CN103266131B - 一种杨树遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杨树遗传转化方法，包括从外植体选择、愈伤组织诱导、悬浮细胞系建立、悬浮细胞植株再生及培养基筛选、激素调配、抗生素敏感性、培养条件等方面建立杨树悬浮细胞系为受体的遗传转化技术系统，本发明以悬浮细胞系为受体农杆菌介导，通过建立生长迅速且细胞状态均一性好的悬浮细胞系，实现简便、快速的杨树遗传转化系统，为杨树转基因操作提供了一种新途径。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种以悬浮细胞系为受体农杆菌介导的杨树遗传转化方法。
背景技术
杨树（Populus）作为木本植物中的模式植物，也是第一个全基因组测序的木本植物。利用转基因技术进行杨树基因功能的研究，已成为杨树基因组测序完成后开展后基因组学研究的重要内容。目前杨树转基因研究普遍以叶盘为受体材料的农杆菌介导遗传转化方法，由于叶片细胞生理生化状态一致性较差，遗传转化条件难以统一，转化效率不高，影响杨树基因功能研究。悬浮细胞系生长迅速，且细胞状态均一性好，遗传转化条件容易控制，是良好的转基因受体材料。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树遗传转化方法，利用悬浮细胞系为受体材料进行遗传转化，提高转化效率，为林木的遗传改良提供了一个新途径。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种杨树遗传转化方法，包括以下步骤：
（1）取南林895杨幼嫩茎段和边缘有伤口的叶片，置于T培养基上诱导培养出愈伤组织；并经过T1培养基多次继代，筛选出状态良好的愈伤组织；其中，所述T培养基为MS+ 2,4-D 2~3mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；所述T1培养基为MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；
（2）将筛选出的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养基为T2；其中，T2培养基为MS+2,4-D2mg/L +NAA0.2mg/L+KT0.1mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；
（3）从平板中挑取含有待遗传转化目的基因的农杆菌单菌落，接种到附加卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，先做菌液PCR鉴定目的基因，再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12-18h，5000rpm、4℃下离心10 min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染；
（4）将步骤（2）的预培养后的悬浮细胞浸入步骤（3）的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回愈伤组织芽诱导培养基M上进行共培养；其中，菌液浓度OD600为0.2-1.0，侵染时间为2-10min，共培养时间为1-7d；
（5）对共培养后的悬浮细胞洗涤除去农杆菌，转移到芽诱导筛选培养基M1上培养，直至分化出可见卡那霉素抗性（Kanr)芽；培养基M1为MS+6-BA1.0mg/L +NAA 0.1mg/L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8g/L +kan20mg/L，pH5.8，121℃，灭菌16min；
（6）将Kanr芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基G(卡那霉素浓度同M1)继代培养；培养基G为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ 0.001mg/L+cef200mg/L+ kan20mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/ L，121℃，灭菌16min；
（7）待Kanr芽伸长至一定长度，将每个Kanr芽分离独立接入不定芽伸长筛选培养基G筛选，至Kanr芽长至一定长度后，移入生根筛选培养基G1；培养基G1为1/2MS+蔗糖25g/L+ cef200mg/L+kan15mg/L，pH5.8，琼脂7.5g/L, 121℃，灭菌16min。
步骤（3）中，所述的LB液体培养基中卡那霉素的浓度为10mg/L。
步骤（3）中，培养12-18h至OD600值为0.6。
步骤（4）中，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间为4min，共培养时间为3d，芽诱导培养基M为MS+6-BA1.0mg/L+ NAA 0.1mg/ L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8g/L， pH5.8，121℃，灭菌16min。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点包括：通过建立生长迅速且细胞状态均一性好的悬浮细胞系，实现简便、快速的杨树遗传转化系统，为杨树转基因操作提供新途径。
附图说明
图1是幼嫩茎段与叶盘愈伤组织诱导结果图；左图为茎段，右图为叶盘；
图2是悬浮细胞系细胞状态图；
图3是悬浮细胞系植株再生图；
图4是转基因愈伤GUS染色图；左右为转基因愈伤，右图为空白对照；
图5是转基因植株再生图；
图6是转基因植株GUS染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
分别取南林895的叶柄、茎段、叶片于T培养基上黑暗培养20-30d，培养温度为25±2℃，叶柄与茎段切口处均出现愈伤组织，但叶片逐渐呈透明状，叶片表面产生一层薄薄的愈伤，无法继代培养。叶柄与茎段所长生的愈伤中，其形态、颜色均有所不同，图1为幼嫩茎段与叶盘愈伤组织诱导结果。选取色泽淡黄、质地疏松的愈伤组织于不同浓度的激素配比培养基上培养，发现2,4-D对愈伤组织的生长有显著影响。2,4-D浓度小于1mg/L时，愈伤生长较慢，色泽暗淡；2,4-D大于2mg/L时，愈伤生长速度快，且颜色呈白色较多，水渍状，有粘性物质分泌；当2,4-D浓度处于2~3mg/L之间时，愈伤组织呈淡黄色，小颗粒状，质地疏松，易分散，在显微镜下观察，细胞内含物较多。故确定南林895杨愈伤诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖20g/L。采用T1培养基多次继代，培养条件为光照16h/d,温度为25±2℃，用于筛选出状态良好的愈伤组织。愈伤继代筛选，愈伤在固体培养基上培养时，初始继代周期为20-25d，两个月以后愈伤生长加快，继代周期变短，15d左右就要继代一次，筛选出色泽淡黄、鲜嫩的小颗粒状的愈伤组织继代。愈伤组织固体继代T1培养基为：MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L。
实施例2
对愈伤组织进行悬浮培养，培养基中激素配比、摇床转数、愈伤接种量以及液体培养基体积均对悬浮系的建立有影响。取实施例1经继代培养10-15d状态一致、分散性较好的南林895杨愈伤组织2g左右，置于100mL无菌三角瓶中，加入30mL悬浮培养基为T2：MS+2,4-D2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，悬浮培养在100rpm的恒温（28℃）的摇床上进行。根据培养物的生长状况4-6d继代一次，前几次继代时，用吸管吸取2/3左右上清液，并补充液体培养基于30mL，悬浮细胞，如图2所示。
实施例3
取悬浮培养2~3个月的南林895杨细胞悬浮培养系分别放入表1所示的芽分化培养基中，培养30d和45d后统计其出芽率，以研究不同激素配比的培养基对细胞悬浮系芽分化的影响。芽诱导培养条件为温度25±2℃，光照3000-4000lux，光照时间16-18h/d。
表1 悬浮细胞系芽诱导培养基
注：培养基基本成分为：MS+蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8g/L +kan20mg/L，pH：5.8，激素浓度单位为mg/L。
实验结果如表2所示，结合试验结果最终确定南林895杨愈伤悬浮系的最适合芽诱导培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜1.8g/L+kan20mg/L，芽伸长培养基为：MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，生根培养基为：1/2MS+蔗糖25g/L+琼脂7.5g/L。经过培养，悬浮细胞系植株再生过程，如图3所示。
表2 不同激素组合对悬浮细胞系芽分化的影响
实施例4
从平板中挑取单菌落（含有待遗传转化目的基因的农杆菌），接种到附加kan 10mg/L的10mL LB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，之后做菌液PCR，确定菌液中含有GUS目的基因。再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12～18h左右至OD600值达到特定的浓度，菌液在5000rpm、4℃下离心10min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染。
将悬浮培养状态良好的愈伤组织离心齐上清液后置于预先制备好的菌液中，充分浸泡后，并附以轻微震荡，弃去菌液，用高压蒸汽灭菌过的滤纸吸去多余菌液，放到愈伤组织芽诱导培养基上黑暗培养3d。
共培养后，先用加入头孢的的无菌水洗2次，再用无菌水洗2次，然后转入愈伤组织芽诱导筛选培养基中，一般经过40~50d愈伤组织边缘就会产生绿色小芽。
采用光密度测定法测定农杆菌浓度，将不同浓度菌液（OD600值分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）离心重悬后用于侵染外植体。结果见表3。通过研究发现菌液浓度OD600达到0.6时，GUS瞬时表达率最高，且经芽诱导培养45d能够产生芽。随着OD600值的升高，GUS瞬时表达率反而降低。农杆菌侵染愈伤组织的最佳浓度相对较低，极可能是由于悬浮细胞系中细胞较分散，呈单细胞状态，农杆菌易侵入。当菌液浓度OD600达到1.0时，GUS瞬时表达率下降，且经农杆菌转化的愈伤组织培养过程中，愈伤褐化，呈水渍状，不能产生诱导芽，说明较高浓度的农杆菌已损害细胞。
表3 菌液浓度对遗传转化效率的影响
方法同上，以OD600值为0.6时进行实验，结果如表4，可知农杆菌侵染时间为4min时GUS瞬时表达率最高，且培养45d后产生抗性芽也最多。因此本专利中，最佳侵染时间为4~6min。
表4 侵染时间对遗传转化率的影响
方法同上，以OD600值为0.6、侵染时间为4min时进行的该组实验，结果如表5所示，可知共培养3d时转化效率最高，随着共培养时间的延长，农杆菌大量繁殖，不利于细胞的分裂分化，影响出芽率。综上所知，最佳共培养时间为3d。
表5 共培养时间对遗传转化效率的影响
实施例5
GUS基因经组织化学定位法检测，底物X-Gluc( 5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸) 与GUS基因的产物葡萄糖苷酸酶发生反应，使其产生吲哚酚，吲哚酚被氧化后形成的二聚体为深蓝色原位沉淀物，可用来初步检测转基因植株是否呈阳性。GUS稀释液（pH=7.0）配方见表6。
表6 GUS稀释液
A液：6.24g NaH2PO4·2H2O，加水至100 mL；
B液：14.34g Na2HPO4·12H2O，加水至100 mL；
X-gluc母液：10 mg/mL；
GUS工作液：用稀释液将X-gluc稀释10倍；
固定液：70％乙醇︰冰醋酸（v/v）=9︰1
染色方法：将组织器官置于合适体积的GUS工作液中，于37℃反应2-3h，然后将染色后的组织器官置于固定液中洗脱2-3遍，然后用倒置显微镜观察拍照，记录实验结果。
参照实施例4的方法，以GUS基因为目的基因，进行遗传转化实验，结果如图4、图5和图6所示，图4是是转基因愈伤的GUS染色图，图5是转基因植株再生图，图6是转基因植株GUS染色图。可见，GUS目的基因已经成功转入杨树。
Claims (1)
1.一种杨树遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取南林895杨幼嫩茎段和边缘有伤口的叶片，置于T培养基上诱导培养出愈伤组织；并经过T1培养基多次继代，筛选出状态良好的愈伤组织；其中，所述T培养基为MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；所述T1培养基为MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；
(2)将筛选出的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养基为T2；其中，T2培养基为MS+2,4-D2mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.1mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；
(3)从平板中挑取含有待遗传转化目的基因的农杆菌单菌落，接种到附加10mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，先做菌液PCR鉴定目的基因，再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12-18h，5000rpm、4℃下离心10min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染；
(4)将步骤(2)的预培养后的悬浮细胞浸入步骤(3)的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回愈伤组织芽诱导培养基M上进行共培养；其中，菌液浓度OD600为0.6，侵染时间为4min，共培养时间为3d；芽诱导培养基M为MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜1.8g/L，pH5.8，121℃，灭菌16min；
(5)对共培养后的悬浮细胞洗涤除去农杆菌，转移到芽诱导筛选培养基M1上培养，直至分化出可见卡那霉素抗性芽；培养基M1为MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜1.8mg/L+kan20mg/L，pH5.8，121℃，灭菌16min；
(6)将卡那霉素抗性芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基G继代培养；培养基G为MS+6-BA0.2mg/L+TDZ 0.001mg/L+蔗糖30g/L+cef200mg/L+kan20mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；
(7)待卡那霉素抗性芽伸长至2～3cm后，移入生根筛选培养基G1；培养基G1为1/2MS+蔗糖25g/L+cef200mg/L+kan15mg/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min。
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