CN110699377A - 一种花生转基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花生转基因的方法，包括如下步骤：(1)消毒浸种，(2)切取半粒种子，(3)预培养，(4)农杆菌浸染，(5)共培养，(6)蛭石培养，(7)潮霉素筛选，(8)PCR检测。本发明直接将共培养花生种子播种在蛭石中成苗，并利用潮霉素水培法筛选阳性植株，避免了组织培养过程中复杂而繁琐的无菌操作培养以及成苗后的练苗过程。无需特殊的器材、技术和培养条件，操作过程极其简单。本发明直接对花生半粒种子进行遗传转化，大大缩短了遗传转化的时间，从浸种到成苗仅需20天。

Description

一种花生转基因的方法
技术领域
本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种花生转基因的方法。
背景技术
花生(Arachis hypogaea L.)是全球第四大油料作物，也是中国重要的经济和油料作物之一。花生的遗传转化研究起步较晚，由于技术难度较大，进展缓慢。根癌农杆菌介导的基因转化是利用Ti质粒实现基因的转移并整合到植物细胞基因组中的天然转化途径之一。该转化系统由于理论机理最清楚、技术方法最成熟，已被广泛应用于花生转基因研究。近年来，花生的遗传转化研究随着体细胞再生技术的进步取得了很大进展，已经可以有目的地获得特定基因的转化花生植株。但是这些花生转化系统普遍存在着转化周期长，筛选难度大，转化效率低及重复性差的问题。
目前已建立的花生遗传转化体系主要是基于组织培养技术，以胚小叶、子叶节、下胚轴、带子叶的胚轴等作为外植体，但是这些遗传转化体系操作复杂、转化周期长、重复性差。
中国油料作物学报2018，40(2)公开了农杆菌介导的花生遗传转化条件优化，该文献中，为建立花生快速高效的遗传转化体系,以浸泡吸水后的花生半粒种子为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,以除草剂Basta抗性筛选及基因组DNA的bar基因PCR检测为指标,优化花生遗传转化体系。研究结果表明,在侵染悬浮液中加入1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)提高了农杆菌介导的转化效率(最高提升36.5％)；与YEB培养液相比,AB重悬液的使用显著提高了农杆菌的转化效率(最高提升19.3％)；农杆菌菌液OD_(600)为0.7时转化效率最高；基因型显著影响转化效率,EXP27-1516的转化效率为69.03％,显著高于14AU01(56.67％)；以花生半粒种子为转化受体,从种子培养到形成茁壮根系仅需8周,明显短于子叶节转化所需的13周。优化后的农杆菌介导的花生遗传转化体系为花生转基因研究提供了重要的研究工具。即使如此，由于该方法将半粒种子接种到MS培养基上，因此，需要严格的无菌操作，而且成苗后需要练苗。更重要的是，该方法采用的质粒载体为p201B Cas9，仅含有选择标记基因(对除草剂Basta有抗性的bar基因)，没有目的基因，其实际应用价值有限。
申请号为2016111395009的中国专利申请公开了利用横切花生种子快速获得转基因花生的方法及其应用，包括以下步骤：1)取处于对数生长期的含有外源基因的农杆菌，重悬于培养基中，得到转化菌液；2)取成熟的花生种子，浸泡20-30分钟，萌发0-4天；然后在离胚根0.2-0.5cm处将所述花生种子横切为两半，选择含有胚根的一半，即为转化受体；3)将所述转化受体浸泡在转化菌液中，侵染20-50分钟，接着取出转化受体，吸干表面的液体，再置于吸水纸上，于22±2℃暗培养3-4天，得到花生幼苗；培养过程中，向吸水纸上喷施含0.2mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基，使得吸水纸保持湿润；4)将所述花生幼苗继续培养至得到花生植株，对花生植株进行鉴定，即可确定转基因植株。该方法共培养后半粒种子成苗培养过程中用的是MS培养基，需要无菌操作，成苗后需要练苗。大大的增加了成本及时间，获得转基因植株需要3个月。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：克服现有的花生转基因技术难度大、培养周期长、转化效率偏低等缺陷，提供一种快速、简单、高效且实用的花生转基因新技术。
本发明的技术方案为：
一种花生转基因的方法，包括如下步骤：
1.一种花生转基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)消毒浸种：将花生种子先用70％酒精清洗1～2min，再用0.1％升汞清洗5～8min，然后用无菌水清洗3次每次3～5min，最后将花生移至无菌水中浸种24h。
(2)切取半粒种子：在无菌条件下，将经过消毒浸种处理后的花生剥皮，然后将刀插入花生的裂缝中，压住一片子叶，再用工具夹住另一片子叶将其去除；
(3)预培养：将半粒种子放于MS液体基本培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养1～3d；
(4)农杆菌浸染：利用含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因的pCXSN质粒载体构建AhZIP1基因的过表达载体，并转入农杆菌GV3101中；活化的农杆菌接种于含有20μL卡那霉素，100μL利福平的20mLYEP液体培养基中，于240rpm、28℃摇床震荡3～4h；摇菌至OD600为0.6～0.9时离心收菌，将重悬好的菌种置于收菌MS中，并加入浓度为150μM的乙酰丁香酮和1mM的二硫苏糖醇；将步骤(3)处理后的半粒种子移入菌液中，30Hz超声处理4～10min，然后在真空度为0.06MP的条件下真空处理5～10min；
(5)共培养：将已侵染农杆菌的半粒种子置于含有150μM AS的液体MS培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养2～5d；
(6)蛭石培养：完成共培养的半粒种子洗涤后直接播种于蛭石中，在光照条件下进行培养；
(7)潮霉素筛选：待花生长出两个复叶后，移苗至含30～40％潮霉素的Hoagland营养液中进行筛选；培养3天后，存活的正常植株即为潮霉素抗性植株；
(8)PCR检测：潮霉素筛选获得的潜在转基因阳性植株可进一步移到蛭石中进行培养，待苗长大后，剪取叶片提取DNA，进行PCR检测鉴定。
进一步地，步骤(1)消毒浸种：将花生种子放入锥形瓶中，先用70％酒精清洗1min，再用0.1％升汞清洗6min，然后用无菌水清洗3次每次4min，最后将花生移至无菌水中浸种24h。
进一步地，步骤(2)切取半粒种子：在无菌条件下，用消过毒的镊子将浸泡24h的花生放在带滤纸的培养皿上，将花生剥皮，将刀插入花生的裂缝中，压住一片子叶，再用镊子夹住另一片子叶将其去除。
进一步地，步骤(3)预培养：将半粒种子(去掉一片子叶的胚)放于MS液体基本培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养2d。
进一步地，步骤(4)农杆菌浸染：利用pCXSN质粒载体(含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因)构建AhZIP1基因的过表达载体，并转入农杆菌GV3101中；活化的农杆菌接种于含有20μL卡那，100μL利福平的20mLYEP液体培养基中，于240rpm、28℃摇床震荡3-4h；摇菌至OD600＝0.8时离心收菌，将重悬好的菌种置于收菌MS中，并加入浓度为150μM的乙酰丁香酮(AS)和1mM的二硫苏糖醇(DTT)；将暗培养2d的半粒种子移入菌液中，30Hz超声处理4min，然后在真空度为0.06MP的条件下真空处理5min。
进一步地，步骤(5)共培养：将已侵染农杆菌的花生置于含有150μM AS的液体MS培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养3d。
进一步地，步骤(7)潮霉素筛选：待花生长出两个复叶后，移苗至含35％潮霉素的Hoagland营养液中进行筛选；培养3天后，存活的正常植株即为潮霉素抗性植株。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、简单：本发明直接将共培养花生半粒种子播种在蛭石中成苗，并利用潮霉素水培法筛选阳性植株，避免了组织培养过程中复杂而繁琐的无菌操作培养以及成苗后的练苗过程。无需特殊的器材、技术和培养条件，操作过程极其简单。
2、快速：本发明直接对花生半粒种子进行遗传转化，大大缩短了遗传转化的时间，从浸种到成苗仅需20天。而愈伤组织转化即使培养体系技术完善，也需要12～14个月。
3、高效：本发明在农杆菌浸染花生半粒种子的同时，采用超声和真空处理，极大地提高了转化效率。据报道，采用中胚轴、子叶节、胚小叶、带子叶的胚轴作为外植体进行农杆菌介导的花生转化，PCR检测转化率最高为9.98％、54.5％、70.1％、73.3％；本发明通过花农杆菌介导的花生半粒法进行的花生转化，PCR检测阳性率为65.05％，转化效率达到较高水平。
4、实用：本发明利用pCXSN质粒载体(含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因)构建AhZIP1基因的过表达载体(pCXSN-AhZIP1)，通过农杆菌介导遗传转化。转化植株直接通过水培法，利用潮霉素筛选阳性植株。因此，本发明相对于大多数研究中只采用含bar基因的质粒更加实用，可以直接应用于花生转基因育种和基因的功能验证研究。
附图说明
图1本发明过表达载体pCXSN结构示意图；
图2使用本发明的试剂盒，用潮霉素引物扩增花生DNA产物的电泳图谱，M:分子量标准(DL2000bp Ladder)；具有750bp条带的样品为阳性植株。
具体实施方式
实例1AhZIP1过表达载体的构建
将含AhZIP1基因的大肠杆菌在含卡那抗性的LB平板上划线，37℃，倒置过夜，待长出单菌落后用含卡那抗性的LB培养液摇菌。用生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提AhZIP1和pCXSN(过表达载体)的质粒(图1)。酶切pCXSN，用TakaRa的Xcm 1酶切，体系为水:12μL；NE Buffer:2.5μL；pCXSN质粒:10μL；Xcm 1:0.5μL，37℃过夜，次日65℃水浴20-30min灭活，-20℃备用。采用TOYOBO的KOD酶对AhZIP1质粒进行PCR扩增，PCR体系为水:30μL；Buffer:5μL；dNTPs:5μL；引物(Forward:ATGGCTTCTTCTGATGCTACAAGAG；Reverse:TCAATCCCATATCATGACGACAG):各1.5μL；质粒:3μL；MgSO4:3μL；KOD酶:1μL。PCR程序为:94℃预变性3min；98℃变性20s；52.5℃退火30s；68℃延伸1min，33个循环；最后10℃保温。
使用1％的琼脂糖凝胶电泳，检测是否有正确条带，若有AhZIP1条带，则用生工的SanPrep柱式DNA回收试剂盒回收PCR产物，然后再用TakaRa的Premix Taq加A，体系为回收产物:16.2μL；Buffer:2μL；dNTPs:1.5μL；Taq酶:0.3μL，72℃，30min。酶切pCXSN灭活产物与AhZIP1质粒PCR回收加A产物一起电泳，再用TakaRa的T4 DNA Ligase连接，体系为Buffer:2.5μL；T4 DNA Ligase酶:1μL；载体和目的基因据浓度按1:10加，4℃，2d。
采用热激法转化DH5α感受态细胞，具体为从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α，冰上融化，10μL质粒加200μL感受态细胞，轻混匀，冰浴30min。再放入42℃水浴90s，取出后迅速将离心管放入冰浴中冷却5min。向管中加入1mL未加抗生素的LB液体，37℃，200rpm，震荡培养1h。倒入含卡那抗性的LB平板上，吹干后37℃，倒置过夜培养。最后收板，备用。
用生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提过表达AhZIP1质粒后用TakaRa的EcoR1和Nco1酶切过表达AhZIP1质粒，具体为水:2μL；H×Buffer:1μL；过表达AhZIP1质粒:5μL；EcoR1:0.5μL；Nco1:0.5μL，37℃，2h。1％的琼脂糖凝胶电泳，对的摇菌，测序，序列比对后保留对的菌株和质粒。
实例2农杆菌的遗传转化
采用冻融法将过表达载体pCXSN-AhZIP1质粒转化GV3101感受态细胞：先从超低温冰箱中取出农杆菌感受态细胞GV3101，冰上融化。然后2μL过表达AhZIP1质粒加200μL感受态细胞，轻混匀，冰浴30min后放入37℃水浴5min。
取出后迅速将离心管放入冰浴中冷却5min，向管中加入1mL未加抗生素的YEP液体，28℃，200rpm，震荡培养2h。接着倒入含卡那和利福平抗性的YEP平板上，吹干后28℃，倒置2-3d培养。最后收板，备用。
实例3农杆菌浸染花生半粒种子
花生种子操作台用70％酒精消毒1min，0.1％升汞洗6min，无菌水洗三遍，每次5min。无菌水浸泡，黑暗，25℃，24h。操作台切花生外植体，去一半子叶，放入MS基础培养液中预培养，黑暗，25℃，100rpm，2d。预培养1d后活化农杆菌，次日，将活化的农杆菌接种于含有20μL卡那，100μL利福平的20mL YEP液体培养基中，于240rpm、28℃摇床震荡培养3-4h。摇菌至OD600＝0.7时离心收菌，重悬于MS中，并加入浓度为150μM的乙酰丁香酮(AS)和1mM的二硫苏糖醇(DTT)。将暗培养2d的半粒种子移入菌液中，30Hz超声处理6min，然后在真空度为0.06MP的条件下真空处理10min。再除去菌液，用MS液体共培养，黑暗，25℃，100rpm。
实例4共培养花生种子在蛭石中直接成苗
通过对培养基、营养液和蛭石等不同培养基质的比较试验，我们发现，将共培养后的花生种子直接移至灭菌蛭石中，2-3天即可长出主根并产生侧根，1周即可长出茎叶成苗。以蛭石作为培养基质，与培养基相比，成活率没有差异，均在97％以上，但蛭石培养不需要无菌操作，同时避免了培养基培养后的练苗过程，因而具有操作简便、成本低、周期短的特点。与营养液培养相比，蛭石培养无需特殊培养容器，也不需要定期通气和更换营养液，操作更加简便。
实例5阳性植株的PCR检测
用CTAB法提取潮霉素筛选后的花生叶片DNA，具体为在已加入700uL CTAB提取液的离心管中将植物组织研磨碎，置65℃水浴3h，其间颠倒混匀2-3次。然后加入等体积氯仿，充分颠倒混匀，4℃冰箱20min后12000rpm，4℃离心15min。取上清至新离心管，加等体积预冷异戊醇，轻颠倒混匀。接着12000rpm，离心5min，去上清后加70％酒精，10000rpm，离心5min。离心管控干，沉淀溶于50μL无菌水中，-20℃备用。设计潮霉素引物(Forward：TACTTCTACACAGCCATCGGTCCAG；Reverse：GGAAGTGCTTGACATTGGGGAGTT)。采用高保真Taq酶，以上述花生DNA为模板，用潮霉素引物进行PCR鉴定。PCR体系为Mix:5μL；引物(F/R):各0.5μL；水:2.5μL；DNA:1.5μL。PCR程序为94℃预变性5min；94℃变性30s；58.5℃退火30s；72℃延伸45s，30个循环；再72℃，10min，最后4℃保存。使用1％的琼脂糖凝胶电泳，检测是否有正确条带(图2)。从图2看出，除第4个样品外，其余植株均为阳性植株，其PCR产物为750bp。

Claims (7)

1.一种花生转基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)消毒浸种：将花生种子先用70％酒精清洗1～2min，再用0.1％升汞清洗5～8min，然后用无菌水清洗3次每次3～5min，最后将花生移至无菌水中浸种24h。
(2)切取半粒种子：在无菌条件下，将经过消毒浸种处理后的花生剥皮，然后将刀插入花生的裂缝中，压住一片子叶，再用工具夹住另一片子叶将其去除；
(3)预培养：将半粒种子放于MS液体基本培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养1～3d；
(4)农杆菌浸染：利用含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因的pCXSN质粒载体构建AhZIP1基因的过表达载体，并转入农杆菌GV3101中；活化的农杆菌接种于含有20μL卡那霉素，100μL利福平的20mLYEP液体培养基中，于240rpm、28℃摇床震荡3～4h；摇菌至OD600为0.6～0.9时离心收菌，将重悬好的菌种置于收菌MS中，并加入浓度为150μM的乙酰丁香酮和1mM的二硫苏糖醇；将步骤(3)处理后的半粒种子移入菌液中，30Hz超声处理4～10min，然后在真空度为0.06MP的条件下真空处理5～10min；
(5)共培养：将已侵染农杆菌的半粒种子置于含有150μM AS的液体MS培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养2～5d；
(6)蛭石培养：完成共培养的半粒种子洗涤后直接播种于蛭石中，在光照条件下进行培养；
(7)潮霉素筛选：待花生长出两个复叶后，移苗至含30～40％潮霉素的Hoagland营养液中进行筛选；培养3天后，存活的正常植株即为潮霉素抗性植株；
(8)PCR检测：潮霉素筛选获得的潜在转基因阳性植株可进一步移到蛭石中进行培养，待苗长大后，剪取叶片提取DNA，进行PCR检测鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)消毒浸种：将花生种子放入锥形瓶中，先用70％酒精清洗1min，再用0.1％升汞清洗6min，然后用无菌水清洗3次每次4min，最后将花生移至无菌水中浸种24h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)切取半粒种子：在无菌条件下，用消过毒的镊子将浸泡24h的花生放在带滤纸的培养皿上，将花生剥皮，将刀插入花生的裂缝中，压住一片子叶，再用镊子夹住另一片子叶将其去除。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)预培养：将半粒种子(去掉一片子叶的胚)放于MS液体基本培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养2d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)农杆菌浸染：利用pCXSN质粒载体(含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因)构建AhZIP1基因的过表达载体，并转入农杆菌GV3101中；活化的农杆菌接种于含有20μL卡那，100μL利福平的20mLYEP液体培养基中，于240rpm、28℃摇床震荡3-4h；摇菌至OD600＝0.8时离心收菌，将重悬好的菌种置于收菌MS中，并加入浓度为150μM的乙酰丁香酮(AS)和1mM的二硫苏糖醇(DTT)；将暗培养2d的半粒种子移入菌液中，30Hz超声处理4min，然后在真空度为0.06MP的条件下真空处理5min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)共培养：将已侵染农杆菌的花生置于含有150μM AS的液体MS培养基中，将其放于25℃、100rpm的摇床中暗培养3d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)潮霉素筛选：待花生长出两个复叶后，移苗至含35％潮霉素的Hoagland营养液中进行筛选；培养3天后，存活的正常植株即为潮霉素抗性植株。
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