CN101946708A - 一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明为“一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法”，属植物基因工程技术领域。本发明对甜高粱幼穗外植体诱导愈伤组织，采用农杆菌介导法转化外源基因，通过预培养，然后共培养，再筛选培养，得到抗性愈伤，再将其继代分化培养、出芽、生根，移栽得到转化植株。本发明利用所建立的遗传转化体系转化甜高粱植物获得转基因抗虫植株。本发明为利用生物技术改良甜高粱的品质和提高抗逆性等研究提供了技术支撑，也为加快甜高粱的基础研究打下了很好的基础。

Description

一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法。

背景技术

甜高粱是普通高粱的一个变种，生长耗水量仅为玉米的1/3，亩产可高达5～10吨，其茎秆汁液是发酵制造酒精和培养酵母的理想生物质原料。用甜高粱取代玉米等粮食作物作为原料生产酒精的新工艺，不仅能节约粮食、降低成本，有力地带动发酵产业、振兴酒精生产行业、而且能推进可再生能源事业和畜牧业的发展。发展甜高粱产业关键在于甜高粱新品种的选育与高效栽培。传统育种技术在甜高粱的产量、品质、抗病、抗虫等特性改良方面已发挥了重要作用，但在生产上对品种、品质要求日益提高的情况下，因受现有资源的限制，单靠传统的育种方法难以取得重大突破。利用转基因技术改良高梁品种已引起广泛的关注。植物转基因技术通常依赖于植物快捷、高频率再生体系的建立。然而，甜高粱同普通高粱一样，通过组织培养获得再生植株相对比较困难。目前针对甜高粱组织培养的研究还很少。

从甜高粱的成熟胚和未成熟胚诱导愈伤到获得整个再生植株以前虽已有过一些报道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep.5：349-351；Ma et al.，1987，Theor App Genet.73：389-394；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci.58：692-693)，但遗憾的是能够从外植体诱导胚性愈伤到再生出植株的仅限于个别几个品种(Smith and Bhaskaran，1986，Springer-Verlag，New York，pp.220-223；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep.15：72-75)。近年来随着人们对甜高粱应用价值的重视，甜高梁组织培养方面的研究也取得了快速的发展。通过对不同基因型品种及外植体、不同培养基成分(包括蔗糖浓度和激素配比等)、不同培养条件对愈伤的诱导、增殖及分化再生能力的影响进行系统研究，为甜高粱品种建立有效的组织培养再生体系提供了参考(Zhao et al.，2008，Chinese Bull Bot.25：465-468；Zhao et al.，2010，African Journal ofBiotechnology.9(16)：2367-2374)。但以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚为外植体，目前为止以幼穗为外植体的研究尚很少见有报道。

近年来各国科学家正在致力于相关方面的研究，相比其它作物，甜高粱组织培养植株再生困难，而且受基因型的限制，因此甜高粱遗传转化研究进展缓慢，目前尚很少见成功报道。据报道，2009年美国昆士兰大学的研究人员培育出了世界上首例木质素含量降低的转基因甜高粱植株，他们将编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)的DNA片段导入甜高粱品种中，通过改变木质素的含量和组分获得了成功，该项研究成果已申请了专利(Pub.No.US 2010/0058496A1)。其它研究尚未见相关报道。

因此建立甜高粱的遗传转化体系，通过转基因技术培育甜高粱新品种，使其更好地满足实际生产的需求。转化体系的研发将为绿色能源生物燃料和生物材料的开发利用开辟新的途径。

发明内容：

本发明的目的是提供一种以甜高粱幼穗材料的组织培养再生体系及遗传转化方法和以甜高粱幼穗诱导的愈伤组织的组织培养再生体系及遗传转化方法，以用于甜高粱转基因的研究。

一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法，包括如下顺序步骤：1)选取幼穗，旗叶期长约2-5cm幼穗，切成薄片；2)将幼穗诱导产生的愈伤组织或幼穗薄片接种于预培养基中培养，所述预培养基为YS-P：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS(乙酰丁香酮)100μmol/L，pH 5.8；所述幼穗诱导产生的胚性愈伤组织为将薄片接种于诱导培养基上诱导愈伤而得到，所述诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH5.8；3)农杆菌介导法转入外源基因；4)接种于共培养基中共培养，所述共培养基YS-C为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 500mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS 100μmol/L，pH 5.6；5)再转入筛选培养基上进行梯度筛选培养，所述筛选培养基为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+羧苄青霉素250mg/L+不同浓度的双丙氨膦，pH 5.8；6)将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 2mg/L+PVP 10mg/L+羧苄青霉素125mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8；7)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：1/2MS基础培养基+肌醇50mg/L+NAA 0.400mg/L+IBA 2mg/L+PVP10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8；8)转移至蛭石培养基上过渡培养1-2周后移栽至温室花盆或大田。

所述幼穗长度为2-3cm，薄片约3mm长。

所述预培养为26-28℃暗培养3天。

所述步骤3)为将预培养的外植体浸泡于农杆菌LBA4404悬浮液(含有携带外源基因的植物表达载体)中15-20分钟，所述农杆菌悬浮液组成为：1/2MS无机盐+酵母浸出物2.5g/L+2，4-D 1.5mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS 100μmol/L，pH 5.2。

所述农杆菌悬浮液的OD600值为0.5-0.6。

所述外源基因为Bt杀虫基因cry1Ah，所述筛选剂为双丙氨膦。

所述共培养为在26-28℃下暗培养3天。

所述筛选培养的方法为先在筛选剂浓度为0的筛选培养基上避光恢复培养7天，再转入筛选剂浓度为1mg/L的筛选培养基上，进行一周低压筛选，再转入筛选剂浓度为3mg/L的筛选培养基上，进行一周筛选，之后再转入筛选剂浓度为5mg/L的筛选培养基上，进行一周高压筛选。

所述分化培养基中的培养条件为：在周期为16小时光照与8小时黑暗循环于26-28℃条件下培养，每7-10天继代培养一次。

所述步骤8)转入之前，甜高梁植株苗长约为3-4cm高。

所述步骤9)转入之前，甜高粱植株根长2-3cm。

所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。

本发明通过对植物激素配比、培养基成分、不同基因型等因素对甜高粱组织培养的影响比较发现，培养基中添加玉米素2.0mg/L对于幼穗愈伤组织的诱导具有重要的作用，可以大幅度提高诱愈率；同时在培养基中适量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗坏血酸，可以有效地减轻褐化现象，促进诱愈率的提高。

本发明建立了甜高粱幼穗愈伤组织培养再生体系，并通过农杆菌介导法成功的将外源基因cry1Ah转化幼穗和转化幼穗愈伤组织，得到转基因再生植株，经检测表明，外源基因得到了不同程度的表达，说明本发明的再生体系可用于遗传转化。虽然本发明农杆菌介导法的外植体采用的是幼穗愈伤组织，而没有转化幼穗，但本领域技术人员根据相同的方法及步骤直接转化幼穗，是同样可以实现的。

本发明利用甜高梁幼穗为外植体在条件适宜时，能得到较高的愈伤组织诱导率，但是，不同基因型来源的愈伤组织的胚性状况及再生能力差别较大。实验结果表明幼穗是建立甜高梁再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。甜高粱转基因研究目前尚很少见报道，本发明通过甜高粱农杆菌介导的转化体系的建立，为今后深入开展甜高粱转基因研究奠定了基础。

附图说明：

图1用于甜高粱转化的农杆菌p3301UH双元载体T-DNA区结构示意图

图2农杆菌介导转基因甜高粱再生植株的形成过程。(A)-(E)转基因甜高粱幼穗愈伤组织的筛选、植株再生过程：(A)农杆菌侵染幼穗愈伤组织用筛选培养(5mg/l双丙氨膦)；(B)抗性愈伤组织的分化培养；(C)诱导形成的不定芽；(D)生根后移栽温室；(E)开花授粉结实。

图3T0代部分转化植株PCR检测结果。

1-11：T0代部分甜高粱转化植株；12：未转化植株(CK-)；13：空白对照(以水为模板PCR产物)；14：CK+(以p3301UH为模板PCR产物)；15：DNA标准分子量λ/Eco1301(λ/E)(bp)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421。

图4部分T0代转化植株RT-PCR结果。

M：DNA分子量标准DL 2000(bp)：100、250、500、750、1000、2000；1，3，5：以转化植株cDNA为模板；2，4，6：以转化植株总RNA为模板；7：以未转化植株cDNA为模板；8：CK+，以p3301UH为模板。

图5T0代转化植株双丙氨膦抗性检测。

非转基因植株(左边两个叶片)，转基因植株(右边两个叶片)。

图6T0代转化植株温室玉米螟抗性生测实验。

A：非转基因植株；B：转基因植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下面所涉及的不同基因型的甜高粱均表明来源了，公众可以从申请人的实验免费得到。

实施例1甜高粱幼穗组织培养再生体系的建立

1.1用于甜高粱组织培养的幼穗材料选择与准备

本发明取旗叶期长约2～5cm的幼穗，用70％酒精进行表面消毒3min，无菌水冲洗多次；在超净台中用刀切成大小均一的薄片接种于诱导培养基[MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT(玉米素)2.0mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH 5.8]置于20～21℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；之后选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养[诱导培养基+KT(激动素)0.2mg/L]，每7～10天继代一次。挑选生长状态良好的愈伤组织接于分化培养基[MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH 5.8]上26-28℃光培养2～3周，之后将愈伤组织再生出的苗移入生根培养基[1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH 5.8]中，当长出根时(苗高3～4cm，根长2～3cm)，洗去培养基，转移到装有消毒蛭石的小培养钵中炼苗培养7-15天，然后移栽温室或大田。

1.2选择合适的发育时期的幼穗诱导愈伤组织

不同发育时期的幼穗(以幼穗长度为准)接种于幼穗培养基上，其愈伤诱导能力存在差别。幼穗长度小于1.0cm时诱导愈伤率很低，仅为16.7％；幼穗长度为1.0～2.0cm时期的诱愈率有所提高，可达到43.8％；当幼穗长度在2.0～3.0cm时，诱愈率达到最高，为61.7％。当幼穗长度大于5.0cm后，随着其发育时期的延长，幼穗长度的增加，愈伤组织的诱导率逐渐下降(表1)。本实验结果表明，甜高粱幼穗长度即幼穗在不同发育时期对愈伤组织的诱导具有较大的影响，因此，在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时，应注意选择适宜的发育时期的幼穗。

表1幼穗长度对愈伤组织诱导的影响

1.3不同基因型对幼穗愈伤组织诱导的影响

选取7种不同甜高粱基因型幼穗材料，在接种的866块外植体中共有617块外植体能诱导出愈伤组织，平均诱愈率为71.25％，褐化死亡率为28.75％。但不同基因型间诱愈率差异很大，其中以“BABUSH”诱愈率最高，可达84.23％，其次是“MN-3025”，诱愈率为79.26％；“品甜三号”诱愈率很低，仅为31.11％(表2)。说明基因型是影响甜高粱幼穗组织培养的一个重要因素，因此在实际操作中应注意选择基因型。

表2不同基因型对甜高粱幼穗愈伤组织诱导的影响

注：/--表示未诱导出愈伤组织

1.4不同基因型幼穗愈伤组织的再生能力比较

如表3所示，不同基因型愈伤组织的分化再生能力表现出明显的差异。供试的7种不同幼穗基因型中，幼穗愈伤组织分化率明显不同。在接种的368块幼穗愈伤组织中，共有228块愈伤组织能够分化再生出苗，平均分化率为61.96％，褐化死亡率为38.04％。其中“BABUSH”的分化率最高，可达94.44％，其褐化死亡率最低，为5.56％，而“品甜三号”的分化率最低，仅有26.67％，褐化死亡率则高达73.33％。此结果说明各基因型间愈伤组织分化率差异很明显，基因型也是影响其再生能力极其重要因素之一。

表3不同基因型对愈伤组织分化率的影响

注：a：代表能分化出苗的愈伤组织块；b：代表分化出苗的愈伤组织占转接到分化培养基上的愈伤组织总数的百分率。

结论：本发明通过比较发现不同甜高粱幼穗长度对愈伤组织的诱导率具有显著的影响(p＝0.000＜0.001)，因此，在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时，选择2-3cm的发育时期的幼穗较为合适。研究发现不同基因型幼穗材料的诱导愈伤能力及分化再生能力表现出明显的差异：平均诱愈率为71.25％，平均分化率为61.96％。经过比较从中筛选出两个具有高频再生能力的甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”，可用于进一步的遗传转化研究。

本发明通过对植物激素配比、培养基成分、不同基因型等因素对甜高粱组织培养的影响比较发现，培养基中添加玉米素2.0mg/L对于幼穗愈伤组织的诱导具有重要的作用，可以大幅度提高诱愈率；同时在培养基中适量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗坏血酸，可以有效地减轻褐化现象，促进诱愈率的提高。本发明建立了甜高粱幼穗愈伤组织培养再生体系：其中愈伤组织诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH 5.8；继代培养基为：诱导培养基+KT 0.2mg/L；分化培养基为：MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH 5.8；生根培养基为：1/2MS+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8。

实施例2.农杆菌法转化

2.1农杆菌转化所用培养基：

农杆菌预培养基：1/2MS无机盐+酵母浸出物2.5g/L+蔗糖30g/L+葡萄糖60g/L+AS100μmol/L+125mM链霉素(SM)+100mM卡那霉素(Kan)，pH 5.6；

农杆菌悬浮液：1/2MS无机盐+酵母浸出物2.5g/L+2，4-D 1.5mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS 100μmol/L，pH 5.2。

预培养基YS-P：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2mg/L+KT 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+PVP 10mg/L+AS 100μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8；

共培养基YS-C：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2mg/L+KT 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+抗坏血酸10mg/L+PVP 500mg/L+AS 100μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.6；

筛选培养基YS-S：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2mg/L+KT 0.2mg/L+水解酪蛋白500mg/L+抗坏血酸10mg/L+PVP 10mg/L+羧苄青霉素(Carb)250mg/L+不同浓度的双丙氨膦(1、3、5mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8；

分化培养基YS-R：MS无机盐+MS有机物+ZT 2mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+羧苄青霉素(Carb)125mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8；

生根培养基YS-RT：1/2MS基础培养基+肌醇0.05g/L+NAA 0.4mg/L+IBA 2mg/L+PVP 10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH 5.8。

2.2转化方法：

将含p3301UH质粒(携带有cry1Ah基因的双元植物表达载体，见附图1；申请人的实验室保存，可以免费对外发放)的农杆菌在YEB固体培养基(含125mM链霉素SM+100mM卡那霉素Kan)上划线，28℃下暗培养至出现单菌落；挑取单菌落接种于5mL YEB液体培养基(含125mM SM+100mM Kan)中振荡培养(28℃、180rpm)过夜；将培养的菌液转移到50mL农杆菌预培养基中振荡培养(28℃、180rpm)约36h；4℃、5000rpm离心10min收集菌体，并用悬浮液悬浮至OD600值为0.5～0.6，用于甜高梁幼穗愈伤组织的共培养。

选取适宜发育时期的幼穗材料，切成大小均一(约3mm)的薄片，接种于诱导培养基上诱导愈伤。挑选经幼穗诱导产生或继代培养后、质量好的愈伤组织接种在预培基上，26-28℃暗培养3d，之后在OD600值为0.5～0.6的农杆菌悬浮液中浸泡15～20min；弃菌液，用无菌滤纸吸去幼穗愈伤组织块表面多余菌液，接种于共培养基上26-28℃暗培养3d；取出共培养后的幼穗愈伤组织块，用含有500mg/L Carb的清洗液洗涤2～3次，用无菌滤纸吸去清洗液，将幼穗愈伤组织块转移到选择培养基上进行筛选培养。

共培养后的幼穗愈伤组织块先置于不含筛选剂的选择培养基YS-S0上避光恢复培养7d，转入含有较低浓度双丙氨膦(1mg/L)的选择培养基YS-S1上，进行1周的低压筛选，然后将幼穗愈伤组织块转入含有浓度为3mg/L的双丙氨膦的选择培养基YS-S2上，进行一周的筛选，之后再转入含有较高浓度双丙氨膦(5mg/L)的选择培养基YS-S3上，进行一周的高压筛选。将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基上进行分化培养(26-28℃、16h光照/8h黑暗)，每隔7-10天继代培养一次，直至有不定芽出现；待不定芽成苗，苗长3～4cm时，将其转移到生根培养基上，诱导生根；如有不定根出现，待根长2～3cm时，转移到蛭石培养基上过渡培养1～2周，移栽温室或大田。

2.3甜高粱转cry1Ah基因再生植株的获得

选生长良好的甜高粱幼穗诱导愈伤组织，经农杆菌侵染共培养3天后，转移到恢复培养基上，恢复培养7天后转入含不同浓度的双丙氨膦的选择培养基进行三轮筛选，大部分愈伤组织生长缓慢，颜色暗淡，甚至褐变至死，只有少部分愈伤组织颜色鲜嫩、生长状态良好。不同基因型间差异明显，其中“BABUSH”筛选到的抗性愈伤较多，达到28.4％，而“MN-3025”只有7.69％可产生抗性愈伤。筛选之后所获得的抗性愈伤经再生、生根、壮苗后，蛭石过渡培养移栽温室(附图2)，最终共获得了66个转化植株。

2.3.1甜高粱转化植株的分子鉴定

2.3.1.1甜高粱转化植株的PCR分析

各取T0代甜高粱转化植株与非转基因对照叶片0.2g，用CTAB法提取基因组总DNA。用cry1AhF(5’-GCCCAAGCTGCCAACCTCCACTTGTCTTTGC-3’)和cry1AhR(5’-GGTGCTCTTATGATGCTGACACTGCTACTAGAGCC-3’)特异引物扩增cry1Ah基因，目的片段大小为898bp。反应体系为25μL，扩增反应参数为：94℃4min；94℃1min，58℃40s，72℃50s，35个循环；72℃10min。分别提取转基因植株的基因组DNA，用cry1Ah基因特异引物进行PCR检测，结果如附图3所示。在66个转化植株中有22株可检测到cry1Ah基因(目标片段大小为898bp)，转化率达到10.48％，初步说明外源cry1Ah基因已整合入甜高粱的基因组DNA中。同时发现，这些阳性植株均是由“BABUSH”获得的再生转化植株，而“MN-3025”未获得阳性植株，平均阳性率33.3％。结果表明，不同基因型甜高粱的转化频率存在明显差异。

2.3.1.2甜高粱转化植株的RT-PCR分析

选取部分PCR阳性植株和对照植株，分别提取叶片总RNA，反转录后用PCR检测cry1Ah基因的转录情况。结果显示，对照植株没有扩增到目标条带，转基因植株都可扩增到898bp目标片段，表明导入甜高粱基因组中的cry1Ah基因得到正确的转录(附图4)。

2.4.甜高粱转化植株的生物活性检测

待甜高粱转化苗生长到6～8片叶即心叶中期时，将玉米螟初孵幼虫接于心叶中，每株接玉米螟初孵幼虫40～60头，以非转化植株作为阴性对照，接虫1～2周后调查食叶级别。对所获得的66株转化植株进行了玉米螟生测，结果表明，不同转基因植株单株间的抗虫性表现差异显著：仅有2株对玉米螟表现为抗性，没有或只有很小的玉米螟为害的虫孔(附图5)，其余转基因植株对玉米螟表现为不同程度的感虫，未转化植株被玉米螟咬食严重，叶片虫孔大且虫孔数目多，已影响到植株的正常生长。

2.5.甜高粱转化植株的除草剂抗性检测

为了验证bar基因在植株中是否正常表达，当甜高粱转化苗生长至4～6叶期，用浓度为7mg/L的双丙氨膦药液进行叶片涂抹实验。以非转基因植株作为负对照，在离叶尖5cm处划线作为标记，用棉签蘸取适宜浓度的除草剂药液均匀地涂抹在划线部位，一周后统计甜高粱叶片受害情况。结果发现：在检测的66株转化植株中，有22株对双丙氨膦有抗性，涂液部位出现轻微褪色或未出现任何病变症状，而非转基因植株和转基因阴性植株则在涂液部位出现不同程度的褐斑(附图6)，表明bar基因能够在转基因植株中正常表达，对双丙氨膦有抗性。

Claims (10)

1.一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法，包括如下顺序步骤：1)选取幼穗，旗叶期长约2-5cm幼穗，切成薄片，2)将幼穗诱导产生的胚性愈伤组织或幼穗薄片接种于预培养基中培养，所述预培养基为YS-P：MS无机盐+MS有机物+2，4-D2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS100μmol/L，pH 5.8；所述幼穗诱导产生的胚性愈伤组织为将薄片接种于诱导培养基上诱导愈伤而得到，所述诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH5.8；3)农杆菌介导法导入外源基因；4)接种于共培养基中共培养，所述共培养基YS-C为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 500mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS 100μmol/L，pH 5.6；5)再转入筛选培养基上进行梯度筛选培养，所述筛选培养基为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+羧苄青霉素250mg/L+不同浓度的双丙氨膦，pH 5.8；6)将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS无机盐+MS有机物+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+KT 2mg/L+PVP 10mg/L+羧苄青霉素125mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH 5.8；7)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：1/2MS基础培养基+肌醇50mg/L+NAA 0.400mg/L+IBA 2mg/L+PVP10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8；8)转移至蛭石培养基上过渡培养1-2周后移栽至温室花盆或大田。

2.根据权利要求1所述的方法，所述幼穗长度为2-3cm，薄片约3mm长，所述预培养为26-28℃暗培养3天。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤3)为将预培养的外植体浸泡于含有携带外源基因的植物表达载体的农杆菌LBA4404悬浮液中15-20分钟。

4.根据权利要求3所述的方法，所述农杆菌悬浮液的OD600值为0.5-0.6，所述农杆菌悬浮液组成为：1/2MS无机盐+酵母浸出物2.5g/L+2，4-D 1.5mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS 100μmol/L，pH 5.2。

5.根据权利要求3所述的方法，所述外源基因为Bt杀虫基因cry1Ah，所述筛选剂为双丙氨膦。

6.根据权利要求1所述的方法，所述共培养为在26-28℃下暗培养3天。

7.根据权利要求1所述的方法，所述筛选培养的方法为先在筛选剂浓度为0的筛选培养基上避光恢复培养7天，再转入筛选剂浓度为1mg/L的筛选培养基上，进行一周低压筛选，再转入筛选剂浓度为3mg/L的筛选培养基上，进行一周筛选，之后再转入筛选剂浓度为5mg/L的筛选培养基上，进行一周高压筛选。

8.根据权利要求1所述的方法，所述分化培养基中的培养条件为：在周期为16小时光照与8小时黑暗循环于26-28℃条件下培养，每7-10天继代培养一次。

9.根据权利要求1所述的方法，所述步骤8)转入之前，甜高粱植株苗约为3-4cm高，所述步骤9)转入之前，甜高粱植株根长2-3cm。

10.根据权利要求1所述的方法，所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。

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