CN109628374A - 猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，步骤包括：(1)培养愈伤组织，培养基为以MS为基础培养基，添加6‑BA，NAA，蔗糖和琼脂，并调节pH为5.7‑5.8，培养温度为23‑26℃，光照强度为1000‑1500lx，光照时间为16h/d；(2)对愈伤组织用0.3‑0.7mol·L^‑1甘露醇进行预处理，预处理时间为0＜t≤90min；(3)再将愈伤组织放入酶解液进行酶解；(4)将酶解所得的混合液过滤，收集滤液并离心；取沉淀重悬，再次离心并弃去上清液，对沉淀洗涤即得原生质体。通过对愈伤组织培养条件的调整得到适宜的愈伤组织，此外通过甘露醇对愈伤组织进行预处理，提高原生质体的分裂频率，进而使原生质体的活力和产量都有所提高，本发明通过酶的种类、浓度、酶解时间、温度、pH、渗透剂等的配合，使特定愈伤组织得到的原生质体数量最多，且活力良好。

Description

猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法

技术领域

本发明涉及植物组织提取培养领域，具体涉及猕猴桃愈伤组织的原生质体的分离提取方法。

背景技术

猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)的落叶类木质藤本植物，多数是雌雄异株，极少数是雌雄同株。全世界猕猴桃分布于从马来西亚至西伯利亚东部的广阔地带，目前有猕猴桃属66种，其中62个种原产我国，我国是猕猴桃的的原生中心，湖北宜昌市夷陵区雾渡河镇是世界猕猴桃的原产地。猕猴桃具有较高的营养价值，有消炎、抗肿瘤等药用价值，还可以加工成果汁等可以长时间贮藏的食物。

植物原生质体因其失去细胞壁，可以作为基础研究及作物改良的理想材料，因此原生质体培养是猕猴桃育种的重要手段。原生质体通常从愈伤组织中提取分离而得，对于愈伤组织的形态、原生质体的分离纯化等条件均有进一步优化的空间。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种优化的猕猴桃愈伤组织原生质体的提取分离方法，对特定形态愈伤组织的处理方式、酶解液等分离条件进行调整，使该愈伤组织提取得到的原生质体数量更多。

本发明的技术方案是提供一种猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，包括如下步骤：

(1)培养愈伤组织，培养基为以MS为基础培养基，添加0.5-1.5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)，0.05-0.5mg/L NAA(萘乙酸)，25-35g/L蔗糖和5-9g/L琼脂，并调节pH为5.7-5.8，培养温度为23-26℃，光照强度为1000-1500lx，光照时间为16h/d；

(2)对步骤(1)所得的愈伤组织用0.3-0.7mol·L^-1甘露醇进行预处理，预处理时间为0＜t≤90min；

(3)将步骤(2)所得的愈伤组织放入酶解液进行酶解；

(4)将酶解所得的混合液过滤，收集滤液并离心；取沉淀重悬，再次离心并弃去上清液，对沉淀洗涤即得原生质体。

进一步地，上述步骤(1)中，添加物质浓度优选为0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30g/L蔗糖和7g/L琼脂。在该浓度下，所得的愈伤组织为浅绿色，质地较致密，块状有少数颗粒凸起，其分离原生质体效果最好。

进一步地，上述步骤(2)中，预处理条件优选为甘露醇浓度0.7mol·L^-1，处理时间60min，甘露醇作为渗透剂对猕猴桃愈伤组织进行预处理，使愈伤组织能够迅速适应后续步骤的渗透压，有利于分离操作。

进一步地，上述步骤(3)中，酶解液的组成为甘露醇0.3-0.7mol·L^-1，纤维素酶0.5-2.5％，果胶酶0.1-0.5％，离析酶0.25-1.25％(纤维素酶、果胶酶、离析酶的浓度均指质量浓度)。

进一步地，上述步骤(3)中，酶解液的组成为甘露醇0.7mol·L^-1，纤维素酶1.0％，果胶酶0.1％，离析酶1.25％(纤维素酶、果胶酶、离析酶的浓度均指质量浓度)。

进一步地，上述步骤(4)中，沉淀重悬和沉淀洗涤用溶液均为含13％(w/v)甘露醇的CPW溶液。

本发明的优点和有益效果：通过对愈伤组织培养条件的调整得到适宜的愈伤组织，特别是得到的浅绿色、质地较致密、块状有少数颗粒凸起的愈伤组织，其最有利于后续提取分离原生质体；此外通过甘露醇对愈伤组织进行预处理，一方面改变了细胞以及细胞壁的生理形态，从而提高原生质体的分裂频率，进而使原生质体的活力和产量都有所提高，更为重要的是经过预处理的愈伤组织能够迅速适应后续酶解环境的渗透压，减少原生质体损伤，促使得到数量更多的原生质体。此外原生质体的酶解与酶的种类和浓度、酶解时间、温度、pH、渗透压及其他因素有关，本发明通过酶的种类、浓度、酶解时间、温度、pH、渗透剂等的配合，使特定愈伤组织得到的原生质体数量最多，且活力良好。

附图说明

图1是本发明得到的原生质体的扫描照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

选择合适的游离材料在原生质体游离过程中很关键。原生质体的分离受很多因素的影响，例如：材料的预处理、渗透压浓度、酶解时间、pH、离心转速和时间、酶解液组成、培养温度等都会对原生质体分离产生较大的影响，一般刚诱导而成的愈伤组织较紧密，不适合作为游离原生质体的材料，因此需要选取转代后的愈伤组织进行原生质体的分离。

本发明以‘金艳’猕猴桃愈伤组织为材料，进行原生质体的提取分离。

实施例1

CPW盐溶液配制：CPW盐溶液配制原料如表1所示，将预先配好的CPW在设置温度为121℃，时间为20min的高温高压灭菌锅里进行灭菌，然后等到冷却至室温后，4℃保存。

表1

CPW-13M洗液的配制：称取适量甘露醇溶解于上述CPW盐溶液中，使最终形成含13％(w/v)甘露醇CPW洗液，即CPW-13M洗液，调整pH值为5.8，灭菌条件同CPW盐溶液。

猕猴桃原生质体酶解液的配制：分别称取不同质量的离析酶、纤维素酶、果胶酶、甘露醇溶解于含20mmol·L^-1，10mmol·L^-1KCl的CPW溶液中，溶解后将酶混合液放入55℃恒温水浴锅中加热10min，后冷却至室温，再用CPW溶液定容至25mL，调整pH值为5.7-5.8。在超净工作台内，用孔径为0.45μm的滤膜的过滤器(过滤器应预先进行湿热灭菌)对配制好的混合酶解液进行抽滤灭菌，得到系列浓度的酶解液。应注意的是为了保证酶解效果，酶解液需现配现用。

甘露醇溶液的配制：分别称取27.33g、36.43g、45.54g、54.65g、63.76g的甘露醇溶于500mL的无菌水中，制得浓度分别为0.3mol·L^-1、0.4mol·L^-1、0.5mol·L^-1、0.6mol·L^-1、0.7mol·L^-1的甘露醇溶液，室温下保存。

实施例2

愈伤组织的培养：取猕猴桃叶片诱导愈伤组织，以MS为基础培养基，添加不同质量浓度的植物生长调节剂6-BA(0.5％、1.0％、1.5％)和NAA(0.05％、0.1％、0.5％)，共设置了9种不同浓度梯度，添加蔗糖30g·L^-1，琼脂7g·L^-1，pH调为5.7-5.8之间，培养温度为23-26℃，光照强度为1000-1500lx，光照时间为16h/d，进而获得不同形态特征的愈伤组织，如表2所示，备用。

表2

实施例3

取实施例2中编号3的愈伤组织置于4℃条件下黑暗培养24h，然后取1g愈伤组织用刀切薄片片状后加入0.7mol·L^-1甘露醇中预处理0(对照组)、30、60、90min，后用4层纱布过滤，再用镊子取下纱布上的组织放入15mL酶解液(2.5％纤维素酶+0.4％果胶酶+0.75％离析酶+0.7mol·L^-1甘露醇，8h)中，后置于27±1℃、黑暗条件下进行真空振荡1h，后转移至27±1℃、黑暗、转速为60-70r·min^-1的恒温振荡器中，振荡酶解2-8h。在酶解过程中，相隔2h取1次样，放于显微镜下观察原生质体的酶解情况并作下相应的记录。

酶解结束后，在超净工作台上把混合液依次通过8层纱布和400目不锈钢细胞筛，去除未酶解彻底的组织，用1-2mL的CPW-13M溶液洗涤网，收集滤液置于15mL无菌离心管中，在700r·min^-1下离心8min，使原生质体沉降。离心结束后弃去上层酶液，剩余0.5-1mL左右的沉淀，用移液枪吸取10mL CPW-13M溶液沿离心管壁缓慢加入离心管，重悬原生质体。悬浮液700r·min^-1离心8min.，把上清液舍弃，再用CPW-13M溶液洗涤1-2次。最后，再加入CPW盐溶液后成原生质体悬浮液进行测数。

原生质体的产量统计采用血球计数板，并用以下的计算方式：

原生质体产量/(个·g^-1)＝5个大格内原生质体总数×5×10000×稀释倍数/叶片总质量

结果如表3所示。

表3

其中，酶的规格为纤维素酶R-10，果胶酶Y-23，离析酶R-10。

从表3可以看出，用甘露醇处理愈伤组织时，进行预处理的组得到的原生质体要明显多于未处理组(对照组)，在0-60min时原生质体的数量随着时间的增加显著增加，而90min时数量又明显下降。因此用甘露醇预处理60min能够有效的提高原生质体的产量，说明加入甘露醇可以使植物材料适应之后环境的高渗透压，同时提高原生质体的分裂频率。

实施例4

取实施例2中不同形态的愈伤组织，按照实施例3的步骤分别进行酶解并分离原生质体，其中预处理时间为60min。结果如表4所示

表4

由表4可知，愈伤组织为黄绿色质地较致密块状、深绿质地坚硬块状、浅绿质地疏松粉状这3种形态的无法提取到原生质体，而且组织不是沉于酶解液底部就是浮于酶解液表面，含有杂质。其他三种能得到原生质体，但是产量均偏低，且混合液的颜色都偏褐色，观察到的原生质体的颜色也呈褐色。而愈伤组织形态为浅绿色，质地较致密，块状有少数颗粒凸起的，可以分离出相对多的原生质体。

实施例5

取实施例2中编号3的愈伤组织，按照实施例3的步骤分别进行酶解并分离原生质体，其中预处理时间为60min，酶解液为系列浓度，结果如表5所示。

表5

由表5可知，不同的浓度组合的酶解液，其原生质体产量有很大的不同，其中22号组合的酶解效果最好，原生质体的产量达1.25×106个·g^-1。通过极差分析可得，不同处理组合对猕猴桃愈伤的原生质体产量的影响具有显著差异。各因素水平对猕猴桃愈伤原生质体产量影响的大小顺序为：R(甘露醇)>R(果胶酶)>R(纤维素酶)>R(离析酶)，说明在这4个因素中，甘露醇浓度对原生质体酶解产量影响最大，其次是果胶酶浓度，再者就是纤维素酶、离析酶浓度。各因素的最优水平分别是甘露醇浓度第五水平，纤维素酶浓度为第二水平，果胶酶浓度为第一水平，离析酶浓度为第五水平。因此，根据原生质体产量大小，可以确定猕猴桃愈伤酶液最优组合为0.7mol·L^-1甘露醇+1.00％纤维素酶+0.10％果胶酶+1.25％离析酶。

实施例6

对实施例5中22号组合所得的原生质体产物进行活力检测，检测方法为荧光素双醋酸酯染色法(FDA法)：将5mg FDA溶于1mL丙酮中制成0.5％FDA贮备液贮存于0℃下，使用时取0.22mL FDA贮存液加入5mL 0.65mol/L甘露醇中，使用时，使最终浓度为0.01％。用时将纯化后的原生质体每毫升加入25μL FDA母液，混匀、室温放置10min后在荧光显微镜下观察。发绿色荧光的为有活性的原生质体，不产生荧光的为无活力。由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄-绿荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。原生质体活力(％)＝(暗视野下发荧光原生质体数÷明视野下原生质体数)×100％。检测结果其活力为80％，可见当进行本发明的最优实施方案时，原生质体的活力也很高，可作为后续原生质体培养以及细胞融合的基础材料。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物组织提取培养技术领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (6)

1.猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养愈伤组织，培养基为以MS为基础培养基，添加0.5-1.5mg/L 6-BA，0.05-0.5mg/L NAA，25-35g/L蔗糖和5-9g/L琼脂，并调节pH为5.7-5.8，培养温度为23-26℃，光照强度为1000-1500lx，光照时间为16h/d；

(2)对步骤(1)所得的愈伤组织用0.3-0.7mol·L^-1甘露醇进行预处理，预处理时间为0＜t≤90min；

(3)将步骤(2)所得的愈伤组织放入酶解液进行酶解；

(4)将酶解所得的混合液过滤，收集滤液并离心；取沉淀重悬，再次离心并弃去上清液，对沉淀洗涤即得原生质体。

2.如权利要求1所述的猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，添加物质浓度为0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30g/L蔗糖和7g/L琼脂。

3.如权利要求1所述的猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，预处理条件为甘露醇浓度0.7M，处理时间60min。

4.如权利要求1所述的猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，酶解液的组成为甘露醇0.3-0.7mol·L^-1，以质量浓度计，纤维素酶0.5-2.5％，果胶酶0.1-0.5％，离析酶0.25-1.25％。

5.如权利要求1所述的猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，酶解液的组成为甘露醇0.7mol·L^-1，以质量浓度计，纤维素酶1.0％，果胶酶0.1％，离析酶1.25％。

6.如权利要求1所述的猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，沉淀重悬和沉淀洗涤用溶液均为含质量/体积为13％甘露醇的CPW溶液。