatctgaaagaagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttatataggcccatttaagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacgaagctgagtttatatacagctagagtcgaagtagtgATTGGAAAACAGAGGAAAGCGTGTTTtagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcATTATCAGAGTGGTGGTGGGCCCATAACCCACAGGTCCGCTCTGATAAAAAAAAAttttttttgcaaaattttccagatcgatttcttcttcctctgttcttcggcgttcaatttctggggttttctcttcgttttctgtaactgaaacctaaaatttgacctaaaaaaaatctcaaataatatgattcagtggttttgtacttttcagttagttgagttttgcagttccgatgagataaaccaatattaatccaaact(Seq_4)；
其中：
cgacttgccttccgcacaatacatcatttcttcttagctttttttcttcttcttcgttcatacagtttttttttgtttatcagcttacattttcttgaaccgtagctttcgttttcttctttttaactttccattcggagtttttgtatcttgtttcatagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaatttgattgaataaaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgggaatctgaaagaagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttatataggcccatttaagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacgaagctgagtttatatacagctagagtcgaagtagtg(Seq_5)为pU6-26 promoter；
GAAAACAGAGGAAAGCGT(Seq_6)为sgRNA；
tagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(Seq_7)为gRNA Scaffold sequence；
ATTATCAGAGTGGTGGTGGGCCCATAACCCACAGGTCCGCTCTGATA(Seq_8)为tRNAMetΔDT(TLS2)sequences；
ttttttttgcaaaattttccagatcgatttcttcttcctctgttcttcggcgttcaatttctggggttttctcttcgttttctgtaactgaaacctaaaatttgacctaaaaaaaatctcaaataatatgattcagtggttttgtacttttcagttagttgagttttgcagttccgatgagataaaccaatattaatccaaact(Seq_9)为tU6-26terminator sequence。
1.2可移动CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
基因编辑载体骨架采用华南农业大学刘耀光院士课题组pYLCRISPR/Cas9P35S-N(Addgene Plasmid#66191)，按照Friedrich Kragler课题组题(Lei Yang等，2023)的方法在cas9蛋白终止密码子后面添加TLS2序列(ATTATCAGAGTGGTGGTGGGCCCATAACCCACAGGTCCGCTCTGATATCGA)，得到pYLCRISPR/Cas9-TLS2，将合成的sgRNA的表达盒利用AscI酶切位点插入到该载体，得到可移动CRISPR/Cas9基因编辑载体，如图2所示。
可移动CRISPR/Cas9基因编辑载体质粒采用冻融法转化发根农杆菌K599(NCPPB2659,streptomycin resistance)，从平板上挑取阳性克隆用1mL LB培养基(含50mg/L kanamycin和50mg/L streptomycin)在28℃、250rpm摇菌，然后取200μL在固体LB平板(含50mg/Lkanamycin和50mg/Lstreptomycin)上28℃过夜培养。
1.3发根农杆菌侵染
选取白菜49菜心、辣椒南京早椒、番茄micro-TOM生长期短、颗粒饱满、大小相近的种子，播种在灭菌蛭石基质中，培养条件为：光照12h，光强2000～3000lx，温度25℃。等到7d之后，两片子叶长势良好，从中选取大小一致的植株，切取带有两片子叶的下胚轴，用涂布器从LB平板上刮取含有可移动CRISPR/Cas9基因编辑载体质粒的发根农杆菌，涂抹在下胚轴基部伤口处，栽培到基质里培养，保持基质和环境湿润。待发根后利用PCR扩增Cas9基因，检测根系是否含有基因编辑元件；为了快速获得种子，将带有阳性根系的植株可按短生长周期培养，并收获种子。
1.4基因编辑植株鉴定
取白菜、辣椒和番茄阳性根系植株收获的种子各200粒，进行播种培养，用CTAB法提取叶片的基因组DNA根据编辑的基因序列，设计包含编辑位点的引物进行PCR扩增(表2)，扩增后的PCR片段用胶回收试剂盒纯化回收，连接T载体后，进行大肠杆菌的转化，每个样品挑取3个单克隆摇菌后进行菌液PCR然后送公司测序。将测序结果与基因序列进行比较，检测基因位点是否被编辑，并计算编辑效率。
表2不结球白菜和辣椒编辑位点鉴定引物序列
如图3的结果显示，白菜200粒种子的测序的结果中有2个样品的序列在基因编辑位点附近发生了基因突变，基因编辑效率为1.0％；辣椒200粒种子的测序的结果中有1个样品的序列发生了基因突变，基因编辑效率为0.5％；番茄200粒种子的测序的结果中有4个样品的序列发生了基因突变，基因编辑效率为2.0％。
Claims (6)
1.一种无外源DNA的植物基因编辑方法，其特征在于：采用含有移动TLS基因编辑元件的发根农杆菌侵染植物的营养体，之后进行培养至营养体萌发出转基因毛状根，含有移动TLS基因编辑元件所转录的RNA在移动TLS的带动下从根部移动到营养体新生长的器官以编辑植物基因组。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物为具有茎并能诱导毛状根的植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述植物为草本植物或木本植物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述草本植物为白菜、辣椒、番茄、黄瓜、洋葱、小麦或水稻；所述木本植物为苹果、梨或桃。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，根据待编辑的目的基因设计sgRNA，合成带有移动TLS的sgRNA表达盒；
步骤2，将步骤1得到的sgRNA表达盒插入到CRISPR/Cas9基因编辑载体骨架，并在cas9蛋白基因末端添加移动TLS序列，构建得到含有移动TLS基因编辑元件，然后将含有移动TLS基因编辑元件转化发根农杆菌；
步骤3，将步骤2转化后的发根农杆菌侵染植物的营养体，培养后至营养体萌发出转基因毛状根，继续培养，含有移动TLS基因编辑元件所携带的RNA在移动TLS的带动下从根部移动到营养体新生长的器官以编辑植物基因组。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述移动TLS为TLS2序列。
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