CN85101971B - 中国冬虫夏草真菌及其人工培养方法 - Google Patents

Abstract

中国冬虫夏草是一种珍贵的野生药用和食用菌类植物。本发明从野生天然虫草上采用组织培养和子囊孢子培养的不同方法，均获得了与天然虫草性状一样的虫草真菌。在无菌器皿中人工培养，能长出与天然虫草一样的子座及与天然

Description

中国冬虫夏草真菌及其人工培养方法

本发明涉及中国冬虫夏草的人工培养问题。

中国冬虫夏草（Cordyceps Sinensis〔Berk〕Sacc），是一种名贵的野生药用和食用菌类植物。它的纯培养真菌从未被真正分离到。本发明得到的这一微生物新种的分生孢子世代分类上属：半知菌纲（Fungi Impergecti）从梗孢目（Moniliales），梗孢科（Monjliacean），头孢子菌属（Cephalosporium），定名为“冬虫夏草头孢菌”，学名：Cephalosporis Dongchongxiacae Sp.nev。该菌种现保藏在中国微生物菌种委员会普通微生物中心，保藏号为0020，保藏日期为1985·5·28。

冬虫夏草属（Cordyceps）在全世界已发现并鉴定的种有三百多个，对生长在青藏高原的中国冬虫夏草虽在一百多年前就被命名为C.Sinqnsis（Berk）Sacc，但其真菌因从未被真正分离到，使其分生子世代（无性世代）的分类地位一直没有得到解决。国内外的许多研究都把分离到的杂菌或冬虫夏草属的其它种，误认为是中国冬虫夏草真菌。本发明澄清了这一错误。

本发明的目的是在获得真正的中国冬虫夏草真菌的同时，提出了它的人工培养方法。

其菌种的分离有两种方法：

一是组织分离法采集未成熟的新鲜冬虫夏草（最好是子座还未长出地面的），洗净，用无菌水多次冲洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分钟，用灭菌蒸馏水洗去升汞，在无菌条件下，切去外皮，避开肠道，切取白净组织，剪碎，接于分离培养基表面，置于5～20℃温度条件下培养，此法简单易行，如材料不理想，培养温度不适宜或消毒不彻底，容易长出其它共生菌或互生菌。

一种是子囊孢子培养法：将尚未成熟的野生天然虫草移栽到有保护条件圃中，用消毒纸袋套在它的子座上，使弹出的子囊孢子附着在纸袋上，收取纸袋阴干，放在冰箱中备用。净化时将附有子囊孢子的纸袋浸于土壤浸出液中，浸透后用小刀将子囊孢子刮下，收集于离心管中，离心分离，弃去上部清液，用土壤浸出液反复洗涤，再用蔗糖溶液洗涤，反复离心分离，收集浮于液面的子囊孢子，再用土壤浸出液洗涤，放入冰箱中备用。萌发时取净化的子囊孢子少许，放入含庆大霉素的土壤浸出液中，室温培养三到六天，子囊孢子即可萌发，用灭菌吸管吸取已萌发的子囊孢子稀悬液，滴在琼脂平板上，在显微镜下挑取单个萌发孢子，接种在分离培养基上室温培养，此法麻烦，初生长缓慢，但可靠性高。

上述两种方法使用的分离培养基最好的配方是：葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克、硫酸镁0.5克、磷酸二氢钾1克、维生素液20毫升（其配方是：盐酸硫胺100毫克、核黄素25毫克、吡哆醇25毫克、矾酸钙100毫克、对安基苯甲酸25毫克、氯化胆碱100毫克、肌醇100毫克、烟酰胺100毫克、叶酸2.5毫克、生物素1毫克、蒸馏水500毫升混合而成。）、琼脂20克、蒸馏水1000毫升，最好再加20%虫草蝙蝠蛾幼虫（即虫草菌寄生体）浸出液（即将切碎干净的鲜幼虫1克与5毫升蒸馏水混合，浸泡8～12小时后过滤而成。）。

新鲜组织块在分离培养基上接种培养一周后，周围长出细小菌丝，两个月后形成菌落，三到四个月菌落直径可达1～2厘米。净化子囊孢子在分离培养基上接种培养10天后，孢子芽管伸长、分枝，形成菌丝，两个月菌落直径2～6毫米，三个月可见很短的灰白色气中菌丝，四个月菌落直径达1～2厘米，并有棕黑色色素扩散于培养基中。

将上述两方法获得的虫草真菌，接种于特殊培养基上（编号为S31）培养基配方为：肉水500毫升（即将新鲜牛肉或其它无脂肪肉500克与蒸馏水1000毫升，保持其比例，煮沸1小时后过滤而成。）、水解乳蛋白5克、酵母1克、葡萄糖30克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.2克、琼脂18克、核酸0.5克、牛奶200毫升、蒸馏水400毫升。5～20℃温箱中培养一段时间长好后，移入5℃左右冰箱中，四个月后可看到小子座长出，移到室温下培养一、二个月后小子座可长到2～3厘米，颜色、形态与天然虫草子座基本一样。将上述培养出的子座，用黑光灯照射，弹射出的子囊孢子的形态，大小与天然虫草的子囊孢子完全一样。

还可采用液体发酵方法加快菌丝的培养，其液体培养基有蚕蛹培养基（蚕蛹粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾和水）;肝汤培养基（肝汤、洋芋汤、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、复合维生素B和水）等，获得的人工虫草菌丝经药理药化对比试验和天然虫草基本一样。

中国冬虫夏草真菌菌种的鉴别，可以从菌落形态、其中菌丝颜色和分生孢子的形态、颜色、大小等方面观察，在不同培养基中菌丝形态不同。在蚕蛹培养基和肝汤培养基中，菌丝为绒毛状，有较长的白色菌丝，呈不规则的树枝状，菌落表面较细碎。在分离培养基和特殊培养基（编号为S31）中，气中菌丝短小，分枝较少，菌落初表面平滑坚硬，后变皱折不平，颜色从灰白色转向棕色，基中菌丝呈棕黑色，并有棕黑色素在基中扩散，而其它杂菌的底色多数为黄色、红色或无色。菌丝在两个月以上长出分生孢子，单生无色，或双生、数个直至十多个呈头状生长，分生孢子是椭圆形，其柄往往呈直角或锐角生长在菌丝上，为细长瓶状，一般不分枝，也有少数2-5个分枝。

上述方法的一个实施例是：从化隆县挖来的新鲜虫草一株，洗净，用无菌水反复冲洗，放入0.1%的升汞液中消毒5分钟，用无菌水洗去升汞，在无菌条件下，切取内部白色组织，剪碎，接种在分离培养基表面，放在5～20℃温箱中一周后长出了菌丝，两个月后形成凸起硬壳的菌落。经扩大繁殖培养后将其移入前述编号为S31生长子座的培养基上继续培养，先在5～20℃温箱中培养一个月，然后移入5℃左右冰箱中，四个月后开始有尖细的子座长出。再移到有散射阳光的实验台上继续培养，一两个月后，子座可达2～3厘米长，颜色、形态与天然虫草的子座基本一样。将成熟的子座用20瓦黑光灯间歇照射，个别子座弹射出了子囊孢子，经鉴别，其形态、大小与天然生长的完全一样。

Claims (4)

1、一种名贵药用和食用的中国冬虫夏草（简称虫草）头孢子菌（Cephalosporium）（现保藏在普通微生物中心，保藏号为0020）的人工培养方法，其特征是将尚未成熟的天然虫草处理后，切取其内部的新鲜组织块，接种在分离培养基（其成份是：葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克、磷酸二氢钾1克、维生素液20毫升、琼脂20克、蒸馏水1000毫升、硫酸镁0.5克、虫草蝙蝠蛾幼虫浸出液20%）上，置于5～20℃的条件下，培养1-2个月，再将纯分离物转接于特殊培养基（其成份是：肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母1克、葡萄糖30克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.2克、琼脂18克、核酸0.5克、牛奶200毫升、蒸馏水400毫升）中，仍在5～20℃的条件下继续培养一个月时间，然后移入5℃左右的冰箱中，四个月后有子座原基形成，待长到1-2厘米时，再移到有散射阳光的室温下继续培养1-2个月，即长成与天然虫草形态、颜色一样的子座。

2、如权利要求1所述的虫草菌的人工培养方法，其特征在于新鲜组织块的制取办法是将未成熟的新鲜虫草，洗去泥土后，用无菌水反复冲洗，然后放入0.1%的升汞液中消毒5分钟左右，再用无菌水洗掉升汞，然后在无菌的条件下，避开肠道，切取其内部的白净组织。

3、一种中国冬虫夏草（简称虫草）头孢菌的人工培养方法，其特征是取已经净化的孢子少许，放入含庆大霉素或其它抗菌素的土壤浸出液中，在室温条件下培养3-6天，待孢子萌发后，用灭菌吸管吸取已萌发的孢子稀悬液，滴在琼脂平板上，在显微镜下挑取单个萌发的孢子，接种在分离培养基（其成份同前，略）上，置于5～20℃的条件下，培养1-2个月，再将纯分离物转接于特殊培养基（其成份同前，略）中，仍在5～20℃的条件下继续培养一个月时间，然后移入5℃左右的冰箱中，四个月后有子座的原基形成，待长到1-2厘米时，再移到有散射阳光的室温下继续培养1-2个月，即长成与天然虫草形态、颜色一样的子座。

4、如权利要求3所述的虫草菌的人工培养方法，其特征在于净化孢子的制备方法是，将未成熟的虫草移栽到有保护条件的圃中，用消毒纸袋套在子座上，待子座成熟后弹出的孢子附着在纸袋上，将纸袋放入土壤浸出液中，浸透之后用小刀刮下孢子，在离心管中分离，用土壤浸出液反复洗涤，再用蔗糖水洗涤，反复离心分离，收集浮在液面上的孢子，再用土壤浸出液洗涤一次，即为净化的孢子。