CN106613978B - 一种高粱体细胞悬浮培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高粱体细胞悬浮培养方法，具体包括以下步骤：高粱种子先用70％乙醇浸泡1‑3min，再用无菌水冲洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10‑20min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温‑20，最后无菌水冲洗，得到无菌高粱种子；制备高粱愈伤组织；选取合适的愈伤组织接种于液体培养基中培养，每隔7天继代一次，每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42‑45天后获得高粱体细胞悬浮系。本发明的细胞悬浮培养方法，愈伤诱导率高，建立的细胞悬浮系不褐化，容易观察，且悬浮细胞系细胞密度大，游离细胞体积小，细胞质浓厚，近圆形细胞比例达70％以上，活细胞率达60％以上，细胞分裂生长旺盛。

Description

一种高粱体细胞悬浮培养方法及应用

技术领域

本发明属于植物细胞培养技术领域，具体涉及一种高粱体细胞悬浮培养方法及应用。

背景技术

高粱品种资源创新不足是目前高粱育种中面临的最大问题，创造具有丰富遗传基础的资源材料是高粱育种工作者研究的重点之一。实践证明，育种新技术的开发应用对高粱育种材料的创新是非常重要的。生物技术是世界新技术革命的主要内容之一，为培育高产、多抗、优良的农作物新品种提供了科学的手段。

近年来,植物细胞和组织培养作为植物生物技术的组成部分被应用于作物育种后,取得了一系列重大进展与突破,在作物品种改良上发挥了很大的作用。与植物组织培养相比,植物细胞培养属技术层次更高的培养技术,它是指以离体的单细胞或细胞团为外植体，在无菌条件下进行培养，增殖形成新的细胞团，经再分化形成完整植株的技术。细胞培养具有群体数量大、诱变率高、易于筛选等优点,不仅可以应用于原生质体分离、培养与杂交，基因转移和生产次生代谢物等，还可以在细胞水平上短期筛选出预期突变体，为作物品种改良提供了一种新途径。很多植物的体细胞悬浮培养已获得成功，其在作物育种方面的应用也很广泛。

在禾谷类作物中，对水稻、玉米、小麦、大麦等作物的细胞悬浮培养研究较多，并已得到原生质体再生植株，其中对水稻的研究比较深入，不仅进行了遗传转化和突变体的筛选，还培育出了新品种。但是，目前尚没有一种比较成熟的高粱体细胞悬浮培养方法，影响了高粱育种工作的开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种高粱体细胞悬浮培养方法及应用，愈伤诱导率高，建立的细胞悬浮系不褐化，容易观察，且悬浮细胞系中游离细胞体积小，细胞质浓厚，细胞分裂生长旺盛，在高粱育种方面具有良好的应用前景。

本发明提供的一种高粱体细胞悬浮培养方法，具体包括以下步骤：

步骤1，高粱种子的处理：

高粱种子先用70％乙醇浸泡1-3min，再用无菌水冲洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10-20min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温-20，最后无菌水冲洗，得到无菌高粱种子；

步骤2，制备高粱愈伤组织；

步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：

选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织接种于液体培养基中，接种比例为2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次；每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42-45天后获得高粱体细胞悬浮系；

所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D和30g的蔗糖，pH为5.8。

优选的，步骤1中，高粱种子先用70％乙醇浸泡1min后，再用无菌水冲洗2-3次；HgCl₂水溶液浸泡15min后，用无菌水冲洗5-6次。

优选的，步骤2中，制备高粱愈伤组织，具体包括：

将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长为3-5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20-30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，继代培养温度为25±1℃，自然光照，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；

所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8。

优选的，步骤2中，所述继代培养的次数为2-3次，每次间隔18-25天。

优选的，步骤3中，接种比例为2.5g:100mL。

本发明还提供了一种高粱体细胞悬浮培养方法在高粱育种中的应用。

与现有技术相比，本发明的方法具备以下有益效果：

(1)高粱无菌苗叶片为外植体诱导愈伤，诱导率高，诱导出的愈伤经过2-3次继代后，可以得到较多的Ⅲ型胚性愈伤，这样的愈伤适合用于悬浮培养的起始材料，并在后续的培养中容易建立细胞悬浮系，并且悬浮液不褐化。而从高粱幼穗培养得到的愈伤进行悬浮培养时，悬浮液很容易褐化，很难在倒置显微镜下跟踪观察及计数。

(2)本发明建立的稳定优良的悬浮细胞系，细胞密度大(为6.45×10⁵-5.08×10⁶个/mL)，游离细胞体积小，细胞质浓厚，近圆形细胞(圆形细胞、椭圆形细胞、肾形细胞)比例达70％以上，活细胞率达60％以上，细胞分裂生长旺盛。

附图说明

图1为三种类型愈伤组织结构图；

图1中，a为Ⅰ型高粱愈伤组织；b为Ⅱ型高粱愈伤组织；图1中c和d均为Ⅲ型高粱愈伤组织；

图2为制备细胞悬浮系时，不同培养时期的细胞显微视图；

图2中，a图为Ⅲ型愈伤组织培养一周后的细胞形态16×4倍放大图，b图为Ⅲ型愈伤组织培养一周后的细胞形态16×25倍放大图，c图为Ⅲ型愈伤组织第3次继代培养后的细胞形态16×10倍放大图，d图为Ⅲ型愈伤组织第4次继代培养后的细胞形态16×10倍放大图，e图Ⅲ型愈伤组织第6次继代培养后的细胞形态16×4倍放大图，f图Ⅲ型愈伤组织第6次继代培养后经伊文斯蓝染色后的细胞形态16×25倍放大图。

具体实施方式

下面对发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明提供的一种高粱体细胞悬浮培养方法，将高粱无菌苗叶片培养获得愈伤组织进行培养获得高粱体细胞悬浮系，具体包括以下步骤：

步骤1，高粱种子的处理：

高粱种子先用70％乙醇(体积分数)浸泡灭菌1-3min，再用无菌水冲洗2-3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡灭菌10-20min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温-20，最后无菌水冲洗5-6次，得到无菌高粱种子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡时，均进行搅拌处理。

需要说明的是，上述浸泡过程中浸泡液(70％乙醇或者HgCl₂水溶液)漫过种子上表面即可，以达到节约实际用量的目的。

步骤2，制备高粱愈伤组织：

将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，接种时注意高粱种子胚朝上，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长为3-5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20-30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，连续继代培养2-3次，每次间隔18-25天，培养条件同愈伤培养(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；

所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：

选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织接种于液体培养基中，接种比例(高粱颗粒状愈伤组织与液体培养基的比例)为2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次，每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42-45天后获得高粱体细胞悬浮系；

所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

需要说明的是，步骤3中，新液体培养基是指新配置且尚未使用的液体培养基；旧液体培养基指的是继代培养高粱愈伤组织以后的培养基；以上一代培养后的留下的液体为旧液体培养基，然后加入新的培养基，混合后作为下一代的培养基，这个与本领域技术人员的常规理解是相同的。

优选的，本发明高粱体细胞悬浮培养方法，还包括以下实施例。

实施例1

步骤1，高粱种子的处理(所述高粱种子的基因型为R111)：

高粱种子先用70％乙醇(体积分数)浸泡灭菌1min，再用无菌水冲洗2次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡灭菌15min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温-20，最后无菌水冲洗5次，得到无菌高粱种子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡时，均进行搅拌处理。

步骤2，制备高粱愈伤组织：

将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，接种时注意高粱种子胚朝上，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长3-5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20-30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，连续继代培养2次，每次间隔18天，培养条件同愈伤培养(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；

所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：

选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织，用镊子夹碎成小颗粒状，接种于液体培养基中，接种比例(高粱颗粒状愈伤组织与液体培养基的比例)为2.5g:100mL，每个处理接种两瓶，置于100r/min的摇床上进行震荡培养，25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次，每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42-45天后获得高粱体细胞悬浮系；

所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH为5.8。

实施例2

步骤1，高粱种子的处理：

高粱种子先用70％乙醇(体积分数)浸泡灭菌3min，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡灭菌10min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温-20，最后无菌水冲洗6次，得到无菌高粱种子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡时，均进行搅拌处理。

步骤2，制备高粱愈伤组织：

将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，接种时注意高粱种子胚朝上，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长3-5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20-30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，连续继代培养2次，每次间隔25天，培养条件同愈伤培养(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；

所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：

选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织接种于液体培养基中，接种比例(高粱颗粒状愈伤组织与液体培养基的比例)为2g:100mL，每个处理接种两瓶，置于100r/min的摇床上进行震荡培养，25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次，每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42-45天后获得高粱体细胞悬浮系；

所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

实施例3

步骤1，高粱种子的处理：

高粱种子先用70％乙醇(体积分数)浸泡灭菌2min，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡灭菌20min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温-20，最后无菌水冲洗5次，得到无菌高粱种子；

上述70％乙醇浸泡或者HgCl₂水溶液浸泡时，均进行搅拌处理。

步骤2，制备高粱愈伤组织：

将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，接种时注意高粱种子胚朝上，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长3-5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20-30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，连续继代培养2次，每次间隔22天，培养条件同愈伤组织培养(25±1℃，自然光照)，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；

所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：

选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织接种于液体培养基中，接种比例(高粱颗粒状愈伤组织与液体培养基的比例)为3g:100mL，每个处理接种两瓶，置于100r/min的摇床上进行震荡培养，25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次，每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42-45天后获得高粱体细胞悬浮系；

所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)和30g的蔗糖，pH5.8。

下面以实施例1的方法为例，对高粱体细胞悬浮系构建过程中的愈伤组织生长状况、细胞密度等进行说明，具体包括：

以基因型R111的高粱种子灭菌后制备高粱愈伤组织，R111幼苗苗叶的愈伤诱导率为80-85％，有三种类型愈伤组织，如图1所示，图1中a为Ⅰ型高粱愈伤组织结构图，为白色或浅褐色半透明愈伤，柔软，含水量很高，水渍状，分泌粘液；图1中b为Ⅱ型高粱愈伤组织结构图，愈伤白色或浅绿色，含水量较Ⅰ型少，形状不规则，结构松散；图1中c和d均为Ⅲ型高粱愈伤组织结构图，愈伤白色或浅绿色，干燥，表面颗粒状，结构较疏松。Ⅲ型高粱愈伤组织的颗粒状愈伤脱分化程度和胚性高，适于作细胞悬浮培养。经过2-3次的继代，可以得到许多Ⅲ型颗粒状的愈伤组织。继代时应注意将不同类型的愈伤分离开，并保持其原有极性，这样有利于快速获得Ⅲ型颗粒状的愈伤组织。

以上述Ⅲ型愈伤组织为材料，制备细胞悬浮系，不同培养时期的细胞显微视图如图2所示，a图为Ⅲ型愈伤组织培养一周后的细胞形态16×4倍放大图，b图为Ⅲ型愈伤组织培养一周后的细胞形态16×25倍放大图，该时期的悬浮细胞系由游离单细胞和多细胞团组成，大小形状极不均一，多属薄壁细胞，破碎和质壁分离普遍存在，活细胞率较低，细胞内容物少，分裂能力弱，细胞团由几个到几十个不等的细胞组成。

图2中c图为Ⅲ型愈伤组织第3次继代培养后的细胞形态16×10倍放大图，d图为Ⅲ型愈伤组织第4次继代培养后的细胞形态16×10倍放大图，经过连续3-4次的继代培养，细胞形状开始转为近圆形细胞，细胞数量也逐渐增加。

图2中e图Ⅲ型愈伤组织第6次继代培养后的细胞形态16×4倍放大图，f图Ⅲ型愈伤组织第6次继代培养后经伊文斯蓝染色后的细胞形态16×25倍放大图，该时期游离细胞体积小，细胞质浓厚，血球计数板检测显示细胞密度为6.45×10⁵-5.08×10⁶个/mL，伊文斯蓝检测显示活细胞率为60.87-75％，近圆形细胞(圆形细胞、椭圆形细胞、肾形细胞)率为77.13-83.96％，细胞分裂生长旺盛，至此建立起一个良好的液体细胞悬浮系，可以用于高粱育种的研究。

所述活细胞率的检测方法为：取悬浮细胞液一滴于载玻片中间，滴一滴0.05％伊文斯蓝染色液染色，置于倒置显微镜下观察，活细胞无色或仅有液泡呈淡淡的蓝色，死细胞核被染成蓝色或整个原生质呈蓝色。显微镜下计数10个视野的悬浮细胞，计算活细胞的比例，活细胞率计算公式为：活细胞率(％)＝(活细胞总数/悬浮细胞总数)×100％。

所述近圆细胞为圆形细胞、椭圆形细胞或者肾形细胞，检测方法为计数完活细胞后，同时计数近圆形细胞，近圆细胞率的计算公式为：近圆细胞率(％)＝(近圆细胞总数/悬浮细胞总数)×100％；

所述细胞密度的测定方法为：取1ml悬浮细胞液，将其稀释3-5倍后，取1ml稀释的悬浮细胞液加入1ml伊文斯蓝染色液染色，滴于血球计数板上，盖玻片压片后，于显微镜下计数，取四周大格为计数区，计算细胞密度，细胞密度的计算公式为：细胞密度(个/mL)＝四周大格的细胞数/4×10000×稀释倍数×10×2。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种高粱体细胞悬浮培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1，高粱种子的处理：

高粱种子先用70％乙醇浸泡1-3min，再用无菌水冲洗，然后用0.1g/100mL的HgCl₂水溶液浸泡10-20min，HgCl₂水溶液浸泡过程中加入2滴吐温-20，最后无菌水冲洗，得到无菌高粱种子；

步骤2，制备高粱愈伤组织，具体包括：

将无菌高粱种子接种于无菌苗培养基中，于25±1℃培养，每天光照12h；培养到高粱无菌苗苗长为3-5cm时取出，将距离叶基1.0cm以上的叶片切成宽度为1mm的叶段，并将叶段接种于诱导培养基中，在25±1℃下培养愈伤，自然光照，20-30天后挑选状态良好的愈伤组织进行继代培养，继代培养温度为25±1℃，自然光照，直至得到高粱颗粒状愈伤组织；

所述无菌苗培养基为：每升MS培养基中添加30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

所述继代培养的培养基与诱导培养基相同，均为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D、30g的蔗糖和8g的琼脂，pH为5.8；

步骤3，高粱体细胞悬浮系的建立：

选取步骤2中疏松、干燥、易碎、生长旺盛、颗粒状的高粱愈伤组织接种于液体培养基中，接种比例为2-3g:100mL，于100r/min、25±1℃、自然光下培养，每隔7天继代一次；每次继代时，将新、旧液体培养基以体积比为2：1的比例混合后作为继代培养的培养基，总共培养42-45天后获得高粱体细胞悬浮系；

所述液体培养基为：每升MS培养基中添加1mg的2,4-D和30g的蔗糖，pH为5.8。

2.根据权利要求1所述的高粱体细胞悬浮培养方法，其特征在于，步骤1中，高粱种子先用70％乙醇浸泡1min后，再用无菌水冲洗2-3次；HgCl₂水溶液浸泡15min后，用无菌水冲洗5-6次。

3.根据权利要求1所述的高粱体细胞悬浮培养方法，其特征在于，步骤2中，所述继代培养的次数为2-3次，每次间隔18-25天。

4.根据权利要求1所述的高粱体细胞悬浮培养方法，其特征在于，步骤3中，接种比例为2.5g:100mL。

5.一种如权利要求1所述的高粱体细胞悬浮培养方法在高粱育种中的应用。