CN114807007B - 猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用 - Google Patents

猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用。每升本发明所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3％～2％W/V混合酶液，300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mMDTT和10～20mM MES；所述混合酶液包括纤维素酶R‑10和果胶酶Y‑23。利用本发明猕猴桃原生质体提取液对猕猴桃果肉进行酶解，能够缩短酶解时间，使制备的原生质体保持长时间的活力，增大提取效率。

Description

猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于原生质体制备技术领域，具体涉及猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用。
背景技术
猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)的落叶类木质藤本植物，多数是雌雄异株，极少数是雌雄同株。全世界猕猴桃分布于从马来西亚至西伯利亚东部的广阔地带，目前有猕猴桃属66种，其中62个种原产我国，我国是猕猴桃的的原生中心，湖北宜昌市夷陵区雾渡河镇是世界猕猴桃的原产地。猕猴桃具有较高的营养价值，有消炎、抗肿瘤等药用价值，还可以加工成果汁等可以长时间贮藏的食物。
植物原生质体是指细胞壁以内各种结构的总称，因其失去细胞壁，可以作为基础研究及作物改良的理想材料，并且具有再生形成完整植株的能力。因此原生质体培养是猕猴桃育种的重要手段。目前制备猕猴桃原生质体的主要手段是酶解法，然而利用常规酶解法制备猕猴桃原生质体时，酶解时间长，制备效率不高。例如，王明明利用酶解8～10h的方法制备猕猴桃原生质体(王明明.红阳猕猴桃原生质体培养及影响其生长分裂的理化因子分析[D].重庆:西南大学,2019.)。对于愈伤组织的制备条件有进一步优化的空间。
发明内容
本发明的目的在于提供猕猴桃原生质体提取液和猕猴桃原生质体及其制备方法和应用，缩短制备猕猴桃原生质体时的酶解时间，使制备得到的原生质体保持长时间的酶活力。
本发明提供了一种猕猴桃原生质体提取液，每1L所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3％～2％W/V混合酶液，300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mM DTT和10～20mM MES；
所述混合酶液包括纤维素酶R-10和果胶酶Y-23。
优选的，所述纤维素酶R-10和果胶酶Y-23的质量比为2～3:0.6～1。
本发明还提供了所述的猕猴桃原生质体提取液的制备方法，包括如下步骤：
将预热的混合酶液与甘露醇，CaCl2，DTT和MES混合，得所述猕猴桃原生质体提取液。
优选的，所述预热的温度为52～55℃；所述预热的时间为10～15min。
本发明还提供了一种猕猴桃原生质体的制备方法，包括如下步骤：
利用上述技术方案所述的猕猴桃原生质体提取液对洁净的猕猴桃果肉进行酶解45～120min，分离，得沉淀后，对所述沉淀重复进行重悬-静置-得沉淀的过程，得到猕猴桃原生质体；
所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液的质量体积比为2～3g：20～30mL。
优选的，所述酶解的温度为20～28℃；所述酶解的pH为5.6～5.8。
优选的，所述洁净的猕猴桃果肉的制备方法包括依次对猕猴桃果肉进行切块处理和洗涤处理；
所述猕猴桃果肉包括猕猴桃中轴胎座或除中轴胎座之外的其余猕猴桃果肉；
每1L所述洗涤用洗涤液包括300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mM DTT和10～20mM MES。
优选的，对所述猕猴桃果肉进行切块处理时，包括分别对中轴胎座和除中轴胎座之外的其余猕猴桃果肉进行切块处理，得中轴胎座切块和其他部分果肉切块；
所述中轴胎座切块的长为1～3mm，宽为1～2mm，厚为1～2mm；所述其他部分切块的长为2～3mm，宽为2～3mm，厚为1～3mm。
优选的，所述猕猴桃果肉的制备方法包括对去除外果皮的猕猴桃果实进行切片处理，得所述猕猴桃果肉；所述切片处理的方式包括沿去除外果皮的猕猴桃果实的纵轴对半分开，每半切成多个扇形。
本发明还提供了上述技术方案所述猕猴桃原生质体在猕猴桃育种和生物信息学方面的应用。
本发明提供了一种猕猴桃原生质体提取液，每1L所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3％～2％W/V混合酶液，300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mM DTT和10～20mM MES；所述混合酶液包括纤维素酶R-10和果胶酶Y-23。本发明通过精心调配猕猴桃原生质体提取液，能够降解猕猴桃细胞壁，缩短酶解时间，使细胞游离出来，维持细胞的生理状态。
本发明对纤维素酶R-10和果胶酶Y-23的混合酶液进行预热处理，能够进一步激发酶活力，促进纤维素酶R-10和果胶酶Y-23的混合酶液与其他成分混合，更好地降解细胞壁，缩短酶解时间。
本发明在制备猕猴桃原生质体的过程中基于猕猴桃不同部分的细胞特性，根据切块的部分，调整的切块的大小，有利于酶解液与细胞更好的接触，提高提取效果；并且酶解前，本发明对猕猴桃果肉进行洗涤，去除了破损的组织和细胞，以及破碎细胞释放出的高浓度糖份、酸、多酚、淀粉粒等内含物，保持酶解时pH在5.6～5.8，使得酶能够高效发挥功能，酶解游离出来的原生质体长时间保持活力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例6除中轴胎座部分的其他部分的猕猴桃果肉制备得到的原生质体的状态图；
图2为对比例1除中轴胎座部分的其他部分的猕猴桃果肉制备得到的原生质体的状态图；
图3为实施例6中轴胎座部分制备得到的原生质体的状态图；
图4为对比例1中轴胎座部分制备得到的原生质体的状态图。
具体实施方式
本发明提供了一种猕猴桃原生质体提取液，每1L所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3％～2％W/V混合酶液，300～900mM甘露醇，50～65mM CaCl2，1～2mM DTT和10～20mM MES；所述混合酶液包括纤维素酶R-10和果胶酶Y-23。
以1L猕猴桃原生质体提取液计，本发明提供的猕猴桃原生质体提取液包括1.3％～2％W/V混合酶液，优选为1.5％～1.8％W/V。本发明所述混合酶液优选包括纤维素酶R-10和果胶酶Y-23。本发明所述纤维素酶R-10和果胶酶Y-23的质量比优选为2～3:0.6～1，进一步优选为2.4～2.8：0.65～0.85，更优选为2.5～2.6：0.7～0.75。本发明所述纤维素酶R-10能够分解细胞壁中的纤维素、半纤维素成分；所述果胶酶Y-23分解细胞与细胞之间的果胶质以及细胞壁中的果胶质。本发明将纤维素酶R-10和果胶酶Y-23组合使用，能有效的分解细胞壁，离散细胞，从而释放原生质体。本发明所述纤维素酶R-10和果胶酶Y-23均优选购自Yacult Honsha,Tokyo,Japan。
以1L猕猴桃原生质体提取液计，本发明提供的猕猴桃原生质体提取液包括300～900mM甘露醇，优选为400～800mM，进一步优选为500～700mM，更优选为600mM。本发明所述甘露醇稳定原生质体的渗透压。
以1L猕猴桃原生质体提取液计，本发明提供的猕猴桃原生质体提取液包括50～65mM CaCl2，优选55～60mM。本发明所述CaCl2对原生质体膜有稳定作用。
以1L猕猴桃原生质体提取液计，本发明提供的猕猴桃原生质体提取液包括1～2mMDTT，优选为1.2～1.8mM，进一步优选为1.5mM。本发明所述DTT是还原剂，保护原生质体膜上以及膜内蛋白不被氧化和降解。
以1L猕猴桃原生质体提取液计，本发明提供的猕猴桃原生质体提取液包括10～20mM MES，优选为12～18mM，进一步优选为15～16mM。本发明所述MES是PH缓冲剂，维持原生质体提取液的pH在5.8左右。
本发明所述原生质体提取液通过精心调配，可以更好地将猕猴桃细胞壁去除，使原生质体游离出来，保持长时间的细胞护理，维持很好的生理状态。
本发明还提供了所述猕猴桃原生质体提取液的制备方法，包括如下步骤：
将预热的混合酶液与甘露醇、CaCl2，DTT和MES混合，得所述猕猴桃原生质体提取液。
本发明将所述纤维素酶R-10和果胶酶Y-23混合，得混合酶液后进行预热处理，得预热的混合酶液。本发明所述预热的温度优选为52～55℃，进一步优选为53～54℃；所述预热的时间优选为10～15min，进一步优选为12～14min。本发明对混合酶液进行预热处理能够激发酶活力，促进酶的溶解，在短时间内实现细胞壁的降解，避免原生质体皱缩导致的提取效果降低。
本发明优选将预热的酶解液冷却至室温后，与甘露醇、CaCl2，DTT和MES混合，得所述猕猴桃原生质体提取液。本发明对所述冷却和所述混合的方式没有严格要求，常规进行即可。本发明所述将预热的酶解液冷却能够避免预热的酶解液与甘露醇、CaCl2，DTT和MES混合时温度过高影响DTT的功能。
本发明还提供了一种猕猴桃原生质体的制备方法，包括如下步骤：
利用上述猕猴桃原生质体提取液对洁净的猕猴桃果肉进行酶解进行酶解45～120min，分离，得沉淀后，对所述沉淀重复进行重悬-静置-得沉淀的过程，得到猕猴桃原生质体；
所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液的质量体积比2～3g：20～30mL。
本发明优选对去除外果皮的的猕猴桃果实进行切片处理，得猕猴桃果肉。本发明所述切片处理的方式优选包括沿去除外果皮的猕猴桃果实的纵轴对半分开，每半切成多个扇形。本发明在切成扇形时，优选延与纵轴平行的方向进行切片；本发明所述扇形的厚度优选为6～10mm，进一步优选为7～8mm。本发明对所述扇形的半径没有严格要求，常规进行即可。
得猕猴桃果肉后，本发明将猕猴桃果肉的中轴胎座与其他部分分开，分别对中轴胎座和其他部分进行切块处理，得中轴胎座切块和除中轴胎座之外的其余猕猴桃果肉。本发明所述中轴胎座切块的长优选为1～3mm，进一步优选为1.5～2.5mm；所述中轴胎座切块的宽优选为1～2mm，进一步优选为1.2～1.8mm；所述中轴胎座切块的厚优选为1～2mm，进一步优选为1.4～1.6mm；所述其他部分切块的长优选为2～3mm，进一步优选为2.5～2.8mm；所述其他部分切块的宽优选为2～3mm，进一步优选为2.5～2.8mm；所述其他部分切块的厚优选为1～3mm，进一步优选为1.5～2.8mm，更优选为2～2.5mm。本发明优选使用手术刀对中轴胎座和其他部分进行切块处理。猕猴桃果肉的中轴胎座部分细胞小，排列紧密；中轴胎座以外的果肉部分，细胞较大，细胞内含的水分、糖分等物质较多细胞在外力的作用下，较易受损。本发明基于猕猴桃不同部分的细胞特性，根据切块的部分，调整的切块的大小，有利于酶解液与细胞更好的接触，还能保护细胞不受损，增大原生质体的提取效果。
得中轴胎座切块和其他部分果肉切块后，本发明分别将所述中轴胎座切块和除中轴胎座之外的其余猕猴桃果肉切块置于洗涤液中，进行洗涤处理，得洁净的中轴胎座果肉和洁净的其他部分果肉；或者将所述中轴胎座切块和其他部分切块混合，得猕猴桃果肉切块，将所述猕猴桃果肉切块置于洗涤液中，进行洗涤处理，去除洗涤液，得洁净的猕猴桃果肉切块。本发明在洗涤过程中，优选将所述中轴胎座切块、或其他部分果肉切块，或猕猴桃果肉切块迅速置于洗涤液中，防治果肉脱水老化。本发明所述洗涤液的pH优选为5.6～5.8，进一步优选为5.6～5.7。本发明所述洗涤液优选为4℃预冷后的洗涤液。本发明得到的洁净的中轴胎座果肉和洁净的其他部分果肉的混合物，以及洁净的猕猴桃果肉切块统称为洁净的猕猴桃果肉。本发明对所述混合的方式没有严格要求，常规进行即可。
本发明所述洗涤处理的次数优选为5～8次，进一步优选为6～7次。本发明每次进行洗涤处理时，所述猕猴桃果肉切块与洗涤液的质量体积比优选为2～4g：20～30mL，进一步优选为2.5～3g：25～28mL。本发明优选在洗涤处理时，使猕猴桃果肉切块悬浮，实现猕猴桃果肉切块与洗涤液的充分接触。本发明在所述洗涤处理的过程中，实时观察洗涤液的浑浊程度，去除浑浊的洗涤液，加入新的洗涤液进行下一次洗涤。本发明对猕猴桃果肉切块进行多次洗涤处理，能够去除破损的果肉、果肉残渣和淀粉粒等，并且保持猕猴桃果肉切块与洗涤液的pH一致，即5.6～5.8，避免猴桃果肉切块影响酶解过程的pH而降低酶解效果。
在本发明中，每1L所述洗涤用洗涤液优选包括300～900mM甘露醇，50～65mMCaCl2，1～2mM DTT和10～20mM MES。
以1L洗涤液为基准，本发明提供的洗涤液优选包括300～900mM甘露醇，进一步优选为400～800mM，更优选为500～600mM。本发明以甘露醇作为洗涤液组分稳定原生质体的渗透压。
以1L洗涤液为基准，本发明提供的洗涤液优选包括50～65mM CaCl2，进一步优选为52～60mM，更优选为54～58mM。本发明以CaCl2作为洗涤液组分对原生质体膜有稳定作用。
以1L洗涤液为基准，本发明提供的洗涤液优选包括1～2mM DTT，进一步优选为1.2～1.8mM，更优选为1.4～1.5mM。本发明以DTT是还原剂，作为洗涤液组分保护原生质体膜上以及膜内蛋白不被氧化和降解。
以1L洗涤液为基准，本发明提供的洗涤液优选包括10～20mM MES，进一步优选为12～18mM，更优选为15～16mM。本发明以MES是PH缓冲剂，作为洗涤液组分维持原生质体提取液的pH在5.8左右。
得洁净的猕猴桃果肉后，本发明将上述技术方案得到的猕猴桃原生质体提取液与所述洁净的猕猴桃果肉混合酶解45～120min，得含有猕猴桃原生质体的酶解液。本发明所述酶解的时间优选为50～110min，进一步优选为60～100min，更优选为80～95min。本发明所述酶解的温度优选为20～28℃，进一步优选为22～26℃，更优选为24～25℃；所述酶解的pH优选为5.6～5.8，进一步优选为5.6～5.7。本发明所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液的质量体积比为2～3g：20～30mL，优选为2.4～2.6g：22～26mL。本发明所述酶解优选在避光条件下进行。本发明对避光的方式没有严格要求，常规进行即可，如将所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液混合后，置于无菌培养皿中，利用锡箔纸包括所述无菌培养皿，避免透光即可。本发明避光酶解能保护原生质体膜的稳定性不被光能破坏，以及提高酶的活性。本发明优选在酶解过程中，每酶解15min，晃动所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液的混合物，使所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液充分接触，使原生质体更好地游离出来，提高酶解效果。
得含有猕猴桃原生质体的酶解液后，本发明对有猕猴桃原生质体的酶解液进行分离处理，得未酶解完的猕猴桃果肉和含有猕猴桃原生质体的酶解上清液。本发明对所述分离的方式没有严格要求，常规进行即可。
得未酶解完的猕猴桃果肉和含有猕猴桃原生质体的酶解上清液后，本发明优选使用含有猕猴桃原生质体的酶解上清液淋洗所述未酶解完的猕猴桃果肉，得到含有猕猴桃原生质体的酶解液。本发明所述淋洗的次数优选为3～4次。
本发明优选对含有猕猴桃原生质体的酶解液进行分离处理，得猕猴桃原生质体。本发明所述分离优选包括依次进行的过滤处理和静置处理。本发明过滤所述含有猕猴桃原生质体的酶解液，得含有猕猴桃原生质体的酶解滤液。本发明所述过滤处理优选使用细胞筛；本发明所述细胞筛的孔径优选为50～100目，进一步优选为60～80目，更优选为65～75目。
得含有猕猴桃原生质体的酶解滤液后，本发明静置所述含有猕猴桃原生质体的酶解滤液，收集沉淀，即为所述猕猴桃原生质体。本发明所述静置的时间优选为15min。本发明优选对得到的猕猴桃原生质体的沉淀重复进行重悬-静置-得沉淀的过程，得到干净的猕猴桃原生质体。本发明所述重悬-静置-得沉淀的重复次数优选为2次；所述重悬使用的重悬液优选为制备过程中使用的洗涤液，对于洗涤液的组成与上述方案一致，在此不作赘述。
本发明所述猕猴桃原生质体的制备方法简单高效，缩短了酶解时间，可以获得大量长时间保持活力的猕猴桃原生质体。本发明所述技术方案适用与所有猕猴桃品种以及各发育时期，例如阳光金果、徐香和东红等。本发明在具体实施中以采自江西农业大学旁边的生态园的野生的中华猕猴桃为例进行说明，但是不能理解为本发明只适用于野生的中华猕猴桃。
本发明还提供了所述猕猴桃原生质体在猕猴桃育种和生物信息学方面的应用。本发明所述生物信息学方面的应用，优选包括在单细胞测序、转录组、蛋白质组或代谢组中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明所用材料及试剂包括甘露醇、CaCl2、DTT、MES、纤维素酶R-10、果胶酶Y-23和无菌水；
1.洗涤液的配制：
无菌水、甘露醇、CaCl2、DTT和MES配制洗涤液，其中甘露醇、CaCl2、DTT和MES的摩尔比为800：65：1和10。
将洗涤液置于4℃冷藏室2～4h，取出20～30mL洗涤液置于50mL无菌离心管中，置于冰箱冷藏室备用；取26～30mL洗涤液到50mL烧杯中备用。
2.混合酶液的配制：
用无菌水、纤维素酶R-10和果胶酶Y-23配制混合酶液，其中纤维素酶R-10和果胶酶Y-23的质量浓度比为1：0.3。
3.原生质体提取液的配制：
将步骤2混合酶液在55℃的条件下水浴10min，取出置于试管架，冷却至室温；用步骤1洗涤液稀释冷却至室温的混合酶液，得原生质体提取液，原生质体酶解液中各组分的浓度为纤维素酶-101.5％W/V，果胶酶Y-230.3％W/V，800mM甘露醇，65mM CaCl2，1mM DTT和10mM MES，pH为5.8。
实施例2～6
使用实施例1的材料及试剂，配制与实施例1组分相同，浓度不同的原生质体提取液，原生质体提取液中各组分的浓度具体列于表1中。
表1实施例1～6原生质体提取液中各组分的浓度
组分 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
甘露醇(mM) 800 900 500 300 300 300
CaCl2(mM) 65 65 55 50 50 50
DTT(mM) 1 2 1.5 1 1 1
MES(mM) 10 20 15 10 10 10
pH 5.8 5.8 5.7 5.6 5.6 5.6
纤维素酶-10(g/mL) 1.5％ 1％ 1％ 1.5％ 1.2％ 1％
果胶酶Y-23(g/mL) 0.3％ 0.3％ 0.3％ 0.5％ 0.4％ 0.3％
实施例7
1.洁净的猕猴桃果肉的制备：
(1)用自来水洗净新鲜无损伤的猕猴桃果实(采自江西农业大学旁边的生态园)，再用灭菌蒸馏水冲洗三遍。用手轻轻将猕猴桃外果皮去除，再用灭菌手术刀将猕猴桃果实沿纵轴对半分开，每半切成6～10mm宽的扇形猕猴桃果片(与纵轴平行切片)，置于洁净的称量纸上。
(2)用手术刀将猕猴桃中轴胎座与其他部分分开，对于中轴胎座部分，切成约1～3(长)×1～2(宽)×1～2(厚)mm的小块，迅速放入实施例1装有预冷洗涤液的50mL无菌离心管中；对于其他部分，切成约2～3(长)×2～3(宽)×1～3(厚)mm大小的小块，迅速放入实施例1装有预冷洗涤液的50mL无菌离心管中。整个操作步骤要迅速，具体的，每将果肉切成小块后尽快置于洗涤液中，防止果肉脱水和氧化。
(3)待果肉全部切完之后，将已浑浊的洗涤液缓慢倒掉，并用1mL一次性移液管将残液吸取干净，再缓慢倒入20～30mL实施例1的预冷洗涤液(4℃)，盖好管盖，水平拿着离心管，左右轻轻摇晃离心管使果肉悬浮并与洗涤液充分接触。
(4)重复第(3)步骤5～8次，直到溶液变得澄清且果肉和洗涤液混合物的pH为5.6。
(5)准备直径11cm无菌滤纸3～6张叠放置于试验台上，滴少量洗涤液微微湿润滤纸(最上面两层滤纸湿润但不滴水)，再将润湿的滤纸置于电子天平上，去皮，准备称重。
(6)准备直径11cm无菌滤纸3～6张叠放置于试验台上，用22cm单头药匙轻轻挖取洗涤干净的果肉，将装着果肉药匙的慢慢立起来，放在无菌滤纸上，让洗涤液顺着药匙滑落到滤纸上(果肉尽量不直接接触滤纸)，残液需充分吸干，再将已吸干洗涤液的果肉转移至滤纸上称重。
2.猕猴桃原生质体的制备
2-1利用除中轴胎座其余部分的猕猴桃果肉制备原生质体
(1)称取2g洗涤干净的其他部分的猕猴桃果肉置于装有30mL步骤1得到的猕猴桃原生质体提取液的一次性无菌圆形培养皿(直径90mm)中用铝箔纸包好防止透光，室温(20-28℃)孵育45min，期间每15分中轻轻晃动培养皿，以便原生质体更好的游离出来。
(2)在原生质体游离结束前20-30min，准备100目的无菌低圈带柄细胞筛一个，放入100mL烧杯中，倒入洗涤液直至没过细胞筛的滤网部分，准备过滤用。取无菌一次性培养皿一个，打开，将洗涤液润洗过的细胞筛放入培养皿中(注意细胞筛底部要与培养皿底接触)。
(3)轻轻打开铝箔纸，将培养皿取出，轻轻置于试验台上，用3mL一次性移液管轻轻小心吸走溶液，轻轻置于细胞筛上过滤。未酶解完的果肉用药匙集中到培养皿壁上，1mL洗涤液轻轻冲洗3～4遍，再用药匙沿培养皿壁轻轻挤压果肉，再吸取培养皿里的溶液轻轻冲洗3～4遍，最后吸取培养皿里的溶液至细胞筛上过滤。
(4)将培养皿里的溶液转移至50mL无菌离心管中，4℃静置15min。
(5)去掉上清，用实施例1预冷的洗涤液(4℃)轻轻悬浮沉淀的原生质体，4℃静置。重复此步骤2次。
(6)离心去上清后，离心管底部的沉淀即为干净的其他部分的猕猴桃果肉制备得到的原生质体。
2-2利用猕猴桃中轴胎座制备原生质体
同2-1，将步骤(1)洗涤干净的其他部分的猕猴桃果肉换成等质量的2g洗涤干净的猕猴桃中轴胎座即可，最后得到中轴胎座部分制备得到的原生质体和。
实施例8～24
按照实施例7的方式利用实施例1～6的洗涤液和混合酶液制备猕猴桃原生质体，其中实施例7～9使用实施例1的洗涤液和混合酶液；实施例10～12使用实施例2的洗涤液和混合酶液；实施例13～15使用实施例3的洗涤液和混合酶液；实施例16～18使用实施例4的洗涤液和混合酶液；实施例19～21使用实施例5的洗涤液和混合酶液；实施例22～24使用实施例6的洗涤液和混合酶液；实施例7、10、13、16、19和22的预热温度和时间一致；实施例8、11、14、17、20和23的预热温度和时间一致；实施例9、12、15、18、21和24的预热温度和时间一致，具体列于表2中。
表2实施例7～24不同原生质体提取液处理方式
对比例1
同实施例7，区别在于不进行步骤1中的(3)～(6)，直接对切块后的猕猴桃果肉进行酶解，得原生质体。
测试例1
(1)以实施例7中除中轴胎座部分的其他部分的猕猴桃果肉制备得到的原生质体为1号样品，对比例1中轴胎座部分制备得到的原生质体为2号样品，利用FDA染色法对1号样品和2号样品进行荧光染色，并在显微镜下观察，结果如图1～2所述。其中，图1从左到右依次为明视场下的1号样品、绿色荧光场下的1号样品和明场和绿色荧光场合并下的1号样品，比例尺＝100μm；图2从左到右依次为明视场下的2号样品、绿色荧光场下的2号样品和明场和绿色荧光场合并下的2号样品，比例尺＝100μm，箭头标记所指的为淀粉粒。
由图1～2可以看出，相比图2，图1原生质体溶液里完整的原生质体的数量较多，活力更强，并且淀粉粒较少，说明本发明先洗涤后酶解的方案使得酶能够高效发挥功能，酶解游离出来的原生质体活力更强。
(2)以实施例7中轴胎座部分制备得到的原生质体为3号样品，对比例1中轴胎座部分制备得到的原生质体为4号样品，利用FDA染色法对3号样品和4号样品进行荧光染色，并在显微镜下观察，结果如图3～4所述。其中，图3从左到右依次为明视场下的3号样品、绿色荧光场下的3号样品和明场和绿色荧光场合并下的3号样品，比例尺＝100μm；图4从左到右依次为明视场下的4号样品、绿色荧光场下的4号样品和明场和绿色荧光场合并下的4号样品，比例尺＝100μm，箭头标记所指的为淀粉粒。
由图3～4可以看出，相比图4，图3原生质体溶液里完整的原生质体的数量较多，活力更强，说明本发明先洗涤后酶解的方案使得酶能够高效发挥功能，酶解游离出来的原生质体活力更强，能够提高酶解效率。
由以上实施例可知本发明提供的技术方案能够缩短酶解时间，增加原生质体的数量和活力，大提取效果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种猕猴桃原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用猕猴桃原生质体提取液对洁净的猕猴桃果肉进行酶解45~120min，分离，得沉淀后，对所述沉淀重复进行重悬-静置-得沉淀的过程，得到猕猴桃原生质体；
所述洁净的猕猴桃果肉与所述猕猴桃原生质体提取液的质量体积比为2~3g：20~30mL；
所述洁净的猕猴桃果肉的制备方法包括依次对猕猴桃果肉进行切块处理和洗涤处理；每1L所述洗涤处理用洗涤液包括300~900mM甘露醇，50~65mM CaCl2，1~2 mM DTT和10~20mMMES；
所述对猕猴桃果肉进行切块处理包括：分别对中轴胎座和除中轴胎座之外的其余猕猴桃果肉进行切块处理，得中轴胎座切块和其他部分果肉切块；
所述中轴胎座切块的长为1~3mm，宽为1~2mm，厚为1~2mm；所述其他部分切块的长为2~3mm，宽为2~3mm，厚为1~3mm；
每1L所述猕猴桃原生质体提取液中，包括1.3%~2% W/V混合酶液，300~900mM甘露醇，50~65mM CaCl2，1~2 mM DTT和10~20mM MES；
所述混合酶液由纤维素酶R-10和果胶酶Y-23组成；
所述纤维素酶R-10和果胶酶Y-23的质量比为2~3:0.6~1；
所述酶解的温度为20~28℃；所述酶解的pH为5.6~5.8。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猕猴桃原生质体提取液的制备方法包括如下步骤：
将预热的混合酶液与甘露醇，CaCl2，DTT和MES混合，得所述猕猴桃原生质体提取液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述预热的温度为52~55℃；所述预热的时间为10~15min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猕猴桃果肉的制备方法包括对去除外果皮的猕猴桃果实进行切片处理，得所述猕猴桃果肉；所述切片处理的方式包括沿去除外果皮的猕猴桃果实的纵轴对半分开，每半切成多个扇形。
5.权利要求1~4任一项所述制备方法得到的猕猴桃原生质体在猕猴桃育种中的应用。
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