CN112889668B - 一种杨树遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，公开了一种以杨树叶柄为外植体进行农杆菌侵染的高效遗传转化方法。本发明选择美洲黑杨和欧美杨的杂交种为实验材料，通过农杆菌介导法将pCAMBIA1301载体转化NL895外植体。对本发明以叶柄为外植体和以叶片为外植体的对照组进行侵染后的转化效率进行比较，发现以叶柄为外植体转化效率高达80.6％，比传统方法以叶片为外植体进行侵染转化效率提高5倍以上。首次公开了以NL895叶柄为外植体进行农杆菌侵染的方法，建立了一套针对NL895叶柄的杨树高效遗传转化完整体系，与选择叶片为外植体的传统方法相比转化效率有大幅度提高，同时可以提高分子育种效率，也可以为杨树转基因材料的创制和重要性状基因的功能验证提供了重要工具。

Description

一种杨树遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种以杨树良种NL895叶柄为外植体进行农杆菌侵染的高效的杨树遗传转化方法。
背景技术
杨树(Populus spp.)世界上分布最广、栽培面积最大的速生用材树种之一，是环境绿化的重要的树种。杨树也是全球第一个完成全基因组测序的木本植物，已被广泛用做木本植物基因功能研究和分子育种设计的模式树种。“南林895”(Populus deltoides×P.euramericana‘NL895’)是南京林业大学以美洲黑杨(Populus deltoides)为母本，欧美杨(Populus euramericana cv)为父本杂交选育而成的优良无性系，其材质优良，木材产量高，在生产上大面积推广。NL895易于无性繁殖，是应用较为广泛的林木转基因受体材料，成为木本植物遗传基础研究的模式体系之一。建立高效的遗传转化体系是开展杨树基因功能研究和进行分子育种设计的基础。杨树遗传转化普遍以叶片为外植体，NL895现有的遗传转化体系转化效率仅有12％左右，较低的转化效率限制了其做为模式体系的推广与的应用。随着基因编辑技术等在木本植物基因功能研究和分子育种设计中的应用，建立NL895高效遗传转化体系，对以杨树为代表的林木基因功能研究及新品种创制具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的杨树遗传转化效率低的问题，本发明所要解决的技术问题在于杨树遗传转化效率，尤其是提高杨树NL895遗传转化效率。本发明提供了一种以NL895叶柄为外植体新的遗传转化方法，极显著的提高转化效率，为以杨树为代表的林木基因功能研究及新品种创制提供技术支持。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
(1)预培养
预培养采用表1分化培养基，取NL895长势良好的组培苗为实验材料，剪取倒2-4片展开叶叶柄作为外植体置于分化培养基进行预培养2天，同时保留叶柄端部的叶片，剪去叶片四周边缘作为对照进行同步操作。
表1NL895培养基组成
Figure GDA0003613506020000021
(2)重悬液制备
将已经鉴定的含有pCAMBIA1301载体的农杆菌单克隆菌落接种到含有卡那霉素(Kanamycin/Kan，50mg/L)和利福平(Rifampicin/Rif，20mg/L)的10mL液体Luria-Bertani(LB)培养基制备成小摇液，28℃，200rpm震荡培养48h，吸取1mL小摇液接种到50mL含有Kan(50mg/L)和Rif(20mg/L)的液体LB培养基制备成大摇液，培养4-6h至OD600≈0.5，5000rpm离心15min收集菌体，将菌体用50mL含有乙酰丁香酮(Acetosyringone/AS，100μM)的重悬液稀释，制备成侵染液用于侵染。
(3)共培养
共培养采用表1分化培养基加AS(100μM)。将步骤(1)预培养的叶柄浸入步骤(2)重悬液中浸泡25min左右，期间不断轻轻摇晃，然后将浸泡后的叶柄用无菌纸吸干，置于共培养培养基，在25℃培养室暗培养2天。
(4)光照培养
光照培养采用表1分化培养基加Cef(200mg/L)和特美汀(Timentin/Tim，150mg/L)，将步骤(3)共培养的叶柄浸入加有Cef(200mg/L)的无菌水中浸泡5min，取出用无菌纸吸干，置于光照培养基，在25℃培养室光照培养7天。
(5)筛选培养
筛选培养采用表1分化培养基加Cef(200mg/L)、Tim(150mg/L)和Kan(50mg/L)。将步骤(4)光照培养的叶柄转移到筛选培养基培养至分化出愈伤组织，此阶段生长周期为40天左右，每隔10天更换一次筛选培养基。
(6)抗性芽筛选
抗性芽筛选培养采用表1芽伸长培养基加Cef(200mg/L)、Tim(150mg/L)和Kan(50mg/L)。将步骤(5)筛选培养的叶柄分化后的愈伤组织切下转移到抗性芽筛选培养基，直至长成不定芽。
(7)抗性苗筛选
抗性苗筛选培养采用表1生根培养基加Tim(150mg/L)。将步骤(6)长大的抗性芽分成单株转移到抗性苗筛选培养基，直至长成小苗。
(8)抗性苗鉴定
以pCAMBIA1301载体卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistant gene)序列为模板设计引物，pCAMBIA1301-Kan-F：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAG；pCAMBIA1301-Kan-R：TCACTGAAGCGGGAAGGGACT。选取生根良好的抗性苗提取DNA进行分子检测计算转化效率。
(9)转化效率统计分析
每簇芽分出的小苗按一个株系计算，抗性苗的株系数与步骤(1)预培养的外植体数量的比例为转化效率。结果显示以叶柄为外植体进行农杆菌侵染转化效率为80.6％，而以叶片为外植体进行农杆菌侵染转化效率为12.2％。因此，本发明获得了以杨树叶柄为外植体的高效遗传转化方法。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
本发明通过以长势良好的NL895组培苗的叶柄为外植体进行农杆菌侵染，通过六个批次的重复实验，每个批次选择的叶柄和叶片外植体数目均大于40个，最后结合PCR的分子检测结果统计转化效率(表2)。结果显示本发明中以杨树叶柄为外植体进行农杆菌侵染转化效率为80.6％，而对照是以传统方法选择叶片为外植体的转化效率为12.2％，以叶柄为外植体进行农杆菌侵染转化效率相比传统方法提高5倍以上，极大的克服了现有技术的不足，为NL895转基因材料的创制和重要性状基因的功能验证提供了重要工具，将极大提高分子育种效率。
附图说明
图1为pCAMBIA1301载体结构示意图；
图2为以NL895叶柄和叶片为外植体侵染后分化至产生抗性苗对照图；
图3为以NL895叶柄和叶片为外植体转化效率对比图；
图4为抗性植株分子检测PCR扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶中的电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法；
下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。
实施例1：
1、pCAMBIA1301载体由本实验室保存，将pCAMBIA1301载体转化到EHA105农杆菌感受态28℃培养48h，挑取单克隆菌落接种到含有Kan(50mg/L)和Rif(20mg/L)的液体LB培养基，28℃，200rpm震荡培养48h。所得菌液进行菌液PCR验证pCAMBIA1301载体成功转入农杆菌后，吸取菌液和60％甘油各500uL混匀，制备成甘油菌-80℃保存待用。
2、用接种环蘸取步骤1中保存的甘油菌在含有Kan(50mg/L)和Rif(20mg/L)的固体LB培养基上划板，28℃培养48h。挑取单克隆菌落接种到含有Kan(50mg/L)和Rif(20mg/L)的10mL液体LB培养基制备小摇液，28℃培养48h。吸取1mL小摇液接种到50mL含有Kan(50mg/L)和Rif(20mg/L)的液体LB培养基制备大摇液，28℃培养4-6h，大摇液培养至OD600在0.5左右，收集大摇液到50mL离心管，5000rpm离心15min，收集菌体，提前配置好重悬液，加入AS(100μM)，将菌体用50mL含有AS(100μM)的重悬液稀释，制备成侵染液用于侵染。其中AS可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合，因此重悬液可提前制备好，让其有一定的诱导时间再进行接下来的侵染实验。所有操作均在无菌工作台进行。
其中，所述重悬液组成包括MS 4.43g/L+蔗糖30g/L，pH为5.0，121℃，灭菌20min。
3、取长势良好的NL895无菌组培苗作为实验材料，剪取倒2-4片展开叶，用手术刀切下叶柄作为外植体，保证其有很好的分裂再生能力，叶片作为对照，用手术刀切掉叶片边缘，将切好的叶柄和叶片置于预培养培养基上，封口膜封好保证培养皿内无菌环境，在25±2℃，每天16h光照(8h黑暗)条件下培养2天。统计预培养叶柄和叶片数目，所有操作均在无菌工作台进行。
其中，所述预培养培养基组成为表1分化培养基MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA0.5mg/L+TDZ 0.004mg/L+PHYTAGEL 2.5g/L，pH为5.8，121℃，灭菌20min。
4、取步骤3中预培养2天的叶柄和叶片，置于步骤2制备的重悬液中浸泡25min左右，保证叶柄和叶片全部浸泡。浸泡结束将叶柄和叶片置于无菌纸上，上下两层，用镊子轻轻按压，将叶柄和叶片表面菌液吸干。将叶柄和叶片置于共培养培养基上，在25±2℃，黑暗条件下培养2天。所有操作均在无菌工作台进行。
其中，所述共培养培养基组成为表1分化培养基中加入AS(100μM)，其组成包括：MS4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA0.5mg/L+TDZ 0.004mg/L+PHYTAGEL 2.5g/L+AS 100μM，pH为5.8，121℃，灭菌20min。由于AS不耐高温，因此待培养基灭菌后，温热状态时再加入AS。
5、取步骤4共培养2天的叶柄和叶片，置于含有Cef(200mg/L)的无菌水中，缓缓清洗叶柄和叶片表面残留菌液5min左右，取出置于无菌纸上擦拭干表面水分，将其置于光照培养基上。在25±2℃，每天16h光照(8h黑暗)条件下光照培养7天。所有操作均在无菌工作台进行。
其中，所述光照培养基组成为表1分化培养基中加入Cef(200mg/L)和Tim(150mg/L)，其组成包括：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA 0.5mg/L+TDZ 0.004mg/L+PHYTAGEL 2.5g/L+Cef 200mg/L+Tim 150mg/L，pH为5.8，121℃，灭菌20min。其中Cef和Tim起抑制农杆菌的作用，由于Cef和Tim不耐高温，因此待培养基灭菌后，温热状态时再加入Cef和Tim。
6、取步骤4光照培养7天的叶柄和叶片，转移到筛选培养基，在25±2℃，每天16h光照(8h黑暗)条件下培养直至分化出愈伤组织。此阶段需要生长40天左右，期间为保证培养基养分供应，可间隔10天左右更换一次筛选培养基，所有操作均在无菌工作台进行。
其中，所述筛选培养基组成为表1分化培养基中加入Cef(200mg/L)、Tim(150mg/L)和Kan(30mg/L)，其组成包括：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA0.5mg/L+TDZ 0.004mg/L+PHYTAGEL 2.5g/L+Cef 200mg/L+Tim 150mg/L+Kan 30mg/L，pH为5.8，121℃，灭菌20min。由于Cef、Tim和Kan不耐高温，因此待培养基灭菌后，温热状态时再加入Cef、Tim和Kan。
7、待步骤6筛选培养的叶柄和叶片分化出愈伤组织，用手术刀切下愈伤组织，转移到芽伸长筛选培养基，在25±2℃，每天16h光照(8h黑暗)条件下培养至愈伤组织逐渐长出不定芽，此生长阶段大概为20天左右，所有操作均在无菌工作台进行。
其中，所述芽伸长培养基组成为表1芽伸长培养基中加入Cef(200mg/L)、Tim(150mg/L)和Kan(30mg/L)，具体配方如下：MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA 0.25mg/L+TDZ0.002mg/L+PHYTAGEL 2.5g/L+Cef 200mg/L+Tim 150mg/L+Kan 30mg/L，pH为5.8，121℃，灭菌20min。由于Cef、Tim和Kan不耐高温，因此待培养基灭菌后，温热状态时再加入Cef、Tim和Kan。
8、待步骤7愈伤组织长出的不定芽生长到1cm左右时，用剪刀剪下不定芽，转移到生根培养基，此时单独一个不定芽放入一个培养瓶，约10天左右生根，后长成完整植株。
其中，所述生根培养基组成为表1生根培养基中加入Tim(150mg/L)，其组成包括：MS 2.215g/L+蔗糖25g/L+NAA 0.02mg/L+IBA 0.02mg/L+PHYTAGEL 2.5g/L+活性炭0.8g/L+Tim 150mg/L，pH为5.8，121℃，灭菌20min。由于Tim不耐高温，因此待培养基灭菌后，温热状态时再加入Tim。
9、将步骤8生根得到的植株提取DNA进行分子检测。以pCAMBIA1301载体卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistant gene)序列为模板设计引物，引物序列如下：pCAMBIA1301-Kan-F：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAG；pCAMBIA1301-Kan-R：TCACTGAAGCGGGAAGGGACT，对抗性苗DNA进行PCR扩增，以WT植株作为阴性对照，pCAMBIA1301载体作为阳性对照，扩增出条带的DNA对应的植株为转基因植株。
10、每簇芽分出的小苗按一个株系计算，转基因苗的阳性株系数与步骤3统计的预培养的叶柄和叶片外植体数量的比例为转化效率。如表2所示，统计了六批分别以叶柄和叶片为外植体进行侵染的转化效率，每一批材料叶柄转化效率均高于叶片转化效率。统计结果显示以叶柄为外植体进行农杆菌侵染平均转化效率为80.6％，以叶片为外植体进行农杆菌侵染平均转化效率为12.2％，转化效率提高5倍以上。证明了选择叶柄为外植体可以极大的提高杨树遗传转化效率。
11、以叶柄为外植体进行侵染和以叶片为外植体进行侵染，只是在外植体进行侵染后分化产生愈伤组织阶段存在差异，后期幼苗生长状态无明显差异。
表2NL895转化效率统计分析
Figure GDA0003613506020000071
综合六个接种批次的转化效率统计结果显示，以叶柄为外植体进行侵染平均转化效率高达80.6％，而传统方法以叶片为外植体进行侵染平均转化效率仅为12.2％，相比传统方法，以叶柄为外植体进行侵染转化效率提高5倍以上。

Claims (1)

1.一种以杨树叶柄为外植体的遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)选择长势良好的美洲黑杨和欧美杨的杂交种无性系NL895组培苗为实验材料，剪取倒2-4片展开叶的叶柄作为外植体，用侵染液进行侵染；
(2)侵染完成共培养2天后，将外植体在加有200mg/L头孢羟氨苄的无菌水中浸泡1-10min，取出，用无菌纸吸干，置于分化培养基，在25℃培养室光照培养5-10天，然后进行筛选培养；
(3)筛选培养待外植体分化产生愈伤组织，用手术刀将愈伤组织切下转移到芽伸长培养基，直至长出抗性不定芽；
(4)抗性不定芽生长到0.5-2cm，分成单株转移到生根培养基，直至长成完整植株；
(5)以pCAMBIA1301载体卡那霉素抗性基因序列为模板设计引物，pCAMBIA1301-Kan-F：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAG；pCAMBIA1301-Kan-R：TCACTGAAGCGGGAAGGGACT，选取生根良好的抗性苗提取DNA进行分子检测计算转化效率；
步骤(2)共培养的培养基为：MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、TDZ 0.004mg/L、PHYTAGEL 2.5g/L和乙酰丁香酮AS 100μM；
步骤(2)中分化培养基为：MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、TDZ 0.004mg/L、PHYTAGEL 2.5g/L、Cef 200mg/L和特美汀Tim 150mg/L；
步骤(2)中筛选培养的培养基为：MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、TDZ0.004mg/L、PHYTAGEL 2.5g/L、Cef 200mg/L、Tim 150mg/L和Kan 30mg/L；
步骤(3)中芽伸长培养基为：MS 4.43g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.25mg/L、TDZ 0.002mg/L、PHYTAGEL 2.5g/L、Cef 200mg/L、Tim 150mg/L和Kan 30mg/L；
步骤(4)中生根培养基为：MS 2.215g/L、蔗糖25g/L、NAA 0.02mg/L、IBA 0.02mg/L、PHYTAGEL 2.5g/L、活性炭0.8g/L和Tim 150mg/L；
所述侵染液OD600为0.2-0.8，侵染时间为10-30min；所述侵染液通过以下方法制备：将已经鉴定的含有pCAMBIA1301载体的农杆菌单克隆菌落接种到含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的10mL液体LB培养基制备成小摇液，28℃，200rpm震荡培养48h，吸取1mL小摇液接种到50mL含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的液体LB培养基制备成大摇液，培养4-6h至OD600为0.2-0.8，5000rpm离心15min收集菌体，将菌体用50mL含有100μM乙酰丁香酮的重悬液稀释。
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